CH640866A5 - Oligomeres de composes du type muramyl-peptide et medicaments les contenant. - Google Patents

Oligomeres de composes du type muramyl-peptide et medicaments les contenant. Download PDF

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CH640866A5
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Pierre Lefrancier
Monique Parant
Francoise Audibert
Edgar Sache
Louis Chedid
Jean Choay
Edgar Lederer
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Anvar
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K9/00—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K9/001—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure
    • C07K9/005—Peptides having up to 20 amino acids, containing saccharide radicals and having a fully defined sequence; Derivatives thereof the peptide sequence having less than 12 amino acids and not being part of a ring structure containing within the molecule the substructure with m, n > 0 and m+n > 0, A, B, D, E being heteroatoms; X being a bond or a chain, e.g. muramylpeptides

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Description

L'invention est relative à des produits nouveaux doués de propriétés biologiques et pharmacologiques de grande valeur, lesquelles peuvent être mises à profit soit pour la constitution de réactifs de laboratoire standardisés pour l'étude comparative des propriétés biologiques semblables d'autres composés, soit pour la constitution de médicaments nouveaux à usage humain ou vétérinaire.
Plus particulièrement, l'invention concerne, parmi ces composés, ceux qui possèdent des propriétés immunorégulatrices, notamment d'adjuvants immunologiques non spécifiques, ces composés étant aptes, entre autres activités, à renforcer l'activité immunoprotectrice d'agents immunogènes de tous genres, naturels ou synthétiques, qu'il s'agisse d'agents immunogènes faibles par nature, d'agents immunogènes forts, mais utilisés à des doses très faibles, ou d'agents dont l'effet immunogène initialement fort a été fortement réduit du fait des purifications ou modifications auxquelles ces agents ont donné lieu, en vue de réduire leur toxicité ou les effets secondaires qui accompagnent leur administration in vivo.
L'invention concerne donc également les applications auxquelles les composés objets de la présente demande sont susceptibles de donner lieu, ainsi que les compositions particulières contenant de tels composés, plus particulièrement appropriées à la mise en œuvre 35 de ces applications.
Elle concerne donc des réactifs biologiques, par exemple des adjuvants immunologiques standards, qui peuvent être constitués à l'aide des composés selon l'invention, notamment en vue d'étudier les éventuelles propriétés adjuvantes de substances à l'étude par comparaison à de tels adjuvants standards ou, au contraire, comme agent susceptible de s'opposer à certains effets liés à l'administration de ces substances immunosuppressives.
L'invention concerne plus particulièrement encore l'application des composés en question à l'amplification de l'effet immunogène de principes actifs de vaccins administrés à un hôte, animal ou humain, notamment dans le cas où ces principes vaccinants appartiennent aux catégories d'agents immunogènes rappelés ci-dessus. En conséquence, l'invention concerne également encore des compositions pharmaceutiques dont le principe actif est constitué par un au moins so des composés définis ci-après, en association avec le véhicule pharmaceutique approprié au mode d'administration requis ou utilisable eu égard à la nature du principe vaccinant utilisé.
Plus spécifiquement encore, elle concerne des produits nouveaux capables de stimuler des réponses immunitaires faisant intervenir au 55 moins l'un et de préférence l'ensemble des mécanismes constituant les réponses immunitaires à support humoral (opsonines, anticorps) ou à support cellulaire. Ces mécanismes peuvent être spécifiques (leur mise enjeu dépendant d'une vaccination préalable par un mélange antigénique donné, et plus spécialement provenant d'agents 60 pathogènes) ou non spécifiques (tels qu'ils sont induits par des agents comme le BCG, les corynébactéries ou les endotoxines).
On sait que les organismes des êtres vivants à sang chaud comportent plusieurs types de cellules constituant ce qui pourrait être appelé plusieurs lignes de défense à l'égard des différentes agressions 65 dont ces organismes peuvent être l'objet.
La première ligne de défense met enjeu, comme il est bien connu, les leucocytes et des macrophages dans le sang circulant, capables, lorsqu'ils rencontrent un agent étranger tel qu'un antigène,
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de le phagocyter et souvent de le détruire. Cette phagocytose, qui peut être favorisée notamment par des constituants non spécifiques du sérum (opsonines), voire même par des interventions extérieures visant à une activation des macrophages, peut cependant ne pas être suffisante pour assurer la destruction complète des agents étrangers.
L'organisme doit alors faire appel à une seconde ligne de défense mettant enjeu des réponses immunitaires d'ordre plus spécifique à l'égard des constituants antigéniques de l'agent étranger. Les réponses immunitaires de ce type sont alors susceptibles de faire intervenir des différenciations cellulaires dans au moins l'une des deux directions principales suivantes.
Un premier type de réponse immunitaire met en effet en jeu des cellules spécialisées qui sont ou des précurseurs ou des activateurs des cellules qui sécrètent des immunoglobulines ou anticorps, plus spécialement des anticorps humoraux qui sont particulièrement efficaces pour combattre des infections causées par des bactéries ou autres micro-organismes envahissant les tissus et les fluides du corps, qui sont capables de se multiplier à l'extérieur des cellules, ou encore pour neutraliser des toxines bactériennes ou analogues. Parmi les micro-organismes connus pour leur capacité d'induire une réponse immunitaire humorale, on peut citer les Klebsiella; ceux-ci sont d'excellents agents vaccinants vis-à-vis desquels un immunsérum spécifique assure une très bonne protection. Ils sont souvent utilisés comme micro-organismes de référence dans des tests biologiques utilisés pour l'étude de l'immunostimulation non spécifique.
A titre d'exemple, on peut citer le protocole expérimental décrit par Chedid L. et coll. dans «Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A.», 1977, 74:2089, qui permet de constater l'action stimulante ou non de substances étudiées à l'égard des défenses immunitaires humorales, selon qu'elles protègent ou non des souris auxquelles elles sont injectées contre une dose de Klebsiella pneumoniae qui entraîne la mort de la quasi-totalité des témoins.
L'autre type de réponse immunitaire susceptible d'être mis enjeu par l'organisme des animaux à sang chaud est celui dit à médiation cellulaire, qui fait intervenir soit des cellules spécifiquement sensibilisées considérées comme appartenant à la lignée lymphocytaire (cellules T) — ces lymphocytes ont été décrits comme susceptibles d'intervenir dans l'induction de l'activation des macrophages —, soit directement des macrophages d'une manière non spécifique. Il s'adresse plus particulièrement à des micro-organismes, par exemple des bactéries, qui se multiplient à l'intérieur des cellules et qui sont insensibles aux anticorps circulant dans le sérum sanguin. Ce système joue également un rôle dans la défense vis-à-vis du développement tumoral.
Il en est ainsi des bactéries du type de celles qui, même à l'état phagocyté dans des macrophages, sont capables de se multiplier (bactéries intracellulaires) à l'intérieur de ceux-ci, entraînant finalement la destruction de ces derniers. L'un des exemples les plus étudiés de ce type de bactérie est constitué par les Listeria, notamment les Listeria monocytogenes, qui sont à la base de tests biologiques devenus classiques aussi bien dans le domaine de la protection spécifique que non spécifique, concernant l'étude des produits ou substances susceptibles de stimuler les défenses à médiation cellulaire de l'organisme.
A titre d'exemple, on peut citer le protocole expérimental décrit par Medina, Vas et Robson («J. Immunol.», 1975,114, 1720), qui permet de constater l'action stimulante ou non de substances étudiées à l'égard des défenses immunitaires à support cellulaire, selon qu'elles protègent ou non des souris auxquelles elles sont injectées contre une dose de Listeria monocytogenes qui entraîne la mort de la quasi-totalité des témoins, ou selon qu'elles entraînent ou non la destruction à court terme desdits micro-organismes.
Il est aujourd'hui de plus en plus affirmé que l'immunité à médiation cellulaire constitue un système complexe de défense des organismes intervenant dans de nombreuses situations, non seulement vis-à-vis des micro-organismes intracellulaires du genre précité, mais également vis-à-vis de la croissance néoplasique et la multiplication de nombreux agents fongiques, parasitaires, etc.; c'est ce système qui
également est en cause dans le rejet des greffes et de nombreux processus auto-immuns.
D'une façon générale, on peut faire référence, en ce qui concerne l'ensemble des problèmes évoqués ci-dessus, par exemple aux articles: de Priscilla A. Campbell, intitulé «Immunocompetent Cells in Resistance to Bacterial Infections» (Cellules immunocompétentes pour la résistance aux infections bactériennes), paru dans «Bacterio-Iogical Reviews», juin 1976, pp. 284-313; de G.B. Mackaness, intitulé «Cellular Immunity» (Immunité cellulaire), paru dans les «Annales de l'Institut Pasteur», 1971,120,428-437; de G.H. Werner et coll., intitulé «Toxicological Aspects of Immunopotentiation by Adjuvants and Immunostimulating Substances» (Aspects toxicolo-giques de l'immunopotentiation par des substances adjuvantes et im-munostimulantes), paru dans le «Bulletin de l'Institut Pasteur», vol. 75, N° 1 de janvier 1977, et dans un rapport d'un groupe scientifique de l'Organisation mondiale de la Santé, intitulé «Réponses immunitaires à Support cellulaire», paru dans «Org. mond. Santé, Sér. Rapp. techn.», 1969, N° 423.
Il résulte de ce qui précède que la mise à la disposition des spécialistes, notamment du biologiste et du clinicien, des compositions ou produits capables de stimuler les défenses immunitaires des types susindiqués peut revêtir une importance capitale tant pour l'étude d'autres substances au niveau de la recherche, tant fondamentale qu'appliquée, que dans le domaine de la thérapeutique humaine ou vétérinaire.
On connaît déjà certains agents capables de stimuler ces différentes réponses immunitaires, tant à médiation cellulaire qu'à médiation humorale. Il en est par exemple ainsi des lipopolysaccharides bactériens (LPS), connus pour leur activité protectrice à l'égard des infections mettant enjeu des mécanismes d'immunité humorale ou à médiation cellulaire. Les LPS possèdent en outre des propriétés d'adjuvants immunologiques non spécifiques, en ce qu'ils favorisent une augmentation du taux de synthèse d'anticorps spécifiques par un organisme soumis à l'agression d'antigènes, de quelque nature qu'ils soient.
Il est connu de même que des mycobactéries, et plus particulièrement le bacille de Calmette-Guérin (BCG), possèdent des propriétés immunostimulantes puissantes.
Cependant, il ne peut être question d'envisager l'utilisation des LPS en thérapeutique, compte tenu de leur extrême toxicité qui est bien connue. Le BCG lui-même n'est pas exempt de nombreux inconvénients, lesquels peuvent être mis en évidence par exemple dans l'animal, notamment au niveau de l'augmentation de la sensibilité de l'hôte aux endotoxines, de la production d'une hypersensibilité à la tuberculine, de l'induction de granulomes, d'une hyperplasie du tissu lymphoïde et, notamment chez le rat, de polyarthrites.
On sait que de nombreux chercheurs se sont attachés à l'étude d'extraits susceptibles d'être obtenus à partir des mycobactéries,
dans le but d'obtenir des agents purifiés ou détoxifiés retenant les propriétés biologiques de valeur du BCG ou des LPS, tout en étant débarrassés des inconvénients susmentionnés. Le développement de ces recherches a conduit à des petites molécules, représentant en elles-mêmes un apport considérable à l'arsenal des substances dont on dispose; elles sont maintenant accessibles à la synthèse chimique, et leur activité d'adjuvant immunologique, très puissante, se manifeste même lorsqu'elles sont administrées à un hôte, en l'absence de tout support huileux, contrairement aux fractions obtenues par extraction, notamment à partir des mycobactéries.
Les petites molécules susdites sont, comme il est maintenant bien connu, constituées par des N-acylmuramylpeptides ou certains de leurs dérivés de substitution.
Le produit le plus représentatif de la série des N-acylmuramylpeptides est constitué par la N-acylmuramyl-L-alanyl-D-isogluta-mine (MDP). Des recherches diverses ont cependant montré que l'activité d'adjuvant immunologique pouvait être maintenue, dans une mesure plus ou moins importante, par l'introduction de substitutions diverses dans le groupe muramyle ou par le remplacement du
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premier résidu aminoacyle par d'autres, dérivés d'acides aminés de série L différents.
Il a déjà été constaté pour certains des muramylpeptides du genre en question, et plus particulièrement en ce qui concerne la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine déjà citée (MDP) ou pour le dérivé correspondant non amidé, à savoir l'acide N-acétylmura-myl-L-alanyl-D-glutamique (MDPA) ou encore des a-esters du MDP A, qu'ils possédaient en outre des propriétés anti-infectieuses déjà très importantes, qui se manifestent plus particulièrement au niveau des mécanismes de l'immunité humorale. Récemment, on a constaté également l'activité de certains dérivés lipophiles sur des infections de type endocellulaire telles que celles provoquées par les Listeria.
L'invention résulte de la découverte de ce que des produits nouveaux, constitués par plusieurs molécules de composés du type muramylpeptide réunies sous la forme d'un oligomère, présentent également d'excellentes propriétés pour la stimulation des réponses immunitaires.
Les produits selon l'invention sont bien distincts des produits naturels adjuvants hydrosolubles connus antérieurement et qui peuvent être obtenus à partir des parois cellulaires de micro-organis-mes, tels que les mycobactéries. En effet, ces derniers, qui renferment dans leur structure au moins un fragment de peptidoglycane, présentent des motifs glucosamine, et plus particulièrement N-acétyl-glucosamine, motifs qui sont absents des nouveaux produits selon l'invention.
Toujours par rapport aux produits antérieurs naturels provenant de parois de micro-organismes, les produits nouveaux peuvent présenter l'avantage de manifester leurs propriétés même lorsqu'ils sont administrés sans phase huileuse.
Vis-à-vis des produits monomères antérieurement décrits, les composés oligomères peuvent aussi présenter certains avantages. Un premier avantage est lié au fait que l'utilisation de molécules de poids moléculaire plus élevé peut entraîner une résorption plus lente chez l'individu auquel elles sont administrées. L'effet prolongé ainsi obtenu peut s'accompagner d'un accroissement des réponses du sujet traité par rapport à celles qui résulteraient de la même dose d'agent monomère. Un autre avantage est lié à leur taille moléculaire qui entraîne leur phagocytose, stimulant ainsi les cellules responsables de cet effet. Un autre avantage encore est la possibilité pour les composés oligomères selon l'invention, à activité égale, de modifier les caractères secondaires des monomères utilisés; en particulier, il est possible d'obtenir des composés oligomères dont l'administration n'ait pas d'effets secondaires gênants et qui, par exemple, présentent une atténuation, voire une disparition du caractère pyrogène. Le passage des monomères aux polymères peut également entraîner des changements dans certains types d'activité, comme cela apparaîtra dans les exemples, à propos notamment du ß-D-p-amino-phénylglycoside du MDP.
Pour toutes ces raisons, les oligomères selon l'invention sont des produits nouveaux de grand intérêt, tant du point de vue de l'usage pharmaceutique qu'en tant que réactifs de laboratoire.
Les nouveaux produits selon l'invention sont des oligomères dont les éléments monomères sont des muramylpeptides ou des dérivés de ceux-ci. Ces monomères présentent un groupe dérivé de l'acide muramique sur le carboxyle duquel est fixée une chaîne peptidique comprenant au moins deux résidus aminoacyle. Le premier aminoacyle est l'un du groupe comprenant L-alanyle, L-arginyle, L-asparagyle, L-cystéinyle, L-glutaminyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxyprolyle, L-isoleucyle, L-leucyle, L-méthionyle, L-phényl-alanyle, L-prolyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle et L-valyle. Le second aminoacyle est un résidu D-glutamyle ou D-iso-glutaminyle. Les oligomères selon l'invention sont pour un grand nombre solubles dans l'eau et sont en outre caractérisés par le fait qu'ils ne présentent pas, dans leur structure, de motifs N-acétyl-glucosamine.
De préférence, les oligomères selon l'invention ont une masse moléculaire, ou une masse moléculaire moyenne lorsqu'il s'agit de produits qui ne sont définis que de façon statistique, qui ne dépasse pas environ 25 000.
Selon un autre mode de caractérisation, les oligomères contiennent de préférence au plus 50 unités muramylpeptide.
Dans les oligomères selon l'invention, il est préférable que, dans chaque molécule, le rapport du nombre total de motifs aminoacyle au nombre total de motifs muramyle soit au plus égal à 7.
Les oligomères selon l'invention peuvent être constitués par un assemblage des monomères muramylpeptide entre eux, mettant en jeu des fonctions réactives qu'ils peuvent comporter. Ils peuvent aussi être formés par la réunion des monomères muramylpeptide au moyen d'agents de pontage.
Dans l'hypothèse où l'assemblage des monomères est obtenu, au moins en partie, à l'aide d'un agent de pontage, il est préférable que la proportion des restes correspondant à cet agent, qui se retrouvent dans l'oligomère, soit telle qu'ils ne représentent pas plus de 60% du poids total de la molécule.
Pour certaines applications des produits selon l'invention, et en particulier lorsqu'ils sont utilisés pour leurs propriétés adjuvantes de l'immunité, il est préférable que ces produits ne soient pas eux-mêmes générateurs de réactions immunitaires, autrement dit que ces produits ne soient pas immunogènes. Dans la pratique, il suffit que ce caractère non immunogène puisse être constaté dans les conditions utiles à la manifestation de leur activité adjuvante.
Pour cette même raison, dans les monomères muramylpeptide formant l'oligomère, on préfère ceux pour lesquels le premier résidu aminoacyle fixé au groupe muramyle ne contient pas de noyau aromatique. Ce résidu est par conséquent choisi de préférence parmi: L-alanyle, L-arginyle, L-asparagyle, L-cystéinyle, L-glutaminyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxyprolyle, L-isoleucyle, L-leucyle, L-méthionyle, L-prolyle, L-séryle, L-thréonyle et L-valyle.
La structure des oligomères selon l'invention n'est pas connue dans tous les cas avec exactitude, et certains d'entre eux, comme cela a déjà été indiqué, ne peuvent être définis que de façon statistique. Il est cependant possible, même dans ce dernier cas, de formuler quelques hypothèses sur la façon dont les monomères se rattachent les uns aux autres ou sont reliés entre eux au moyen des agents de pontage, en considérant les groupes fonctionnels des monomères susceptibles d'entrer en réaction. Ces groupes fonctionnels sont,
dans les monomères les plus usuels, des fonctions carboxyle, amine ou hydroxyle.
Le ou les groupes fonctionnels réactifs sont disposés sur la partie peptidique du monomère et/ou en position 1, 2,4 ou 6 du résidu osi-dique du groupe muramyle, ou sur des groupes de substitution occupant ces mêmes positions.
Selon un mode avantageux de réalisation de l'invention, l'oligomère est formé par l'assemblage de deux monomères ou plus, liés entre eux par leur partie peptidique, par des liaisons de type également peptidique. Il est ainsi possible de réaliser des oligomères selon l'invention en reliant les monomères par l'intermédiaire de résidus aminoacyle ou de peptidyles servant d'agent de pontage.
Suivant un mode préféré; on réalise des oligomères selon l'invention en pontant des unités monomères de muramylpeptide au moyen de lysine ou de chaînes peptidiques renfermant des résidus lysyle.
Les monomères peuvent aussi être réunis pour former l'oligomère selon l'invention au moyen d'agents de pontage polyfonction-nels tels que ceux que l'on utilise pour le pontage des protéines.
Des agents de pontage avantageux sont constitués notamment par des composés dialdéhyde ou diacide, ou encore par des dérivés de ces derniers tels que leurs diesters activés. On peut aussi utiliser des agents polyfonctionnels tels que le diméthyladipimidate ou les composés homologues et les dérivés de ceux-ci.
Un agent de pontage particulièrement préféré est constitué par le glutaraldéhyde, connu de l'art antérieur pour sa capacité de réticula-tion des protéines.
De façon préférée, des monomères convenant à la formation des oligomères selon l'invention sont des muramylpeptides répondant à la formule générale:
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nh r-ch-co-x-nh~ch-co~y i
ch0
co - z dans laquelle les substituants R, R,, R2, R4, R6, X, Y et Z ont l'une des significations suivantes:
— R est soit un atome d'hydrogène, soit un groupe alcoyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone,
— R, est soit —NH2, soit —OH, ou un radical résultant de la substitution d'un hydrogène de ceux-ci par un radical alcoyle ou aryle ayant au plus 10 atomes de carbone, pouvant porter des groupes fonctionnels,
— R2 est un atome d'hydrogène ou un radical acyle pouvant porter des groupes fonctionnels et comportant au plus 22 atomes de carbone,
— R4 est un hydroxyle ou le groupe résultant de la substitution de l'hydrogène de l'hydroxyle par un radical acyle comprenant au plus 4 atomes de carbone,
— R6 est soit — NH2, soit —OH, soit le groupe résultant de la substitution d'un hydrogène d'un de ceux-ci par un radical acyle saturé ou non, éventuellement ramifié, substitué ou non, contenant de 1 à environ 90 atomes de carbone, et pouvant en outre porter des groupes fonctionnels: hydroxyle, carboxyle, carbonyle, amino, cyclopropane, méthoxy,
— X est un des résidus aminoacyle L-alanyle, L-arginyle, L-aspara-gyle, L-cystéinyle, L-glutaminyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxy-prolyle, L-isoleucyle, L-leucyle, L-méthionyle, L-phénylalanyle, L-prolyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle et L-valyle,
— Y est soit —OH, soit un radical alcoxy comprenant de 1 à
4 atomes de carbone, soit — NH2, les hydrogènes du groupe amino pouvant être substitués par des restes alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, soit un résidu aminoacyle amide,
— Z est soit —OH, soit — NH2, soit un groupe de formule —(A)n—W—R', avec n soit nul, soit 1, 2 ou 3, ou
—(A)n—A'—CO—R' avec n' soit nul, soit 1 ou 2, dans lesquelles: A est un résidu aminoacyle du groupe indiqué ci-dessus pour X, étant entendu que les groupes A présents dans un même composé peuvent être identiques ou différents, n ne représentant que le nombre total de groupes A dans ce composé,
A' est un résidu d'aminoalcool (—NH—CH—CH2—O—) cor-
I
respondant aux aminoacyle A (—NH — CH—CO—) indiqués ci-dessus, '
W est soit un oxygène, soit un groupe — NH,
R' est un atome d'hydrogène ou un reste alcoyle linéaire ou ramifié, saturé ou non, pouvant porter des groupes fonctionnels hydroxyle, carbonyle, carboxyle, cyclopropane, méthoxy, ou un reste aryle ou alcoyle-aryle éventuellement substitué.
Certains des composés correspondant à la formule générale I présentent des aspects avantageux. Ci-dessous sont indiquées les différentes significations des éléments variables de la formule I correspondant à des structures préférées.
Dans cette formule, le deuxième groupe aminoacyle de la chaîne peptidique liée au résidu de type muramyle est le résidu D-gluta-myle. Le premier groupe aminoacyle (désigné par X) peut, par contre, être choisi parmi les différents résidus aminoacyle mentionnés ci-dessus. Parmi les monomères de formule I, on préfère ceux dans lesquels le premier résidu aminoacyle est L-alanyle. Un deuxième type de monomères préférés est celui dans lequel cet aminoacyle est L-séryle. Un autre type de composés préférés est celui dans lequel cet aminoacyle est glycyle.
Sont également avantageux les monomères dans lesquels le premier résidu aminoacyle est L-prolyle, L-thréonyle ou L-valyle.
Lorsque dans Z figure au moins un résidu aminoacyle (A), on préfère que le premier fixé en position y du résidu glutamyle soit un résidu L-lysyle, L-alanyle ou L-glutamyle. De préférence aussi, lorsque se trouve dans la formule un résidu aminoalcool (A'), les résidus préférés sont ceux correspondant à la lysine, à l'alanine et à l'acide glutamique.
En position a du résidu D-glutamyle, les variantes ou substitutions possibles sont plus limitées qu'en position y de ce même résidu. Le substituant Y peut tout d'abord représenter —OH, c'est-à-dire que l'on retrouve la fonction a carboxylique libre de l'acide glutamique. Il peut s'agir aussi de la forme amide de ce résidu, c'est-à-dire de la forme isoglutaminyle, lorsque Y est — NH2, l'un au moins des atomes d'hydrogène de ce groupe pouvant être substitué par des restes alcoyle courts comprenant de 1 à 4 atomes de carbone. Il peut encore s'agir des formes estérifiées de l'acide, Y étant alors un alcoxy, comprenant de 1 à 4 atomes de carbone.
Dans une forme préférée, Y est un hydroxyle.
Dans une autre forme préférée, Y est — NH2.
Une autre forme préférée est constituée par le cas où Y est soit —OCH3, soit — OC2H5.
Dans la forme préférée la plus usuelle, c'est-à-dire celle pour laquelle on retrouve la structure de l'acide muramique, R est — CH3. Dans une autre forme préférée, le groupe R est un hydrogène; la structure est alors celle de l'homologue désigné sous le nom d'acide normuramique. Enfin, dans une autre forme préférée, R est — C2H5; à cette forme correspond la structure dite homomuramique.
La liaison glycosidique de la partie saccharidique dans les monomères selon l'invention peut se présenter sous les formes anomères a ou ß. Les groupes fonctionnels du résidu osidique peuvent recevoir également différents substituants dont la littérature antérieure, relative aux agents adjuvants du type muramylepeptide, a donné un certain nombre d'exemples. En particulier, la littérature décrit des produits dont les fonctions hydroxyle du résidu osidique sont estérifiées ou éthérifiées, ou la fonction amine en position 2 est acylée.
Dans la formule générale I, les substituants du cycle gluco-pyrannoside ont été désignés par Rj, R2, R4 et Re. Les différentes positions ne présentent pas les mêmes possibilités de substitution, la position 6 étant celle pour laquelle la plus grande latitude est offerte.
Des monomères préférés sont ceux dans lesquels un ou plusieurs des substituants Rj, R4 et R6, indépendamment les uns des autres ou simultanément, sont un hydroxyle.
Des monomères avantageux sont aussi ceux pour lesquels Rj est —NH2, —O —C2H4—NH2 (aminoéthoxy) ou —O—C6H4—NH2 (paraminophényloxy).
Des monomères avantageux sont également ceux pour lesquels R4 correspond aux esters acétique ou monosuccinique.
Des monomères préférés sont ceux pour lesquels R6 est une fonction amine, ou encore un ester, dont le résidu acyle contient de 1 à 6 atomes de carbone, en particulier les esters acétique ou monosuccinique. R6 est aussi avantageusement l'ester correspondant aux groupes mycoloyle (environ C80 à C90) ou corynomycoloyle (C32). Dans les monomères préférés, R2 est un groupe acétyle (—CO—CH3) ou un hydrogène.
Des monomères particulièrement préférés pour la constitution des oligomères selon l'invention sont:
— la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine et ses esters,
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— l'acide N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-glutamique, son diamide, ses a-esters, et diesters méthylique, éthylique, propylique,
— la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-glutamibe et ses esters méthylique, éthylique, propylique.
D'autres monomères avantageux sont:
— la N-acétylmuramyl-L-séryl-D-isoglutamine,
— l'a-glycidylamide de l'acide N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-glutamique,
— la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyle-L-lysine et ses esters méthylique et éthylique,
— la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanine,
— la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-lysyle-L-alanine,
ch2oh
— la 4,6-di-O-acétyl-N-acêtylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine,
— la 6-O-succinyl-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine,
— l'ester méthylique de la 4,6-di-O-succinyl-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine,
— l'ester méthylique de la 4-0-acétyl-6-0-(Na-lysylamide)succinyl-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine.
Un oligomère avantageux selon l'invention est constitué par deux monomères de formule I dans laquelle R,, R4 et R6 sont simultanément un hydroxyle, R2 est — CO—CH3, R est — CH3 ou H, X est un résidu L-alanyle, L-séryle ou glycyle, Z est —OH, les deux monomères étant fixés par leur carboxyle en y du résidu D-gluta-myle aux fonctions amine d'un même résidu lysine. Un oligomère de ce type particulièrement préféré est le dimère de formule:
ch - co - nh - çh - conh - ch - conh,
çh2oh
-O.
ch3 (ch2)2
co - nh
I
ch, I ^ ch.
I
/• nh - cochj °h2
ch,,) / ch,
j s ch - co - nh - ch - conh - <jh - conh, | ^
ho
/i h,oh
H )
ch,
(çh2)2
ix>
(ii)
ch - co i nh
-oh,
-hh2,
( -och^
que nous désignerons sous forme abrégée (MDP)2-Lys-(—OH, -NH2, -OCH3) ou nor(MDP)2-Lys-(—OH, — NH2, -OCH3).
Selon un autre type d'oligomère préféré, des monomères de formule I sont rattachés à une chaîne peptidique constituée de motifs lysine, en nombre au moins égal à celui des muramylpeptides contenus dans ledit oligomère. Un oligomère préféré de ce type est constitué par un trimère de formule:
çh2oh l'acide succinique, ou par un agent pontant difonctionnel comme le diméthyladipimidate ou ses homologues et leurs dérivés, notamment leurs esters. Des résidus d'agents pontants analogues au résidu adi-pimidyle sont notamment ceux de formules :
40
nh - c0ch3
^3-1 /
) ch - conh - çh - conh - çh - conh, h ) ! I 2
ch,
(ch,),
I d
CO I
nh
(ÇH2)4
.nh - ch - co
(III)
-oh
-nh2 ,
( -och.
3 60
dans laquelle le carboxyle terminal de la chaîne peptidique est soit libre, soit amidé, soit estérifié. Nous désignerons le produit estérifiê par l'abréviation (MDP)3-Lys-(—OH, — NH2, — OCH3)ounor-(MDP)3-Lys-(—OH, —NH2, -OCH3).
Un autre type d'oligomère préféré est constitué par des dimères de composés de formule I pontés par un composé diacide tel que
65
-C-(CH2)p-C-
NH
NH
avec p compris entre 2 et 10, en particulier p = 4
-C-(CH2)2-S-S-(CH2)2-C-
NH
NH
Appartient à ce dernier type de composés le dimère de N-acétyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-lysine (ou le composé nor-muramyl correspondant) ponté par un résidu adipimidyle et de formule:
(Formule en tête de la page suivante)
Un autre type de composé oligomère préféré est obtenu à partir de monomères de formule I présentant au moins une fonction amine réactive, notamment sur le résidu osidique, en position 1,2,4 ou 6, les monomères étant pontés au moyen de glutaraldéhyde. Des composés préférés sont obtenus à partir du P-D-p-aminophénylglycoside de la N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine (en abrégé PAP-MDP), et plus particulièrement les oligomères contenant en moyenne de 8 à 10 monomères par molécule.
L'identification de composés oligomères selon l'invention requiert des techniques d'analyses variées habituellement utilisées pour l'étude des molécules complexes, notamment pour l'étude des protéines et des hydrates de carbone.
Sur la molécule complète, on pourra utiliser les modes de détermination des masses moléculaires, les études spectroscopiques, chro-
/ j) 9 640 866
ch2oh nh - coch3
CH,,
) ch - co - nh - ch - conh - ch - c0nho h ) | | 2
pon ch3
CH,,)
/ 1 1 nh -
CH^ (ÇH2)2
,/n mu oh conh - ch - cooh h0 7 1 ' — coch3 (ch2)4
(IV)
■x r ( / I 0 ) ch - co - nh - (jîh - conh - (j)h - c0nh2 m c = nh h ' 0h3 <?h2>2 (ch„)
conh - p - cooh
(?h2>4
nh c = nh
2 p matographiques, etc. Une identification complète nécessite le plus souvent une fragmentation préalable des molécules suivant les méthodes habituelles d'hydrolyse. La fragmentation peut conduire à la libération des unités monomères de muramylpeptide. Néanmoins, le plus souvent, la fragmentation conduit à un ensemble d'éléments 35 plus petits que sont notamment les acides aminés constitutifs, les acides correspondant aux résidus acyle, etc., qui sont eux-mêmes identifiés suivant les modes traditionnels. La combinaison des propriétés de l'oligomère et la connaissance des éléments constitutifs permet alors de reconstituer la structure de l'oligomère étudié. Bien 40 évidemment, dans le cas des produits de structure variable, comme c'est le cas pour les oligomères obtenus avec le glutaraldéhyde comme agent pontant, seule une formulation statistique peut être déduite de l'analyse.
Les produits selon l'invention sont préparés par synthèse. Le cas 45 échéant, certains des fragments utilisés pour ces synthèses peuvent provenir de produits naturels.
Le plus généralement, la synthèse passe d'abord par la formation des monomères, lesquels sont également obtenus par synthèse.
Pour aboutir à un même monomère, diverses voies sont possi- so bles. Dans tous les cas, la synthèse comporte une série d'étapes au cours desquelles les différents fragments constituant la structure d'ensemble des monomères sont progressivement assemblés. Les principales différences entre les voies possibles se situent dans la séquence choisie pour l'assemblage des fragments. Les modes de réac- 55 tion conduisant à la fixation d'un fragment au(x) fragment(s) contigui) sont dans l'ensemble peu modifiés par l'ordre dans lequel cette intégration est conduite, à ceci près bien entendu que de cet ordre dépendent, d'une part, le choix des groupes fonctionnels qui réagissent et qui, par conséquent, doivent être libres pour l'étape considé- «o rée, et, d'autre part, le choix des groupes qui doivent être bloqués pour ne pas intervenir au cours de cette même étape.
La préparation des monomères peut se faire à partir de fragments du type muramyle. L'obtention de ces derniers a été décrite dans de nombreuses publications. Eventuellement, pour ceux dont la 65 préparation n'apparaîtrait pas expressément dans la littérature, ils peuvent être obtenus en suivant les modes traditionnels de préparation des dérivés correspondants de la chimie des Oligosaccharides.
De la même façon, la constitution de la chaîne peptidique liée à l'acide muramique s'effectue selon les modes traditionnels en synthèse des peptides.
On a donné ci-après de façon succincte les principales indications relatives à différentes opérations qui peuvent être mises en œuvre pour synthétiser les monomères répondant à la formule I, d'abord en envisageant séparément chaque étape, puis en indiquant quelques séquences types préférées.
a) Formation de l'acide muramique ou des analogues
Pour obtenir les analogues de l'acide N-acétylmuramique de formule:
ch2oh h,oh nh - coch,
r - ch - cooh dans laquelle R a la signification précédemment indiquée, il est possible de partir d'un dérivé de la N-acétylglucosamine dont les hydr-oxyles en position 1, 4 et 6 sont bloqués de façon traditionnelle. Le mode de préparation d'un tel dérivé, le benzyl-2-acét-amido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-D-glucopyrannoside, est décrit notamment par P.H. Gross et R.W. Jeanloz («J. Org. Chem.», 1967, 32, 2761).
La formation de l'acide N-acétylmuramique (R = CH3) ou d'un de ses analogues peut être réalisée de la manière décrite dans les demandes de brevets français Nos 74.22909 ou 76.19236 (respectivement, pour ces demandes, R = CH3 et R = H) reprenant la méthode décrite par Ozawa et Jeanloz («J. Org. Chem.», 1965 30, 448).
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10
Cette formation comprend par exemple la préparation d'un sel de sodium de l'hydroxyle en position 3 et la condensation ultérieure du dérivé sodé avec le sel ou l'ester d'un acide a-halogéné tel que les acides chloro-2-propionique ou chioroacétique pour reprendre le cas des deux demandes de brevets indiquées précédemment. Le composé halogéné utilisé de forme L peut être préparé suivant la méthode décrite par Sinay et al. («J. Biol. Chem.», 1972,247, 391). En utilisant les acides halogênés appropriés, il est possible de préparer tous les dérivés correspondant aux différentes significations de R. Ainsi, pour introduire un groupe R à 2 carbones, on peut utiliser les sels ou esters de l'acide chloro-2-butyrique.
Lorsqu'on utilise un ester d'acide halogéné, afin de pouvoir pro- ; céder à la condensation peptidique ultérieure, la fonction carboxyli- i que peut être libérée par une hydrolyse appropriée.
b) Substitution sur le résidu saccharidique
CH2R6
/ nh - r2 r - ch - co...
Partant des dérivés N-acétylmuramiques bloqués dans les positions 1, 4, 6, comme obtenus en a, il est possible de préparer les différents composés analogues dans lesquels le groupe acétyl fixé sur l'azote en position 2 est remplacé par les substituants dont la nature est celle donnée dans la définition générale, c'est-à-dire un groupe alcyle comportant au plus 22 atomes de cabone. Pour cette modification, on peut opérer de façon connue une hydrolyse de l'acétyle par une base forte, par exemple comme cela est décrit dans la publication de P.H. Gross et R.W. Jeanloz indiquée plus haut.
Le composé résultant, dans lequel un groupe amino est en position 2 du cycle glucopyrannoside, peut alors être de nouveau soumis à un traitement d'acylation, dans des conditions traditionnelles, avec un agent acylant approprié correspondant au groupe R2 que l'on veut introduire. Comme agent acylant, on peut notamment utiliser les anhydrides ou les chlorures d'acides.
Les substitutions en position 1, 4 et 6 peuvent être réalisées par des méthodes qui ont été décrites antérieurement et qui sont traditionnelles dans la chimie des sucres. Lorsque les substituants envisagés sont différents les uns des autres, on procédera à autant de réactions de substitution successives qu'il y a de substituants distincts. Au cours de ces réactions, les positions ne devant pas être substituées ou celles qui doivent faire ultérieurement l'objet d'une autre substitution sont protégées temporairement par des groupes de blocage selon les modes habituels.
Les groupes de blocage initialement présents, dans le cas où l'on part, comme indiqué précédemment, de benzyl-2-acétamido-4,6-0-benzylidène-2-déoxy-D-glucopyrannoside, sont éliminés par exemple par action de l'acide acétique (à 60% 1 h à reflux) et hydrogénation catalytique, comme décrit par exemple par Merser et al. («Biochem. Biophys. Res. Commun.», 1974, 466, 1316), ou par hydrogénation catalytique suivant la méthode de Lefrancier et al. («Int. J. Peptide Protein Res.», 1977,9,249).
Les modes de substitution sont ceux traditionnellement utilisés. Pour obtenir les dérivés acylés, on opère à l'aide d'un agent acylant correspondant au substituant que l'on souhaite introduire (anhydride, chlorure d'acyle, etc.).
Les positions 1, 4, 6 ne sont pas équivalentes pour ce qui concerne leur réactivité. La position en C6 est la plus facile à substituer; aussi, lorsque seule cette position doit être substituée, il est possible d'opérer sans bloquer les autres positions, avec une quantité d'agent de substitution équivalente à celle nécessaire pour la substitution d'une seule position.
Un exemple particulier de mode de préparation des dérivés substitués en position 6 est donné dans l'article de Kusumoto et al. («Te-trahedron Letters», 1976,47,4237).
Les substitutions sur le résidu osidique peuvent être effectuées avant ou après la fixation de la chaîne peptidique ou des fragments de celle-ci.
c) Chaîne peptidique H—X—CH—CO—Y
i
(CH2)2 i co-z
La fixation d'une chaîne peptidique sur l'acide N-acétylmuramique ou sur un analogue de celui-ci tels qu'ils ont été indiqués ci-dessus est obtenue par des méthodes traditionnelles dans le domaine de la synthèse des peptides. De telles méthodes ont été amplement décrites dans la littérature antérieure et en particulier dans les demandes de brevets français indiquées précédemment.
De façon générale, les synthèses glycopeptidiques peuvent être faites soit en fixant un premier aminoacide au groupe muramyle, puis en fixant au composé ainsi obtenu le second aminoacide, et ainsi de suite de proche en proche. Il est aussi possible de préparer séparément la chaîne peptidique entière aminoacide par aminoacide et de fixer celle-ci sur le groupe muramyle. Il est enfin possible de choisir des procédés intermédiaires dans lesquels on prépare des fragments de la chaîne, puis soit d'assembler ces fragments entre eux jusqu'à former la chaîne complète qui est ensuite fixée au groupe muramyle, soit de fixer un premier fragment au groupe muramyle, puis un second au produit ainsi obtenu, etc. Le choix de la séquence est guidé principalement par des raisons de commodité ou de rendement.
Les substitutions Y et Z sont avantageusement réalisées sur le groupe glutamyle avant la synthèse de la chaîne. De la même façon, lorsque n est différent de 0, c'est-à-dire lorsqu'un ou plusieurs groupes aminoacyle complètent la chaîne peptidique, le groupe R' est d'abord fixé à l'aminoacyle terminal avant que celui-ci ne soit intégré dans la chaîne peptidique.
Les synthèses peptidiques sont réalisées suivant des méthodes traditionnelles. A titre d'exemple, on peut utiliser les méthodes d'ac-tivation des carboxyles, comme la méthode dite des anhydrides mixtes. De façon avantageuse, la synthèse peptidique est réalisée à l'aide d'un composé du type carbodiimide tel que le N,N'-dicyclo-hexylcarbodiimide ou des carbodiimides équivalents. On trouvera une revue des modes de synthèse peptidique traditionnels dans J.H. Jones, «Chemistry and Industry», 723 (1974). On peut aussi se reporter aux demandes de brevets français déjà citées, ou encore aux demandes suivantes: Nos 75.29624,76.06819,76.06820,76.06821, 76.21889, 77.02646, et à l'article de Lefrancier et al. («Int. J. Peptide Protein Res.», 1977, 9, 249).
La formation des dérivés estérifiés ou amidés correspondant au groupe Y est obtenue de façon connue. On peut en particulier se reporter aux demandes de brevets français indiquées ci-dessus, et notamment aux demandes Nos 76.06820, 76.06821, 76.21889 et 77.02646.
Pour fixer le reste W—R' à l'aminoacide situé à l'extrémité de la chaîne peptidique, on procède à une activation du groupe carboxyli-que de l'aminoacide de façon connue en soi, et on le soumet à une alcoolyse ou aminolyse par un alcool R'OH ou une amine R'NH2.
Séquences de synthèse de monomères de formule I dans laquelle Z est un radical — OH ou —NH2(schéma I)
Le produit de départ est un dérivé (1), R! représentant un radical benzyle glycoside, préparé comme décrit par Gross et Jeanloz («J. Org. Chem.», 1967,32, 2759). Pour obtenir le composé semblable dans lequel R] est un groupement alkyle- ou arylalkyle,
5
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on peut utiliser la méthode de préparation des a- ou ß-glycosides décrite dans ce même article, ou toute méthode connue pour de telles préparations en chimie des Oligosaccharides.
Lorsque Rt représente le radical p-nitrophényle, on peut notamment opérer comme décrit par Petitou et Sinay («Carbohyd. Res.», 1973,29, 502). Lorsque R! représente le radical benzyloxycarbonyl-aminoéthyle, on peut opérer de la façon décrite par King et al. («Carbohyd. Res.», 1977, 55, 83). Dans une autre variante, lorsque R, est un groupe azide, l'introduction peut se faire, par exemple, comme décrit par Michael et Klemer («Adv. Carb. Chem.», 1961, 16,95).
Pour modifier la nature du groupe N-acyle en position 2, le groupe N-acétyle peut être hydrolysé comme décrit par Gross et Jeanloz («J. Org. Chem.», 1967, 32, 2759) pour aboutir aux dérivés de formule (2). Ces dérivés peuvent être N-acylés sélectivement notamment par action de l'anhydride d'un acide carboxylique pour aboutir aux dérivés de formule (3). Dans une variante privilégiée, le groupement acyle nouvellement introduit (ainsi le groupe benzyloxy-carbonyle) peut être éliminé sélectivement à l'étape finale de la syn- . thèse, libérant ainsi la fonction amine. Les dérivés de formule (4) peuvent être obtenus à partir des précédents suivant la méthode décrite par Ozawa et Jeanloz («J. Org. Chem.», 1965, 30,448), au moyen d'un acide L-a-chloroalcanoïque.
Les dérivés de formule (4) peuvent être couplés avec un dérivé dipeptidique de formule générale H—X—D—Glu(Z)—OY, chlorhydrate, formule dans laquelle Z est —NH2 ou —OH. Ces divers dérivés peptidiques sont préparés suivant des méthodes décrites par Lefrancier et al. («Int. J. Peptide Protein Res.», 1977,9, 249, et «Int. J. Peptide Protein Res.», 1978, sous presse). Les méthodes de couplage utilisées pour obtenir les dérivés glycopeptidiques de formule (5) sont également décrites dans les articles précédemment cités. Toutefois, aussi bien dans la synthèse des dérivés dipeptidiques que dans celle des dérivés de formule (5), toute méthode de couplage peut être utilisée.
L'hydrogénation catalytique des composés de formule (5) est effectuée classiquement (Lefrancier et al., 1977, référence citée)
pour aboutir aux composés de formule (6), et en particulier,
lorsque Rj est un groupe azide, ou un groupe p-nitrophényloxy, ou un groupe benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien encore lorsque R2 est un groupe benzyloxycarbonyle, à des composés possédant au moins une fonction amine tels que les composés (1) à (4) (schéma II), dans la formule desquels R4 et R6 représentent une fonction alcool.
Dans une variante, les dérivés de formule (5) subissent une dé-benzylidénation sélective telle que décrite par Merser et al. («Biochem. Biophys. Res. Commun.», 1975, 66, 1316) pour donner les dérivés de formule (7). L'acylation sélective de l'hydroxyle primaire en position 6 du résidu saccharidique peut alors se faire directement notamment par action d'un faible excès de l'anhydride d'un acide carboxylique. On obtient des dérivés de formule (8).
Les dérivés de formule (8) peuvent être synthétisés suivant une séquence totalement différente [schéma IV, formule (4)] semblable à celle mise au point par Kusumoto et al. («Tetrahedron Letters», 1976,47, 4237), à partir de la tosylation spécifique de l'alcool primaire du résidu saccharidique. De façon classique en chimie des Oligosaccharides, ce dérivé permet d'obtenir un groupe azide sur cette position.
Après hydrogénation catalytique des composés (8), on obtient, lorsque R, est un groupement azide, ou un groupement p-nitro-phényloxy ou un radical benzyloxycarbonylaminoéthyloxy ou un radical benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien encore lorsque R2 est un groupement benzyloxycarbonyle, les composés portant au moins une fonction amine, tels que (1) à (4) (schéma II) pour lesquels R4 est une fonction —OH, mais aussi dans le cas où R6 est un groupe azide, à des composés tels que (5) (schéma II), pour lesquels R4 est une fonction —OH.
Dans une autre variante, les dérivés de formule (7) sont diacylés sur les deux hydroxyles en positions 4 et 6 du résidu saccharidique notamment par action d'un excès de l'anhydride d'un acide carboxylique pour donner des composés de formule (9) qui, soumis à une hydrogénation catalytique, aboutissent lorsque R! est un groupe azide, ou un groupe p-nitrophényloxy ou un groupe benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien encore lorsque R2 est un groupe benzyloxycarbonyle, les composés portant au moins une fonction amine, tels que (1) à (4) (schéma II).
Séquences de synthèse de monomères de formule I dans laquelle Z = ( A)n—W—R ,n étant nul (schéma III)
Dans ce cas, lorsque n est nul, la fonction y-carboxyle du résidu D-glutamyle est engagée dans une liaison ester.
Une méthode de préparation de ces dérivés consiste à estérifier directement le fragment peptidique partiellement bloqué BOC—X—D—Glu—(OH)—OY [par ailleurs synthétisé suivant des méthodes décrites par Lefrancier et al. (1977, 1978, références citées)], selon la méthode décrite par Wang et al. («J. Org. Chem.», 1977, 42,1286). Après élimination du groupement terbutyloxy-carbonyle (BOC), le dérivé obtenu est couplé avec un dérivé du résidu de type muramyle convenablement protégé correspondant à la formule (1) (schéma III) pour aboutir aux dérivés de formule (2) suivant les procédés décrits dans Merser et al. (1975, référence citée), Lefrancier et al. (1977,1978, références citées). Après l'hydrogénation catalytique la purification effectuée comme décrit dans Lefrancier et al. (1977, 1978, références citées), les composés de formule (3) sont obtenus, et, en particulier, si R! est un groupe azide, ou un groupe p-nitrophényloxy ou un groupe benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien encore, si R2 est un groupe benzyloxycarbonyle, les composés portant au moins une fonction amine tels que (1) à (4) (schéma II), dans la formule desquelles R4 et R6 sont une fonction —OH et Z correspond à OR'.
Dans une variante, les dérivés de formule (2) subissent une dé-benzylidénation sélective telle que décrite par Merser et al. (1975, référence citée) pour donner les dérivés de formule (4).
L'acylation sélective de l'hydroxyle primaire en position 6 du résidu saccharidique peut se faire directement notamment par action d'un faible excès de l'anhydride d'un acide carboxylique. Les dérivés de formule (5) sont ainsi préparés, qui aboutissent, après une hydrogénation catalytique classique, si Rt est un groupe azide, ou un groupe p-nitrophényloxy ou un groupe benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien encore si R2 est un groupement benzyloxycarbonyle, les composés portant au moins une fonction amine tels que (1) à (4) (schéma II), dans la formule desquelles R4 est une fonction —OH et Z correspond à OR'.
Ces dérivés peuvent être synthétisés suivant une séquence totalement différente [schéma IV, formule (5)] semblable à celle mise au point par Kusumoto et al. (1976, référence citée), par l'intermédiaire de la tosylation spécifique de la fonction alcool primaire. Cet intermédiaire permet d'obtenir un groupe azide sur cette position et, de ce fait, après hydrogénation catalytique, un composé portant une fonction amine, tel que (5) (schéma II), formule dans laquelle R4 est une fonction —OH et Z correspond à OR'.
Dans une autre variante, les dérivés de formule (4) sont diacylés sur les hydroxyles en positions 4 et 6 du résidu saccharidique par action notamment d'un excès de l'anhydride d'un acide carboxylique pour obtenir finalement les composés de formule (7) qui donnent, après une hydrogénation catalytique, si R! est un groupe azide ou un groupe p-nitrophényloxy ou un groupe benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien encore si R2 est un groupe benzyloxycarbonyle, les composés porteurs d'au moins une fonction amine tels que (1) à (4) (schéma II), dans la formule desquelles Z correspond à OR'.
Séquence de synthèse de monomères de formule I dans laquelle Z — ~(A)n— W—R' ou Z = ( A) j — A'—CO — R', n étant 2 ou plus
Le schéma V représente une séquence type de réactions aboutissant à l'obtention de dérivés peptidiques correspondant à la partie Z
s io
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30
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60
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de la formule générale, soit Z = — (A)n—W—R', dans laquelle —(A)n— correspond à 1 ou 2 résidus d'acides aminés, W à l'oxygène ou au — NH—, R' à un radical alkyle.
Le dérivé N— protégé d'un premier acide aminé (Na—terbutyl-oxycarbonyl—Ax — OH, ou BOC—A1 — OH, par exemple) est estéri- 5 fié par un alcool selon la méthode de Wang et al. (1977, référence citée) pour donner, après élimination du groupe BOC, H—A! — OR'
(Z,)-
Cependant, dans le cas où R' est un reste alkyle à chaîne de 4 à 20 atomes de carbone, les méthodes classiques d'estérification des io acides aminés sont avantageusement utilisées pour obtenir H—A! —OR' (Z]). Ce dérivé est ensuite couplé suivant des méthodes bien connues avec un deuxième résidu d'acide aminé convenablement protégé pour donner, après élimination du groupement de protection temporaire de la fonction a-amine, un composé dipeptidi- is que de formule H—A2—A, — OR' (Z2).
De la même façon, un ester activé tel que BOC—Aj — OR" (R" étant un ester p-nitrophénylique par exemple) peut être ammonio-lysé pour donner, après déprotection de la fonction a-amine, H—A] — NH2 (Z3) qui, suivant la séquence réactionnelle décrite ci- 20 dessous, aboutit au dérivé dipeptidique de formule H-A2-A,-OR'(Z4).
De la même façon, l'ester activé BOC—Aj — OR" peut être, par exemple, ammoniolysé par une alkylamine pour donner, après déprotection de la fonction a-amine, H—A! —NH—R' (Z5) qui, 25 suivant la séquence réactionnelle décrite ci-dessous, aboutit au dérivé dipeptidique de formule H—A2—A, —NH—R' (Z6).
Dans une variante, correspondant au cas où, dans la formule, Z = — (A)n—W—R', W est un atome d'oxygène et R' un atome d'hydrogène, le groupe estérifiant le dérivé H—A2—At — O (Z2) est 30 choisi de telle sorte qu'il puisse être éliminé sélectivement à la fin de la synthèse.
Une variante de la séquence réactionnelle précédente est décrite dans le schéma VI et correspond à la préparation de composés dans lesquels Z est — (A)n_ j — A'—COR', avec A correspondant à un 35 résidu d'acide aminé, A' à un résidu d'aminoalcool et R' à un radical alkyle.
Pour cette variante, un dérivé N-protégé d'un acide aminé tel que BOC—A'—COOH est réduit sélectivement en son dérivé aminoalcool BOC—A'—CH2OH suivant des méthodes bien 40
connues. L'acide aminé peut aussi être réduit en son aminoalcool correspondant, puis acylé sélectivement sur sa fonction amine suivant des méthodes couramment utilisées en synthèse peptidique. La fonction alcool ainsi créée peut alors être estérifiée par un acide (R'—COOH) suivant la méthode d'estérification décrite par Wang 45
et al. (1977, référence citée). Cet ester peut également se faire notamment à partir du chlorure ou de l'anhydride de l'acide.
La synthèse des dérivés glycopeptidiques correspondant à la variante de la formule générale dans laquelle n est 1 ou 2 est décrite succintement dans le schéma VII.
Le fragment dipeptidique partiellement protégé BOC—X—D— Glu—(OH)—Y est préparé selon des méthodes décrites notamment par Lefrancier et al. (1977,1978, références citées), puis couplé avec le dérivé peptidique, représenté par Z, dont nous venons de donner la préparation pour ses deux variantes.
Après élimination du groupe BOC, le produit obtenu est couplé avec un dérivé adéquat de type acide muramique (1), qui est celui dont la synthèse est décrite dans le schéma I [dérivé (4)] pour obtenir les composés de formule (2).
Après hydrogénation catalytique, on obtient les composés de formule (3) et en particulier si Rj est un groupement azide ou un groupement p-nitrophényloxy ou un radical benzyloxycarbonylaminoéthyloxy, ou bien lorsque R2 est un groupement benzyloxycarbonyle, ou encore si — A— correspond à un résidu Nc-benzyloxy-carbonyllysyl, les composés portant au moins une fonction amine tels que (1) à (4) et (6) (schéma III), formules dans lesquelles R4 et R6 sont des fonctions —OH.
Dans une variante, les dérivés de formule (2) subissent une débenzylidénation sélective telle que décrite par Merser et al. (1975, référence citée) pour donner les dérivés de formule (4). L'acylation sélective sur l'hydroxyle primaire en position 6 du résidu saccharidique peut dès lors se faire comme décrit dans les schémas I et IV. Ainsi que précédemment décrit, il est possible de substituer cette position par un groupe azide. On obtient finalement les composés de formule (6), après hydrogénation catalytique, et en particulier si R! est un groupement azide ou un groupement p-nitrophényloxy ou un radical benzyloxycarbonylaminoéthyloxy ou bien encore lorsque R2 est un groupe benzyloxycarbonyle, ou encore si — A— correspond à un résidu NE-benzyloxy-carbonyllysyl, les composés portant une fonction amine tels que (1) à (4) et (6) (schéma III), formules dans lesquelles R4 est une fonction alcool.
Dans une autre variante, les dérivés de formule (4) sont diacylés sur les 2 hydroxyles en positions 4 ou 6 du résidu saccharidique comme décrit dans le schéma I. Après hydrogénation catalytique, on obtient les composés de formule (7), en particulier, si Rx est un groupe azide, ou un groupe p-nitrophényloxy ou un groupe benzyloxycarbonylaminoéthyloxy ou bien si R2 est un groupe benzyloxycarbonyle, ou encore si — A— est un résidu NE-benzyloxycarbonyl-lysyl, les composés portant une fonction amine tels que (1) à (4) et (6) (schéma II).
Schéma I
Séquences de synthèse de composés glycopeptidiques correspondant à la variante de la formule générale dans laquelle Z est un —OH ou — NH2
0ch„
I
nhcoch.
,0ch„
Ph / . 2
oh vh,r,
(2)
r,-ch-
O 1 L
/ 0
r,
H.Rj (9)
nh-r„
r-ch-co-x-nh-çh-co-y
(ch2)2
co-z
och
1
nh-r-
nrn h,r.
nh-r„
r-ch-cooh
13
Î
cho0h h,r. (3)
(7)
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch-)
I
2 2
f co-z
,och
(5)
640 866
h,r,
(8)
ho nh-r„
r-ch-co-x-nh-ch-co-y !
(ch,)
I
2 2
co-z ch2oh nh-r0
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
h,r.
(6)
nh-r„
r-ch-co-x-nh-ch-co-y
(ch2)2
co-z co-z
Schéma II
ch2-r6
-0\ (I)
0 /jH- ™2
sh-r2
r-ch-co-x-nh-ch-co-y (ch2)2-coz
?H2-R6
(2)
nh.
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch2)2-coz
CVR6
~°N 0C6H4-I,H2 (3)
nh-r2
r-ch-co-x-nh-ch-co-y (ch2)2-coz
ch2-r6
(4)
>(h, o(ch2)2-nh2
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch2)2-coz qh2-sjh2
(5)
)w, r,
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch2)2-coz
ÇH2R6
(6)
h,r.
nh-r.
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch)--conh-ch-coz
2 I
nh2
Schèma III
Séquences de synthèse de composés glycopeptidiques correspondant à la variante de la formule générale dans laquelle Z = (A)n—W—R', n étant nul och,
h, rj (i)
r-ch-cooh
VCH2
h, rj (7)
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch.)
ho-çh,
I
2 2
ho coor'
h, rj (4)
• nhcor2 r-ch-co-x-nh-ch-co-y
(ÇH2)2 coor'
r.
nh-r2
r-ch-co-x-nh-ch-co-y (çh2)2
coor'
och2
(2)
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch,)-
1 ?
coor'
ho-ch nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch-)
I
VI
coor'
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Schéma IV
Séquence de synthèse de dérivés glycopeptidiques correspondant à la formule générale et dont l'hydroxyle en C6 du résidu saccharidique est acylé par un acide gras à longue chaîne
T0S-0-ÇH.,
ho
H, R. (1)
nh-r„
R-CH-C0-CH-(Ph)2
R6°-ÇH2
h, rj (2)
R-CH-C00H
-V
R6-C,H2
/"
h, r, (5)
HO
NH-R-
R-CH-CO-X-NH-CH-CO-Y
Cçh2)2
COO-R*
r6o-ch2
V
ho
0 VH- Rl
NH-R,
R-CH-CO-X-NH-CH-CO-Y
(3)
'v h, rj (4)
HO
NH-R„
R-CH-CO-X-NH-CH-CO-Y
(çh2)2
COOCH2-Ph
(CH0)
I
2'2
COOH
Schéma V
Séquence réactionnelle de la préparation des dérivés peptidiques de formule générale — Z = (A)n—W—R'! avec n = 1 ou 2
r'-nh,
boc-aj-or"
BOC-Aj-NH-R' > H-Aj -NK-R' ,
(z5)
NH,
boc-a2-oh b0c-a2~aj -nh-r' » h-a2-aj -nh-r'
(z6)
->BOC-A, -NH,
-NH2 >H-Aj-NH2 ,
->BOC-A2"Aj-NH2 ■
'H-A2-Aj-NH2
BOC-Aj-OH
(23)
R'OH
boc-a2"oh
-? BOC-Aj-OR' > H-Aj-OR1 , ■
BOC-Aj-AJ-OR'•
(z4)
►H-Aj-AJ-OR'
(V
•(z2)
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Schéma VI
Séquence réactionnelle de la préparation des dérivés peptidiques de formule générale Z = (A)n_!—A'-R^; n 5=2
, /
BOC-A'-C > BOC-A -CH-OH ■
\ 2
OH
a.-/ \
OH
BOC-A'-CH2-0-C-R'
ou O
R' -C
R' -C,
✓
-i \
l_ /
V
0 etc.
HCl, H-A'-CH -O-Ó-R'
boc-a-c
/
\
OH
l.
HCl, A-A'-CHj-O-C-R' <-
boc-a-a'-ch2-o-c-r'j
Schéma VII
Séquences de synthèse de composés glycopeptidiques correspondant à la variante de la formule générale pour laquelle Z = —(A)n—W—R'où Z = (A)n_[—A'—COR'; n >2
PJ1 OCH-j
NH-R.
r-ch-cooh
(O
h, r,
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y i
(ch2)-coz h
VF 2
(6) >
V
h, rj (7)
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y I
(ch ) -coz ph och
0 /
h, r nh-r-,
(2)
r-ch-co-x-nh-ch-co-y
(ch2)2-coz ho-ch,
nh-r,
(3)
r-ch-co-x-nh-ch-co-y (ch2)2-coz ho-ch,
ho
[h, r, (4)
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y
(ch2)2-coz
VfH2
-?• K P HO
h, r, (5)
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y
(ch2)2-coz h, r.
(6)
nh-r,
r-ch-co-x-nh-ch-co-y .1
(ch2)2-c0z
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Oligomérisation de monomères type muramylpeptide, répondant à la formule générale I
Un mode avantageux d'oligomérisation de composés du type muramylpeptide, répondant à la formule générale I, résulte de la présence, dans leur molécule, d'une fonction amine.
Du fait de la structure polyfonctionnelle des composés de ce type, l'introduction d'une telle fonction peut se faire sur diverses positions correspondant à la partie saccharidique ou à la partie peptidique, suivant différentes séquences réactionnelles, comme il a été montré ci-dessus.
Dans le schéma II sont représentées les formules de six classes de dérivés, porteurs d'une fonction amine et dérivant de composés du type muramylpeptide. Ces différents types peuvent se regrouper en fonction de la manière dont la fonction amine apparaît dans le monomère:
— composés possédant une fonction amine préexistante, soit dans la partie peptidique, tels que les composés de formule (6), soit dans la partie saccharidique, tels que les composés de formule (2);
— composés possédant une fonction amine résultant d'une modification sélective d'une des fonctions préexistantes, tels que les composés de formules (1) et (5);
— composés possédant un groupe porteur d'une fonction amine, substituant une des fonctions préexistantes, tels que les composés de formules (3) et (4).
La fonction amine appartenant à l'un quelconque des dérivés des différentes classes ainsi définies peut être pontée avec la fonction amine appartenant à une seconde molécule relevant de préférence, mais non exclusivement, de la même classe de dérivés pour donner, dans le cas le plus simple, un dimère. Cette liaison peut être réalisée au moyen d'un quelconque des réactifs dits de pontage. De tels réactifs sont bien connus et couramment utilisés dans l'étude des interactions existant entre macromolécules de nature protéique telles que les enzymes (voir notamment «Methods in enzymology», S.P. Kolo-wick, N.U. Kaplan, éd. Academic Press, vol. XXV, 1972, 585, et «Fed. Proc.», 1978, 37, 112).
Le diméthyladipimidate (Lubin et al., «Proc. Nat. Acad. Sci. USA», 1975, 72, 43) est ainsi un réactif bifonctionnel particulièrement avantageux pour la préparation de dimères selon l'invention. Peuvent être également utilisés tous les analogues de ce réactif, de formule générale:
Il II
H 3CO—C—(CH2)n—C—OCH3
avec, par exemple, n = 6, pour le diméthylsubérimidate.
Peuvent être également utilisés tous les analogues de ce réactif de formule générale:
NH NH
Il II H3CO - C - (R) - C - OCH3
avec, par exemple, R = —(CH2)2—S—S—(CH2)2 — pour le diméthyl-3-3'-dithiobispropionimidate.
Un autre type de réactif bifonctionnel, particulièrement apte à préparer les dimères selon l'invention, consiste en un acide dicarb-oxylique, dont chaque fonction carboxyle peut être couplée avec la fonction amine présente dans le monomère suivant une quelconque des méthodes bien connues de formation de la liaison peptidique (carbodiimide, esters activés, etc.).
Des réactifs privilégiés de ce type sont ceux de formule générale:
O O
Il II R'—O—C—(R)—C—OR'
dans laquelle OR' représente un ester activé.
Si R = — (CH2)n—, n = 2 ou 3, le réactif est un dérivé de l'acide succinique ou de l'acide glutarique.
Si R = — (CH = CH) —, le réactif est un dérivé de l'acide maléi-que.
Un autre mode d'obtention de dimères selon l'invention correspond à coupler, suivant l'une des méthodes bien connues de formation de la liaison peptidique, la fonction amine appartenant à l'un quelconque des dérivés des différentes classes représentées dans le schéma II avec la fonction carboxyle présente dans un composé adéquat de type muramylpeptide. Cette fonction carboxyle, suivant les revendications correspondant à la formule générale I, peut être dans la partie peptidique ou dans la partie saccharidique. Avantageusement, cette fonction se trouve en position y du résidu d'acide D-glutamique. Le carboxyle peut également se trouver en bout de la chaîne peptidique (Z = — (A)n—W—R', R' = —OH), mais aussi dans une chaîne latérale si, dans Z = — (A)n—W—R' et Z' = — (A)n _ ! — A' — CO — R', l'un des résidus aminoacyle (A) correspond à un résidu acide aspartique ou glutamique; enfin, R6 peut représenter un groupement —O—CO—(CH2)2—COOH.
De façon plus générale, les dimères tels que décrits au précédent paragraphe peuvent être préparés selon la méthodologie en usage dans la synthèse des polypeptides et des Oligosaccharides. De ce fait, et en particulier par l'addition séquencée de dérivés adéquats, il est possible d'obtenir des trimères, tétramères, etc.
Les dérivés possédant une fonction amine, qui appartiennent à l'une quelconque des classes de composés du type muramylpeptide, représentés dans le schéma II, mais aussi leurs formes dimérisées, tri-mérisées, etc., contenant une fonction amine disponible, peuvent réagir avec le glutaraldéhyde pour donner des oligomères suivant un mécanisme non élucidé. Cependant, la littérature concernant en particulier la préparation d'agrégats protéiques au moyen de glutaraldéhyde est abondante (voir notamment, Avrameas, «Immuno-chem.», 1969, 6, 43, Hardy et al., «J. Chem. Soc.», Perkin I, 1976, 958).
L'invention concerne aussi l'utilisation de ces nouveaux produits en tant que réactifs biochimiques, notamment pour les études de laboratoire et particulièrement dans le domaine de l'immunochimie. L'invention est aussi relative à l'utilisation de ces produits comme principes actifs de compositions pharmaceutiques.
Plus particulièrement, l'invention est relative à des médicaments renfermant à titre de principe actif au moins l'un des composés selon l'invention, ce médicament étant applicable en tant que régulateur de la réponse immunitaire de l'hôte.
Il est notamment applicable lorsque est recherché chez l'hôte un renforcement de la réponse immunitaire sous l'effet de tout agent, immunogène de par sa capacité à provoquer chez l'hôte une réponse immunitaire, et ce même dans le cas où cet agent est si faiblement immunogène que ce caractère ne peut s'exprimer que sous l'effet d'une stimulation non spécifique du système immunitaire de l'hôte.
On citera également, comme autres applications, la prévention ou le traitement des maladies infectieuses d'origine bactérienne ou parasitaire, ou l'inhibition des tumeurs.
D'une façon générale, les médicaments selon l'invention se caractérisent par la capacité qu'ils ont de renforcer l'immunité spécifique ou non spécifique de l'hôte, dans ses aspects les plus variés.
En effet, les composés adjuvants de l'invention sont capables d'exercer leur effet adjuvant, non seulement vis-à-vis des agents immunogènes qui sont faibles par nature, mais également d'agents immunogènes forts dont les quantités administrées peuvent avoir à êtr< modulées.
L'invention concerne donc les compositions dans lesquelles les composés adjuvants du genre en question, ou les composés adjuvants qui peuvent en être dérivés, sont associés avec des agents immunogènes forts, ceux-ci étant cependant utilisés à des doses suffisamment réduites pour n'induire chez l'hôte, en l'absence de l'agent adjuvant, qu'une réponse immunitaire insuffisante pour le protéger efficacement contre une agression ultérieure de la part de ce même agent immunogène.
L'invention s'applique avec un avantage particulier à ceux des agents vaccinants dont le caractère immunogène est fort, mais qui sont d'une utilisation difficile en temps normal, en raison d'une trop grande toxicité ou d'effets secondaires indésirables. Il a été confirmé
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que les agents adjuvants selon l'invention étaient capables de compenser efficacement la perte de l'effet immunogène qui résulterait normalement d'une dilution ou d'une diminution des doses utilisées, notamment dans le but de réduire la toxicité ou les effets secondaires susdits dans une proportion correspondante, et ce sans influencer défavorablement ces derniers phénomènes.
On constate les mêmes effets dans le cas d'immunogènes forts dont on a réduit le caractère immunogénique, notamment par des purifications poussées, dans la mesure où cela se montre nécessaire à la diminution correspondante de leurs effets toxiques ou secondaires néfastes. Tel est en particulier le cas des principes vaccinants constitués par des anatoxines bactériennes ou virales ou, d'une façon générale, des principes vaccinants constitués par une partie seulement des constituants initialement contenus dans les bactéries ou virus contre lesquels une protection est recherchée.
D'une façon générale, l'invention s'applique à tout antigène ayant subi des transformations chimiques ou physiques visant à éliminer ou modifier les parties de l'antigène qui sont responsables de ses effets secondaires nuisibles tout en conservant les parties qui sont à l'origine de ses propriétés immunogènes. Elle s'applique en particulier à des immunogènes faibles, soit par nature, soit obtenus à partir d'antigènes forts, mais dont les propriétés antigéniques ont été fortement atténuées du fait des processus auxquels ils ont été soumis pour les purifier ou les détoxifier. C'est à ce type d'immunogènes faibles que se rattachent par exemple les principes constitués par les sous-unités dérivées de virus de la grippe, et qui ne retiennent de ceux-ci que les hémagglutinines et les neuraminidases, à l'exclusion des nucléoprotéines et autres constituants nucléotidiques des virus dont elles sont dérivées. Cela s'applique également à certaines anatoxines, telles que celles, par exemple, de la diphtérie ou du tétanos, lesquelles, on le sait, peuvent être constituées par des substances so-lubles, telles qu'obtenues par l'action simultanée du formol et de la chaleur sur des toxines bactériennes dérivées des bactéries correspondantes.
Les applications indiquées précédemment à titre d'exemples ne sont pas exclusives des autres applications mettant enjeu les propriétés immunorégulatrices des composés selon l'invention. On peut encore citer à titre d'exemple leur action de renforcement au niveau ' de l'immunisation spécifique de l'hôte à l'égard d'antigènes parasitaires, la restauration de l'immunocompétence de l'hôte, lorsque celle-ci a un niveau inférieur à la normale, notamment lorsque celle-ci a été endommagée par les antigènes ou parasites eux-mêmes, ou sous l'effet d'une chimiothérapie, d'une radiothérapie ou de tout autre traitement ayant une action immunosuppressive.
Les adjuvants selon l'invention peuvent être administrés à l'hôte — animal ou être humain — de toute façon appropriée à l'obtention de l'effet désiré. Les administrations du principe immunorégulateur, notamment adjuvant, et de l'agent immunogène, notamment de l'antigène vaccinant, peuvent être envisagées simultanément ou séparément, dans ce dernier cas éventuellement décalées dans le temps, éventuellement encore par des voies d'administration semblables ou différentes (par exemple voies parentérale et orale respectivement ou vice versa).
L'invention concerne naturellement aussi les diverses compositions pharmaceutiques auxquelles les composés selon l'invention peuvent être incorporés, le cas échéant en association avec d'autres substances actives. En particulier, les composés I sont avantageusement associés à des agents immunogènes, qu'il s'agisse par exemple d'agents immunogènes utilisés à de très faibles doses, ou d'agents immunogènes faibles.
Dans les compositions pharmaceutiques, le ou les produits selon l'invention sont associés de façon traditionnelle avec des excipients divers qui ont notamment pour but d'en faciliter l'administration.
Des compositions pharmaceutiques préférées sont celles constituées par des solutions injectables ou celles susceptibles d'être utilisées pour la préparation de solutions ou suspensions injectables contenant une dose efficace d'au moins un composé selon l'invention. On utilise plus particulièrement des solutions ou suspensions dans une phase aqueuse stérilisée isotonique, de préférence des solutions isotoniques salines ou glucosées.
L'invention concerne plus particulièrement de telles suspensions ou solutions qui sont aptes à être administrées par injections intradermiques, intramusculaires ou sous-cutanées, ou encore par scarifications.
Elle concerne également des compositions pharmaceutiques ad-ministrables par d'autres voies, notamment par voie orale ou rectale, ou encore sous forme d'aérosols destinés à venir en contact avec des muqueuses, notamment les muqueuses oculaires, nasales, pulmonaires ou vaginales.
En conséquence, elle concerne des compositions pharmaceutiques dans lesquelles l'un au moins des composés selon l'invention se trouve associé à des excipients pharmaceutiquement acceptables, solides ou liquides, adaptés à la constitution de formes orale, oculaire ou nasale, ou avec des excipients adaptés à la constitution de formes d'administration rectale, ou encore avec des excipients gélatineux pour l'administration vaginale. Elle concerne aussi des compositions liquides isotoniques contenant l'un au moins des produits selon l'invention, adaptés à l'administration sur les muqueuses, notamment oculaire ou nasale. Elle concerne enfin des compositions formées de gaz liquéfiés pharmaceutiquement acceptables, du type propellent, dans lesquelles les produits selon l'invention sont dissous ou maintenus en suspension, et dont la détente provoque la dispersion en un aérosol.
L'invention consiste également en un procédé visant à renforcer les défenses immunitaires de l'hôte, consistant à lui administrer une dose efficace de l'un au moins des produits selon l'invention, sous l'une des formes d'administration qui a été évoquée ci-dessus. A titre d'exemple de doses susceptibles d'induire une action, on mentionnera des doses de 10 à 1000 ng/kg de poids corporel, par exemple de 50 ng, lorsque l'administration est effectuée par voie parentérale, ou encore d'une dose de 200 à 20 000 ng/kg de poids corporel, par exemple de 1000 |xg, pour d'autres modes d'administration, tels que par exemple la voie orale.
D'autres caractéristiques de l'invention apparaîtront au cours de la description d'exemples de préparation de produits selon l'invention, ainsi que des essais mettant en évidence les propriétés pharma-cologiques de ces produits.
Préparation de l'oligomère de ß-D-p-aminoplwnylg[ycoside MDP
100 mg de P-D-p-aminophénylglycoside de Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln sont dissous dans 10 ml d'acétate de sodium 0,2M à pH 4,0, et on ajoute 0,2 cm3 de solution de glutaraldéhyde à 25%.
Le mélange est laissé à température ambiante (25° C) pendant 16 h, et l'on ajoute 0,035 cm3 d'une solution de NaHS03 pour neutraliser les groupes carbonyle restants.
Le mélange réactionnel est filtré sur colonne de gel de Sephadex G.25 (2,5 x 200 cm) équilibrée en milieu acétate de pyridine à pH 5,3, et élué par le même milieu.
Les fractions correspondant aux composés de poids moléculaires les plus élevés sont les premières éluées. Elles correspondent environ à l'intervalle d'élution compris entre 375 et 426 ml. Des fractions de poids moléculaires plus faibles sont éluées jusqu'à environ 600 ml. Les fractions de poids moléculaires élevés sont réunies et lyophilisées, puis de nouveaux soumises à un passage sur gel dans les mêmes conditions.
Ces fractions sont encore purifiées sur une colonne de diméthyl-acrylatepolyéthylèneglycol (Fractogel PGM 2000). Le produit récupéré est désigné comme étant le polymère du P-D-p-aminophényl-glycoside de Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln (pol PAP-MDP).
La réticulation du PAP-MDP par le glutaraldéhyde est suivie qualitativement par Chromatographie sur couches minces sur des plaques de Silicagel dans un mélange butanol/acide acétique/eau (4/1/5). Des échantillons équivalents de PAP-MDP et du produit réticulé (25-50 ng dans 1-2 jil d'eau) sont soumis à la Chromatographie, puis colorés à la ninhydrine. La forme polymérisée ne présente
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aucune tache visible, au contraire de ce que l'on observe avec la forme monomère PAP-MDP.
Les diagrammes UV du monomère et du polymère sont également différents. On observe un pic unique et bien défini à 253 nm correspondant au produit réticulé (pol PAP-MDP).
Un premier essai d'évaluation du poids moléculaire a été réalisé par fìltration sur gel de Sephadex G. 100 montrant un poids moléculaire d'environ 6000. Comme les témoins utilisés étaient de nature polypeptidique et non glycopeptidique comme le MDP, et étant donné que la fraction réticulée a également un volume d'élution relatif (Ve/Vo) très proche de celui du témoin de poids moléculaire le plus faible (constitué d'inhibiteur de trypsine bovin dont le poids moléculaire est de 6513), la valeur de l'estimation doit être considérée comme un ordre de grandeur raisonnable.
I^e produit obtenu contiendrait de 8 à lß unités monomères.
Préparation de Na-N-acétylmuramyl-L-alcmyl-D-isoglutamine-Ne-[ Na-N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isogliaamine-Ne ( Na-N-acétyl-muramyl-L-alaftyUUsoghitanme=tysyl)lysyl]lysylamide, en formule abrégée NaMDP-Ne[NaMDP-Nc(MDP-Lys)Lys]Lys-NH2, ou encore H(MDP-Lys)3-NH2.
Les abréviations utilisées dans la suite de la description ont les significations suivantes:
BOC: t-butyloxycarbonyle
Z: benzyloxycarbonyle
OSu: ester hydroxysuccinimidique
Lys: lysine
Lys-NH2 : lysine amide
MDP : N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine
N" BOC-m Z-Lys-NH2 (A)
2,38 g (5 mmol) de Na BOC-NE Z-Lys-OSu, obtenu de la façon décrite par P. Hartter dans «Z. Physiol. Chem.», 1976,357,1683, dissous dans 100 ml d'acétate d'éthyle, sont traités par un courant d'ammoniac sec pendant 1 h à température ambiante. La solution organique est alors lavée à l'eau jusqu'à pH neutre, puis séchée sur MgS04, et concentrée. Le produit est précipité dans de l'acétate d'éthyléther. On obtient 1,63 g de produit dont les caractéristiques sont: P.F. 140-141° C; [a]|f = +1,5° (méthanol absolu).
Analyse élémentaire pour Ci9H29N305 (379,46):
Calculé: C 60,14 H 7,70 N 11,07%
Trouvé: C 59,86 H 7,70 N 10,73%
N" BOC-W (W BOC-W Z-Lys)-Lys-NH2 (B)
759 mg (2 mmol) de A, dissous dans 25 ml d'acide acétique glacial, sont hydrogênés pendant 4 h en présence de palladium 5% sur charbon. Après fìltration du catalyseur, la solution est concentrée à sec et le résidu obtenu est séché sous vide en présence de KOH. Il est repris dans 5 ml de diméthylformamide contenant 0,21 ml de N-méthylmorpholine. 716 mg (1,5 mmol) de Na BOC-Ne Z-Lys-OSu sont alors ajoutés à cette solution. Le mélange réaction-nel est laissé 20 h à température ambiante, puis concentré à sec. Le résidu est repris dans 100 ml d'acétate d'éthyle, et lavé successivement avec une solution d'acide citrique à 10%, à l'eau, avec une solution de C03HNa molaire, et à l'eau jusqu'à pH neutre. La phase organique est séchée sur S04Mg, filtrée, puis concentrée. Par précipitation à l'éther, on récupère 652 mg de produit dont les caractéristiques sont: P.F. 77-79° C; [<x]^ = —6,7° (acide acétique glacial).
Analyse élémentaire pour C30H49N5O8 (607,76):
Calculé: C 59,29 H 8,13 N 11,52%
Trouvé: C 59,43 H 8,17 N 11,55%
m BOC-Ne [m BOC-m (W BOC-N* Z-Lys)-Lys]-Lys-NH2 (C) 1,2 g (2 mmol) de B sont hydrogénés, puis couplés avec 716 mg (1,5 mmol) de Na BOC-NE Z-Lys-OSu essentiellement selon le mode expérimental décrit pour B. On obtient 1,14 g de produit dont les caractéristiques sont: P.F. 94-98°C; [a]|f = —9,4° (méthanol absolu).
Analyse élémentaire pour C41H69N7011 (836,05):
Calculé: C 58,90 H 8,32 N 17,73%
Trouvé: C 59,07 H 8,38 NI 1,39%
Le dérivé C est débutyloxycarboxylé de façon usuelle par action d'une solution de HCl normale dans l'acide acétique pendant 30 min. Le mélange réactionnel est concentré à sec et le produit est obtenu par précipitation à l'éther C'.
Na MDP-W [m MDP-Ne ( M DP-Lys ) -Lys ]-Lys-NH2 (D)
108,4 mg (0,22 mmol) de MDP, obtenu de la façon décrite par P. Lefrancier, J. Choay, M. Derrien et I. Lederman dans «Int. J. Peptide Protein Res.», 1977, 9,249, sont dissous dans 2,5 ml de diméthylformamide. Après addition de 31 mg de N-hydroxybenzo-triazole et de 45 mg de dicyclohexylcarbodiimide, le mélange réactionnel est laissé 1 h à température ambiante. 21,5 mg (0,033 mmol) de C', dissous dans 2,5 ml de diméthylformamide contenant 11 [il de N-méthylmorpholine, sont alors ajoutés. Après une nuit, le mélange réactionnel est concentré à sec. Le résidu est repris dans de l'eau, et la dicyclohexylurée est éliminée par fìltration. Par lyophilisation du filtrat, on obtient 130 mg de produit. Il est dissous dans un mélange d'acide acétique 2 • 10_3M et de diméthylformamide (3/1) et élué dans ce même mélange à partir d'une colonne (1 x 10cm)d'Agix2. Les fractions intéressantes sont réunies, concentrées et reprises dans un mélange d'acide acétique 0,1M et de diméthylformamide (3/1). Le produit est élué dans ce même mélange à partir d'une colonne (1 x 10 cm) de AG 50 WX2. Les fractions intéressantes sont réunies, concentrées, et reprises dans 10 ml d'un mélange de méthanol et d'eau (50/50) contenant 0,5 ml d'acide acétique. Le produit est hydrogéné pendant 4 h en présence de palladium 5% sur charbon. Le catalyseur est éliminé par fìltration. Le produit est obtenu, après concentration du filtrat, par lyophilisation (50 mg).
41 mg de ce produit brut sont finalement purifiés à l'aide d'une colonne (10 x 1 cm) de Biorex 70, par élutions successives avec des solutions d'acide acétique 2- 10~3M et 1M.
Les fractions intéressantes sont réunies et lyophilisées. On obtient 25 mg de produit de pouvoir rotatoire [a]^ = +22,5° (acide acétique glacial).
L'analyse en acides aminés d'un hydrolysat acide total (HCl 6N, 100° C, 24 h) donne les valeurs théoriques:
Ala: 0,99 (1); Glu: 1,02 (1); Lys: 0,99 (1).
Préparation de Ne-Ne' bis(N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamine-L-lysine)adipidimidyl, dichlorhydrate ou en abrégé adipimidyl-bis (MDP-Lys)
124 mg (0,2 mmol) de N-acétylmuramyl-L-alanyl-D-isogluta-mine-L-lysine, acétate sont dissous dans 20 ml d'un mélange de diméthylformamide et de pyridine (50/50) contenant 22 |il de N-méthylmorpholine. A cette solution, 49 mg (0,2 mmol) de diméthyl-adipimidate, dichlorhydrate et 45 ni de N-méthylmorpholine sont ajoutés. Après 20 h, à température ambiante, de nouveau 24,5 mg (0,1 mmol) de diméthyladipimidate, dichlorhydrate et 22 (il de N-méthylmorpholine sont ajoutés. La réaction se poursuit pendant encore 24 h, puis le mélange réactionnel est concentré à sec. Par précipitation dans un mélange diméthylformamide/éther, on obtient 210 mg de produit. Ce produit brut est repris dans 1 ml de diméthylformamide et chargé sur une colonne (80 x 2,5 cm) de LH-20 élué avec du diméthylformamide. Les fractions intéressantes sont réunies, concentrées presque à sec, et le produit est précipité à l'éther (107 mg). Ce produit, partiellement purifié, est dissous dans 0,5 ml du mélange acétate d'éthyle/pyridine/acide acétique/eau (5/5/1/2) et 0,1 ml d'eau, puis chargé sur une colonne de silice (Merck, type A) préalablement équilibrée et éluée avec le mélange précédent. Les fractions intéressantes sont recueillies, concentrées et repurifiées de la même façon une seconde fois. Par lyophilisation, on recueille finalement 40 mg de produit.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
640 866
20
Analyse élémentaire pour CS6H98N14024C12, 2 H20:
Calculé: C 46,11 H 6,99 N 13,44%
, Trouvé: C 46,19 N 7,076 N 13,37%
Propriétés pharmacologiques
1) Toxicité
On a étudié la toxicité des produits selon l'invention par administration parentérale sur des souris. On a constaté que les doses toxiques sont d'un ordre de grandeur très supérieur à celui des doses auxquelles ces produits manifestent leur activité.
Ainsi, les essais d'injection par voie intraveineuse chez les souris surrénalectomisées, dont la sensibilité aux endotoxines est bien connue, montrent que la dose létale 50 pour le pol-(PAP-MDP) est supérieure à 100 jxg, alors que, pour l'endotoxine extraite $ Escherichia coli, elle n'est que de 0,02 p.g. Le produit est donc 5000 fois moins toxique sur ce test. De plus, le rapport activité/toxicité est très favorable dans le cas du pol-(PAP-MDP), comme cela apparaît lorsque l'on considère les résultats des essais rapportés ci-après.
2) Test du Limulus
Pour montrer l'absence d'activité de type endotoxique, on a soumis le pol-(PAP-MDP) au test du Limulus. A cet effet, on mélange 0,1 ml de la préparation de lysat de Limulus amoebocyte (commercialisé par la société Mallinckrodt, à Saint Louis, E.U.A.) avec un volume égal du produit testé à diverses concentrations en solution dans de l'eau distillée apyrogène. Les ustensiles utilisés sont également rendus apyrogènes par chauffage à sec à l'étuve, à 180° C, pendant 2 h.
Après incubation du mélange pendant 20 min à 37° C dans des tubes, on évalue la formation de gel caractéristique de la présence d'endotoxine.
Un test est positif lorsqu'on constate la présence d'un gel ferme qui reste adhérent au fond du tube lorsque celui-ci est renversé (technique décrite par Elin RJ. et Wolff S.M., «J. Infect. Dis.», 1973, 128:349).
Dans le cas du pol-(PAP-MDP), la concentration conduisant à une réponse positive est de l'ordre de 15 ng/ml. Dans les mêmes conditions, le LPS extrait d'Escherichia coli à titre de comparaison est positif à 0,03 ng/ml. On constate donc que le pol-(PAP-MDP) est 500 000 fois moins actif que le LPS sur ce test. Etant donné les doses actives respectives 10 et 0,01 |ig par souris (voir les résultats rapportés aux essais suivants), l'activité anti-infectieuse ne peut pas être due à une contamination par des endotoxines.
3) Caractère adjuvant en phase aqueuse et en émulsion a) En phase aqueuse
Des groupes de huit souris Swiss âgées de deux mois reçoivent, par injection sous-cutanée (se), 0,5 mg d'antigène constitué par de l'albumine de sérum bovin (BSA) avec ou sans la substance essayée dans une solution saline isotonique. Cette dose élevée d'antigène, parce qu'elle se situe à la limite de la dose paralysante vis-à-vis de la réponse immunitaire, entraîne, de ce fait, une réponse faible ou nulle à l'antigène seul chez les témoins; elle constitue donc un critère sévère pour mettre en évidence l'activité d'une substance adjuvante. 30 d plus tard, les souris reçoivent, par la même voie d'administration, un rappel contenant 0,1 mg du même antigène.
Le taux d'anticorps est déterminé par hémagglutination passive en utilisant des hématies de mouton traitées à la formaline et recouvertes de l'antigène étudié selon la méthode décrite par A.A. Hirata et M.W. Brandiss («J. Immunol.», 100, 641-648, 1968). Les prélèvements ont lieu 14, 18, 34 et 36 d après la première injection.
Le titre en anticorps, représenté par la dilution sérique maximale agglutinant une quantité donnée d'hématies de moutons, atteint un maximum au trente-sixième jour. Les résultats obtenus pour divers produits selon l'invention figurent dans le tableau 1. A titre de comparaison, on a indiqué les résultats obtenus avec le MDP, d'une part, et le PAP-MDP, d'autre part.
Tableau 1
Activité adjuvante des produits administrés dans une solution saline isotonique
Adjuvant en solution saline
Dose (Hg)
Titre en anticorps
Témoins
6
MDP
100
200
PAP-MDP
100
11
Pol-(PAP-MDP)
100
50
(MDP)2 L-Lys OMe
100
200
H(N-a-MDP-Lys)3 NH2
100
200
Adipimidyl-bis-MDP-Lys
100
200
b) En émulsion
Les essais sont effectués sur des lots de 6 cobayes Hartley mâles de 350 g. L'administration est faite par injection intradermique dans le coussinet plantaire de chacune des pattes postérieures. L'ovalbu-mine (constituant l'antigène) à raison de 1 mg est préparée dans 0,1 ml d'une émulsion de solution isotonique saline, dans une phase huileuse constituée soit par l'adjuvant incomplet de Freund (FIA), soit par l'adjuvant complet (FCA) formé par le FIA auquel est ajouté 0,1 mg de cellules tuées entières de Mycobacterium smegmatis. Le composé selon l'invention est administré à raison de 0,05 mg additionné dans l'émulsion contenant le FIA.
18 d après cette immunisation, on recherche d'éventuelles réactions d'hypersensibilité retardée à l'antigène en injectant par voie intradermique 0,01 mg d'ovalbumine sur le flanc des animaux, et l'on observe, 48 h après, la réaction au point d'injection. On mesure en millimètres le diamètre de la réaction ainsi provoquée.
21 d après l'injection, les animaux sont saignés. Sur le sérum recueilli, on mesure la teneur en anticorps spécifiques de l'ovalbumine par précipitation du complexe anticorps/antigène dans la zone d'équivalence. La quantité d'azote protéique contenue dans ce précipité est évaluée suivant la méthode de Folin. Les valeurs moyennes des teneurs en anticorps sont indiquées dans le tableau 2. Ces valeurs expriment la quantité, en microgrammes, d'azote précipita-ble par l'antigène, par millilitre de sérum.
Les résultats de ces essais sont les suivants.
Tableau 2
Composition de l'émulsion contenant l'antigène
Anticorps sériques (Hg/ml)
Test cutané (diamètre en mm)
FIA
500
0
FCA (FIA + mycobactéries 50 |*g)
1500
10
FIA + MDP (50 ng)
3240
11,3
FIA + PAP-MDP (50 ng)
3480
14,4
FIA + (MDP)2 L-Lys OMe (50 ng)
5000
17
FIA + H(N-a-MDP-Lys)3 NH2
5500
16
FIA + adipimidyl-bis-MDP-Lys
6000
17
Ces résultats montrent que les produits selon l'invention provoquent un important accroissement du taux des anticorps formés, que l'administration soit faite en présence ou en l'absence de phase huileuse.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
21
640 866
L'administration du produit engendre aussi une hypersensibilisa-tion de type retardé chez le sujet traité vis-à-vis de l'antigène, hyper-sensibilisation qui est révélée par le test cutané.
4) Activité anti-infectieuse vis-à-vis de Klebsiella 5
Le protocole des essais pour l'étude de cette activité est décrit dans l'article Chedid L. et coll., «Proc. Nati. Acad. Sci. USA», 1977, 74:2089.
On a ainsi établi de façon préalable un mode expérimental permettant de mettre en évidence le caractère anti-infectieux des pro-duits. On a montré qu'une dose de 104 Klebsiella pneumoniae, injectée par voie intramusculaire à des souris, entraîne le décès progressif d'une part importante, sinon de la totalité, des animaux dans la semaine suivant l'inoculation. Après 8 d, la survie des animaux est définitivement acquise. is
Pour ces essais on a utilisé des souris hybrides (C57B1/6 x AKR)F1 élevées à l'Institut Pasteur à partir de souches provenant de l'élevage du C.N.R.S. à Orléans.
L'infection par Klebsiella pneumoniae, souche de type capsu-laire 2, biotype d, est faite à partir d'une culture de 16 h en milieu 20 pour pneumocoques (N° 53515, Institut Pasteur).
Différentes conditions de traitement et d'épreuves ont été étudiées. Ainsi, le traitement a été réalisé soit 24 h avant l'épreuve, soit 1 h après celle-ci. L'influence de la dose infectante et du mode d'administration a également été étudiée. En particulier, les propriétés protectrices des produits ont été déterminées dans le cas d'une injection des Klebsiella pneumoniae par voie intraveineuse, ce qui correspond à une infection violente.
Dans la majorité des cas, les essais ont été effectués sur des souris âgées de 5 à 6 semaines. Dans une partie des essais, on a utilisé par contre des souris de 7 d, car les réponses immunitaires, chez les sujets très jeunes, sont sensiblement différentes et, dans l'ensemble, beaucoup plus difficiles à stimuler que celles que l'on observe chez des sujets adultes. Il était donc intéressant d'observer l'activité des produits dans les deux cas.
Les produits sont administrés dans du soluté physiologique apy-rogène à raison de 0,2 ml pour l'administration intraveineuse aux souris adultes et de 0,05 ml pour l'injection sous-cutanée aux souris de 7 d. Les témoins reçoivent le soluté seul.
Les conditions et résultats de ces essais sont reportés dans les tableaux 3 et 4. Le pourcentage de protection indiqué correspond à la différence des pourcentages de survivants du groupe traité par rapport au groupe témoin.
A titre de comparaison, on a fait figurer les résultats des essais obtenus avec le MDP et avec le paraminophénylglycoside MDP.
Les résultats exprimés dans ces tableaux représentent plusieurs expériences identiques dont les résultats se sont révélés reproductibles.
Tableau 3
Activité artîz'-Klebsiella pneumoniae chez la souris adulte
Infection K. pneumoniae
Traitement
Nombre de souris
%
protection
Admi-nistr.
Dose
Moment
Produit
Mode
Dose (ng)
J0
J+3
J+5
J+10
i.m.
1,5 x 10*
-24 h
(Témoins) MDP
i.v. i.v.
100
32 32
14
32
10
32
4 20
50
i.m.
1,5 xlO4
-24 h
(Témoins) PAP-MDP
i.v. i.v.
100
32 40
16 28
10 17
3 11
19
i.m.
1,5 xlO4
-24 h
(Témoins)
Pol(PAP-MDP)
Pol(PAP-MDP)
i.v. i.v. i.v.
10 100
24 24 24
15 24 24
9 21 24
5 19 22
58 72
i.m.
1,5 xlO4
-24 h
(Témoins)
(MDP)2-L-Lys-OMe i.v. i.v.
100
24 24
15 22
11 18
3 13
41
i.m.
1,5 xlO4
-24 h
(Témoins) H(MDP-Lys)3-NH2
i.v. i.v.
100
24 24
7
20
1
17
1
15
58
i.m.
1,5 x 104
-24 h
(Témoins)
Adipimydil-bis-MDP-Lys i.v. i.v.
100
32 32
13 27
9 23
8
22
44
i.m.
1,5 xlO4
+ 1 h
(Témoins) MDP
i.v. i.v.
100
24 24
12 20
6 16
1
11
42
i.m.
1,5 x 104
+ 1 h
(Témoins)
Pol(PAP-MDP)
Pol(PAP-MDP)
i.v. i.v. i.v.
10 100
16 16 16
13 16 16
8 13 16
3 11 16
50 81
i.v.
1,5 xlO3
-24 h
(Témoins)
MDP
PAP-MDP
Pol(PAP-MDP)
Pol(PAP-MDP)
i.v.
i.v. i.v. i.v. i.v.
100 100 10 100
32 16 24 32 16
11
14 6
22
15
8 11 2 17 14
4 9 2 9 14
44 0 16 75
i.v.
1,5 x 105
-24 h
(Témoins)
MDP
Pol(PAP-MDP)
i.v. i.v.
i.v.
100 100
24 24 24
0 2 12
0 0 4
0 0 3
12
640 866
22
Les résultats obtenus montrent que les produits selon l'invention, à des degrés variables, présentent une activité anti-infectieuse notable vis-à-vis des infections provoquées par l'inoculation de Klebsiella pneumoniae. Cette activité se manifeste, que le produit soit administré avant ou en même temps que l'injection infectante (ou même peu de temps après celle-ci). Cette activité est sensible même pour les conditions d'infection les plus violentes, c'est-à-dire celles pour lesquelles l'inoculation est conduite par voie intraveineuse et, en particulier, pour des doses élevées d'injections infectantes.
Il faut remarquer également que, de façon surprenante, l'oligo-5 mère du p-aminophénylglycoside MDP obtenu par couplage au glutaraldéhyde est anti-infectieux, alors que le p-aminophénylglycoside MDP seul ne l'est pratiquement pas.
Les résultats reportés sur le tableau 4 représentent les essais réalisés chez les souris âgées de 7 d.
Tableau 4
Activité an//-Klebsiella pneumoniae chez le souriceau de 7 d s.c.
103
-24 h
(Témoins)
s.c.
53
20
14
11
s.c.
103
-24 h
MDP
s.c.
100
48
37
26
22
25
s.c.
103
-24 h
LPS
s.c.
0,01
38
9
3
3
s.c.
103
-24 h
(Témoins)
s.c.
—
28
15
13
10
s.c.
103
-24 h
Pol(PAP-MDP)
s.c.
100
27
22
19
19
34
i.v.
2,5 xlO2
-24 h
(Témoins)
s.c.
—
28
0
i.v.
2,5 xlO2
-24 h
MDP
s.c.
100
28
7
5
5
18
i.v.
2,5 x 102
-24 h
(Témoins)
s.c.
—
21
0
i.v.
2,5 xlO2
-24 h
Pol(PAP-MDP)
s.c.
100
22
14
10
9
41
Les résultats obtenus montrent que l'oligomère du p-aminophénylglycoside MDP obtenu par couplage au glutaraldéhyde présente une activité anti-infectieuse notable. Cette activité est remarquable chez des animaux dont on sait que les réponses immunitaires sont très faibles à cet âge et qui ne peuvent pas être protégés par le LPS dans les conditions de l'expérience.
5) Activité anti-infectieuse vis-à-vis des Listeria
Dans des conditions analogues à celles des essais du 4, on a déterminé l'influence de l'administration de l'oligomère du p-aminophénylglycoside MDP sur la mortalité de souris auxquelles on inocule une dose de Listeria monocytogenes, connues pour engendrer de façon typique une infection de type cellulaire.
Comme précédemment, on a comparé l'action du produit selon l'invention à celle du Corynebacterium granulosum dont les propriétés anti-infectieuses sont bien connues dans ce domaine. On a également déterminé, toujours à titre de comparaison, l'action du Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln (MDP).
Le traitement des souris et l'inoculation sont effectués par voie intraveineuse. Les produits injectés sont en solution ou suspension dans 0,2 ml de soluté physiologique apyrogène. Les témoins ne reçoivent que le soluté.
La dose de Listeria administrée est, dans tous les essais, de 1 • 103 unités.
Les essais dont les résultats sont donnés ci-après ont été effectués en faisant varier les doses de produits essayés et l'intervalle de temps séparant le traitement de l'inoculation des Listeria monocytogenes (soit 1, soit 7 d). On suit le nombre de souris survivantes au cinquième et au dixième jour suivant l'inoculation, et on détermine le pourcentage de protection comme pour les essais précédents.
35
Tableau 5
Activité anfi-Listeria monocytogenes chez la souris adulte
Infection Listeria
Traitement
Nombre de souris
%
protection
Moment
Produit
Mode
Dose
(ng)
Admi-nistr.
Dose
J0
J+5
J+10
i.v.
103
—
(Témoins)
i.v.
—
24
3
2
J-l
Corynebacterium i.v.
300
8
0
0
J—7
Corynebacterium i.v.
300
24
12
11
38
i.v.
103
—
(Témoins)
i.v.
—
40
9
4
J-l
MDP
i.v.
100
32
6
2
0
i.v.
103
—
(Témoins)
i.v.
—
24
11
2
J-l
Pol(PAP-MDP)
i.v.
10
16
10
6
29
J-l
Pol(PAP-MDP)
i.v.
100
24
23
19
71
Ces résultats montrent, d'une part, pratiquement l'absence de protection au moyen de MDP dans les conditions de l'expérience et,
au contraire, une protection très significative dans le cas du produit selon l'invention puisqu'elle se manifeste plus rapidement que dans le cas de Corynebacterium utilisé comme produit de référence.
R

Claims (17)

640 866
1
ch i
ch,
ch )
j ) ch - co - nh - ch - conh - çh - c0nho
H > ' (k).
ch, i
CH,
io
1. Oligomère soluble dans l'eau, exempt de motifs N-acétyl-glucosamine, dont les éléments monomères comportent un groupe dérivé de l'acide muramique comprenant une chaîne de type peptidi-que liée au carboxyle de l'acide muramique comportant au moins deux résidus aminoacyle, et dont le premier aminoacyle est l'un du groupe comprenant: L-alanyle, L-arginyle, L-asparagyle, L-cystéi-nyle, L-glutaminyle, glycyle, L-histidyle, L-hydroxyprolyle, L-isoleu-cyle, L-leucyle, L-méthionyle, L-phénylalanyle, L-prolyle, L-séryle, L-thréonyle, L-tryptophanyle et L-valyle, et le second aminoacyle est soit un résidu D-glutamyle, soit un résidu D-isoglutaminyle.
(®2)4
- hh 0 = nh
I
2 »
och,
640 866
ch2oh nh - coch3
ch - co - nh - ch - conh - ch - c0nho j i 2 (IV)
ch3 (çh2)2
h,oh conh - ch - cooh nh - coch3 (ch2)^
ch - co - nh - ch - conh - çh - conh2 llï —— c = nh gh3 ^?h2^2 (chp)
conh - £h - cooh d p
2 2
(ii)
-oh,
ch - co > -nh2,
BH ( -00H3
ch2oh ch,,)
h, oh nh - coch-,
h )
) ch - coniî - <jjh - conh - <j3h - conh,
ch.
h
(ch2)?
i
CO i nh nh - ch - co
(m)
-oh
-nh,
( -
2. Oligomère selon la revendication 1, caractérisé en ce que le rapport du nombre de motifs aminoacyle au nombre de motifs mu-ramyle est au plus égal à 7.
2
REVENDICATIONS
3. Oligomère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les unités muramylpeptide sont liées soit directement entre elles par les groupes fonctionnels réactifs libres qu'elles présentent individuellement, soit par l'intermédiaire d'un agent de pontage polyfonctionnel, soit encore selon ces deux modes, et, de préférence, en ce que l'ensemble des restes correspondant à l'agent de pontage, lorsqu'il est présent, représentent au plus 60% du poids moléculaire total.
4 atomes de carbone, soit — NH2, les hydrogènes du groupe amino pouvant être substitués par des restes alcoyle de 1 à 4 atomes de carbone, soit un résidu aminoacyle amidé,
— Z est soit —OH, soit —NH2, soit un groupe de formule —(A)n—W—R', avec n soit nul, soit 1, 2 ou 3, ou
—(A)n'—A'—CO—R', avec n' soit nul, soit 1 ou 2, dans lesquelles: A est un résidu aminoacyle du groupe indiqué ci-dessus pour X, étant entendu que les groupes A présents dans un même composé peuvent être identiques ou différents, n ne représentant que le nombre total de groupes A dans ce composé,
A' est un résidu d'aminoalcool (—NH—CH—CH2—O—) cor-
I
respondant aux aminoacyle A(—NH—CH—CO—) indiqués ci-dessus, I
W est soit un oxygène, soit un groupe — NH—,
R' est un atome d'hydrogène ou un reste alcoyle linéaire ou ramifié, saturé ou non, pouvant porter des groupes fonctionnels hydroxyle, carbonyle, carboxyle, cyclopropane, ou un reste aryle ou al-coyle-aryle éventuellement substitué.
4. Oligomère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que, dans les conditions utiles à la manifestation de son activité adjuvante, il ne présente pas de caractère immunogène.
5
5. Oligomère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les liaisons entre les unités muramylpeptide s'établissent sur leur partie peptidique ou sur des groupes de substitution réactifs en position 1, 2, 4 ou 6 du résidu osidique du groupe mura-myle.
6. Oligomère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les unités muramylpeptide sont liées par leur partie peptidique, par l'intermédiaire de groupes aminoacide ou peptide, tels qu'un groupe lysine ou un peptide renfermant des maillons de lysine.
7. Oligomère selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les unités muramylpeptide sont liées par l'intermédiaire d'agents de pontage polyfonctionnels, de préférence dérivés d'un dialdéhyde tel que le glutaraldéhyde ou d'un diacide, notamment d'un diméthyladipimidate ou homologue, ou de l'une de leurs formes activées.
8. Oligomère selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce que les éléments monomères muramylpeptide qu'il contient répondent à la formule générale:
hh ch - co ch0
i 2
ch9 i co - z dans laquelle les substituants R, Rj, R2, R4, R6, X, Y et Z ont l'une des significations suivantes:
— R est soit un atome d'hydrogène, soit un groupe alcoyle comprenant de 1 à 4 atomes de carbone,
— R, est soit —NH2, soit —OH, ou un radical résultant de la substitution d'un hydrogène de ceux-ci par un alcoyle ou aryle ayant au plus 10 atomes de carbone, pouvant porter des groupes fonctionnels,
— R2 est un atome d'hydrogène ou un radical acyle pouvant porter des groupes fonctionnels et comportant au plus 22 atomes de carbone,
— R4 est un hydroxyle ou le groupe résultant de la substitution de l'hydrogène de l'hydroxyle par un radical acyle comprenant au plus 4 atomes de carbone,
— R6 est soit —NH2, soit —OH, soit le groupe résultant de la substitution d'un hydrogène d'un de ceux-ci par un radical acyle saturé ou non, éventuellement ramifié, substitué ou non, contenant de 1 à environ 90 atomes de carbone, et pouvant en outre porter des groupes fonctionnels: hydroxyle, carboxyle, carbonyle, amino, cyclopropane,
— X est un des résidus aminoacyle énumérés à la revendication 1,
— Y est soit —OH, soit un radical alcoxy comprenant de 1 à
9. Oligomère selon la revendication 8, caractérisé en ce que les unités muramylpeptide entrant dans sa constitution sont celles répondant à la formule générale (I) dans laquelle Rt, R4 et R6 sont simultanément un hydroxyle, R est — CH3, R2 est — COCH3, X est un résidu L-alanyle, L-séryle ou glycyle, et Z est —OH.
10
10. Oligomère selon l'une des revendications -8 ou 9, formé par deux unités Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln, ou de l'homologue nor-Mur, pontées par une molécule de lysine, laquelle peut être amidée ou estérifiée et répondant à la formule:
(Formule en tête de la page suivante) —»
11. Oligomère selon l'une des revendications 8,9 ou 10, formé par trois unités Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln, ou de l'homologue nor-Mur, liées à une chaîne peptidique comprenant trois maillons de lysine, le carboxyle terminal de la chaîne pouvant être amidé ou esté-rifié, selon la formule:
(Formule en page suivante) ^
12. Oligomère selon l'une des revendications 8 ou 9, caractérisé en ce qu'il est constitué par deux unités Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln-L-Lys, ou de l'homologue nor-Mur, couplées par l'adipimidine ou un homologue et de formule:
(Formule en page suivante) ^
p étant compris entre 2 et 10.
13. Oligomère selon la revendication 8, caractérisé en ce que les unités muramylpeptide portent en position 1,2,4 ou 6 du résidu osidique au moins un groupe de substitution amine.
14. Oligomère selon la revendication 13, caractérisé en ce que les unités muramylpeptide, notamment en un nombre de 8 à 10, sont constituées par le P-D-p-aminophênylglycoside du Mur-NAc-L-Ala-D-isoGln, et que celles-ci sont couplées au moyen du glutaraldé-hyde.
15. Oligomère selon la revendication 8, caractérisé en ce que les unités monomères correspondent à la formule générale (I) dans laquelle X est L-alanyl, Y est —OCH3, —OC2H5 ou —OC3H8, Z est —NH2, et Rj, R4 et Rô sont simultanément —OH et R2 est
-coch3.
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
640 866
ch20h h
ch )
) ch - co - nh - çh - conh - ch - conh,
ch2oh -0,
i/o N h,oh. HoNj f
(CHp)p
I * ^ co - nh i
ch nh - coch-a
16. Oligomère selon la revendication 1, caractérisé en ce que sa masse moléculaire moyenne ne dépasse pas 25 000 ou dont le nombre d'unités muramylpeptide ne dépasse pas 50.
17. Composition pharmaceutique, caractérisée en ce qu'elle contient une dose efficace d'au moins un oligomère selon l'une des revendications 1 à 15, associé à un véhicule ou excipient pharmaceuti-quement acceptable.
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