CH638983A5

CH638983A5 - AGENT FOR PROMOTING DRUG SENSITIVITY OF BACTERIA RESISTANT TO ANTIBIOTICS.

Info

Publication number: CH638983A5
Application number: CH394978A
Authority: CH
Inventors: Chikao Yoshikumi; Yoshio Ohmura; Tetsuya Hotta
Original assignee: Kureha Chemical Ind Co Ltd
Priority date: 1977-04-13
Filing date: 1978-04-13
Publication date: 1983-10-31
Also published as: SE7804110L; JPS53127813A; DD138276A5; NL170593B; CA1100876A; IT7822280A0; IT1095587B; JPS5639288B2; GB1572387A; MX5409E; SU793408A3; FR2387037A1; NL7803875A; DK155916B; HU179217B; DE2816087A1; NL170593C; FR2387037B1; SE446818B; AU519028B2

Description

Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel zur Förderung der Drogenempfindlichkeit von gegen Antibiotika resistent gewordenen Bakterien mit den in Anspruch 1 angegebenen Merkmalen. Ein bevorzugtes Mittel hat das in Anspruch 2 angegebene Merkmal. The invention relates to a means for promoting the drug sensitivity of bacteria which have become resistant to antibiotics and which have the features specified in claim 1. A preferred agent has the feature specified in claim 2.

Die Erfindung wird unter Bezug auf die Zeichnungen erläutert. Es zeigen: The invention will be explained with reference to the drawings. Show it:

Fig. 1 ein IR-Absorptionsspektrum des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids (NP), das mindestens einen Teil des erfindungsgemässen Mittels darstellt, 1 shows an IR absorption spectrum of the nitrogen-containing polysaccharide (NP), which represents at least part of the agent according to the invention,

Fig. 2 ein protonenkernmagnetisches Resonanzabsorp-tionssepektrum (NMR) des Polysaccharids und 2 shows a proton nuclear magnetic resonance absorption spectrum (NMR) of the polysaccharide and

Fig. 3 bis 6 Messkurven, welche die mit erfmdungsge-mässem Mittel erzielbaren Wirkungen veranschaulichen. 3 to 6 measurement curves, which illustrate the effects that can be achieved with means according to the invention.

Das Stickstoff enthaltende Polysaccharid, das als die bzw. als eine aktive Komponente erfindungsgemässer Mittel verwendet wird, wird durch Extrahieren von Myzelien von Basidiomyceten vom Stamm Coriolus der Polyporaceae (Röhrenpilze) mit einem wässrigen Lösungsmittel erhalten. Die hier verwendete Bezeichnung «Myzelien von Basidiomyceten vom Stamm Coriolus der Polyporaceae» beruht auf der Klassifikation in «Coloured Illustration of Fungi of Japan» von Rokuya Imazeki und Tsugio Hongo (Hoikusha Pub. Co.). The nitrogen-containing polysaccharide, which is used as or as an active component of agents according to the invention, is obtained by extracting mycelia from Basidiomycetes from the Coriolus strain of Polyporaceae (tubular mushrooms) with an aqueous solvent. The term "mycelia of Basidiomycetes from the Coriolus strain of Polyporaceae" used here is based on the classification in "Colored Illustration of Fungi of Japan" by Rokuya Imazeki and Tsugio Hongo (Hoikusha Pub. Co.).

Im folgenden wird zunächst die Herstellung des stickstoffhaltigen Polysaccharids zusammenfassend beschrieben: Die Myzelien von Basidiomyceten vom Stamm Coriolus sind das Ausgangsmaterial des Extraktionsverfahrens und können entweder in natürlicher oder künstlicher Kultür erhalten werden. Bei der künstlichen Züchtung der Pilze mit einem flüssigen Medium kann das gesamte Kulturprodukt, das nicht nur die gebildeten Myzelien, sondern auch das Elu-at des flüssigen Mediums nach der Züchtung enthält, als Ausgangsmaterial verwendet werden. Das Ausgangsmaterial wird mit einem wässrigen Lösungsmittel extrahiert und der Extrakt geeigneten Behandlungen, wie Filtrieren, Neutralisieren, Konzentrieren des Filtrâtes, Dialyse, Aussalzen u.dgl. unterworfen, um das niedermolekulare Material (mit Molekulargewichten von weniger als 5000) aus dem Extrakt zu entfernen, der dann zu einem pulvrigen Material getrocknet wird. Die so erhaltene pulverförmige Substanz besteht im wesentlichen aus Stickstoff enthaltendem Polysaccharid, ist für Mittel gemäss der Erfindung geeignet und hat die folgenden Eigenschaften: The production of the nitrogen-containing polysaccharide is first described in the following: The mycelia of Basidiomycetes from the Coriolus strain are the starting material of the extraction process and can be obtained either in natural or artificial culture. In the artificial cultivation of the mushrooms with a liquid medium, the entire culture product, which contains not only the mycelia formed, but also the eluate of the liquid medium after cultivation, can be used as the starting material. The starting material is extracted with an aqueous solvent and the extract suitable treatments such as filtering, neutralizing, concentrating the filtrate, dialysis, salting out and the like. subjected to remove the low molecular weight material (with molecular weights less than 5000) from the extract, which is then dried to a powdery material. The powdery substance thus obtained essentially consists of nitrogen-containing polysaccharide, is suitable for agents according to the invention and has the following properties:

Physiochemische Eigenschaften Physiochemical properties

(1) Allgemein: (1 General:

Die Substanz ist pulverförmig und hat eine braune Farbe, zeigt keinen definitiven Schmelzpunkt und verkohlt bei stärkerer Erwärmung. Das Material ist in den organischen Lösungsmitteln, wie Pyridin, Chloroform, Benzol, Hexan usw. unlöslich, aber in Wasser löslich. The substance is powdery and has a brown color, shows no definite melting point and chars when heated up. The material is insoluble in organic solvents such as pyridine, chloroform, benzene, hexane, etc., but is soluble in water.

(2) Infrarot-Absorptionsspektrum: (2) Infrared absorption spectrum:

Das IR-Absorptionsspektrum dieser Substanz zeigt Absorption bei und in der Nachbarschaft von 3600 bis 3200 cm-1, 2920 bis 2900 cm-1,1660 bis 1610 cm-1, 1460 cm-1,1410cm-1,1360 cm-1,1230 cm-1,1150 cm-1, 1080 cm-1,1060 bis 990 cm-1,925 cm-1, 890 cm-1, 840 cm-1,795 cm-1 und 705 cm-1. Dementsprechend ist eine Absorption durch ß-Bindungen von Glucan im Sac-charidteil bi 890 cm~1 und eine andere Absorption durch a-Bindungen von Glucan bei 840 cm-1 zu erkennen. The IR absorption spectrum of this substance shows absorption at and in the vicinity of 3600 to 3200 cm-1, 2920 to 2900 cm-1.1660 to 1610 cm-1, 1460 cm-1.1410cm-1.1360 cm-1.1230 cm-1,1150 cm-1, 1080 cm-1,1060 to 990 cm-1,925 cm-1, 890 cm-1, 840 cm-1,795 cm-1 and 705 cm-1. Accordingly, absorption by ß-bonds of glucan in the saccharide part up to 890 cm -1 and another absorption by a-bonds of glucan at 840 cm-1 can be seen.

(3) Elementaranalyse: (3) Elemental analysis:

Die elementaranalytisch bestimmte Zusammensetzung der Substanz ist wie folgt: 42-46% C, 5,3-7,0% H und 0,5-8,0% N. Der Rest ist Sauerstoff. The elemental analysis determined composition of the substance is as follows: 42-46% C, 5.3-7.0% H and 0.5-8.0% N. The rest is oxygen.

(4) Optische Drehung: (4) Optical rotation:

Die optische Drehung der Substanz bestimmt als spezifisches Drehungsvermögen [a]D25 beträgt 0 bis 50. The optical rotation of the substance determined as the specific rotatory power [a] D25 is 0 to 50.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

(5) Farbreaktion: (5) Color reaction:

Die Substanz zeigt positive Reaktion bei der Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, der Anthron-Schwefelsäure-Reak-tion und der Ninhydrin-Reaktion. Dies deutet daraufhin, dass die aktive Substanz aus Saccharid und Protein zusammengesetzt ist. Zur Untersuchung ihres Saccharid-Anteiles wurde eine Probe der Substanz mit methanolischem Chlorwasserstoff hydrolysiert und nach Trimethylsilylierung in bekannter Weise der Gaschromatographie unterworfen. Das Ergebnis zeigte, dass die Substanz hauptsächlich aus Glukose aufgebaut ist und ausserdem Mannose, Galactose, Xylose und Fucose enthält. Die Aminosäure-Analyse des Proteinteils des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids zeigte, dass dieser Proteinteil aus folgenden Komponenten zusammengesetzt ist: Aspartinsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Prolin, Glycin, Alanin, Cystin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Tryptophan, Phenylalanin, Lysin, Histidin und Alginin. Die vorherrschenden Komponenten sind dabei Aspartinsäure, Threonin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin und Leucin und stellen mehr als 70% der Gesamtaminosäuren. The substance shows a positive reaction in the phenol-sulfuric acid reaction, the anthrone-sulfuric acid reaction and the ninhydrin reaction. This indicates that the active substance is composed of saccharide and protein. To investigate their saccharide content, a sample of the substance was hydrolyzed with methanolic hydrogen chloride and, after trimethylsilylation, subjected to gas chromatography in a known manner. The result showed that the substance is mainly composed of glucose and also contains mannose, galactose, xylose and fucose. The amino acid analysis of the protein part of the nitrogen-containing polysaccharide showed that this protein part is composed of the following components: aspartic acid, threonine, serine, glutamic acid, proline, glycine, alanine, cystine, valine, methionine, isoleucine, leucine, tyrosine, tryptophan, phenylalanine , Lysine, histidine and alginine. The predominant components are aspartic acid, threonine, glutamic acid, glycine, alanine, valine and leucine and represent more than 70% of the total amino acids.

(6) Protonenkernresonanzspektrum (NMR): (6) Proton nuclear magnetic resonance spectrum (NMR):

Zur Bestimmung der Saccharid- und Proteinanteile des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids sowie zur Bestimmung der darin vorhandenen Saccharidbindungen wurde das Material durch NMR-Absorptionsspektroskopie untersucht. Das NMR-Absorptionsspektrum der Proben wurde bei 100 MHz mit schwerem Wasser als Lösungsmittel und Natrium-2,2-Dimethyl-2-silanopentan-5-sulfonat (D.S.S.) als Internstandard gemessen. Wie in Fig. 2 dargestellt, werden Absorptionen festgestellt bei 0,9+0,2-1,2+0,2 ppm, 2,0 ± 0,2 ppm, 4,5+0,2 ppm, 4,7+0,2 ppm, 5,0+0,2 ppm bzw. 5,4 + 0,2 ppm. Ferner wurde eine breite Absorptionsbande bei 3,0-4,4 ppm festgestellt. Der Proteinanteil wurde unter der Annahme untersucht, dass der Bereich von 0,5 bis 2,5 ppm mit der Protonenintesität des Proteinanteils und der Bereich von 2,5 bis 6,0 ppm mit der Protonenintensität des Saccharidanteils zusammenhängt. Der Proteinanteil beträgt näherungsweise weniger als 40%. Unter der Annahme, dass der Bereich von 4,4 bis 4,9 ppm mit den ß-Bindungen des Saccharids und der Bereich von 4,9 bis 5,4 ppm mit dessen a-Bindungen zusammenhängt, wurde deren Verhältniswert (ß/a) als im Bereich von 85/15 bis 40/60 liegend festgestellt. The material was examined by NMR absorption spectroscopy to determine the saccharide and protein contents of the nitrogen-containing polysaccharide and to determine the saccharide bonds present therein. The NMR absorption spectrum of the samples was measured at 100 MHz with heavy water as a solvent and sodium 2,2-dimethyl-2-silanopentane-5-sulfonate (D.S.S.) as an internal standard. As shown in Fig. 2, absorptions are found at 0.9 + 0.2-1.2 + 0.2 ppm, 2.0 ± 0.2 ppm, 4.5 + 0.2 ppm, 4.7+ 0.2 ppm, 5.0 + 0.2 ppm and 5.4 + 0.2 ppm. A broad absorption band was also found at 3.0-4.4 ppm. The protein content was examined on the assumption that the range of 0.5 to 2.5 ppm is related to the proton intensity of the protein content and the range of 2.5 to 6.0 ppm is related to the proton intensity of the saccharide content. The protein content is approximately less than 40%. Assuming that the range of 4.4 to 4.9 ppm is related to the β-bonds of the saccharide and the range of 4.9 to 5.4 ppm is related to the a-bonds, their ratio (ß / a) found to be in the range of 85/15 to 40/60.

(7) Molekulargewicht: (7) Molecular Weight:

Das Molekulargewicht des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids liegt im Bereich von 5000 bis 300 000, gemessen in der Ultrazentrifuge. The molecular weight of the nitrogen-containing polysaccharide is in the range from 5000 to 300,000, measured in the ultracentrifuge.

Akuttoxizität Acute toxicity

Die Untersuchungen wurden an Mäusen vom Stamm ICR-JCL (4 bis 5 Wochen alt, 21 bis 24 g Körpergewicht) und Ratten vom Stamm Donryu (4 bis 5 Wochen alt, Körpergewicht 100 bis 150 g) durchgeführt. Die Substanz wurde gelöst in einer physiologischen Kochsalzlösung intravenös, subkutan, intraperitoneal und oral verabreicht. Die Allgemeinsymptome, die Veränderung des Körpergewichts und die Zahl der Todesfälle der Versuchstiere wurden während 7 Tagen beobachtet und die Versuchstiere dann getötet und autopsiert. Als Ergebnis wurden weder bei Ratten noch bei Mäusen selbst bei den höchsten der in der folgenden Tabelle I angegebenen Dosierungen Todesfälle festgestellt. Die Bestimmung des LD50-Wertes war praktisch unmöglich, da keines der Versuchstiere als Folge der Verabreichung starb. The tests were carried out on mice from the strain ICR-JCL (4 to 5 weeks old, 21 to 24 g body weight) and rats from the strain Donryu (4 to 5 weeks old, body weight 100 to 150 g). The substance was administered dissolved in a physiological saline intravenously, subcutaneously, intraperitoneally and orally. The general symptoms, the change in body weight and the number of deaths of the test animals were observed for 7 days and the test animals were then killed and autopsied. As a result, no deaths were found in either rats or mice, even at the highest doses shown in Table I below. The determination of the LD50 value was practically impossible since none of the experimental animals died as a result of the administration.

Im folgenden werden die Wirkungen des Stickstoffs enthaltenden Polysaccharids (auch kurz als «Substanz» bezeichnet) auf die Förderung (Promotion) der Drogenemp- The effects of nitrogen-containing polysaccharide (also referred to as “substance” for short) on the promotion (promotion) of drug

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Tabelle I Table I

Versuchstier Laboratory animal

Verabreichung administration

LDS0 (mg/kg) LDS0 (mg / kg)

weibliche female

Tiere männliche Tiere Animals male animals

Maus intravenös Mouse intravenously

> 1300 > 1300

subcutan subcutaneous

> 5000 > 5000

intraperitoneal intraperitoneally

> 5000 > 5000

oral orally

>20000 > 20000

Ratte intravenös Rat intravenously

> 600 > 600

subcutan subcutaneous

> 5000 > 5000

intraperitoneal intraperitoneally

> 5000 > 5000

oral orally

>20000 > 20000

fmdlichkeit von Bakterien untersucht, die gegen Antibiotika resistent geworden waren. The toxicity of bacteria that had become resistant to antibiotics was examined.

Die Antibiotika, die bei Kombination mit der Substanz • Wirkungen gegen die resistenten Bakterien zeigten, sind solche von Pilzen, Bakterien, Actinomyceten u.dgl. àbgeleiteten Antibiotika. Typische Beispiele solcher Antibiotika sind die folgenden: The antibiotics which, when combined with the substance, showed effects against the resistant bacteria are those of fungi, bacteria, actinomycetes and the like. derived antibiotics. Typical examples of such antibiotics are the following:

Penicillin G (hier kurz als PG bezeichnet) Penicillin G (referred to here briefly as PG)

Streptomycin (hier kurz als SM bezeichnet) Streptomycin (here briefly referred to as SM)

Kanamycin (hier kurz als KM bezeichnet) Chlorampheniocol (hier kurz als CP bezeichnet) Tetracyclin (hier kurz als TC bezeichnet) Kanamycin (here briefly referred to as KM) Chlorampheniocol (here briefly referred to as CP) Tetracycline (here briefly referred to as TC)

Erythromycin (hier kurz als EM bezeichnet) Aminobenzylpenicillin (hier kurz als ABPC bezeichnet) Cephaloridin (hier kurz als CER bezeichnet) Erythromycin (here briefly referred to as EM) Aminobenzylpenicillin (here briefly referred to as ABPC) cephaloridine (here briefly referred to as CER)

Colistin (hier kurz als CL bezeichnet) Colistin (briefly referred to here as CL)

Die vorliegende Substanz zeigt eine Förderung der Drogenempfindlichkeit der folgenden gegen die Antibiotika resistenten Bakterien: The present substance shows a promotion of drug sensitivity of the following antibiotic-resistant bacteria:

Escherichia coli Streptococcus faecalis Staphylococcus aureus Enterobacter aerogenes Salmonella enteritidis Shigella Sonnei Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa Escherichia coli Streptococcus faecalis Staphylococcus aureus Enterobacter aerogenes Salmonella enteritidis Shigella Sonnei Klebsiella pneumoniae Proteus mirabilis Pseudomonas aeruginosa

Die Wirkung der Substanz auf die Förderung der Drogenempfindlichkeit der resistenten Bakterien wurde in folgender Weise bestätigt: Die drogenresistenten Bakterien wurden in der weiter unten beschriebenen Weise durch Kon-zentrationsgradienten-Plattenkulturen (s. «Chemotherapeu-tics and Résistant Bacteria», 1970, von Chikara Watanabe, Asakura Shoten) erhalten. Dazu wurden Agar-Platten mit Drogenkonzentrationsgradienten von 10 bis 100 um/ml hergestellt und mit Bakterien der jeweils zu prüfenden Stämme bestrichen. Nachdem die Platten mehrere Tage bei 37 °C gehalten worden waren, wurde die im hohen Konzentrationsbereich gebildete Kolonie isoliert und wiederum in ähnlicher Weise auf Platten überimpft. Dies wurde mehrmals wiederholt, um die gegen die jeweiligen Mittel resistent gewordenen Bakterienstämme zu erhalten. The effect of the substance on promoting the drug sensitivity of the resistant bacteria was confirmed in the following way: The drug-resistant bacteria were determined in the manner described below by concentration gradient plate cultures (see “Chemotherapeutics and Resistant Bacteria”, 1970, by Chikara Watanabe, Asakura Shoten). For this purpose, agar plates with drug concentration gradients of 10 to 100 μm / ml were produced and coated with bacteria from the strains to be tested in each case. After the plates were kept at 37 ° C for several days, the colony formed in the high concentration range was isolated and again inoculated on plates in a similar manner. This was repeated several times in order to obtain the bacterial strains which had become resistant to the respective agents.

Die Drogenempfindlichkeit der resistenten Stämme und die der ursprünglichen Stämme (empfindliche Stämme) wurde durch Bestimmung der Wachstumsinhibierungsminimal-konzentration (im folgenden als MIC bezeichnet) nach der Standardmethode der Japanischen Chemotherapeutischen Gesellschaft (siehe «Chemotherapie», Band 22, Nr. 6,1126/ 1974 des MIC-Bestimmungs-Methoden-Reform-Komitees) ermittelt. Es wurden doppelt verdünnte Systeme jeder Droge hergestellt und diese mit Herzinfusions-Agarmedium (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) zur Bildung der Agar-Platten The drug sensitivity of the resistant strains and that of the original strains (sensitive strains) was determined by determining the minimum growth inhibition concentration (hereinafter referred to as MIC) according to the standard method of the Japanese Chemotherapy Society (see “Chemotherapy”, Volume 22, No. 6.1126 / 1974 of the MIC Determination Method Reform Committee). Dual dilution systems of each drug were made and these were made with cardiac infusion agar medium (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) to form the agar plates

3 3rd

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

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gemischt. Dann wurde die mit einer Drahtschlinge übertragene Menge jedes Stammes, der 18 Stunden bei 37 °C in Tryptosoya-Bouillon (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) gezüchtet worden war, auf jede der Platten aufgestrichen. mixed. Then, the wire looped amount of each strain grown in Tryptosoya broth (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) at 37 ° C for 18 hours was spread on each of the plates.

Nach 18 Stunden Züchten bei 37 °C wurde das Wachstum des Stammes auf jeder Platte untersucht. After growing at 37 ° C for 18 hours, the growth of the strain on each plate was examined.

Zur Bestimmung der Änderung der MIC-Werte der resistenten Stämme durch die kombinierte Verwendung mit der Substanz und dem jeweiligen Antibiotikum (das seine Wirkung auf die Bakterienstämme verloren hatte) wurde wie oben, aber mit der Abänderung gearbeitet, dass beim Vermischen zusätzlich 10 bis 1000 ng/ml der Substanz in das System eingeführt wurden. Die MIC-Werte wurden nach der oben beschriebenen Agarplattenmethode bestimmt. In order to determine the change in the MIC values of the resistant strains due to the combined use with the substance and the respective antibiotic (which had lost its effect on the bacterial strains), the procedure was as above, but with the modification that when mixing an additional 10 to 1000 ng / ml of the substance were introduced into the system. The MIC values were determined using the agar plate method described above.

Durch Zusatz der erfindungsgemäss verwendeten Substanz wurde der MIC-Wert offensichtlich auf die Hälfte oder weniger als die Hälfte des Wertes ohne Zusatz der Substanz vermindert. Die Menge der zugesetzten Substanz beträgt mehr als 10 (ig/ml, vorzugsweise mehr als 100 (ig/ml. Der pH-Wert des Mediums wurde stets auf 7,2+0,1 gehalten, so dass der MIC-Wert nicht durch den pH-Wert des Mediums beeinflusst wurde. Ferner wurde jeweils vorher durch Agar-Verdünnungskultur sichergestellt, dass die Substanz selbst keine antibakterielle Aktivität gegen die getesteten Bakterienstämme zeigte. By adding the substance used according to the invention, the MIC value was obviously reduced to half or less than half the value without the addition of the substance. The amount of substance added is more than 10 (ig / ml, preferably more than 100 (ig / ml). The pH of the medium was always kept at 7.2 + 0.1, so that the MIC value was not affected by the The pH of the medium was influenced, and agar dilution cultures were used to ensure that the substance itself showed no antibacterial activity against the bacterial strains tested.

Therapeutischer Test für Infektionskrankheiten Therapeutic test for infectious diseases

Dieser Test wurde in folgender Weise durchgeführt: Das Versuchstier (Maus) wurde intraperitoneal mit 1 x 108 Zellen der resistenten Bakterien inokuliert; 1 bis 3 Stunden später wurden 10 bis 1000 mg/kg (Körpergewicht) an Antibiotikum und 1 bis 104 mg/kg der Substanz entweder intraperitoneal oder oral verabreicht. Die Versuchstiere wurden nach der Verabreichung täglich während 7 Tagen zur Feststellung der Überlebensrate als Bewertung der Wirksamkeit der Substanz beobachtet. Hierbei wurde gefunden, dass die wirksame Dosis der Substanz bei intraperitonealer Verabreichung vorzugsweise über 10 mg/kg und bei oraler Verabreichung über 100 mg/kg liegen sollte. Die Überlebensrate lag über 40%. This test was carried out in the following manner: the test animal (mouse) was inoculated intraperitoneally with 1 × 10 8 cells of the resistant bacteria; 1 to 3 hours later, 10 to 1000 mg / kg (body weight) of antibiotic and 1 to 104 mg / kg of the substance were administered either intraperitoneally or orally. The experimental animals were observed daily for 7 days after the administration to determine the survival rate as an evaluation of the efficacy of the substance. It was found that the effective dose of the substance should preferably be above 10 mg / kg with intraperitoneal administration and over 100 mg / kg with oral administration. The survival rate was over 40%.

Auf diese Weise wurde festgestellt, dass die Substanz den therapeutischen Effekt nicht nur in vitro, sondern auch bei der Chemotherapie der getesteten Infektionskrankheiten verstärkt. In this way it was found that the substance enhances the therapeutic effect not only in vitro, but also in the chemotherapy of the infectious diseases tested.

Die Substanz hat eine extrem niedrige Akuttoxizität und kann auf verschiedenen Wegen verabreicht werden, z. B. durch intraperitoneale Injektion, durch dermale Applikation sowie durch orale und intrarektale Verabreichung. Dementsprechend .kann die vorliegende Substanz im Zuge der Herstellung pharmazeutischer Präparate mit Antibiotikum gemischt und in einer solchen Mischung oder aber separat verabreicht werden. The substance has an extremely low acute toxicity and can be administered in various ways, e.g. B. by intraperitoneal injection, by dermal application and by oral and intrarectal administration. Accordingly, in the course of the production of pharmaceutical preparations, the present substance can be mixed with an antibiotic and administered in such a mixture or else separately.

Wenn die Substanz für orale Verabreichung zu Tabletten, Granulaten, pulverförmigen Zubereitungen, Kapseln od.dgl. verarbeitet wird, können die üblichen Additive, wie Bindemittel, Einschlussmittel, Exzipientien, Gleitmittel, Zerlegungsmittel, Benetzungsmittel u.dgl. zugesetzt werden. Entsprechende flüssige Mittel für orale Verabreichung können die Substanz in Form flüssiger Madizinzubereitung für innere Verwendung, wie Schüttelmischungen, Suspensionen, Emulsionen, Sirups u.dgl. oder als Trockenprodukt hergestellt werden, das vor der Verwendung gelöst wird. Auch die flüssigen Zubereitungen können die pharmakologisch üblichen Additive und/oder Konservierungsmittel enthalten. Injektionszubereitungen können Additive wie Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel, Isotonisierungsmittel u.dgl. enthalten und in Form von Einheitsdosis-Ampullen oder Mehrfach-Dosisbehältern abgefüllt werden. Diese Zubereitungen können auch in Form wässriger Lösungen, Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in Öl oder wässrigen Trägern hergestellt werden, wobei die aktive Komponente als Pulver vorliegt, das kurz vor der Verwendung in einem geeigneten Träger, z.B. sterilisiertem pyrogenfreiem Wasser, gelöst wird. Wenn die Substanz in einer Salbe oder als Einreibmittel verwendet werden soll, kann die entsprechende Zubereitung ein Öl oder eine Fettgrundlage, eine Emulsionsbasis, eine wasserlösliche Grundlage, Konservierungsmittel od.dgl. enthalten. Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung und ihrer hervorragenden Wirkung. If the substance for oral administration to tablets, granules, powdered preparations, capsules or the like. processed, the usual additives such as binders, inclusion agents, excipients, lubricants, disassembling agents, wetting agents and the like. be added. Corresponding liquid agents for oral administration can the substance in the form of liquid madizine preparation for internal use, such as shake mixtures, suspensions, emulsions, syrups and the like. or manufactured as a dry product that is dissolved before use. The liquid preparations can also contain the pharmacologically conventional additives and / or preservatives. Injection preparations can contain additives such as stabilizers, buffers, preservatives, isotonizing agents and the like. contained and filled in the form of unit dose ampoules or multiple dose containers. These preparations can also be prepared in the form of aqueous solutions, suspensions, solutions or emulsions in oil or aqueous carriers, the active component being in the form of a powder which is used in a suitable carrier, e.g. sterilized pyrogen-free water. If the substance is to be used in an ointment or as a liniment, the corresponding preparation may be an oil or a fat base, an emulsion base, a water-soluble base, preservative or the like. contain. The following examples serve to further explain the invention and its outstanding effect.

Beispiel 1 example 1

Herstellung des Stickstoff enthaltenden Polysaccharids: Es wurde ein flüssiges Medium folgender Zusammensetzung hergestellt: Production of the nitrogen-containing polysaccharide: A liquid medium of the following composition was produced:

Pepton 5 g Peptone 5 g

Hefeextrakt 3 g Yeast extract 3 g

KH2P04 0,3 g KH2P04 0.3 g

K2HP04 0,3 g K2HP04 0.3 g

MgS04 • 7HzO 0,3 g MgS04 • 7HzO 0.3 g

Glucose 50 g Glucose 50 g

Wasser 1 Liter pH-Wert 6,0 Water 1 liter pH 6.0

Ein 150-ml-AIiquot dieses Mediums wurde jeweils in einen von 100 Erlenmeyerkolbenmit 1000 ml Fassungsvermögen gegeben. Nach Verschliessen der Kolben mit Wattestopfen wurde das flüssige Medium 30 Minuten bei 120 °C sterilisiert und dann in an sich üblicher Weise mit den separat in einer Schrägkultur erhaltenen Myzelien von Coriolus versicolor (Fr.) Quél. Stamm-CM-105 (Ferm. Res. Inst, Hinterlegung Nr. FERM-P-2416) angeimpft. Dann wurde 20 Tage bei 25 bis 27 °C in stationärer Kultur gezüchtet Die erhaltene Kulturaufschlämmung (Brühe) wurde in einem Trommeltrockner mit Doppeltrommel zu 451 g Trockenprodukt getrocknet. 150 g dieses trockenen Produktes wurden zerkleinert und mit 0,1 n Natriumhydroxidlösung bei 95 bis 98 °C unter Normaldruck während 3 Stunden in einem Extraktor aus rostfreiem Stahl extrahiert. Die erhaltene alkalische Extraktlösung wurde neutralisiert, filtriert und das Filtrat dann auf 500 ml eingeengt Diese konzentrierte Lösung wurde dann in Celluloseregenerat-Folie eingeschlossen und 90 Stunden gegen fliessendes Wasser dialysiert Das Dialysat wurde unter vermindertem Druck konzentriert und zur Bildung von 19,5 g pulverförmigem Produkt sprühgetrocknet A 150 ml aliquot of this medium was placed in one of 100 1000 ml Erlenmeyer flasks. After sealing the flask with cotton plugs, the liquid medium was sterilized at 120 ° C. for 30 minutes and then in a conventional manner with the Coriolus versicolor (Fr.) Quél. Mycelia obtained separately in a slant culture. Strain-CM-105 (Ferm. Res. Inst, deposit no. FERM-P-2416) inoculated. Then, culture was carried out in stationary culture at 25 to 27 ° C. for 20 days. The culture slurry (broth) obtained was dried in a drum dryer with double drum to 451 g of dry product. 150 g of this dry product were crushed and extracted with 0.1 N sodium hydroxide solution at 95 to 98 ° C under normal pressure for 3 hours in a stainless steel extractor. The alkaline extract solution obtained was neutralized, filtered and the filtrate was then concentrated to 500 ml. This concentrated solution was then sealed in cellulose regenerate film and dialyzed against running water for 90 hours. The dialysate was concentrated under reduced pressure and to give 19.5 g of powdery product spray dried

Zur Untersuchung der Eigenschaften dieses pulverförmigen Produktes wurde eine Probe der Elementaranalyse in einem CHN-CORDEM MT-2 Analysator (Yanagimoto Sei-sakujo Co., Ltd.) unterzogen: Analysenergebnis: 42,1% C, 6,9% H und 5,8% N. Die spezifische Drehungskraft einer 0,25%igen wässrigen Lösung der Probe, gemessen mit einem YANAKO-OR-50-Gerät (Yanagimoto Seisakujo Co., Ltd.) betrug +12°. To investigate the properties of this powdered product, a sample was subjected to elemental analysis in a CHN-CORDEM MT-2 analyzer (Yanagimoto Sei-sakujo Co., Ltd.): analysis result: 42.1% C, 6.9% H and 5, 8% N. The specific rotational force of a 0.25% aqueous solution of the sample, measured with a YANAKO-OR-50 device (Yanagimoto Seisakujo Co., Ltd.), was + 12 °.

Zur Prüfung der Saccharidzusammensetzung des Produktes (Substanz) wurde 10 mg Probematerial zu einer 3%igen methanolischen Chlorwasserstoffsäure gegeben und dann 16 Stunden bei 100 °C methanolysiert. Das Reaktionsmaterial wurde nach Neutralisieren der Salzsäure mit Silberkarbonat bei Raumtemperatur filtriert, das erhaltene Filtrat eingeengt und zur Trockenheit eingedampft Der Rückstand wurde in 0,5 ml Pyridin gelöst und mit 0,2 ml Hexamethyl-disilazan und 0,3 ml Trimethylchlorsilan vermischt. Die Mischung wurde zur Trimethylsilylierung 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Reaktionsprodukt wurde in Chloroform gelöst und nach Auswaschen von überschüssigem Material und Entwässern als Filtrat zur Trockenheit eingedampft. Dieses Produkt wurde dann wie4 To test the saccharide composition of the product (substance), 10 mg of sample material was added to a 3% methanolic hydrochloric acid and then methanolysed for 16 hours at 100 ° C. After neutralizing the hydrochloric acid with silver carbonate, the reaction material was filtered at room temperature, the filtrate obtained was concentrated and evaporated to dryness. The residue was dissolved in 0.5 ml of pyridine and mixed with 0.2 ml of hexamethyl-disilazane and 0.3 ml of trimethylchlorosilane. The mixture was left to stand for 30 minutes at room temperature for trimethylsilylation. The reaction product was dissolved in chloroform and, after washing off excess material and dewatering, evaporated to dryness as a filtrate. This product then became4

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

«0 «0

65 65

638 983 638 983

der in Tetrachlorkohlenstoff gelöst und der Gaschromatographie unterzogen, was folgendes Ergebnis lieferte: 70,5% Glucose, 3,8% Galactose, 10,3% Mannose, 5,4% Xylose und 10,0% Fucose. which was dissolved in carbon tetrachloride and subjected to gas chromatography, giving the following result: 70.5% glucose, 3.8% galactose, 10.3% mannose, 5.4% xylose and 10.0% fucose.

Zur Bestimmung der Proteinzusammensetzung des pul-verförmigen Produktes (Substanz) wurde eine Probe der üblichen Aminosäureanalyse mit folgendem Ergebnis unterzogen: 15% Aspartinsäure, 8% Threonin, 6% Serin, 14% Glutaminsäure, 4% Pyrolin, 8% Glycin, 10% Alanin, 4% Isoleucin, 6% Leucin, 1% Tyrosin, 4% Phenylalanin, 2% Tryptophan, 2% Lysin, 3% Alginin, 4% Ammoniak und 1 % N-Glucosamin sowie eine Spur Histidin. To determine the protein composition of the pulverulent product (substance), a sample was subjected to the usual amino acid analysis with the following result: 15% aspartic acid, 8% threonine, 6% serine, 14% glutamic acid, 4% pyroline, 8% glycine, 10% alanine , 4% isoleucine, 6% leucine, 1% tyrosine, 4% phenylalanine, 2% tryptophan, 2% lysine, 3% alginine, 4% ammonia and 1% N-glucosamine and a trace of histidine.

Zur Messung der NMR-Absorption wurde schweres Wasser als Lösungsmittel und DSS als Internstandard verwendet; zur Ausschaltung allfälliger Restanteile an leichtem Wasser wurden die entsprechend der angenommenen Lo-renz-Kurve korrigierten Werte verwendet. Unter diesen Bedingungen wurde das Verhältnis des Saccharidanteils zum Proteinteil mit der Annahme bestimmt, dass die Absorption bei 0,5 bis 2,5 ppm durch das Proton im Proteinteil und die Absorption bei 2,5 bis 6,0 ppm durch das Proton im Sac-charidteil bedingt ist. Der so erhaltene Verhältniswert von Saccharid zu Protein betrug 89/11. Auch das Verhältnis a/ß wurde unter der Annahme bestimmt, dass eine Absorptionsbande bei 4,4 bis 4,9 ppm mit den ß-Bindungen des Sac- Heavy water was used as the solvent and DSS as the internal standard to measure the NMR absorption; the values corrected in accordance with the assumed Lo-renz curve were used to switch off any residual light water. Under these conditions, the ratio of the saccharide portion to the protein portion was determined on the assumption that the absorption at 0.5 to 2.5 ppm by the proton in the protein portion and the absorption at 2.5 to 6.0 ppm by the proton in the sac portion charid is conditional. The saccharide to protein ratio thus obtained was 89/11. The ratio a / ß was also determined on the assumption that an absorption band at 4.4 to 4.9 ppm with the ß bonds of the sac

20 20th

25 25th

charids und eine Absorptionsbande bei 4,9 bis 6,0 ppm mit dessen a-Bindungen zusammenhängt. Der so bestimmte Verhältniswert betrug 65/35. charids and an absorption band at 4.9 to 6.0 ppm related to its a-bonds. The ratio thus determined was 65/35.

Das Molekulargewicht wurde in der Ultrazentrifuge bestimmt und die Messung im Sedimentierungsgleichgewicht mit einem künstlichen Grenzmuster und einem optischen Interferenzsystem unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Konzentration der Probe 0,3%, Lösungsmittel M/10 KCl, Temperatur 25 °C, Flüssigkeitssäule 1,7 mm und 22 000 Umdrehungen pro Minute bei einer Messdauer von 5 Stunden. Der erhaltene Wert des Molekulargewichtsmittels betrug 100000. The molecular weight was determined in the ultracentrifuge and the measurement in the sedimentation equilibrium was carried out using an artificial boundary pattern and an optical interference system under the following conditions: concentration of the sample 0.3%, solvent M / 10 KCl, temperature 25 ° C., liquid column 1.7 mm and 22,000 revolutions per minute with a measuring time of 5 hours. The average molecular weight obtained was 100,000.

Der Test der Förderung der Drogenempfindlichkeit von Bakterien, die gegen Antibiotika resistent geworden waren, wurde wie folgt durchgeführt: The test of promoting drug sensitivity of bacteria that had become resistant to antibiotics was carried out as follows:

1. Herstellung der drogenresistenten Bakterien: Proben der drogenresistenten Bakterien wurden wie oben beschrieben durch Plattenkulturen mit Konzentrationsgradienten unter Verwendung folgender Bakterienstämme durchgeführt: Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae und Pseudomonas aeruginosa. Die MIC-Werte der ursprünglichen Bakterien und der resistent gewordenen Bakterien sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt: 1. Preparation of the drug-resistant bacteria: Samples of the drug-resistant bacteria were carried out as described above by plate cultures with concentration gradients using the following bacterial strains: Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis, Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Klebsiella pneumoniae and Pseudomonas aeruginosa. The MIC values of the original bacteria and the bacteria that have become resistant are summarized in Table II below:

Tabelle!! Table!!

Bakterien bacteria

Antibiotika Antibiotics

Minimale Wachstumsinhibierungs-konzentration MIC (ng/ml) ursprünglicher resistenter Stamm Stamm Minimum growth inhibition concentration MIC (ng / ml) original resistant strain strain

Staphylococcus aureus Staphylococcus aureus

PC PC

0,025 0.025

12,5 12.5

CP CP

34 34

25 25th

TC TC

0,8 0.8

25 25th

EM EM

0,4 0.4

12,5 12.5

SM SM

1,6 1.6

100 < 100 <

Streptococcus faecalis Streptococcus faecalis

TC TC

0,4 0.4

25 25th

Escherichia coli Escherichia coli

PC PC

12,5 12.5

100< 100 <

SM SM

3,1 3.1

100 100

KM KM

6,3 6.3

200 200

CP CP

1,6 1.6

50 50

TC TC

3,1 3.1

25 25th

CER CERIUM

3,1 3.1

25 25th

EM EM

100< 100 <

Enterobacter aerogenes Enterobacter aerogenes

KM KM

3,1 3.1

100 100

Salmonella enteriditis Salmonella enteriditis

PC PC

6,3 6.3

100 < 100 <

CP CP

0,8 0.8

12,5 12.5

SM SM

25 25th

100< 100 <

TC TC

1,6 1.6

12,5 12.5

EM EM

100 < 100 <

Shigella sonnei Shigella sonnei

KM KM

3,1 3.1

50 50

Klebsiella pneumoniae Klebsiella pneumoniae

PC PC

6,3 6.3

100 < 100 <

SM SM

1,6 1.6

100 100

CP CP

0,8 0.8

25 25th

TC TC

1,6 1.6

25 25th

EM EM

12,5 12.5

100 < 100 <

Proteus mirabilis Proteus mirabilis

ABPC ABPC

0,8 0.8

25 25th

Pseudomonas aeroginosa Pseudomonas aeroginosa

CL CL

12,5 12.5

200 200

Die MIC-Werte von PC wurden mit der Annahme berechnet, dass 1667 E (Einheiten) = l mg. Die MIC-Werte von CL wurden mit der Annahme berechnet, dass 30 000 E (Einheiten) = 1 mg. The MIC values of PC were calculated on the assumption that 1667 E (units) = 1 mg. The MIC values of CL were calculated on the assumption that 30,000 U (units) = 1 mg.

2. Förderung der Drogenempfindlichkeit der resistenten Bakterien: 2. Promotion of drug sensitivity of resistant bacteria:

Zur Bestimmung der Veränderung der MIC-Werte der jeweiligen drogenresistenten Stämme bei gemeinsamer Verwendung mit der vorliegenden Substanz und verschiedenen Antibiotika (diejenigen, die zum Resistentmachen der Bäk- To determine the change in the MIC values of the respective drug-resistant strains when used together with the present substance and various antibiotics (those that make the bakery resistant

638 983 6 638 983 6

terien verwendet worden waren) wurde die vorliegende Sub- mittelt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zustanz in Mengen von 10 bis 1000 Hg/ml zum Kulturmedium sammengestellt. teries were used), the present sub-means were used. The results are summarized in the following Table III condition in amounts of 10 to 1000 Hg / ml to the culture medium.

gegeben und die MIC-Werte durch Agar-Plattenmethode erTabelle III given and the MIC values by agar plate method erTable III

resistenter Bakterienstamm Antibiotikum Konzentration Minimale Wachstumsinhibie- resistant bacterial strain antibiotic concentration minimal growth inhibition

der Substanz rungskonzentration (ng/ml) Hg/ml) kein Zusatz** Zusatz* the substance concentration (ng / ml) Hg / ml) no additive ** additive *

Staphylococcus aureus PC-resistant CP-resistant TC-resistant EM-resistant Staphylococcus aureus PC-resistant CP-resistant TC-resistant EM-resistant

Streptococcus faecalis TC-resistant Streptococcus faecalis TC-resistant

Escherichia coli SM-resistant KM-resistant CP-resistant TC-resistant CER-resistant Escherichia coli SM-resistant KM-resistant CP-resistant TC-resistant CER-resistant

Enterobacter aerogenes KM-resistant Enterobacter aerogenes KM-resistant

Salmonella enteriditis CP-resistant TC-resistant Salmonella enteriditis CP-resistant TC-resistant

Klebsiella pneumoniae SM-resistant CP-resistant TC-resistant Klebsiella pneumoniae SM-resistant CP-resistant TC-resistant

Shigella sonnei KM-resistant Shigella sonnei KM-resistant

Proteus mirabilis ABPC-resistant Proteus mirabilis ABPC-resistant

Pseudomonas aeruginosa CL-resistant Pseudomonas aeruginosa CL-resistant

PC CP TC EM PC CP TC EM

TC TC

SM SM

KM KM

CP CP

TC TC

CER CERIUM

KM KM

CP TC CP TC

SM CP TC SM CP TC

KM KM

ABPC ABPC

CL CL

1000 100 100 1000 1000 100 100 1000

100 100

1000 1000 100 100 10 1000 1000 100 100 10

1000 1000

100 100 100 100

1000 100 100 1000 100 100

1000 1000

10 10th

1000 1000

12,5 25 25 12,5 12.5 25 25 12.5

25 25th

100 200 50 25 25 100 200 50 25 25

100 100

12,5 12,5 12.5 12.5

100 25 25 100 25 25

50 50

25 25th

200 200

1,6 1.6

6,3 3,2 6.3 3.2

3.2 3.2

6.3 6.3

25 50 12,5 6,3 12,5 25 50 12.5 6.3 12.5

12,5 12.5

3.2 3.2

6.3 6.3

25 6,3 12,5 25 6.3 12.5

12,5 12.5

100 100

Bern.: *Zusätz der Substanz zum Kulturmedium Bern .: * Addition of the substance to the culture medium

**kein Zusatz der Substanz zum Kulturmedium ** no addition of the substance to the culture medium

Beispiel 2 Example 2

Ein therapeutischer Test für Infektionskrankheiten wurde an fünf Gruppen von männlichen Mäusen (ICR-JCL-Stamm, 10 Tiere pro Gruppe, Körpergewicht 22+1 g) durchgeführt. Penicillin G-resistentes Staphylococcus aureus wurde wie in Beispiel 1 hergestellt. Die gegen Penicillin G resistenten Staphylococcus aureus-Bakterien waren ursprünglich in einem Tryptosoya-Agarmedium (Nippon Eiyo Kaga-ku Co., Ltd.) 18 Stunden bei 37 °C gezüchtet worden und wurden dann in einer Tryptosoya-Bouillon (Nippon Eiyo Kagaku Co., Ltd.) suspendiert, die 5% Mucin enthielt. Jeweils 0,25 ml dieser Suspension wurden intraperitoneal an die Mäuse verabreicht. Das kontrollierte Inokulat enthielt 5 x 10® Zellen pro Maus. Zwei Stunden nach dem Inokulieren wurde Penicillin G intraperitoneal mit einer Dosierung von 2,5 x 104E/kgbzw. 5 x 104E/kg(E = Einheit) verabreicht. Die gemäss Beispiel 1 erhaltene Substanz wurde ebenfalls intraperitoneal in einer Dosierung von 100 mg/kg (Körpergewicht der Maus) verabreicht. Die so behandelten Versuchstiere wurden täglich während 7 Tagen nach der Verabreichung zur Bestimmung der Überlebensrate beobachtet. A therapeutic test for infectious diseases was carried out on five groups of male mice (ICR-JCL strain, 10 animals per group, body weight 22 + 1 g). Penicillin G-resistant Staphylococcus aureus was produced as in Example 1. The Penicillin G resistant Staphylococcus aureus bacteria were originally grown in a tryptosoya agar medium (Nippon Eiyo Kaga-ku Co., Ltd.) for 18 hours at 37 ° C and were then in a tryptosoya broth (Nippon Eiyo Kagaku Co. , Ltd.) containing 5% mucin. 0.25 ml of this suspension was administered intraperitoneally to the mice. The controlled inoculate contained 5 x 10® cells per mouse. Two hours after inoculation, penicillin G was administered intraperitoneally at a dose of 2.5 x 104 U / kg or 5 x 104U / kg (E = unit) administered. The substance obtained according to Example 1 was also administered intraperitoneally in a dosage of 100 mg / kg (body weight of the mouse). The experimental animals treated in this way were observed daily for 7 days after the administration to determine the survival rate.

Die Ergebnisse sind in Fig. 3 zusammengestellt und zeigen, dass die kombinierte Verwendung der Substanz, dem Stick-50 stoff enthaltenden Polysaccharid (NP), die Behandlungswirkungen von Penicillin G verbessern und dabei die Empfindlichkeit der resistenten Bakterien in vivo gegen Penicillin G erhöhen kann. The results are summarized in FIG. 3 and show that the combined use of the substance, the nitrogen-containing polysaccharide (NP), can improve the treatment effects of penicillin G and thereby increase the sensitivity of the resistant bacteria to penicillin G in vivo.

Beispiel 3 Example 3

ss Ein ähnlicher therapeutischer Test für Infektionskrankheiten wurde mit 5 Gruppen männlicher Mäuse (ICR-JCL, Körpergewicht 22+1 g, 10 Mäuse pro Versuchsgruppe) unter Verwendung von gegen Tetracyclin resistenten Escherichia coli und der gemäss Beispiel 1 hergestellten Substanz 60 durchgeführt. Jeder Maus wurden 0,25 ml Suspension in Tryptosoya-Bouillon (s. Beispiel 2) mit Zusatz von 5% Mucin der gemäss Beispiel 1 erhaltenen tetracyclinresistenten Bakterien intraperitoneal verabreicht. Das Inokulat enthielt 5 x 108 Zellen pro Maus. Zwei Stunden nach der Verabrei-65 chung wurde Tetracyclin oral in einer Dosis von 80 mg/kg (Körpergewicht der Maus) bzw. 160 mg/kg bei gleichzeitiger oraler Verabreichung der Substanz in einer Dosierung von 100 mg/kg gegeben. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 anhand A similar therapeutic test for infectious diseases was carried out with 5 groups of male mice (ICR-JCL, body weight 22 + 1 g, 10 mice per test group) using Escherichia coli resistant to tetracycline and substance 60 prepared according to Example 1. Each mouse was given 0.25 ml suspension in tryptosoya broth (see Example 2) with the addition of 5% mucin of the tetracycline-resistant bacteria obtained according to Example 1 intraperitoneally. The inoculate contained 5 x 108 cells per mouse. Two hours after the administration, tetracycline was administered orally in a dose of 80 mg / kg (mouse body weight) or 160 mg / kg with simultaneous oral administration of the substance in a dose of 100 mg / kg. The results are shown in Fig. 4

der Überlebensrate bei 7tägiger Beobachtungsdauer nach der Verabreichung dargestellt. Es zeigt sich, dass die kombinierte Verwendung der Substanz mit Tetracyclin einen wesentlich höheren Behandlungseffekt bietet als die Verwendung von Tetracyclin allein. Da bei oraler und bei intraperitonealer Verabreichung der Substanz gleiche Effekte erzielt werden können, bietet die Substanz zusätzlich zu ihrer hohen Wirksamkeit auch eine verbreiterte Anwendbarkeit. the survival rate at a 7-day observation period after administration. It turns out that the combined use of the substance with tetracycline offers a significantly higher treatment effect than the use of tetracycline alone. Since the same effects can be achieved with oral and intraperitoneal administration of the substance, in addition to its high effectiveness, the substance also offers a widened applicability.

Beispiel 4 Example 4

Mäuse wurden mit Penicillin G-resistenten Bakterien vom Stamm Staphylococcus aureus in Mengen von 5 x 108 Zellen pro Maus inokuliert, und zwar in 5 Gruppen (10 Mäuse pro Gruppe) ICR-JCL-Mäuse (männlich, 22 +1 g Körpergewicht) nach der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsweise mit nachfolgender intraperitonealer Verabreichung von 2,5 x IO4 E/kg Penicillin G und Verabreichung von jeweils 1,10,100,1000 mg/kg der Substanz von Beispiel 1 an 4 Gruppen der Versuchstiere. Die Tiere wurden 7 Tage nach der Verabreichung täglich beobachtet, und die Ergebnisse sind in Fig. 5 zusammengestellt. Mice were inoculated with Penicillin G-resistant bacteria from the Staphylococcus aureus strain in amounts of 5 x 108 cells per mouse, in 5 groups (10 mice per group) ICR-JCL mice (male, 22 +1 g body weight) after the Procedure described in Example 2 with subsequent intraperitoneal administration of 2.5 x IO4 U / kg penicillin G and administration of 1.10, 100.1000 mg / kg of the substance from Example 1 to 4 groups of the test animals. The animals were observed daily for 7 days after administration and the results are summarized in FIG. 5.

Ein ähnlicher therapeutischer Test für Infektionskrankheiten wurde mit sechs Gruppen von Versuchstieren (männliche Mäuse ICR-JCL, je 10 Tiere pro Gruppe) durchgeführt. Jedes Tier wurde nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode mit 5 x 108 Zellen von gegen Tetracyclin resistenten Escherichia coli inokuliert. Zwei Stunden nach der Inokulation wurden den Mäusen jeweils 80 mg/kg (Körpergewicht der Maus) Tetracyclin bei gleichzeitiger oraler Verabreichung der erfindungsgemäss verwendeten Substanz von Beispiel 1 in Dosen von jeweils Null, 10,100,1000 bzw. 10 000 mg/kg gegeben, wobei die sechste Versuchstiergruppe als Kontrollgruppe diente. Die Versuchstiere wurden täglich während sieben Tage beobachtet. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 wiedergegeben. A similar therapeutic test for infectious diseases was carried out on six groups of experimental animals (male mice ICR-JCL, 10 animals per group). Each animal was inoculated with 5 x 108 cells of tetracycline-resistant Escherichia coli by the method described in Example 3. Two hours after the inoculation, the mice were given 80 mg / kg (mouse body weight) of tetracycline with simultaneous oral administration of the substance of Example 1 used according to the invention in doses of zero, 10, 100, 1000 and 10,000 mg / kg, respectively, the sixth experimental animal group served as a control group. The experimental animals were observed daily for seven days. The results are shown in FIG. 6.

Beispiel 6 Example 6

Coriolus hirsutus (Fr.) Quél (Ferm. Res. Inst., Hinterlegungsnummer FERM-P 2711) des Stammes CM-151 wie in Beispiel 1 gezüchtet, dann extrahiert und zur Gewinnung von 17,5 pulverförmiger Substanz gereinigt. Die Eigenschaften dieser Substanz, bestimmt nach den in Beispiel 1 angegebenen Methoden, sind wie folgt. Coriolus hirsutus (Fr.) Quél (Ferm. Res. Inst., Accession number FERM-P 2711) of strain CM-151 grown as in Example 1, then extracted and purified to obtain 17.5 powdery substance. The properties of this substance, determined by the methods given in Example 1, are as follows.

1. Elementaranalyse: 43,7% C, 6,4% H, 5,5% N. 1. Elemental analysis: 43.7% C, 6.4% H, 5.5% N.

2. Spezifische Drehung: [a]D2 5 = +30° 2. Specific rotation: [a] D2 5 = + 30 °

3. Saccharid-Zusammensetzung: 79% Glucose, 15% Mannose, 2% Xylose, 4% Galactose und Spuren von Fuco-se. 3. Saccharide composition: 79% glucose, 15% mannose, 2% xylose, 4% galactose and traces of fucose.

4. Proteingehalt: 33% 4. Protein content: 33%

5. Anteil der Saccharidbindungen (ß/a): 71/29 5. Proportion of saccharide bonds (ß / a): 71/29

6. Molekulargewichtsmittel: 95 000 6. Average molecular weight: 95,000

638 983 638 983

7. Zusammensetzung des Proteinanteils: 15% Aspartinsäure, 9% Threonin, 5% Serin, 14% Glutaminsäure, 6% Prolin, 9ö° Glycin, 9% Alanin, 7% Valin, 1% Methionin, 5% Isoleucin, 6% Leucin, 2% Tryptophan, 4% Phenylalanin, 2 g Lysin, 3% Alginin, 2% Ammoniak, 1" N-Glucos-amin und Spuren von Cystin, Tyrosin und Histidin. 7. Composition of the protein content: 15% aspartic acid, 9% threonine, 5% serine, 14% glutamic acid, 6% proline, 9 ° glycine, 9% alanine, 7% valine, 1% methionine, 5% isoleucine, 6% leucine, 2% tryptophan, 4% phenylalanine, 2 g lysine, 3% alginine, 2% ammonia, 1 "N-glucose amine and traces of cystine, tyrosine and histidine.

Mit dieser Substanz wurde folgender Versuch durchgeführt: Gegen Chloramphenicol resistente Salmonella enteri-tidis wurden wie in Beispiel 1 gezüchtet. 0,25 ml der Suspension dieser Bakterien in Tryptosoya-Bouillon (s. Beispiel 2) mit 0,5% Mucinzusatz wurden den Mäusen von 5 Gruppen (10 Mäuse pro Gruppe) intraperitoneal verabreicht. Das Inokulat enthielt 1 x 108 Zellen pro Maus. 25 Stunden nach der Verabreichung wurden 50 mg/kg Chloramphenicol intraperitoneal gegeben. Einer Versuchtstiergruppe wurden ausserdem 500 mg/kg der Substanz oral gegeben. Die Überlebensrate 5 Tage nach der Verabreichung betrug bei der nur mit Chloramphenicol behandelten Gruppe 40%, dagegen 80% bei der Gruppe, der das Antibiotikum in Kombination mit der vorliegenden Substanz verabreicht worden war. The following experiment was carried out with this substance: Salmonella enteritidis resistant to chloramphenicol were grown as in Example 1. 0.25 ml of the suspension of these bacteria in tryptosoya broth (see Example 2) with 0.5% mucin addition was administered intraperitoneally to the mice of 5 groups (10 mice per group). The inoculate contained 1 x 108 cells per mouse. 25 hours after the administration, 50 mg / kg of chloramphenicol was given intraperitoneally. A group of experimental animals was also given 500 mg / kg of the substance orally. The survival rate 5 days after the administration was 40% in the group treated only with chloramphenicol, whereas it was 80% in the group to which the antibiotic was administered in combination with the present substance.

Beispiel 7 Example 7

Streptomycinresistente Klebsiella pneumoniae, erhalten gemäss Beispiel 1, wurden in Form von 0,25 ml einer dieser Bakterien enthaltenden Tryptosoya-Bouillon (s. Beispiel 2), die 5% Mucin enthielt, zur Inokulation der Mäuse von zwei aus jeweils 10 Tieren bestehenden Gruppen in einer Dosierung von 1 x 10® Zellen pro Maus verwendet. Drei Stunden nach dem Inokulieren wurden 100 mg/kg Streptomycin intraperitoneal gegeben. Einer Versuchstiergruppe wurde ausserdem 120 mg/kg der gemäss Beispiel 6 hergestellten Substanz intraperitoneal gegeben. Die Überlebensrate sechs Tage nach der Verabreichung betrug bei der nur mit Streptomycin behandelten Gruppe 50%, dagegen 80% bei der ausser mit Streptomycin auch mit der vorliegenden Substanz behandelten Gruppe. Streptomycin-resistant Klebsiella pneumoniae, obtained according to Example 1, were in the form of 0.25 ml of a tryptosoya broth (see Example 2) containing these bacteria, which contained 5% mucin, for inoculating the mice of two groups of 10 animals each a dosage of 1 x 10® cells per mouse was used. Three hours after inoculation, 100 mg / kg streptomycin was given intraperitoneally. A group of experimental animals was also given 120 mg / kg of the substance prepared according to Example 6 intraperitoneally. The survival rate six days after administration was 50% in the group treated only with streptomycin, but 80% in the group treated with the present substance in addition to streptomycin.

Beispiel 8 Example 8

0,25 ml einer Suspension der gemäss Beispiel 1 gezüchteten colistinresistenten Pseudomonas aeruginosa in Tryptosoya-Bouillon (s. Beispiel 2, mit Zusatz von 5% Mucin) wurden den Tieren von zwei Gruppen männlicher Mäuse (Stamm ICR-JCL, Körpergewicht 22+1 g, 10 Mäuse pro Gruppe) in einer Dosis von 1 x 108 Zellen pro Maus intraperitoneal verabreicht. Zwei Stunden danach wurden den Mäusen 190 mg/kg (1 ng = 30 Einheiten) Colistin intraperitoneal verabreicht. Die gemäss Beispiel 6 erhaltene Substanz wurde der einen Versuchstiergrappe in einer Dosis von 1500 mg/kg oral gegeben. Die Überlebensrate sechs Tage nach der Verabreichung betrug bei der nur mit Colistin behandelten Gruppe 40%, dagegen 70% bei der Gruppe, die zusätzlich mit der vorliegenden Substanz behandelt worden war. 0.25 ml of a suspension of the colistin-resistant Pseudomonas aeruginosa grown in Example 1 in Tryptosoya broth (see Example 2, with the addition of 5% mucin) was given to the animals by two groups of male mice (strain ICR-JCL, body weight 22 + 1 g , 10 mice per group) administered intraperitoneally in a dose of 1 x 108 cells per mouse. Two hours later, the mice were given 190 mg / kg (1 ng = 30 units) colistin intraperitoneally. The substance obtained according to Example 6 was orally given to one group of experimental animals in a dose of 1500 mg / kg. The survival rate six days after administration was 40% in the group treated with colistin only, compared to 70% in the group who had also been treated with the present substance.

7 7

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10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

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S S

2 Blatt Zeichnungen 2 sheets of drawings

Claims

638 983 2 PATENT CLAIMS

1. Means for promoting the drug sensitivity of bacteria which have become resistant to antibiotics, characterized in that it consists at least partially of a nitrogen-containing polysaccharide which can be obtained by extracting mycelia from Basidiomycetes of the strain Coriolus of the Polyporaceae with an aqueous solvent, a molecular weight of 5000 to 300,000, determined by ultracentrifugation, contains 42.0 to 46.0% carbon, 5.3 to 7.0% hydrogen and 0.5 to 8.0% nitrogen, a specific rotatory power from zero to + 50 , 0 °, is readily soluble in water, but is insoluble in acetone, pyridine, chloroform and hexane and shows a characteristic absorption at 840 cm "1 and 890 cm-1 in the infrared absorption spectrum, the ratio of the saccharide content to the protein content of the polysaccharide according to the nuclear magnetic resonance spectrum is 62/38 to 97/3.

2. Composition according to claim 1, characterized in that it also contains at least one of the following antibiotics: streptomycin, chloramphenicol, penicillin G, Kan-amycin, aminobenzylpenicillin, tetracycline, erythromycin, cephaloridine or colistin.

Advances in chemotherapy, and in particular the use of a variety of antibiotics, have led to a drastic reduction in bacterial infectious diseases such as tuberculosis, dysentery, etc., and the magnitude of the contribution of these substances to the improvement of general health can hardly be estimated. On the other hand, these advances have led to a rapid increase in drug-resistant bacteria, i.e. Bacteria that are practically insensitive to the known chemotherapy drugs. To make matters worse, many multi-resistant bacteria, i.e. those that have become resistant to two or more different pharmaceuticals have developed from seriously pathogenic germs such as mycobacteria, shigella, staphylococci and the like. These very dangerous new pathogens are a serious problem in chemotherapy for infectious diseases.

Antibiotic agents can therefore generally not be used for very long, and the pharmaceutical industry has to develop new antibiotics quickly and at great expense. This effort represents an economically considerable loss.

Based on this, the applicant has carried out extensive investigations into the resistance of bacteria and it has been found that the use of a certain nitrogen-containing polysaccharide together with antibiotic agents can bring about a dramatic improvement in the drug sensitivity of antibiotic-resistant germs. It has also been found that this polysaccharide can not only increase the effectiveness of antibiotics against resistant germs, but can also expand the effectiveness of the antibiotics in the sense that their long-term use is possible without a reduction in activity.