CH634106A5

CH634106A5 - Procedimento per l'ossidazione selettiva del progesterone mediante microorganismi.

Info

Publication number: CH634106A5
Application number: CH213582A
Authority: CH
Inventors: Pasquale Zaffaroni; Vincenza Vitobello; Anna Maria Gamalerio
Original assignee: Snam Progetti
Priority date: 1976-05-18
Filing date: 1982-04-07
Publication date: 1983-01-14
Also published as: FR2391276B1; BE854814A; US4273872A; FR2391276A1; CA1093990A; NL7705537A; GB1577425A; CH634105A5; DE2722578C2; LU77359A1; DE2722578A1

Description

634106

2

RIVENDICAZIONE Procedimento per l'ossidazione selettiva del progesterone mediante microorganismi con produzione del A4-androsten--3,17-dione e del AM-androstadien-3,17-dione, caratterizzato dal fatto che per la modificazione del progesterone sono impiegati batteri dei ceppi NRRL B-ll 116, NRRL B-ll 117 e/o NRRL B-l 1 118 in medi di cultura contenenti n-paraffini C15 a C20 come sola fonte di carbonio e di energia.

Le trasformazioni microbiologiche di steroidi da lungo tempo sono sfruttate per la produzione di derivati aventi particolari attività farmacologiche o per la preparazione di intermedi utili nella produzione di questi derivati (W. Charney und W. L. Herzog-Microbial Transformations of Steroids Handbook - Academic Press, N.Y. 1967).

Queste trasformazioni vengono normalmente eseguite coltivando opportuni ceppi microbici culturali contenenti dei carboidrati e/o altri substrati complessi come fonte di C e di energia.

In queste condizioni le trasformazioni microbiologiche dei substrati steroidi non hanno una diretta relazione con il metabolismo dei ceppi microbici che le eseguono, e sembrano piuttosto doversi attribuire a meccanismi di de-tossificazione (A. Capek. O. Hanc and M. Tadra - Microbial transformations of Steroids - Academia, Praha 1966 pagg. 63-64).

Ora noi abbiamo trovato che le trasformazioni microbiologiche su steroidi di maggiore importanza industriale (idrossi-1 azione, deidrogenazione, demolizione della catena laterale) possono essere favorite usando idrocarburi piuttosto che carboidrati nei terreni di cultura.

I ceppi microbici utilizzati nella realizzazione della presente invenzione erano stati isolati da campioni di diversa origine (suolo, acqua di scarico) di solito prelevati in vicinanza di raffinerie o di impianti petrolchimici.

Con questi campioni venivano inoculate delle culture di arricchimento, contenenti miscele di idrocarburi come unica fonte di C e di energia. I ceppi venivano purificati seguendo i normali procedimento microbiologici. I ceppi isolati venivano mantenuti su slant di agar PS (Tabella I).

TABELLA I Composizione dei terreni di cultura (g/l)

Terreno

PS (mante

AM 3

M9-YE

nimento)

(precultura)

(cultura)

Peptone

6

5

—

Autolisato di lievito

3

—

Idrolizzato di caseina

4

—

Estratto di carne

1,5

—

Estratto di lievito

—

1,5

0,1

Glucosio

—

1

—

NaCl

—

3,5

0,5

NH4C1

—

1

MgS04 • 7 H20

—

0,2

kh2po4

—

1,32

3

k2h po4

—

3,68

—

Na2HP04 • 12H20

—

6

Agar

25

—

pH

7,3

7

6,9

La fonte di C nel terreno M9-YE è specificata negli esempi.

Il procedimento per l'ossidazione selettiva del progesterone mediante microorganismi con produzione del A4-androsten--3,17-dione e del A1,4-androstadien-3,17-dione secondo l'invenzione è caratterizzato nella rivendicazione precedente. 5 Per l'esecuzione del procedimento che è oggetto della presente invenzione, dallo slant venivano inoculate delle pre-culture di terreno AM 3 (Tabella I) e con queste pre-culture venivano inoculate delle culture di terreno minimo M9-YE (Tabella I) contenente una miscela di n-paraffine C15-C20 come io unica fonte di C e di energia.

La composizione della miscela di paraffine è riportata nella Tabella II.

TABELLA II Caratteristiche della miscela di n-paraffine

DI5/4°C

0,7470

n-paraffine (% peso)

99,40

n-C13

1,0

n-Cl4

3,4

n-C15

9,7

n-C16

16,2

n-C17

19,1

n-C1B

17,3

n-Ci9

14,7

fr"C2o

11,3

n-C2i

5,2

^*^22

1,2

fl"C23

0,3

iso- e ciclo-paraffine

0,40

aromatici

0,20

Quando le culture mostravano una buona crescita, ad esse venivano aggiunte le sostanze steroidee da trasformare come sospensione, in acqua o nella miscela di n-paraffine, micronizzata mediante ultrasuoni, oppure come soluzione in un solvente organico (etanolo, acetone, dimetilformammide).

so Dopo un tempo opportuno le culture venivano estratte con un solvente immiscibile con acqua come cloroformio o acetato di etile.

Gli estratti venivano evaporati ed esaminati mediante cromatografia su strato sottile (TLC) e/o mediante gas-cro-55 matografia.

La struttura dei prodotti di modificazione degli steroidi veniva assegnata mediante confronto delle proprietà cromatografiche (TLC e gas-cromatografia) con quelle di un campione autentico e/o mediante spettrometria nell'infrarosso, 60 spettrometria di massa, risonanza magnetica nucleare.

Per stabilire che le trasformazioni osservate fossero effettivamente causate o potenziate dall'uso di idrocarburi come unica fonte di C e di energia, vennero condotte delle culture in parallelo in cui la fonte di C era costituita rispettivamente 65 da glucosio, una miscela di n-paraffine e dallo steroide senza altre fonti di C.

Le reazioni osservate in condizioni di co-ossidazione con idrocarburi sono:

3

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— demolizione della catena laterale di steroidi, come il colesterolo o il progesterone, a 17-chetosteroidi;

—■ ossidazione del gruppo -OH in C-3 di diversi steroidi a

3-CO gruppo;

— A'-deidrogenazione di diversi steroidi.

Come reazioni secondarie sono state osservate:

— riduzione del gruppo 3-CO a 3-OH;

— riduzione del gruppo 20-C0 a 20-OH;

— riduzione del doppio legame tra C-4 e C-5.

E' da notare che con questo metodo di co-ossidazione la demolizione della catena laterale avviene senza che si verifichi in notevole misura la demolizione del nucleo steroideo.

La presente invenzione è illustrata, ma non limitata, dagli esempi che seguono.

Procedimento A

Uno slant dei ceppi batterici NRRL B-ll 112, NRRL B-ll 113, NRRL B-ll 114 e NRRL B-ll 115 di 48 h di età veniva lavato con 6 mi di acqua sterile; con 2 mi della sospensione veniva inoculata una beuta di Erlenmeyer da 500 mi contenente 100 mi del terreno AM3.

Le beute di precultura venivano incubate per 24 ore a 30°C su un agitatore rotatorio (220 giri/min, 3,5 cm spostamento).

Con 2 mi delle precolture venivano inoculate altre beute dello stesso tipo, contenenti 100 mi del terreno minimo M9-YE contenenti rispettivamente l'l% v/v di n-paraffine C15-C20, l'l% p/v di glucosio o lo 0,1% p/v di colesterolo, come sospensione acquosa micronizzata.

Dopo 24 ore di incubazione nelle stesse condizioni delle preculture, alle beute contenenti n-paraffine o glucosio, venivano aggiunti 100 mg/100 di colesterolo, come sospensione micronizzata in miscela di n-paraffine o H20.

Dopo 40 ore di incubazione le culture venivano estratte con acetato di etile: gli estratti, essiccati con Na2S04 anidro, venivano evaporati a secco e portati ad un volume finale di 2 mi con etanolo assoluto.

Queste soluzioni degli estratti venivano analizzate mediante cromatografia su strato sottile: le lastre venivano eluite dapprima con pentano e quindi con una miscela costituita da cloroformio + etere etilico = 80 + 20 (v/v).

Dopo la seconda eluizione le lastre venivano spruzzate con una miscela di H2S04 conc. ed etanolo = 1 + 1 (v/v) e scaldate per 8 minuti a 110°C.

Sulle lastre, assieme al residuo di colesterolo (Rp = 0,37 macchie di colore viola) appariva una macchia più o meno intensa, color giallo oro, con RP = 0,61.

Mediante cromatografia preparativa il composto avente RP = 0,61 veniva isolato e purificato, cristallizzato da metanolo e identificato, in base allo spettro infrarosso ed allo spettro di massa, come A4-colesten-3-one.

Procedimento B

Con 2 mi di una precoltura del ceppo NRRL B-ll 115 ottenuta come nel procedimento A vennero inoculate delle beute di Erlenmeyer da 500 mi, contenenti 100 mi del terreno minimo M9-YE con l'I % v/v della miscela di n-paraf-fine C15-C20.

Dopo 24 ore di incubazione a 30°C su un agitatore rotatorio a 220 giri/min con uno spostamento di 3,5 cm, vennero aggiunti in ogni beuta 100 mg di colesterolo come soluzione di dimetilformammide.

Dopo 70 ore di ulteriore incubazione, gli estratti di brodocolture vennero esaminati mediante cromatografia su strato sottile.

Effetto della fonte di C sulla selettività nelle modificazioni microbiologiche del progesterone

E' stato condotto un esperimento come quello descritto nel procedimento A, ma usando 16 ceppi di batteri capaci di utilizzare idrocarburi come sola fonte di C e di energia ed aggiungendo progesterone invece che colesterolo.

Dall'esame degli estratti delle brodocolture mediante cromatografia su strato sottile è risultato che 7 dei ceppi esaminati, tra cui i ceppi NRRL B-ll 116 e NRRL B-ll 117 solo quando crescono alle spese della miscela di n-paraffine, sono capaci di trasformare il progesterone, mentre non lo attaccano quando crescono su glucosio.

Con 4 ceppi, come il ceppo NRRL B-ll 118 il progesterone veniva trasformato sia nelle colture su glucosio che in quelle su n-paraffine, ma nelle seconde erano presenti altri prodotti che non si formavano nelle colture su glucosio.

Sui cromatogrammi degli estratti di tutti i ceppi sono state osservate due macchie principali (oltre quella del progesterone residuo). La prima, di colore verde, avente un Rs (progesterone = 1) di 0,75, mentre la seconda, di colore arancio, mostra un Rs = 0,50.

Mediante paragone con campioni autentici, i due prodotti sono stati identificati rispettivamente come A4-androsten--3,17-dione (4-AD) e A1,4-androstadien-3,17-dione (1,4-ADD).

Esempio 1

Trasformazione del progesterone in t^-androsten-3,17-dione e ls1'4-androstadien-3,17-dione

Il ceppo batterico NRRL B-ll 116 viene coltivato come descritto nel procedimento, ma aggiungendo alle beute di coltura, dopo 24 ore dall'inoculazione, 100 mg di progesterone come sospensione nella miscela di n-paraffina C15-C20.

Mediante analisi gas-cromatografica su XE-60 degli estratti sono stati determinati quantitativamente i prodotti ottenuti, come risulta dalla Tabella I.

TABELLA I

Trasformazione del progesterone con il ceppo NRRL B-ll 116

Tempo dell'aggiunta Steroidi della brodocolutura (mg/100 cc) del progesterone .Progesterone *t-AD .1,4-ADD

0

100

—

48

8,87

28,29

37,56

72

3,8

,17,57

55,15

Come si vede, la massima resa in 4-AD è del 31% a 48 ore, mentre la massima resa in 1,4-ADD è del 61% a 72 ore.

Esempio 2

Co-ossidazione del progesterone in piccoli fermentatori

Sui cromatogrammi degli estratti delle colture in beuta, accanto ai prodotti principali (4-AD e 1,4-ADD) descritti negli esempi precedenti, erano visibili delle macchie di altri prodotti presenti in tracce.

Per poter ottenere una maggiore quantità di questi prodotti, venne condotta una prova di co-ossidazione in piccoli fermentatori da 17 litri, contenenti 10 litri del terreno M9-YE a cui erano stati addizionati 10 ml/1 della miscela di n-paraffine.

I fermentatori vennero inoculati con 200 mi di una precoltura dei ceppi NRRL B-ll 116, NRRL B-ll 117 e NRRL B-ll 118.1 fermentatori vennero incubati a 30°C, con una agitazione di 500 rpm ed una aerazione di 5 litri al minuto.

5

io

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

634106

4

Dopo 24 h di incubazione, quando la crescita dei ceppi batterici era ben avviata, ad ogni fermentatore vennero aggiunti 5 g di progesterone solido, finemente polverizzato e la incubazione venne proseguita per altre 78 ore.

L'andamento della co-ossidazione del progesterone venne seguito prelevando dei campioni delle colture, ed esaminando gli estratti mediante cromatografia su strato sottile.

Il cromatogramma dei prelievi a 24 + 78 ore è riportato nella fig. 1.

Il recupero degli steroidi dalle brodocolture venne eseguito come seque:

— alle brodocolture vennero aggiunti 2 litri di acetato di etile sotto costante agitazione

— dopo qualche minuto di agitazione il motore venne fermato e la miscela venne lasciata decantare

— la porzione superiore venne quindi trasferita in un imbuto separatore per completare la separazione delle fasi la fase inferiore venne scartata e la fase superiore venne essiccata con Na2S04 anidro

— l'acetato di etile venne allontanato mediante evaporazione sotto vuoto

— nelle n-paraffine residue si formò un precipitato, che venne recuperato per filtrazione (I precipitato) e lavato con n-pentano gelato, che venne aggiunto al filtrato.

Sistema eluente: cloroformio + etere etilico 80 + 20

Rivelatore: H2S04 50% inEtOH

Per evaporazione di questo secondo liquido di lavaggio venne recuperato un secondo precipitato costituito da steroidi senza traccia di n-paraffine.

Il recupero degli steroidi con questo metodo è risultato s pressoché totale.

Mediante cromatografia preparativa su strato sottile sono stati isolati la maggior parte dei prodotti che danno le macchie riportate nella fig. 1.

I prodotti isolati vennero identificati mediante spettro-io metria di massa, spettrometria all'infrarosso o per confronto con un campione autentico.

I risultati dell'identificazione sono riportati nella Tabella II.

I prodotti identificati sono riportati nella fig. 2 (I numeri 15 tra parentesi indicano i prodotti della fig. 1 e della Tabella II):

20

25

30

Fronte

NRRL B-ll 116

©

<D ©

©

S

<3>

NRRL B-ll 117

©

NRRL Mx St B-ll 118

35

40

45

50

55

Per recuperate gli steroidi disciolti nella miscela di n- 60 paraffine e nel n-pentano, la soluzione venne versata su una colonna del diametro di 3 cm e caricata con 100 g di gel di silice sospeso in pentano.

Quando tutta la soluzione era percolata sulla colonna,

questa venne lavata con 300 mi di n-pentano: il percolato 65 conteneva solo le n-paraffine, senza traccia di steroidi.

La colonna veniva quindi lavata con 300 mi di una miscela costituita da 80% CHC13 + 20% etanolo.

5 634106

TABELLA II Prodotti della co-ossidazione del progesterone

Macchia Colore IDENTITÀ' Metodo di identificazione Ceppi produttori

N° VIS UV (F = fluo- IR Massa NMR NRRL NRRL NRRL

rescente) 1 B-ll 116 B-ll 117 B-ll 118

1

giallo chiara

5-pregnan-3,20-dione

+

2

3

rosa verde lilla giallo (F)

+

4

giallo giallo-verde (F)

progesterone

(substrato)

5

verde giallo (F)

A4-androsten-3,17-dione

+

6

marrone chiara

A1,4-pregnadien-3,20-dione

+

(2)

+

7

arancio arancio (F)

A1,4-androstadien-3,17-dione

+

8

marrone lilla (F)

5-pregnan-3 ß-oIo-20-one

+

9

giallo giallo (F)

A4-pregnen-20ß-olo-3-one

+

10

verde giallo (F)

testosterone

+

11

giallo verde (F)

(impurezza del substrato)

12

rosa arancio

+

' +

+

13

rosa arancio

+

(1) Gli spettri IR vennero paragonati con quelli riportati in W. NEUDERT und H. RÖPKE - Steroid Spektrenatlas -Springer Verlag 1965.

(2) La macchia di questo prodotto comprende nelle prime ore dopo 'aggiunta del progesterone, ma viene in seguito coperta dalla macchia 5.

634106

6

Figura 2

Prodotti della co-ossidazione del progesterone Prodotti non identificati (2, 3, 11, 12, 13)

CH3

ch3 ?h3 c=o

CH3?H3 3C=0

Da notare il fatto che in queste condizioni di co-ossidazione con idrocarburi si verificano anche delle reazioni secondarie di riduzione al doppio legame (1,8), al carbonile in C-3 (8) e al carbonile in C-20 (9).

Esempio 3

Effetto del CSL sulla co-ossidazione del progesterone

I ceppi NRRL B-ll 117 ed NRRL B-ll 116 vennero coltivati come descritto nell'esempio 1 con la differenza che al terreno di coltura M9-YE erano stati aggiunti 5 g/1 di Corn Steep Liquor (CSL) o liquido di macerazione dal granoturco.

L'andamento delle trasformazioni venne seguito mediante cromatografie su strato sottile: in nessuna delle colture fu possibile rivelare la presenza di 4-AD nè di 1,4-ADD, ma mentre nelle colture del ceppo NRRL B-ll 117 si accumulava 5-a-pregnan-3ß-olo-20-one, in quelle del ceppo NRRL B-ll 116 si aveva la completa demolizione del progesterone senza l'accumulo di prodotti di trasformazione.

Esempio 4

Effetto della temperatura sulla co-ossidazione del progesterone

Il ceppo NRRL B-ll 116 venne coltivato come descritto 55 nell'esempio 5, con la differenza che l'incubazione delle beute venne condotta a 25° ed a 35°C.

L'esame delle colture, mediante gas-cromatografia, ha permesso di stabilire che a 35°C la demolizione della catena laterale del progesterone (P) viene inibita, per cui si ha pro-60 duzione di Ax-progesterone (A1-?) mentre a 25°C i prodotti principali sono gli stessi che erano stati trovati a 30°C e cioè A4-androsten-3,17-dione (4-AD) e A1,4-anidrostadien-3,17--dione (1,4-ADD).

I risultati dell'analisi gas-cromatografici delle brodocol-65 ture sono riportati nella Tabella III.

634106

TABELLA III

Effetto della temperatura sulla co-ossidazione del progesterone

TEMPERATURA

. 25°C steroidi (mg/100 mi) A*-P 4-AD

1,4-ADD

35°C

steroidi (mg/100 mi) A*-P 4-AD

1,4-ADD

ore dell'aggiunta del .progesterone

0 100

24 91,3

48 40,9

5,8 pi,3

0,85 25,8

100 94,6 83,3

6,3 8,6

Esempio 5

Effetto dello ione Mn++ nella co-ossidazione del progesterone

Il ceppo NRRL B-ll 116 venne coltivato a 25°C come nell'esempio precedente, con la differenza che alcune beute del terreno M9-YE, contenevano 150 g/1 di MnS04. 7H20.

•messo di stabilire che l'aggiunta di Mnrt favorisce la demolizione della catena laterale del progesterone.

20 Le concentrazioni degli steroidi nelle brodocolture contenenti MnH dopo 24 ore dall'aggiunta del progesterone erano rispettivamente:

progesterone 4-AD

L'esame delle colture mediante gas-cromatografia ha per- 2s — 1,4-ADD

72,8 16,2 8,9

mg/100 mi v