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PATENTANSFRÜCHE
1. Verfahren zur Herstellung von tertiären optisch aktiven aliphatischen Verbindungen der allgemeinen Formel
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in der einer der Reste X' und Y' gegebenenfalls verestertes Carboxy und der andere gegebenenfalls verestertes Carboxy oder gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, wobei X' und Y' voneinander verschiedene funktionelle Bedeutungen haben und ferner freie Carboxy- und Hydroxymethylgruppen miteinander unter Bildung der Gruppe -CO-O-CH2- oder -CH2-O-CO- lactonisiert sind, und falls X' alkylveräthertes Hydroxymethyl darstellt, Y' auch gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeuten kann, dadurch gekennzeichnet, dass man einen aeroben oder fakultativ aeroben Mikroorganismus, der eine in einer aliphatischen Kette zwischen CH und methyliertem C befindliche Doppelbindung hydriert,
auf eine Verbindung der allgemeinen Formel
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in der X gegebenenfalls verestertes Carboxy oder gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl und Y gegebenenfalls verestertes Carboxy, gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, wobei X und Y voneinander verschiedene funktionelle Bedeutungen haben und ferner, falls X gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeutet, Y verestertes Carboxy oder gegebenenfalls acetalisiertes Formyl darstellt und falls Y gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeutet, X verestertes Carboxy oder alkylveräthertes Hydroxymethyl darstellt, in einem wässrigen Medium einwirken lässt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die fermentative Hydrierung unter aeroben Bedingungen mit einem Mikroorganismus in nicht wachsender (stationärer) Phase durchführt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass man die fermentative Hydrierung in Gegenwart einer assimilierbaren Kohlenstoffquelle durchführt.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Kohlenstoffquelle einen Zucker in einer Menge von etwa 10 bis 100 g pro Liter wässriges Medium verwendet.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass man die fermentative Hydrierung bei einem pH-Wert von 2 bis 10, insbesondere 3 bis 8 durchführt.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass man die fermentative Hydrierung bei einer Temperatur von 20 bis 35 C durchführt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass man das Edukt der Formel I in einer Konzentration von 0,1 bis 5,0%, insbesondere 0,5 bis 2,5 %, bezogen auf das wässrige Medium, einsetzt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Ausgangsverbindung der Formel I einsetzt, in der X gegebenenfalls verestertes Carboxy und Y gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder X verestertes Carboxy und Y gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellen, und als Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae (Presshefe; Backhefe) verwendet, wobei man ein Fermentationsprodukt der Formel II erhält, in der X' gegebenenfalls verestertes Carboxy und Y/ gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, wobei freie Carboxy- und Hydroxymethylgruppen miteinander unter Bildung der Gruppe -CO-O-CH2- lactonisiert sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Ausgangsverbindung der Formel I einsetzt, in der X gegebenenfalls verestertes Carboxy und Y gegebenenfalls acetalisiertes Formyl darstellt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass man als Ausgangsverbindung der Formel I Äthyl-trans4,4-dimethoxy-3-methylcrotonat einsetzt, wobei man als Fermentationsprodukt der Formel II zur Hauptsache (S)-3 Methyl-4-hydroxy-buttersäureäthylester erhält, welcher durch saure Hydrolyse in (S)-Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanon übergeführt wird.
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von tertiären, optisch aktiven aliphatischen Verbindungen der allgemeinen Formel
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in der einer der Reste X' und Y' gegebenenfalls verestertes Carboxy und der andere gegebenenfalls verestertes Carboxy oder gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, wobei X' und Y' voneinander verschiedene funktionelle Bedeutungen haben und ferner freie Carboxy- und Hydroxymethylgruppen miteinander unter Bildung der Gruppe -COSCH2- oder -CH2-OCO lactonisiert sind, und falls X' alkylveräthertes Hydroxymethyl darstellt, Y' auch gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeuten kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man einen aeroben oder fakultativ aeroben Mikroorganismus, der eine in einer aliphatischen Kette zwischen CH und methyliertem C befindliche Doppelbindung hydriert, auf eine Verbindung der allgemeinen Formel
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in der X gegebenenfalls verestertes Carboxy oder gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl und Y gegebenenfalls verestertes Carboxy, gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, wobei X und Y voneinander verschiedene funktionelle Bedeutungen haben und ferner, falls X gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeutet, Y verestertes Carboxy oder gegebenenfalls acetalisiertes Formyl darstellt und falls Y gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeutet, X verestertes Carboxy oder alkylveräthertes Hydroxymethyl darstellt,
in einem wässrigen Medium einwirken lässt.
Das erfindungsgemässe Verfahren eröffnet einen neuen vorteilhaften Weg zu Zwischenprodukten in der Synthese von natürlichem, optisch aktivem Vitamin E, Vitamin E-Ester und Vitamin Kl, Verbindungen, welche bisher aus Naturprodukten oder durch aufwendige Synthesemethoden in unwirtschaftlicher Weise gewonnen werden mussten. Durch das neue Verfahren gemäss der Erfindung erhält man nämlich in besonders einfacher Weise teilweise neue, optisch aktive Verbindungen der Formel II, welche in vorteilhafter Weise zu den erwähnten, optisch aktiven Vitaminen aufgebaut werden können. Insgesamt stellt daher der neue Weg zu natürlichem, optisch aktivem Vitamin E, Vitamin E-Ester und Vitamin Kl, ebenso wie das erfindungsgemässe Verfahren selbst, eine wertvolle Bereicherung des Standes der Technik dar.
Die oben definierte Bedingung, dass X und Y bzw. X' und Y' voneinander verschiedene funktionelle Bedeutungen haben, ist so zu verstehen, dass einer der beiden Reste selektiv, d.h.
unter Ausschluss des anderen Restes, reagieren kann. So können X und Y bzw. X' und Y' beide gleichzeitig beispielsweise Carboxy bedeuten; desgleichen können sie nicht beide gleichzeitig verestertes Carboxy darstellen. Hingegen kann z.B.
einer der Substituenten X und Y bzw. X' und Y' Carboxy und der andere verestertes Carboxy darstellen, denn die Carboxygruppe kann selektiv zur Hydroxymethylgruppe reduziert werden (vgl. nachstehend). X und Y bzw. X' und Y' können nicht beide gleichzeitig Hydroxymethyl oder veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellen, auch nicht Kombinationen dieser Gruppen; jedoch kann einer der Substituenten X und Y bzw. X' und Y' alkylveräthertes Hydroxymethyl und der andere gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl bedeuten, denn Alkoxymethyl bleibt bei Verseifung, Halogenierung und magnesium- bzw. phosphororganischen Reaktionen im Gegensatz zu gegebenenfalls verestertem Hydroxymethyl erhalten.
Die unter der Bedeutung von X und Y bzw. X' und Y' aufgeführten, gegebenenfalls veresterten Carboxygruppen, gegebenenfalls verätherten oder veresterten Hydroxymethylgruppen bzw. acetalisierten Formylgruppen sind konventionelle Gruppen. Veresterte Carboxylreste sind beispielsweise Reste der Formel RIOOC-, in der Rl niederes Alkyl, Phenyl oder Phenyl-niederes Alkyl darstellt. Veresterte/verätherte Hydroxymethylreste sind beispielsweise Reste der Formel R20CH2-, in der R2 eine niedere Acylgruppe, z.
B. niederes Alkanoyl, Benzoyl oder Phenyl-niederes Alkanoyl, oder eine Ätherschutzgruppe, z.B. niederes Alkyl bedeutet, oder Reste der Formel R30-CHR4-, in der R3 niederes Alkyl und R4 Wasserstoff oder niederes Alkyl oder zusammen mit R3 n Butylen (2-Tetrahydropyranyl) darstellt, Acetalisierte Formylgruppen sind beispielsweise Reste der Formel
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in der Rs niederes Alkyl bedeutet, oder beide Substituenten Rs zusammen niederes Alkylen darstellen. In den Resten X und Y bzw. X' und Y' allenfalls vorhandene niedere Alkyl-, niedere Alkoxy-, niedere Alkylen- und niedere Alkanoylgruppen, allein oder in Zusammensetzungen [wie Phenyl-niederes Alkyl, Phenyl-niederes Alkanoyl, Di-(nieder-alkoxy)-methyl], stellen geradkettige oder verzweigte Gruppen dar, welche vorzugsweise bis zu 4 Kohlenstoffatome enthalten.
Beispiele sind Methyl, Äthyl, n-Propyl, Isopropyl, n-Butyl, Isobutyl, sec Butyl, t-Butyl; Methoxy, Äthoxy, n-Propoxy, Isopropoxy, n Butoxy, Isobutoxy, sec-Butoxy, t-Butoxy; Methylen, Äthylen, n-Propylen, 1-Methyl-äthylen, 1,2-Dimethyl-äthylen; Acetyl, Propionyl, n-Butyryl, Isobutyryl.
X und Y in der Bedeutung Carboxy oder Formyl sind bevorzugt verestert bzw. acetalisiert. Bevorzugte Gruppen R in veresterten Carboxygruppen RlOOC- sind Methyl und Äthyl. Bevorzugte Gruppen Rs in acetalisierten Formylgruppen
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sind Methyl und Äthyl sowie (beide Rs zusammen) Äthylen und 1,3-Propylen.
X und Y in der Bedeutung Hydroxymethyl können unsubstituiert oder veräthert bzw. verestert sein. Falls die Hydroxymethylgruppe substituiert ist, stellt der Substituent vorzugsweise Methyl, Acetyl oder Benzoyl dar.
Der erfindungsgemäss verwendete Mikroorganismus besitzt aeroben oder fakultativ aeroben Charakter, d.h. er hat die Fähigkeit, sowohl unter aeroben als auch unter anaeroben Bedingungen (fakultativ aerober Mikroorganismen) oder auch nur unter aeroben Bedingungen (aerober Mikroorganismus) zu wachsen. Durch Austesten von beliebigen aeroben oder fakultativ aeroben Hefen, Pilzen und Bakterien auf das erfindungsgemäss eingesetzte Edukt der Formel I findet man leicht einen geeigneten Mikroorganismus, der in der Lage ist, die zwischen CH und methyliertem C befindliche Doppelbindung zu hydrieren und somit im erfindungsgemässen Verfahren eingesetzt werden kann. Bevorzugt verwendbare, bekannte Mikroorganismen sind: 1) Eukaryonten 1.1. Hefen der Gattungen
Candida z. B. C. albicans C. gufflermondii
Kloeckera z. B. K. brevis
Rhodotorula z. B. R. rotundata
Saccharomyces z. B.
S. carlsbergensis
S. cerevisiae 5. cer. ellipsoides
Torulopsis z. B. T. apicola
T. rotundata 1.2. Pilze der Gattungen
Absidia z. B. A. regneri
Aspergillus z. B. A. clavatus
A. fumigatus
A. ochraceus
A. niger
Colletotrichum z. B. C. gloeosporioides
Cunninghamella z. B. C. blakesleeana Curvularia z. B. C. lunata
Geotrichum z. B. G. candidum
Gibberella z. B. G. fujikuroi
Gliocladium z. B. G. roseum
Mucor z. B. M. circinelloides
M. corymbifer
M. griseo-cyanus
M. hiemalis
M. parasiticus
M. spinosus
Penicillium z. B. P. notatum
P. novae-zeelandiae P.viride
Phycomyces z. B. P. blakesleeanus
Rhizopus z. B. R. arrhizus
R. circinans
Trichothecium z. B. T. roseum 2. Prokaryonten 2.1. Mycelbildende Bakterien (Actinomyceten) der Gattungen
Mycobacterium z. B. M. butyricum
M. rhodochrous
Streptomyces z. B.
S. fradiae
S. rimosus
Proactinomyces z. B. P. restrictus
P. roseus 2.2. Gram-positive Bakterien der Gattungen
Bacillus z. B. B. subtilis
Micrococcus z. B. M. lysodeikticus Propionibacterium z. B. P. shermanu
Pediococcus z. B. P. cerevisiae
Streptococcus z. B. S. faecalis
S. lactis 2.3. Gram-negative Bakterien der Gattungen
Azotobacter z. B. A. indicus
Pseudomonas z. B. P. fluorescens
Serratia z. B. S. marcescens
Vibrio z. B. V. metschnikovii
Bevorzugte Mikroorganismen im erfindungsgemässen Verfahren sind, wie aus den nachstehenden Ausführungen ersichtlich, Saccharomyces cerevisiae (Presshefe, Backhefe) und Geotrichum candidum. Saccharomyces cerevisiae ist als käufliche Presshefe im Handel erhältlich. Auch Geotrichum candidum ist ein bekannter Mikroorganismus, der von anerkannten Depositorien allgemein zugänglich ist.
Zur Sicherstellung der Durchführbarkeit des Verfahrens unter Verwendung von Geotrichum candidum wurde jedoch eine Kultur des verwendeten Stammes bei dem Centraalbureau voor Schimmelcultures in Baarn, Holland unter der Nummer CBS 233.76 deponiert.
Es versteht sich, dass jeder der erfindungsgemäss eingesetzten Mikroorganismen vor der Verwendung in der erfindungsgemässen Fermentation angezüchtet werden soll; die Anzucht erfolgt in der Regel in an sich bekannter Weise in einem wässrigen Medium unter Zuhilfenahme der üblichen Nährstoffe, d.h. in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle, wie Glucose, Fruc tose. Saccharose und/oder Maltose; einer Stickstoffquelle, wie Harnstoff, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren und/oder Ammoniumsalze; anorganischer Salze, wie Magnesium, Natrium-, Kalium-, Calcium und/oder Ferrosalze; anderer wachstumsfördernder Substanzen, wie Vitamine und dgl.
Manchmal ist es zweckmässig, das Anzuchtmedium ebenfalls in der erfindungsgemässen Fermentation zu verwenden, obwohl - wie nachstehend näher erläutert - die Zusammensetzung des erfindungsgemäss verwendeten Fermentationsmediums wesentlich einfacher sein kann.
Die erfindungsgemässe Fermentation ist ohne weitere Zusätze allein mit dem Edukt der Formel I und dem zu verwendenden Mikroorganismus durchführbar. Es ist jedoch vorteilhaft, dem wässrigen Medium eine assimilierbare Kohlenstoffquelle als Mikroorganismennährstoff zuzusetzen, vorzugsweise in einer Menge von etwa 10 bis 100 g pro Liter, beispielsweise in Form eines Zuckers, wie Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose und dergleichen, damit die Lebensfähigkeit und die damit verbundene Stoffwechselaktivität des Mikroorganismus möglichst lange erhalten bleiben. Mehr als 100 g Kohlenstoffquelle pro Liter Nährmedium beeinträchtigen das Endergebnis nicht, bringen jedoch keine Vorteile gegenüber dem Fall, bei dem 10 bis 100 g Kohlenstoffquelle zugesetzt werden.
Bei langen Fermentationszeiten ist es von Vorteil, die Kohlenstoffquelle in einer bevorzugten Menge von 10 bis 100 g/l einmal oder mehrmals nachzufüttern. Der Zusatz einer Stickstoffquelle ist nicht notwendig; gegebenenfalls kann aber eine assimilierbare Stickstoffquelle zugesetzt werden, vorzugsweise in einer Menge von etwa 1 bis 50 g pro Liter, beispielsweise in Form von Harnstoff, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt, Aminosäuren, Ammoniumsalzen und dgl.
Das Fermentationsmedium kann ferner auch anorganische Salze, wie Magnesium-, Natrium-, Kalium-, Calcium- und/ oder Ferrosalze, andere wachstumsfördernde Substanzen, wie Vitamine und dgl., enthalten.
Der pH-Wert der Fermentation soll vorzugsweise innerhalb des Bereiches von 2 bis 10, insbesondere 3 bis 8 liegen, ein Bereich, der zumeist ohne besondere Zusätze erreichbar ist.
Erwünschtenfalls kann der pH-Wert durch Verwendung von Puffern, z.B. Phosphat-, Phthalat- oder Trispuffern [tris (Hydroxymethyl)-aminomethan], reguliert werden. Die Temperatur kann in weitem Rahmen schwanken, z.B. zwischen 10oC und 40 C, wobei eine Temperatur von 20 bis 35oC bevorzugt ist. Um optimale Ausbeuten zu erhalten, ist es vorteilhaft, dass das Edukt der Formel I in der Gärbrühe in einer Konzentration von 0,1 bis 5,0%, insbesondere 0,5 bis 2,5%, vorliegt.
Nach erfolgter Reaktion kann erneut Edukt in einer bevorzugten Konzentration zwischen 0,2 und 1,5% zugesetzt werden. Dieses Verfahren lässt sich bis zur Inaktivierung der Mikroorganismen wiederholen. Das Substrat kann auch mit Hilfe einer Pumpe kontinuierlich zugefügt werden.
Die nützliche Fermentationszeit ist von den verwendeten Mikroorganismen abhängig. Sie schwankt bei einmaliger Eduktzugabe zumeist zwischen 4 und 250 Stunden, insbesondere zwischen 1 und 2 Tagen. Bei mehrmaliger oder kontinuierlicher Eduktzugabe kann sich die Fermentationszeit entsprechend verlängern.
Die Fermentation wird vorzugsweise aerob durchgeführt, z.B. unter Rühren, Schütteln unter Luftzutritt oder mittels einer Belüftungsvorrichtung. Zur Schaumbekämpfung können die üblichen Antischaummittel, wie Siliconöle, Polyalkylenglykol-Derivate, Sojabohnenöl und dgl., zugesetzt werden. Vorzugsweise verwendet man einen Mikroorganismus, der sich in nicht wachsender (stationärer) Phase befindet. Die Wahl eines stationären Mikroorganismus hat den Vorteil, dass der Gärvorgang nicht unter sterilen Bedingungen ausgeführt werden muss, sofern ein Nährmedium verwendet wird, das keine wesentliche Vermehrung von Mikroorganismen zulässt, beispielsweise ein Nährmedium ohne Stickstoffquelle.
Je nach der Wahl des Eduktes der Formel I und des Mikroorganismus wird dieses unterschiedlichen Umwandlungen unterworfen, d.h. man erhält verschiedene Produkte der Formel II. Das erfindungsgemässe Verfahren kann nach diesen Gesichtspunkten in fünf Untergruppen A, B, C, D und E unterteilt werden:
A) Bei Verwendung von Edukten der allgemeinen Formel
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in der XA gegebenenfalls verestertes Carboxy und YA gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder XA verestertes Carboxy und YA gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, erhält man bei Wahl geeigneter Mikroorganismen Fermationsprodukte der Formel II, in der X' gegebenenfalls verestertes Carboxy und Y' gegebenenfalls veräthertes oder verestertes Hydroxymethyl darstellt, wobei freie Carboxy- und Hydroxymethylgruppen miteinander unter Bildung der Gruppe -CO-O-CH2- lactonisiert sind.
Das lactonisierte Produkt ist das (S)-Dihydro-4-methyl-2-(3H)-furanon der Formel
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Die Fermentation bewirkt die Sättigung der Doppelbindung unter Ausbildung einer optisch einheitlichen Verbindung sowie auch die Reduktion der Formylgruppe bzw. Hydrolyse und Reduktion der acetalisierten Formylgruppe zu Hydroxymethyl.
Allfällige Substituenten an Carboxy bzw. Hydroxymethyl sind weniger leicht hydrolisierbar. Diese Gruppen können nach der Sättigung der Doppelbindung zunächst teilweise erhalten bleiben. Entsprechende Fermentationsprodukte der Formel II, die noch an Carboxy und/oder Hydroxymethyl substituiert sind, können als solche aus der Gärbrühe isoliert werden, oder sie können durch Verlängerung der Fermentationsdauer, z.B.
bis auf 3 bis 10 Tage, in das Lacton der Formel IIA übergeführt werden, indem die Substituenten an Carboxy bzw.
Hydroxymethyl gespalten werden. Das Fermentationsprodukt erfährt dabei einen Lactonringschluss unter Bildung des oben definierten Lactons der Formel IIA. Der Lactonringschluss kann ferner auch bei der Reinigung eines Fermentationsprodukts der Formel II, in der X' verestertes Carboxy und Y' Hydroxymethyl darstellt, eintreten (z.B. durch Destillation, vorzugsweise unter leicht sauren, z.B. p-toluolsulfonsauren Bedingungen). Die Spaltung der Substituenten an Carboxy bzw. Hydroxymethyl kann ebenfalls durch alkalische Verseifung erfolgen.
Falls in Formel IA YA eine alkylverätherte, z.B. methylver ätherte, Hydroxymethylgruppe darstellt, bleibt diese Alkylgruppe nach der Fermentation erhalten. Man erhält Fermentationsprodukte der Formel II, in der X' gegebenenfalls verestertes Carboxy und Y' Alkoxymethyl darstellt.
Für die Fermentation der Edukte der Formel IA wird als Mikroorganismus vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae (Presshefe, Backhefe) verwendet. Nach einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man eine Ausgangsverbindung der Formel IA, in der XA gegebenenfalls verestertes Carboxy und YA gegebenenfalls acetalisiertes Formyl darstellt. Für diese Ausführungsform können beispielsweise folgende Mikroorganismen verwendet werden: 1. Eukaryonten 1.1. Hefen der Gattungen
Candida z. B. C. utilis
Kloeckera z. B. K. brevis
Saccharomyces z. B. S. carlsbergensis
S. cerevisiae
S. cer. ellipsoides
Torulopsis z. B. T. apicola 1.2. Pilze der Gattungen
Absidia z. B. A. regneri
Aspergillus z. B. A. niger
Colletotrichum z. B. C. gloeosporioides
Cunninghamella z. B. C. blakesleeana
Gibberella z. B. G. fujikuroi
Gliocladium z. B.
G. roseum
Mucor z. B. M. circinelloides
M. griseo-cyanus
M. parasiticus
Penicillium z. B. P. novae-zeelandiae
Phycomyces z. B. P. blakesleeanus
Rhizopus z. B. R. arrhizus
R. circinans
Trichothecium z. B. T. roseum 2. Prokaryonten 2.1. Mycelbildende Bakterien (Actinomyceten) der Gattung
Mycobacterium z. B. M. butyricum 2.3. Gram-negative Bakterien der Gattung
Azotobacter z. B. A. indicus
Gemäss einem besonders bevorzugten Verfahren verwendet man als Ausgangsverbindung der Formel I Äthyl-trans-4,4dimethoxy-3-methylcrotonat und als Mikroorganismus Saccharomyces cerevisiae, wobei als Fermentationsprodukt der Formel II vornehmlich (S)-3-Methyl-4-hydroxy-buttersäureäthylester erhalten wird. Die saure Hydrolyse dieser Verbindung in der oben beschriebenen Weise liefert das (S)-Dihydro-4methyl-2(3H)-furanon.
B) Bei Verwendung von Edukten der allgemeinen Formel
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in der einer der Reste XB und YB Carboxy und der andere verestertes Carboxy darstellt, erhält man bei Wahl geeigneter Mikroorganismen Fermentationsprodukte der Formel II, worin einer der Reste X' und Y' Carboxy und der andere verestertes Carboxy darstellt. Es wird somit lediglich die stereospezifische Sättigung der Doppelbindung bewirkt. Als Mikroorganismus für diese Umsetzung verwendet man vorzugsweise Saccharomyces cerevisiae. Als Ausgangsverbindung der Formel IB verwendet man insbesondere eine Verbindung, worin XB verestertes Carboxy und YB Carboxy darstellt.
C) Bei Verwendung von Edukten der allgemeinen Formel
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in der Xc verestertes Carboxy und Yc gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl darstellt, kann bei Einsatz geeigneter Mikroorganismen zusätzlich zur stereospezifischen Sättigung der Doppelbindung eine Oxidation bzw. Hydrolyse und Oxidation der gegebenenfalls acetalisierten Formylgruppe oder der gegebenenfalls veresterten Hydroxymethylgruppe eintreten. Man erhält in diesem Falle Fermentationsprodukte der Formel II, worin X' verestertes Carboxy und Y' Carboxy darstellt. Diese Umsetzung wird vorzugsweise von dem Pilz Geotrichum candidum ausgelöst.
D) Bei Verwendung von Edukten der allgemeinen Formel
EMI5.2
in der XD gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl und YD gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder verestertes Carboxy darstellt, erhält man bei Wahl geeigneter Mikroorganismen Fermentationsprodukte der Formel II, worin X' gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl und Y' gegebenenfalls verestertes Carboxy darstellt, wobei freie Carboxy- und Hydroxymethylgruppen miteinander unter Bildung der Gruppe -CH2-O CO- lactonisieren. Das lactonisierte Produkt ist das (S)-Dihydro-3-methyl-2(3H)-furanon der Formel
EMI5.3
Somit wird einerseits eine stereospezifische Sättigung der Doppelbindung bewirkt, andererseits werden vorhandene, gegebenenfalls acetalisierte Formylgruppen einer Oxidation bzw. einer Hydrolyse und Oxidation unterworfen.
Die gegebenenfalls vorhandenen Substituenten an Hydroxymethyl bzw. Carboxy sind, wie auch bei der Untergruppe A) oben, weniger leicht hydrolysierbar als die Substituenten an Formyl und können nach der Sättigung der Doppelbindung zunächst teilweise erhalten bleiben. Sie können durch Verlängerung der Fermentation gespalten werden, wobei das Lacton der Formel IID erhalten wird.
Vorzugsweise wird für diese Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens als Mikroorganismus der Pilz Geotrichum candidum verwendet. Nach einer bevorzugten Ausführungsform verwendet man eine Ausgangsverbindung der Formel ID, in der XD gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl (vorzugsweise freies Hydroxymethyl) und YE gegebenenfalls acetalisiertes Formyl (vorzugsweise acetalisiertes Formyl) darstellt. Für diese Ausführungsform können beispielsweise folgende Mikroorganismen verwendet werden: 1. Eukaryonten 1.1. Hefen der Gattungen
Candida z. B. C. albicans
C. guillermondii
Rhodotorula z. B. R. rotundata
Saccharomyces z. B. S. cerevisiae
Torulopsis z. B. T. apicola
T. rotundata 1.2. Pilze der Gattungen
Aspergillus z. B. A. clavatus
A. fischeri
A. flavus
A. fumigatus
A. ochraceus Weniger
Curvularia z. B. C. lunata
Cylindrocarpon z. B.
C. radicicola
Mucor z. B. M. corymbifer
M. griseo-cyanus
M. hiemalis
M. parasiticus
M. spinosus Penicfflium z. B. P. notatum
P. viride
Rhizopus z. B. R. arrhizus
R. circinans
Absidia z. B. A. regneri
Geotrichum z. B. G. candidum
Gibberella z. B. Gibberella fujikuroi
Gliocladium z. B. G. roseum
Phycomyces z. B. P. blakesleeanus 2. Prokaryonten 2.1. Mycelbildende Bakterien (Actinomyceten) der Gattungen
Mycobacterium z. B. M. butyricum
M. rhodochrous
Streptomyces z. B. 5. fradiae
S. rimosus
Proactinomyces z. B. P. restrictus
P. roseus 2.2. Gram-positive Bakterien der Gattungen
Bacillus z. B. B. subtilis
Micrococcus z. B. M. lysodeikticus Propionibacterium z. B. P. shermanii
Pediococcus z. B. P. cerevisiae
Streptococcus z. B. S. faecalis
S. lactis 2.3.
Gram-negative Bakterien der Gattungen
Pseudomonas z. B. P. fluorencens
Serratia z. B. S. marcescens
Vibrio z. B. V. metschnikovü -Gemäss einem besonders bevorzugten Verfahren verwendet man als Ausgangsverbindung der Formel I trans-3-(1,3-Dioxolan-2-yl)-2-buten-1-ol und als Mikroorganismus Geotrichum candidum, wobei als Fermentationsprodukt das (S)-Dihydro3-methyl-2(3H)-furanon der Formel IID erhalten wird.
Falls in Formel ID XD gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl und YD verestertes Carboxy darstellt, liefert Geotrichum candidum ebenfalls das oben angegebene Endprodukt, jedoch werden durch Verwendung von Saccharomyces cerevisiae höhere Ausbeuten erhalten.
E) Bei Verwendung von Edukten der allgemeinen Formel
EMI6.1
in der XE alkylveräthertes Hydroxymethyl und YE gegebenenfalls acetalisiertes Formyl oder gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl darstellt, erhält man bei Wahl geeigneter Mikroorganismen Fermentationsprodukte der Formel II, worin X' alkylveräthertes Hydroxymethyl und Y' Carboxy oder gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl darstellt. Charakteristisch für diese Eduktgruppe ist, dass die Alkoxymethylgruppe XE während der Fermentation unverändert bleibt.
Mit Saccharomyces cerevisiae erzielt man beispielsweise hauptsächlich eine Reduktion bzw. Hydrolyse und Reduktion der gegebenenfalls acetalisierten Formylgruppe YE ZU Hydroxymethyl, während veresterte Hydroxymethylgruppen YE zum Teil hydrolysiert werden können und Hydroxymethylgruppen YE unverändert bleiben. Mit Geotrichum candidum wird bevorzugt eine Oxidation bzw. Hydrolyse und Oxidation der gegebenenfalls acetalisierten Formylgruppe sowie auch der gegebenenfalls veresterten Hydroxymethylgruppe YE in Carboxy bewirkt.
Nach Beendigung des Kultivierens wird das Fermentationsprodukt in üblicher Weise aus der Gärbrühe isoliert. Vorzugsweise kommt eine Extraktion mit einem nicht wasserlöslichen organischen Lösungsmittel in Betracht, beispielsweise mit einem aliphatischen oder cycloaliphatischen, gegebenenfalls chlorierten Kohlenwasserstoff, wie n-Hexan, Cyclohexan, Methylenchlorid, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff; einem aliphatischen Ester, wie Äthylacetat, n-Butylacetat, Amylacetat; oder einem aliphatischen Äther, wie Diäthyläther oder Diisopropyläther. Ein bevorzugtes Lösungsmittel ist Methylenchlorid. Zur Vermeidung von Emulsionen wird die Extraktion zweckmässig kontinuierlich, oder mit Hilfe der multiplikativen Verteilung durchgeführt.
Nach einer bevorzugten Isolierungsmethode wird die fermentierte Brühe zunächst filtriert oder zentrifugiert, wonach die wässrige Phase und das Sediment getrennt aufgearbeitet werden. Das erhaltene Rohprodukt kann in üblicher Weise, z.B. durch fraktionierte Destillation, gereinigt werden. Wie bereits erwähnt, können erhaltene offene Zwischenprodukte der Formel II (mit Ausnahme der Alkyläther) während der Aufarbeitung in das entsprechende Lacton der Formel IIA bzw. IID übergehen.
Das erhaltene Produkt der Formel II kann in optisch aktives Vitamin E oder K1 übergeführt werden, beispielsweise wie folgt:
Estergruppen an Hydroxymethyl bzw. an Carboxy können hydrolytisch, vorzugsweise durch basische Hydrolyse, abgespalten werden. Man erhält das entsprechende Lacton. Zwecks Erhalts von optisch reinem Lacton werden vorzugsweise solche Ester für die Hydrolyse eingesetzt, die zum Lacton der Formel IIA führen.
Fermentationsprodukte der Formel II, in der einer der Reste X' und Y' Carboxy und der andere verestertes Carboxy darstellt, (Untergruppe B oben) können chemisch selektiv reduziert werden, wobei die freie Carboxygruppe in Hydroxymethyl umgewandelt wird. Diese Reduktion erfolgt z.B. durch Behandeln mit einem Borhydrid/Dimethylsulfidkomplex, vorzugsweise in einem ätherischen Lösungsmittel, wie Tetrahydrofuran, und bei einer Temperatur von etwa -10oC bis Zimmertemperatur. Die Carboxyschutzgruppe kann in an sich bekannter Weise abgespalten werden, wobei man das Lacton der Formel IIA bzw. IID erhält. Vorzugsweise wird die selektive Reduktion an einem Fermentationsprodukt der Formel II, worin X' verestertes Carboxy und Y' Carboxy darstellt, ausgeführt; man erhält dabei das Lacton der Formel IIA.
Die Lactone der Formeln IIA und IID können gemäss folgendem Reaktionsschema in natürliches, optisch aktives Vitamin E, in optisch aktiven Vitamin E-Ester und in optisch aktives Vitamin Kl übergeführt werden:
EMI6.2
EMI7.1
EMI8.1
(Vitamin E bzw. dessen Ester)
EMI8.2
EMI9.1
(Vitamin K1 )
Im obigen Reaktionsschema bedeutet R6 eine Carboxylschutzgruppe, vorzugsweise niederes Alkyl, z.B. Methyl oder Äthyl; R7 eine carbonylfreie, durch saure Hydrolyse abspaltbare Schutzgruppe, vorzugsweise 2-Tetrahydropyranyl; Rs Wasserstoff oder niederes Alkanoyl, z. B. Acetyl; Rs niederes Alkyl, z.B. Methyl oder Äthyl; Rlo die Gruppe
EMI10.1
Rll niederes Alkyl, z.B. Methyl oder Äthyl; R12 Wasserstoff oder niederes Aryl, z.B.
Acetyl oder Benzoyl und Hal ein Halogenatom, z.B. Chlor, Brom oder Jod.
Die Umsetzungen IIAIII und IIDeVIII erfolgen durch Behandeln mit Halogenwasserstoff, vorzugsweise Chlor- oder Bromwasserstoff, in einem zur Einführung der Schutzgruppe R6 entsprechenden Alkohol, z.B. in einem niederen Alkanol, wie Methanol oder Äthanol. Es können anstelle der Lactone IIA und IID auch die entsprechenden offenen Fermentationsprodukte der Formel II angewendet werden, worin einer der Substituenten Xl und Y' verestertes Carboxy und der andere Hydroxymethyl darstellt.
Die Estergruppe von Verbindungen III wird reduktiv in Hydroxymethyl unter Bildung von Verbindungen IV umgewandelt. Die Reduktion erfolgt z.B. bei -20 bis OoC in einem inerten organischen Lösungsmittel mit einer aluminiumorganischen Verbindung, z.B. mit einem ss-verzweigten Aluminiumdi-niederalkylhydrid, wie Di-Isobutylaluminiumhydrid oder auch mit Lithiumaluminiumhydrid.
Durch mildere Reduktion der Estergruppe in Verbindungen VIII wird diese in die Aldehydgruppe unter Bildung von Verbindungen IX umgewandelt, beispielsweise durch Behandeln mit einem ss-verzweigten Aluminium-di-nieder-alkyl-hydrid, wie Di-isobutyl-aluminiumhydrid bei -80 bis -400C.
Die Hydroxygruppe von Verbindungen IV wird unter Bildung von Verbindungen V durch eine säurehydrolytisch abspaltbare Schutzgruppe R7 geschützt. Die Einführung dieser Schutzgruppen erfolgt z.B. durch Behandeln mit der entsprechenden olefinischen Verbindung, z.B. mit 3,4-Dihydro-2,4pyran, Methylvinyläther oder 2-Methylpropen.
Die Kettenverlängerung der erhaltenen Cs-Verbindung der Formel V kann durch Umsetzen mit einem 1-Halogen-3methyl-butan, vorzugsweise mit 1-Brom-3-methylbutan, oder mit einem entsprechenden Sulfonat, vorzugsweise 3-Methyl-1butanol-p-toluolsulfonat, mit Hilfe einer magnesiumorganischen Reaktion durchgeführt werden. Vorzugsweise wird ein Bromid der Formel V verwendet. Zur Ausführung der magnesiumorganischen Reaktion wird die Verbindung der Formel V mit metallischem Magnesium in einem ätherischen Lösungsmittel, z.B. in Tetrahydrofuran, vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa Raumtemperatur und 80 C umgesetzt, wobei Magnesium angelagert wird.
Nach Zusatz der zweiten Kopplungskomponente, sowie einer katalytischen Menge eines Di-(alkalimetall)-tetrahalogenkuprats, vorzugsweise Dilithium-tetrachlorkuprat, erhält man die gewünschte Clo Verbindung der Formel VI. Als Lösungsmittel wird das erwähnte ätherische Lösungsmittel verwendet. Die Temperatur liegt im allgemeinen zwischen etwa -800C und der Raumtemperatur. Die Reaktion wird vorzugsweise bei niederer Temperatur eingeleitet (-80 bis 0OC) und anschliessend bei höherer Temperatur, z.B. Raumtemperatur, vervollständigt.
Im erhaltenen Produkt der Formel VI wird nun die Gruppe R7S gegen Halogen ausgetauscht, insbesondere gegen Brom, Chlor oder Jod. Dies erfolgt vorzugsweise durch eine saure Hydrolyse, z.B. mit wässriger Mineralsäure, wie Salzsäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure bei Raumtemperatur, gefolgt von einer Halogenierung mit dem entsprechenden Halogenwasserstoff, oder auch durch Behandeln mit N-Chloroder N-Bromsuccinimid und Triphenylphosphin, mit Phosphortribromid bzw. -chlorid oder Phosphorpentabromid bzw.
-chlorid, mit Triphenylphosphordibromid bzw. -chlond oder mit Methyltriphenoxyphosphoniumj odid. Ein erhaltenes Bromderivat der Formel VII kann in das entsprechende Jodderivat durch Behandeln mit einem Alkalimetalljodid in einem ketonischen Lösungsmittel, z.B. Methyläthylketon oder Methylisobutylketon, bei erhöhter Temperatur umgewandelt werden.
Hiernach werden zur weiteren Kettenverlängerung die Verbindungen V und VII miteinander umgesetzt, und zwar mit Hilfe einer magnesiumorganischen Reaktion, im wesentlichen in der gleichen Weise wie oben beschrieben für die Kettenverlängerung V < VI. Man erhält so eine optisch aktive Cls-Verbindung der Formel XI, die in der gleichen Weise wie die soeben beschriebene Überführung VVI in das Halogenid XII übergeführt wird.
Die Kettenverlängerung des Aldehyds IX erfolgt mit Hilfe einer phosphororganischen Reaktion durch Umsetzen mit einem 3-Methylbutyl-triarylphosphoniumhalogenid, vorzugsweise 3 -Methylbutyl-triphenylphosphoniumbromid. Die Reaktion erfolgt in Gegenwart einer Base, z.B. in Gegenwart eines Niederalkyllithiums, wie n-Butyllithium, Phenyllithium, oder in Gegenwart eines Alkalimethyllhydrids oder -amids, gegebenenfalls in einem inerten organischen Lösungsmittel, z.B. in einem niederen Alkan, wie n-Hexan; in einem chlorierten Kohlenwasserstoff, wie Methylenchlorid; in einem Äther, wie Diäthyläther; in einem aprotischen, polaren Lösungsmittel, wie Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid oder Hexamethylphosphorsäuretriamid oder in Mischungen dieser Lösungsmittel, bei einer Temperatur zwischen etwa- 10"C und Raumtemperatur.
Zur weiteren Kettenverlängerung werden die Verbindungen IX und X miteinander umgesetzt und zwar mit Hilfe einer phosphororganischen Reaktion im wesentlicilcn in der gleichen Weise wie oben angegeben für die Kettenverlängerung IX < X.
Man erhält auf diese Weise das optisch aktive Halogenid XV.
Die erhaltenen Halogenide XII und XV können mit Hilfe der beschriebenen phosphororganischen Reaktion mit (S)-6 Hydroxy-2-formyl-2,5 ,7,8-tetramethyl-2-chroman oder mit dem entsprechenden 6-Ester zu natürlichem, optisch aktivem Vitamin E oder dessen 6-Ester (Formel XIV) umgesetzt werden. Man erhält zunächst die entsprechenden, ungesättigten Verbindungen XIII und XVI mit 1 bzw. 3 Doppelbindungen in der Seitenkette. Diese Doppelbindungen können durch katalytische Hydrierung gesättigt werden. Als Katalysator wird vorzugsweise ein Edelmetallkatalysator verwendet, der üblicherweise für Hydrierungen eingesetzt wird, z.B. Platindioxid, Palladiumkohle, des weiteren aber auch Raney-Nickel oder Raney-Cobalt. Die Hydrierung erfolgt vorzugsweise in einem niederen Alkancarbonsäureester, wie Äthylacetat, oder in einem niederen Alkanol, wie Methanol oder Äthanol.
Es wird insbesondere unter Normaldruck und bei einer Temperatur zwischen der Raumtemperatur und etwa 80OC gearbeitet.
Ein allfällig erhaltenes Produkt mit einer freien Hydroxygruppe in 6-Stellung des Chromanteils kann erwünschtenfalls verestert werden, z.B. mit Acetanhydrid in Pyridin.
Die Lactone IIA und IID können ebenfalls zur Herstellung von natürlichem, optisch aktivem Vitamin K1 verwendet werden. Ausgehend von den in obiger Weise erhaltenen Halogeniden XV und XII kann wie folgt vorgegangen werden:
Die Halogenide XV werden durch Hydrierung wie bei den Umsetzungen XIIIoXIV und XVIoXIV in die Halogenide XII umgewandelt. Ein Halogenid XII wird durch Einwirken eines Acetessigsäure-niederalkylesters, z. B. des Methyl- oder Äthylesters, in den Ester XVII umgewandelt, welcher mit wässrigem Alkali zu Hexahydrofarnesylaceton der Formel XVIII hydrolysiert und decarboxyliert wird.
Das optisch aktive Hexahydrofarnesylaceton XVIII wird nach einer Variante durch Umsetzen mit einem Alkalimetallacetylid, gefolgt von einer Partialhydrierung mit Lindlarkatalysator in optisch aktives Isophytol XX umgewandelt. Wahlweise wird das Hexahydrofarnesylaceton XVIII mit einer Verbindung der Formel
EMI11.1
in einem nieder-alkanolischen Lösungsmittel und dem entsprechenden niederen Alkalimetallalkoxid, z.B. mit Triäthylphosphonoacetat in äthanolischem Natriumäthoxid, zur Verbindung XXI umgesetzt, welche durch Reduktion mit einem komplexen Metallhydrid, wie Lithiumaluminiumhydrid oder Diisobutylaluminiumhydrid, in optisch aktives Phytol XXII übergeführt wird.
Das Isophytol XX oder das Phytol XXII kann mit Hilfe einer Lewissäure, z.B. Bortrifluorid, in einem ätherischen Lösungsmittel, z.B. Dibutyläther, mit Menadiol bzw. dessen 1 Acylderivat (Verbindung XXIII) kondensiert werden. Nach Verseifung des erhaltenen 1-Acylderivates XXIV, z.B. mit methanolischem Alkali, erhält man durch Oxidation mit Luft das optisch aktive Vitamin Kl der Formel XXV. Der Anteil an gewünschtem trans-Produkt kann durch Trennung der cis- und trans-Formen XXI und/oder XXIV, beispielsweise durch Chromatographie oder Umkristallisation, erhöht werden.
Die Überführung von optisch aktivem Hexahydrofarnesylaceton in natürliches Phytol und natürliches Vitamin Kl ist auch in J. Chem. Soc. (C), 1966, Seiten 2144-2176 (insbesondere 2146, 2151 und 2152) bzw. in Helv. Chim. Acta, 48, 1965, Seiten 1332-1347 (insbesondere 1333 und 1346) beschrieben.
Fermentationsprodukte der Formel
EMI11.2
in der X" alkylveräthertes Hydroxymethyl, z. B. Methoxymethyl, und Y" gegebenenfalls verestertes Carboxy oder gegebenenfalls verestertes Hydroxymethyl darstellt, können die entsprechenden Verbindungen der Formel II", worin Y" Hydroxymethyl darstellt, übergeführt werden, wobei die gegebenenfalls veresterte Carboxygruppe in Analogie zur obigen Umsetzung III-iIV reduziert und die veresterte Hydroxygruppe basisch verseift wird. Der Alkohol der Formel IIi kann mit Tosylchlorid in das entsprechende Tosylat umgewandelt werden.
Dieses kann mit einem 1-Halogen-3-methylbutan, z.B. 1-Brom-3-methyl-butan und metallischem Magnesium mit Hilfe von Dilithium-tetrachlorkuprat unter Reaktionsbedingungen, wie sie für die Umsetzung VVI beschrieben sind, in die entsprechenden Clo-Verbindung übergeführt werden, wonach die Alkoxygruppe gegen Halogen unter Ausbildung der obigen Verbindung VII ausgetauscht wird. Alkoxy geht durch Behandeln mit Bortribromid oder -chlorid in Methylenchlorid bei etwa 200 bis 0OC in die Hydroxygruppe über, die anschliessend wie oben beschrieben halogeniert wird.
Die Überführung der Verbindung VII in Vitamin E, Vitamin E-Ester oder Vitamin Kl erfolgt in der obigen Weise.
In den nachstehenden Beispielen sind folgende Depositorien aufgeführt: ATCC = American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, USA CBS = Centraal-Bureau voor Schimmelcultures,
Baarn - Holland NRRL = Northern Utilization Research and
Development Division of U.S.D.A.,
Peoria, Illinois, USA NCIB = National Collection of Industrial Bacteria,
Aberdeen - Schottland ETH = Eidgenössische Technische Hochschule,
Zürich - Schweiz PRL = Prairie Regional Laboratories, Sascatoon, Canada Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1
Transformation von trans-3-(1,3-Dioxolan-2-yl)-2- buten-1-ol zu (S)-Dihydro-3-methyl-2(3H)-furanon.
Biokatalysator: Geotrichum candidum.
EMI11.3
Anzucht des Mikroorganismus
Die Anzucht des Mikroorganismus erfolgt in einem Medium der folgenden Zusammensetzung:
EMI11.4
<tb> 20 <SEP> g <SEP> D(+)-Glucose <SEP> (Monohydrat) <SEP> | <SEP> in <SEP> einem <SEP> Liter
<tb> 10 <SEP> g <SEP> Yeast-Extract <SEP> (Difco) <SEP> deionisiertem
<tb> 16 <SEP> g <SEP> KH2PO4 <SEP> Wasser
<tb> <SEP> 2,6 <SEP> g <SEP> Na2HPO4 <SEP> ' <SEP> l <SEP> (pH <SEP> 6)
<tb>
Dieses Medium wird während 30 Minuten im Autoklav bei 1350 sterilisiert. Der Mikroorganismus wird unter Anwendung der üblichen mikrobiologischen Arbeitstechnik von einer Schrägagarkultur in 500 ml Anzuchtmedien eingeimpft und in einem sterilen Erlenmeyerkolben mit Sterilstopfen während 48 h auf einer Rundschüttelmaschine bei 30O bebrütet.
Dieser Ansatz wird dann in einen sterilen Laborfermenter übertragen, der 20 1 Nährmedium der oben genannten Zusammensetzung enthält. Zur Schaumbekämpfung werden 10 ml Polypropylenglycolmonobutyläther zugesetzt. Der Fermenter wird während 24 h, bei einer thermostatisch geregelten Temperatur von 300, mit einer Rührfrequenz von 900 U/min und einer Luftflussrate von 600 l/h betrieben. Anschliessend wird die Biomasse abfiltriert. Aus einem solchen 20 Ansatz gewinnt man 1 kg Biomasse. Bis zum Einsatz im Transformationsexperiment wird die Biomasse im Kühlschrank aufbewahrt.
Transformation von trans-3-(1,3-Dioxolan
2-yl)-2-buten-1-ol (a)
In einem sauberen, jedoch nicht sterilisierten Laborfermenter (Gesamtvolumen 311) werden 18 1 deionisiertes Wasser und 200 g Saccharose eingefüllt. In dieser Zuckerlösung werden 2 kg Biomasse (Geotrichum candidum CBS 233.76) suspendiert. Anschliessend werden 350 g Substrat (a) zugesetzt. Dieser Ansatz wird 24 h bei einer thermostatisch geregelten Temperatur von 30 unter Rühren (Rührerdrehzahl 900 U/min) mit einer Luftflussrate von 600 l/h belüftet. Nach 2, 4, 6, 8 und 24 h werden Proben von je 10 ml entnommen, mit Methylenchlorid zweimal extrahiert, über Na2SO4 getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt.
Der Rückstand wird in Dioxan aufgenommen und gaschromatographisch analysiert (Glassäule mit 12% Carbowax als Adsorbens, Starttemperatur 100 , Temperaturanstieg 4'/min, Endtemperatur 220 , Trägergas: N2). Die prozentuale Transformation zum optisch aktiven Fermentationsprodukt (S)-Dihydro-3-methyl2(3H)-furanon (llD) wird in Tabelle 1 wiedergegeben.
Tabellel Fermentationszeit Transformation zum Lacton IID
2h 11,6% 4h 23,9% 6h 35,7% 8h 44,0% 24h 61,1%
Die Fermentation wird nach 24 Stunden abgebrochen und das gewünschte Fermentationsprodukt wie folgt isoliert:
Die Brühe wird filtriert. Wasserphase und Sediment werden getrennt aufgearbeitet. Die Wasserphase wird zweimal mit je 40 1 Methylenchlorid ausgerührt, das Sediment wird zweimal mit je 5 1 Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die abgetrennte Lösungsmittelphase wird über Na2SO4 entwässert und unter vermindertem Druck eingeengt. Es ergeben sich 248 g Rohextrakt.
Dieser Rohextrakt wird bei 81-840/14-15 Torr destilliert (Badtemperatur 105-115 ). Man erhält 107,8 g Produkt, das laut Gaschromatogramm zu 95% aus (S)-Dihydro-3methyl-2(3H)-furanon besteht und eine optische Drehung an = -20,7 (2% in Äthanol) aufweist. Im NMR-Spektrum des Produktes, aufgenommen unter Zusatz chiraler Shiftreagenzien, ist nur das eine Enantiomere (S-Konfiguration) sichtbar.
Beispiel 2
Transformation verschiedener Edukte zu (S)
Dihydro-3-methyl-2(3H)-furanon. Biokatalysator:
Geotrichum candidum CBS 233.76
Der Mikroorganismus wird in gleicher Weise angezüchtet, wie dies in Beispiel 1 beschrieben wurde.
Bei den Transformationsexperimenten werden die nachfolgenden Substrate eingesetzt:
EMI12.1
EMI12.2
Die Transformationsexperimente werden wie folgt angesetzt: 5 g Biomasse (Geotrichum candidum CBS 233.76) werden in 45 ml sterilem Transformationsmedium suspendiert, das die folgende Zusammensetzung hat: D(+ )-Glucose (Monohydrat) 50 g KH2PO4 8 g Na2HPO4 1,3 g
EMI12.3
in 1 1 deionisier- tem Wasser (pH 6)
Nun wird das Edukt in einer Konzentration von 1 resp. 2 g/l (s. Tabelle) zugesetzt und der Ansatz während 7 Tagen auf einer Rundschüttelmaschine (260 U/min) in einem thermosta tisierten Raum bei 30O bebrütet. Nach 1 und 7 Tagen wird eine Probe von 10 ml entnommen und mit Methylenchlorid zweimal extrahiert.
Die Lösungsmittelphase wird abgetrennt, über Na2SO4 getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt.
Der Rückstand wird in soviel Dioxan aufgenommen, dass, bezogen auf das eingesetzte Edukt, eine 1 %ige Lösung entsteht. Diese wird anschliessend gaschromatographisch analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle enthalten.
Tabelle
EMI13.1
<tb> <SEP> Ä
<tb> <SEP> Edukt <SEP> Eduktkon- <SEP> in <SEP> % <SEP> nach <SEP> Gaschromatogramm
<tb> <SEP> zentration <SEP> (GC)
<tb> <SEP> in <SEP> gil <SEP> Fermenta- <SEP> Fermenta
<tb> <SEP> tionszeit <SEP> tionszeit
<tb> <SEP> 1Tag <SEP> 7 <SEP> Tage
<tb> <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 15 <SEP> 33
<tb> <SEP> HO
<tb> <SEP> Ho#·Oo <SEP> 2 <SEP> 40 <SEP> 75
<tb> <SEP> ·
<tb> <SEP> HO <SEP> 2 <SEP> 32 <SEP> 74
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 89 <SEP> 95
<tb> <SEP> HO <SEP> O
<tb> <SEP> o
<tb> 2 <SEP> 0 > <SEP> 74 <SEP> 94
<tb> Ho
<tb> <SEP> 1 <SEP> 20 <SEP> 79
<tb> <SEP> 1 <SEP> 24 <SEP> 45
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> 2 <SEP> 79 <SEP> 88
<tb> 4ow <SEP> ) <SEP> 2 <SEP> 79 <SEP> 88
<tb> <SEP> OIo
<tb> <SEP> 4o <SEP> H <SEP> 2 <SEP> 76 <SEP> 89
<tb> tow <SEP> 1 <SEP> 17 <SEP> 55
<tb> <SEP> O
<tb>
Beispiel 3 Transformation von
Äthyl-trans-4,4-dimethoxy
3-methyl-crotonat. Biokatalysator: Presshefe
EMI13.2
Ein sauberer, jedoch nicht sterilisierter Fermenter mit 311 Gesamtvolumen wird mit den folgenden Ingredientien beschickt: - deionisiertes Wasser 9,91 - Presshefe 1,1 kg - Zucker 0,55 kg - Äthyl-4,4-dintethoxy-3-methylcrotonat (b) 133 g - Polypropylenglykolmonobutyläther 10 ml
Die Fermentation wird unter den nachstehenden Bedingungen durchgeführt: Temperatur 30 (thermostatisch geregelt) Rührfrequenz 1000 U/min Luftflussrate 600 ich pH 3,4-3,8 (keine pH-Regelung) Fermentationszeit 56 h
Nach 16, 24, 40, 48 und 56 h werden Proben von 10 ml entnommen und mit Methylenchlorid zweimal extrahiert.
Die Lösungsmittelphase wird abgetrennt, über Na2SO4 getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird in so viel Dioxan aufgenommen, dass, bezogen auf das eingesetzte Edukt, eine 1 %ige Lösung entsteht und anschliessend gaschromatographisch analysiert.
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt: Zusammensetzung der Extrakte in %
EMI14.1
<tb> Fer <SEP> o <SEP> > <SEP> AbOH <SEP> A <SEP> 4
<tb> ment,- <SEP> co-.G-l <SEP> 1;
<tb> tionszeit <SEP> 0- <SEP> 0 <SEP> 0
<tb> 16 <SEP> h <SEP> 23.8 <SEP> 40.6 <SEP> 34.3 <SEP> 0.3
<tb> 24h <SEP> 11.9 <SEP> 43.4 <SEP> 42.7 <SEP> 0.3
<tb> 40 <SEP> h <SEP> 3.7 <SEP> 43.3 <SEP> 49.1 <SEP> 0.3
<tb> 48h <SEP> 1.8 <SEP> 44.4 <SEP> 50.1 <SEP> 0.7
<tb> 56h <SEP> 0.5 <SEP> 46.9 <SEP> 49.2 <SEP> 1.0
<tb>
Die Fermentation wird nach 56 h abgebrochen. Das gewünschte Fermentationsprodukt wird folgendermassen isoliert:
Die Brühe wird mit NaCI gesättigt und während 4 Tagen kontinuierlich mit Diäthyläther extrahiert. Das Lösungsmittel wird abgetrennt, über Na2S04 getrocknet und unter reduziertem Druck wieder entfernt.
Man erhält 122 g Rohextrakt, der zum grossen Teil (S)-3-Methyl-4-hydroxy-buttersäureäthylester enthält. Diese Substanz kann chromatographisch (über Kieselgel, das mit 0,5 So gesättigtem Ammoniak desaktiviert wurde) gereinigt werden.
Beispiel 4
Hydrolyse des (S)-3 -Methyl-4-hydroxy-buttersäure äthylesters und Reinigung des entstehenden (S)
Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanons. (IIA)
Der gemäss Beispiel 3 erhaltene Rohextrakt wird mit 100 mg p-Toluolsulfonsäure versetzt und in einer Stickstoffatmosphäre unter vermindertem Druck destilliert. Das während der Destillation gebildete (S)-Dihydro-4-methyl-2(3H)-fura- non destilliert bei 86 bis 88 C/14 Torr (Badtemperatur 125 bis 140'). Man erhält 26,2 g Produkt, das nach GC 93% (S) Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanon enthält und eine optische Drehung von -210 (4% in Methanol) aufweist.
Die optische Reinheit des (S)-Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanons lässt sich nach Überführen des Lactons in den entsprechenden Bromester
EMI14.2
an Hand des NMR-Spektrums, aufgenommen unter Zusatz eines chiralen Shift-Reagenz [Eu(HFC)3], nachweisen.
Die Ausbeute an isoliertem, optisch reinem (S)-Dihydro-4methyl-2(3H)-furanon beträgt 34,4% der theoretisch möglichen Produktmenge.
Beispiel 5
Tranformation von Äthyl-trans-4,4-dimethoxy-3 methyl-crotonat bei kontinuierlicher Substratzufuhr.
Biokatalysator: Presshefe.
Im sauberen, jedoch nicht sterilisierten Kleinfermenter (Arbeitsvolumen 5 1) werden zwei Transformationsexperimente A und B unter kontinuierlicher Zufuhr des Substrats (Äthyl-trans-4,4-dimethoxy-3-methyl-crotonat) durchgeführt.
Der Fermenter wird in beiden Fällen mit folgenden Substanzen beschickt.
Entionisiertes Wasser (nicht steril) 4,51 Kristalliner Zucker 250 g Presshefe 500 g
Beide Transformationen werden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Temperatur 30'C Rührfrequenz 1000 U/min Luftflussrate 600 ich pH 3,0-4,3 (keine Regelung)
Das Substrat wird mit einer Förderleistung von ca. 7,5 ml/h kontinuierlich zugepumpt. Bei A wird das Substrat während 10 h zugeführt und eine Endkonzentration von 16 g/l erreicht.
Bei B wird während 22 h Substrat zugepumpt, so dass die Endkonzentration 33 g/l beträgt.
Bei Experiment B werden zudem nach 17 h Fermentationszeit 100 g Zucker nachgefüttert.
Zur Schaumbekämpfung werden 10 ml Polypropylenglycolmonobutyläther zugesetzt.
Der Verlauf der Fermentation A und B wird durch gaschromatographische Analysen gemäss Beispiel 3 verfolgt.
Die Reaktion A ist nach 20 h, die Reaktion B nach 46 h weitgehend abgeschlossen. Nach dieser Fermentationszeit ergibt die GC-Analyse die folgende prozentuale Zusammensetzung der Extrakte:
EMI15.1
<tb> <SEP> Expen- <SEP> Fermen- <SEP> Substrat: <SEP> Zusammensetzung <SEP> der <SEP> Extrakte <SEP> in <SEP> % <SEP> nach <SEP> GC
<tb> <SEP> ment <SEP> tations- <SEP> End-Kon- <SEP> o <SEP> o <SEP> 0 <SEP> 5
<tb> <SEP> zeit <SEP> zentration <SEP> zwei <SEP> Ao)4 & ( <SEP> Ao)W <SEP> '
<tb> A <SEP> 20 <SEP> h <SEP> 16 <SEP> g/l <SEP> 5,6 <SEP> 0,4 <SEP> 37,3 <SEP> 53,4 <SEP> 1,6
<tb> B <SEP> 46 <SEP> h <SEP> 33 <SEP> g/l <SEP> 17,5 <SEP> 6,8 <SEP> 30,0 <SEP> 40,2 <SEP> 2,0
<tb>
Die Isolierung des gesättigten Hydroxyesters und die Über führung in das (S)-Dihydro-4-methyS2(3H)-furanon erfolgen gemäss den Beispielen 3 und 4.
Aus dem Ansatz A wurden so 18,2 g und aus dem Ansatz B 23,0 g optisch reines (S)-Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanon isoliert.
Beispiel 6
Transformation verschiedener Edukte zu optisch aktiven Zwischenprodukten, die in (S)-Dihydro
4-methyl-2(3H)-furanon übergeführt werden können.
Biokatalysator: Presshefe
Bei den Transformationsexperimenten werden die nachstehenden Substrate eingesetzt:
EMI15.2
EMI15.3
EMI15.4
EMI15.5
Die Transformationsexperimente werden in gleicher Weise ausgeführt, wie dies in Beispiel 2 beschrieben wird. Als Biokatalysator werden jedoch 5 g Presshefe eingesetzt.
Die Ergebnisse zeigt die folgende Tabelle:
EMI15.6
<tb> <SEP> Edukt <SEP> Edukt-Ul'in <SEP> %
<tb> <SEP> konzen- <SEP> ,
<tb> <SEP> tration
<tb> <SEP> g/l <SEP> Id <SEP> 3d <SEP> 7d
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> (" <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> 26 <SEP> 36
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 69 <SEP> 75 <SEP> 63
<tb> <SEP> > <SEP> ) < <SEP> 2 <SEP> 61 <SEP> 66 <SEP> 58
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> 2 <SEP> zW < <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 12 <SEP> 10
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> - <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> <SEP> o
<tb> 1 <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 22 <SEP> 45
<tb> <SEP> o
<tb> <SEP> 2 <SEP> Y <SEP> 2 <SEP> 4 <SEP> 17 <SEP> 34
<tb>
Beispiel 7
Transformation von trans-3-(1,3-Dioxolan-2-yl)-2 buten-1-ol und Äthyl-trans-4,4-dimethoxy-3 methylcrotonat durch verschiedene Mikroorganismen
Es werden mindestens 70 willkürlich ausgewählte Mikroorganismen auf ihre Fähigkeit,
die folgenden Transformationsreaktionen zu vermitteln. getestet:
EMI16.1
Die Mikroorganismen werden aus den folgenden Gruppen ausgewählt:
1. Eukaryonten
1.1. Hefen der Gattungen: Candida
Kloeckera
Rhodotorula
Saccharomyces
Torulopsis 1.2. Pilze der Gattungen: Absidia
Aspergillus
Colletotrichum
Cunninghamella
Curvularia
Cylindrocarpon
Endomyces
Fusarium
Gibberella
Gliocladium
Hypomyces
Mucor
Penicillium
Phycomyces
Rhizopus
Trichothecium 2. Prokaryonten 2.1. Actinomyceten der Gattungen: Actinomyces
Mycobacterium
Nocardia
Proactinomyces
Streptomyces 2.2. Gram-positive Bakterien der
Gattungen: Arthrobacter
Bacillus
Micrococcus
Pediococcus
Propionibacterium
Sarcina
Streptococcus 2.3.
Gram-negative Bakterien der
Gattungen Azotobacter
Klebsiella
Pseudomonas
Serratia
Vibrio
Die Mikroorganismen werden unter Anwendung der üblichen mikrobiologischen Arbeitstechnik in 50 ml eines komplexen Anzuchtmediums eingeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 30OC während 48 bis 72 h bebrütet. Das Medium ist folgendermassen zusammengesetzt: KH2PO4 3,7 g Na2HPO4 7,0 g Yeast-Extrakt (Difco) 10 g D(+)-Glucose (Monohydrat) 20 g
EMI16.2
in einem Liter deionisiertem Wasser
Nach 48 bis 72 h werden zu jedem 50 ml-Ansatz nochmals 0,5 g D(+)-Glucose (Monohydrat) (10 g/l) sowie 50 mg trans 3-( 1 ,3-Dioxolan-2-yl)-2-buten-1 -ol resp. trans-Äthyl-4,4dimethoxy-3-methylcrotonat (1 g/l) zugesetzt.
Die Bebrütung wird unter gleichen Bedingungen eine Woche lang fortgesetzt.
Nach einem und nach 7 Tagen werden je 10 ml der Zellsuspension aller Ansätze zweimal mit Methylenchlorid extrahiert.
Die organische Phase wird über Na2SO4 getrocknet und unter reduziertem Druck bei 40O eingeengt. Der Rückstand wird in 1 ml Dioxan aufgenommen und gaschromatographisch analysiert. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle zusammengefasst. In dieser Tabelle bedeuten - kein Umsatz zum erwünschten Produkt + es werden nur Spuren des erwünschten Produktes nachgewiesen (Umsatz < 5 %) + der Rohextrakt enthält mindestens 5 % des gewünschten
Produktes.
HEFEN
EMI16.3
<tb> Mikroorganismus <SEP> Transforma- <SEP> Transformationsreaktion <SEP> b)
<tb> <SEP> tionsreaktion <SEP> a)
<tb> <SEP> K <SEP> FoO <SEP> oX
<tb> <SEP> 1Tag <SEP> 7Tage <SEP> 1Tag <SEP> 7Tage
<tb> <SEP> Candida <SEP> albicans <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Candida <SEP> guillenmondiii <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Candida <SEP> utilis <SEP> 621 <SEP> CBS <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Kloeckera <SEP> brevis, <SEP> Stamm <SEP> 1 <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Kloeckera <SEP> brevis,
<SEP> Stamm <SEP> 2 <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Rhodotorula <SEP> rotundata <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Saccharomyces <SEP> carlsbergensis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> HEFEN (Fortsetzung)
EMI17.1
<tb> <SEP> Mikroorganismus <SEP> Transforma- <SEP> Transformationsreaktion <SEP> h
<tb> <SEP> tionsreaktion <SEP> a)
<tb> <SEP> < <SEP> Foffi <SEP> oO
<tb> <SEP> 1Tag <SEP> Tage <SEP> 1Tag <SEP> 7Tage
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae, <SEP> Stamm <SEP> 1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae, <SEP> Stamm <SEP> 2 <SEP> f <SEP> ¯ <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae, <SEP> Stamm <SEP> 3 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae,
<SEP> ellipsoides <SEP> - <SEP> 9896 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Torulopsis <SEP> apicola <SEP> PRLNo.123-64 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Torulopsis <SEP> rotundata <SEP> NRRL <SEP> 1402 <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> PILZE
EMI17.2
<tb> Mikroorganismus <SEP> Transforma- <SEP> Transformationsreaktion <SEP> b)
<tb> <SEP> tionsreaktion <SEP> a)
<tb> <SEP> X <SEP> Ao4+oX
<tb> <SEP> 1Tag <SEP> Tage <SEP> 1Tag <SEP> 7Tage
<tb> Absidia <SEP> regneri <SEP> Lendner <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Aspergillus <SEP> clavatus <SEP> + <SEP> + <SEP> i <SEP> +
<tb> Aspergillus <SEP> fischeri <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Aspergillus <SEP> flavus <SEP> + <SEP> f.
<tb>
Aspergillus <SEP> fumigatus <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Aspergillus <SEP> ochraceus <SEP> 12337 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Aspergillus <SEP> wentii <SEP> Wehmer <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Colletotrichum <SEP> gloeosporioides <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Cunninghamella <SEP> blakesleeana <SEP> + <SEP> i <SEP> + <SEP> +
<tb> Curvularia <SEP> lunata <SEP> NRRL <SEP> 2380 <SEP> + <SEP> + <SEP> i <SEP> +
<tb> Cyhndrocarpon <SEP> radicicola <SEP> 11011 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Endomyces <SEP> fibuliger <SEP> 2521 <SEP> CBS <SEP> i <SEP> + <SEP> i <SEP> +
<tb> Fusarium <SEP> culmorum <SEP> + <SEP> +
<tb> Fusarium <SEP> solani <SEP> 12823 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> +
<tb> Gibberella <SEP> fujikuroi <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Gliocladium <SEP> roseum <SEP> +
<SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Hypomyces <SEP> rosellus <SEP> + <SEP> +
<tb> Mucor <SEP> circinelloides <SEP> + <SEP> +
<tb> Mucor <SEP> corymbifer <SEP> + <SEP> + <SEP> ¯ <SEP> +
<tb> Mucor <SEP> griseo-cyanus <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> + <SEP> +
<tb> Mucor <SEP> parasiticus <SEP> 6476 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Mucor <SEP> spinosus <SEP> 2604 <SEP> ETH <SEP> + <SEP> +
<tb> Penicillium <SEP> griseofulvum <SEP> 11 <SEP> 885 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> +
<tb> Penicillium <SEP> notatum <SEP> 832 <SEP> CBS <SEP> + <SEP> + <SEP> i
<tb> Penicillium <SEP> novae-zeelandiae <SEP> 10473 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Penicillium <SEP> viride <SEP> 2603 <SEP> ETH <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Phycomyces <SEP> blakesleeanus <SEP> + <SEP> + <SEP> i <SEP> +
<tb> Rhizopus <SEP> arrhizus <SEP> 11 <SEP> 145 <SEP> ATCC <SEP> +
<SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Rhizopus <SEP> circinans, <SEP> Stamm <SEP> 1 <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Rhizopus <SEP> circinans, <SEP> Stamm <SEP> 2 <SEP> - <SEP> i <SEP> + <SEP> +
<tb> Trichothecium <SEP> roseum <SEP> 8685 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> ACTINOMYCETEN
EMI18.1
<tb> Mikroorganismus <SEP> Transforma- <SEP> Transformationsreaktion <SEP> b)
<tb> <SEP> tionsreaktion <SEP> a)
<tb> <SEP> 5 <SEP> CH3
<tb> <SEP> 1Tag <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 1Tag <SEP> 7 <SEP> Tage
<tb> Actinomyces <SEP> cellulosae <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Mycobacterium <SEP> butyricum <SEP> i <SEP> + <SEP> i <SEP> +
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> f <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Mycobacterium <SEP> rhodochrous <SEP> 4277 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> Nocardia <SEP> asteroides <SEP> 27 <SEP> 042 <SEP> ETH <SEP> - <SEP> - <SEP> +
<SEP> +
<tb> <SEP> Nocardia <SEP> brasiliensis <SEP> 27 <SEP> 048 <SEP> ETH <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Nocardiaopaca <SEP> 33161 <SEP> CBS <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> Proactinomyces <SEP> restrictus <SEP> 15 <SEP> 745 <SEP> CBS <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> Proactinomyces <SEP> roseus <SEP> +- <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> Streptomyces <SEP> albus <SEP> 6860 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> Streptomyces <SEP> fradiae <SEP> 10 <SEP> 745 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Streptomyces <SEP> lavendulae <SEP> 11 <SEP> 924 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP>
<tb> <SEP> Streptomyces <SEP> nmosus <SEP> 10970 <SEP> ATCC <SEP> i <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Streptomyces <SEP> venezuelae <SEP> 10 <SEP> 595 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> - <SEP> + <SEP> BAKTERIEN gram-positive
EMI18.2
<tb> Mikroorganismus <SEP> Transforma- <SEP> Transformationsreaktion <SEP> b)
<tb> <SEP> tionsreaktion <SEP> a)
<tb> <SEP> acs
<tb> <SEP> iTag <SEP> 7Tage <SEP> 1Tag <SEP> 7Tage
<tb> <SEP> 1 <SEP> Tag <SEP> 7 <SEP> Tage <SEP> 1 <SEP> Tag <SEP> 7 <SEP> Tage
<tb> Arthrobacter <SEP> simplex <SEP> 6946 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Bacillus <SEP> sphaericus <SEP> 12300 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 6633 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Micrococcus <SEP> lysodeikticus <SEP> 4638 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Pediococcus <SEP> cerevisiae <SEP> 8042 <SEP> ATCC <SEP> i <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Propionibacterium <SEP> shermanii <SEP> + <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> <SEP> Sarcina <SEP>
lutea <SEP> 8340 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> ¯ <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 9790 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Streptococcus <SEP> lactis <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> BAKTERIEN gram-negative
EMI18.3
<tb> <SEP> Transforma- <SEP> Transformationsreaktion <SEP> b)
<tb> <SEP> tionsreaktion <SEP> a)
<tb> <SEP> < <SEP> )9NotH
<tb> <SEP> 1Tag <SEP> 7Tage <SEP> 1Tag <SEP> 7 <SEP> Tage
<tb> Azotobacter <SEP> indicus <SEP> 9540 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Pseudomonas <SEP> fluorescens <SEP> 13430 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP>
<tb> Pseudomonas <SEP> testosteroni <SEP> 11 <SEP> 996 <SEP> ATCC <SEP> - <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> Serratia <SEP> marcescens <SEP> i <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP>
7708 <SEP> ATCC <SEP> + <SEP> + <SEP> f <SEP> +
<tb> Die Ergebnisse können wie folgt zusammengefasst werden:
EMI19.1
<tb> Transformationsreaktion <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Zahl <SEP> der <SEP> Stämme
<tb> <SEP> geprüften <SEP> - <SEP> + <SEP> +
<tb> <SEP> Stämme <SEP> kein <SEP> gewünoch- <SEP> weniger <SEP> mindestens
<tb> <SEP> tes <SEP> Produkt <SEP> als <SEP> 5 <SEP> % <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Produkt
<tb> <SEP> nachgewiesen <SEP> Produkt
<tb> <SEP> HO+oz <SEP> zu <SEP> 11 <SEP> (15,5%) <SEP> 15 <SEP> (21,1%) <SEP> 45 <SEP> (63,4 o)
<tb> <SEP> : <SEP> W <SEP> 74 <SEP> 0 <SEP> 48(64,9%) <SEP> 26(35,1%)
<tb> <SEP> 0/
<tb> <SEP> 0 <SEP> 5,
<tb>
Beispiel 8 Herstellung des optisch aktiven Halbesters 2 -Methyl-3 -äthoxycarbonyl-propionsäure
EMI19.2
Geotrichum candidum CBS 233.76 wird wie in Beispiel 1 angezüchtet.
Die Transformationsexperimente werden wie in Beispiel 2 durchgeführt. Die Umsätze zum gesättigten Halbester (nach GC) sind nachstehend für Fermentationszeiten von 1 3 und 7 Tagen tabelliert:
EMI20.1
<tb> Edukt <SEP> Eduktkon- <SEP> Mikro- <SEP> in <SEP> %
<tb> <SEP> zentration <SEP> organis
<tb> <SEP> in <SEP> g/l <SEP> mus <SEP> 1 <SEP> Tag <SEP> 3 <SEP> Tage <SEP> 7 <SEP> Tage
<tb> <SEP> K <SEP> 1 <SEP> Press- <SEP> 70 <SEP> 92 <SEP> 76
<tb> <SEP> hefe
<tb> <SEP> cn
<tb> <SEP> D <SEP> 1 <SEP> 72 <SEP> 82 <SEP> 78
<tb> <SEP> V1
<tb> <SEP> 1 <SEP> ) < <SEP> 1 <SEP> 14 <SEP> 38
<tb> <SEP> 0
<tb> > <SEP> + <SEP> 2 <SEP> U <SEP> 7 <SEP> 66 <SEP> 84
<tb> <SEP> ii
<tb> <SEP> 1 <SEP> so <SEP> 75 <SEP> 75
<tb> <SEP> o <SEP> O
<tb> <SEP> o <SEP> C3
<tb> <SEP> 2 <SEP> 2 <SEP> 41 <SEP> 77 <SEP> 79
<tb>
Beispiel 9 Überführung von (S)-2-Methyl-3-äthoxycarbonyl
propionsäure in (S)-Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanon
819 mg des gemäss Beispiel 7 erhaltenen optisch aktiven Halbesters werden in einer Argonatmosphäre in 6 ml absolutem Tetrahydrofuran gelöst und auf 0 bis -10oC abgekühlt.
Nach Zugabe von 3 ml Trimethylborat und 10,3 ml BH3 - S(CH3)2 in Tetrahydrofuran (tropfenweise) wird das Reaktionsgemisch bei -10 bis 0O 50 Minuten in einer Argonatmosphäre gerührt. Nach vorsichtiger Zugabe von 20 ml Methanol wird das Gemisch unter vermindertem Druck bei 40O eingedampft. Der Rückstand wird in Dichlormethan gelöst und nacheinander mit 30 ml gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung und zweimal mit 20 ml wässriger Kochsalzlösung geschüttelt. Die wässrige Phase wird dreimal mit Dichlormethan extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 586 mg Äthyl-(S)-3 Methyl-4-hydroxybutyrat als ein farbloses Öl.
Das erhaltene Äthyl-(S)-3-Methyl-4-hydroxybutyrat wird mit einer Spur p-Toluolsulfonsäure in Methanol 3 Stunden unter Rückflussbedingungen erhitzt. Man erhält (S)-Dihydro4-methyl-2(3H)-furanon, das bei etwa 500/0,1 Torr siedet.
Beispiel 10
Transformation von trans- 1,1 ,4-Trimethoxy-2-methyl-2-buten, trans-4-Methoxy-2-methyl-2-buten- 1-ol, bzw. 1-ol-acetat, trans-2-(3-Methoxy-1-methylpropenyl)- 1,3-dioxolan bzw. trans-4-Methoxy-2-methyl-crotonaldehyd durch Press hefe oder Geotrichum candidum
Als Mikroorganismen werden käufliche Presshefe oder Geotrichum candidum CBS 233.76 (Anzucht wie in Beispiel 1) verwendet. Als Substrat werden 0,2% der nachstehenden
Edukte a, b, c, d und e eingesetzt. Die Transformationsexperimente werden wie in Beispiel 2 durchgeführt.
Es entstehen dabei je nach Wahl des Mikroorganismus die folgenden Hauptprodukte:
EMI20.2
Die Umsätze zu diesen Produkten (nach GC = Gaschromatogramm) sind nachstehend für Fermentationszeiten von 1, 3 und 7 Tagen tabelliert:
EMI21.1
<tb> <SEP> CH3 <SEP> CH3
<tb> Edukt <SEP> Mikro- <SEP> Fermenta-\Ot <SEP> \ <SEP> OtOH
<tb> <SEP> organismus <SEP> tionszeit <SEP> 0 <SEP> H
<tb> <SEP> in <SEP> Tagen <SEP> in <SEP> % <SEP> It.
<SEP> GC <SEP> in <SEP> % <SEP> lot <SEP> GC
<tb> <SEP> Presshefe <SEP> 1 <SEP> 17 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 36 <SEP> 7
<tb> <SEP> OH <SEP> 7 <SEP> 26 <SEP> 32
<tb> <SEP> 0 <SEP> Geotrichum <SEP> 1 <SEP> 1 <SEP> 42
<tb> <SEP> candidum <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 51
<tb> <SEP> CBS <SEP> 233.76 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 64
<tb> <SEP> Presshefe <SEP> 1 <SEP> 13 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 32 <SEP> 5
<tb> 7 <SEP> < <SEP> 7 <SEP> 24 <SEP> 25
<tb> <SEP> 0
<tb> <SEP> <SEP> Geotrichum <SEP> 1 <SEP> 5 <SEP> 34
<tb> <SEP> candidum <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 39
<tb> <SEP> CBS <SEP> 233.76 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 45
<tb> <SEP> Presshefe <SEP> 1 <SEP> 32 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 54 <SEP> 2
<tb> <SEP> 0¯ <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 49 <SEP> 27
<tb> <SEP> 0o <SEP> Geotrichum <SEP> 1 <SEP> 0 <SEP> 86
<tb> <SEP> candidum <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 91
<tb> <SEP> CBS <SEP> 233.76 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP>
91
<tb> <SEP> Presshefe <SEP> 1 <SEP> 34 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 48 <SEP> 0
<tb> <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 7 <SEP> 38 <SEP> 36
<tb> <SEP> Geotrichum <SEP> 1 <SEP> 20 <SEP> 66
<tb> <SEP> candidum <SEP> 3 <SEP> 0 <SEP> 94
<tb> <SEP> CBS233.76 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 97
<tb> <SEP> Presshefe <SEP> 1 <SEP> 21 <SEP> 0
<tb> <SEP> 3 <SEP> 43 <SEP> 0
<tb> <SEP> 7 <SEP> H <SEP> 7 <SEP> 31 <SEP> 39
<tb> <SEP> Geotrichum <SEP> 1 <SEP> 37 <SEP> 0
<tb> <SEP> candidum <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> 71
<tb> <SEP> CBS <SEP> 233.76 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 82
<tb>
Beispiel 11
Zu 110 ml einer frisch hergestellten äthanolischen Brom wasserstofflösung (etwa 8n) werden unter Rühren bei 0" 11,0 g (0,11 Mol) (S)-Dihydro-4-methyl-2(3H)-furanon innerhalb von 10 Min. zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird anschliessend zwei Stunden bei Zimmertemperatur weitergerührt.
Zur Aufarbeitung wird die Reaktionsmischung auf Eis gegossen, mit Wasser auf etwa 1 Liter verdünnt und zweimal mit Chloroform ausgeschüttelt. Die vereinigten organischen Phasen werden zuerst mit Wasser, dann mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Chloroforms am Rotationsverdampfer destilliert das farblose Äthyl-(S)-4-brom-3-methylbutyrat im Wasserstrahlvakuum bei 90 bis 920. Ausbeute: 18,5 g (80%); [(tJ025 = -2,30 (c = 4,0, CHCl3).
204 ml (0,204 Mol) einer 1 m Lösung von Diisobutylaluminiumhydrid werden in einer Argonatmosphäre bei 0OC mit 17,8 g (0,085 Mol) Äthyl-(S)-4-brom-3-methylbutyrat unter Rühren innerhalb von 15 Min. tropfenweise versetzt. Man zersetzt den Überschuss des Reduktionsmittels durch Zutropfen von Methanol bei 0O. Anschliessend wird die Reaktionsmischung auf Eis gegossen und durch Zugabe von 2n wässriger Schwefelsäure angesäuert, wobei das ausgefallene Aluminiumhydroxid teilweise in Lösung geht, Das gebildete (S)-4-Brom3-methyl-1-butanol wird durch mehrmaliges Ausschütteln in Äther aufgenommen. Die vereinigten Ätherphasen werden zuerst mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung, dann mit gesättigter Kochsalzlösung neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.
Nach Entfernen des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer beträgt die Ausbeute 14,0 g (98%); das Produkt lässt sich ohne Destillation weiterverwenden. Für analytische Zwecke wird eine Probe am Kugelrohr bei 600/ 0,04 Torr destilliert; [a]20 = -2,00 (c = 3,3, CHCb).
14 g (0,084 Mol) (S)-4-Brom-3-methyl-1-butanol werden bei 00 mit 50 ml frisch destilliertem 3,4-Dihydro-2H-pyran tropfenweise versetzt. Die Reaktionsmischung wird anschliessend 1 Stunde bei 0 gerührt. Überschüssiges 3,4-Dihydro-2Hpyran wird am Rotationsverdampfer bei 35o entfernt. Zur möglichst vollständigen Entfernung des 3,4-Dihydro-2Hpyrans wird Chloroform wiederholt zugegeben, jeweils gefolgt von Destillation am Rotationsverdampfer. Das rohe Produkt [(S)-4-Brom-3-methylbutoxyj-tetrahydro-2H-pyran wird bei 75O/0,03 Torr destilliert. Ausbeute; 17,5 g (83 %) [a]D = +3,4O (c = 4,0, CHCl3).
In einem mit Argon begasten und mit einem Calciumchloridrohr versehenen 3-Halskolben werden 4,7 g (0,202 Mol) Magnesiumspäne durch Zugabe von 2,0 ml Methyljodid aktiviert. Nach 5 Minuten wird das Methyljodid abgesaugt und das Magnesium mehrere Male mit absolutem Tetrahydrofuran gewaschen. Zum aktivierten Magnesium fügt man tropfenweise eine Lösung von 44 g (0,175 Mol) 2-[(S)-4-Brom-3 methylbutoxy]-tetrahydro-2H-pyran in 50 ml absolutem Tetrahydrofuran mit einer solchen Geschwindigkeit zu, dass das Lösungsmittel gerade siedet. Falls die Grignardreaktion nicht von selbst startet, wird mit dem Ölbad auf 85 o erwärmt.
Nach beendeter Zugabe von 2-[(S)-4-Brom-3-methylbutoxy]- tetrahydro-2H-pyran wird noch so lange bei 85" gerührt (0 bis 15 Min.) bis gemäss gaschromatographischer Analyse nur noch Spuren von 2-[(S)-4-Brom-3-methylbutoxy]-tetrahydro-2Hpyran vorhanden sind. Die erhaltene Lösung wird auf -780 abgekühlt und tropfenweise mit 21,2 g (0,0875 Mol) 3 Methyl-1-butanol-p-toluolsulfonat versetzt, gefolgt von 3,6 ml einer 0,1 molaren Lösung von Li2CuCl4 in absolutem Tetrahydrofuran. Die Reaktionsmischung wird 10 Min. bei -780, dann 2 Stunden bei 0 und anschliessend noch 14 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.
Zur Aufarbeitung des erhaltenen 2 [(R)-3,7-Dimethyloctanoxy]-tetrahydro-2H-pyrans wird die Mischung auf Eis gegossen und mit 2n Schwefelsäure auf pH 5 bis 6 gebracht. Nach dreimaliger Extraktion mit Äther und Entfernung des Lösungsmittels am Rotationsverdampfer erhält man eine Mischung von (R)-3,7-Dimethyl-1-octanol und 2 [(R)-3 ,7-Dimethyloctanoxy]-tetrahydro-2H-pyran. Diese Mischung wird in 100 ml Methanol bei 0 portionenweise mit gesamthaft 100 ml 7n wässriger Salzsäure versetzt. Nach 2stündigem Rühren bei Zimmertemperatur wird mit verdünnter wässriger Natronlauge neutralisiert und mit Äther extrahiert.
Nach Chromatographie an mit 0,5% Ammoniak desaktiviertem Kieselgel mit Pentan/Äther (4:1) erhält man 10,6 g (76% bezogen auf eingesetztes 3 -Methyl-1-butanol-p-toluolsulfonat) reines (R)-3,7-Dimethyl-1-octanoL Sdp. 58 bis 59o/0,05 Torr; [a]20 = +4,0 (c = 1,03, CHCl3).
Das (R)-3,7-Dimethyl-1-octanol kann auch wie folgt erhalten werden:
Zu einer Grignardlösung (hergestellt in Analogie zum oben beschriebenen Magnesiumderivat von 2-[(S)-4-Brom-3 methylbutoxyl-tetrahydro-2H-pyran) aus 0,3 g (12,4 mMol) Magnesium und 1,51 g (10 mMol) 1-Brom-3-methylbutan in 25 ml absolutem Tetrahydrofuran, wird bei 00 unter Argon und unter Rühren 1,26 g (5 mMol) 2-[(S)-4-Brom-3-methyl butoxy] -tetrahydro-2H-pyrin innerhalb einer Minute zugetropft. Anschliessend werden 0,3 ml einer 0,1 m Lösung von Li2CuCl4 in Tetrahydrofuran zugefügt. Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 00 weitergeführt.
Die Aufarbeitung sowie die Hydrolyse von 2-[(R)-3,7-Dimethyl-octanoxy]-tetrahydro- 2H-pyran zu (R)-3,7-Dimethyl-1-octanol erfolgt in der oben angegebenen Weise. Die Ausbeute an (R)-3,7-Dimethyl-1octanol nach Kugelrohrdestillation bei 950/14 Torr beträgt 0,56 g (71%); [(k]020 = +4,0 (c + 1,03, CHCl3).
Eine Lösung von 6,5 g (41 mMol) (R)-3,7-Dimethyl-loctanol und 7,8 g (41 mMol) p-Toluolsulfochlorid in 50 ml absolutem Chloroform wird bei 0" mit 7,9 g (0,1 Mol) absolutem Pyridin versetzt. Die Mischung wird anschliessend 20 Stunden bei 4O gerührt. Zur Aufarbeitung giesst man auf 500 g Eis und extrahiert dreimal mit Chloroform. Die vereinigten organischen Phasen werden zuerst mit kalter in Salzsäure, dann mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung und anschliessend mit gesättigter wässriger Kochsalzlösung gewaschen. Nach Trocknen über Kaliumcarbonat und Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck wird das Rohprodukt an 300 g Kieselgel mit Benzol chromatographiert.
Man erhält 11,4 g (89%) (R)-3,7-Dimethyl-1-octanol ptoluolsulfonat; [a]20 = +2,0 (c = 4,0, Benzol).
Eine Grignard-Lösung aus 2 g Magnesium und 18,3 g (72,6 mMol) 2-[(S)-4-Brom-3 -methylbutoxyj-tetrahydro-2H-pyran in 50 ml abs. Tetrahydrofuran, hergestellt in der nachstehend angegebenen Weise, wird bei -78" mit 11,4 g (36,3 mMol) (R)-3,7-Dimethyl-1-octanol-p-toluolsulfonat und 3 ml einer 0,1-molaren Lösung von Li2CuCl4 in Tetrahydrofuran versetzt.
Die Aufarbeitung sowie die Hydrolyse des Tetrahydro-2 { [(3R,7R)-3,7, 1 1-trimethyldodecyl}-oxy }-2H-pyrans zu (3R,7R)-3,7,11-Trimethyl-l-dodecanols erfolgt in Analogie zur nachstehend beschriebenen Aufarbeitung und Hydrolyse von 2[(R)-3,7-Dimethyl-octanoxy]-tetrahydro-2H-pyran. Das (3R,7R)-3,7,11-Trimethyl-1-dodecanol destilliert bei 114 / 0,04 Torr mit einer Ausbeute von 7,0 g (84% bezogen auf (R)-3,7-Dimethyl-1 -octanol-p-toluolsulfonat); [(t]o2t = + 3,7 O (c = 1,015, n-Octan).
Das im Zuge der Aufarbeitung erhaltene Gemisch von Tetrahydro-2- { [(3R,7R)-3,7,11-trimethyldodecyl]-oxy } -2H-pyran und (3R,7R)-3,7,11-Trimethyl-1-dodecanol kann chromatographisch getrennt werden [mit durch 0,5% wässrigen Ammoniak desaktiviertem Kieselgel; Laufmittel: Toluol]. Das Tetrahydro-2- { [(3R,7R)-3 7,11 -trimethyldodecyl]-oxy}-2H- pyran hat einen optischen Drehwert von [cx]D = + 2,330 (c = 4,0, Chloroform).
Das (3R,7R)-3,7,11-Trimethyl-1-dodecanol kann ebenfalls wie folgt hergestellt werden:
Zu einer Lösung von 5 g (31,6 mMol) (R)-3,7-Dimethyl-1octanol und 9,05 g (34,5 mMol) Triphenylphosphin in 20 ml Methylenchlorid werden 5,65 g (31,8 mMol) N-Bromsuccinimid portionenweise unter Rühren zugefügt. Durch gelegentliche Kühlung des Reaktionsgefässes wird die Temperatur unter 25o gehalten. Nach einer Rührzeit von 30 Min. bei Raumtemperatur wird das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Der Rückstand wird mehrere Male mit n Hexan ausgewaschen, dann filtriert und nochmals mit n-Hexan gewaschen. Die vereinigten n-Hexanphasen werden am Rotationsverdampfer eingeengt. Das Rohprodukt wird an 200 g Kieselgel mit n-Hexan chromatographiert.
Destillation im Kugelrohr bei 105 /15 Torr ergibt 6,1 g (87%) (R)-1-Brom3,7-dimethyloctan; [(2t = -5,0 (c = 0,82, CHCl3).
Eine Grignard-Lösung aus 0,3 g (12,4 mMol) Magnesium und 2,54 g (11,5 mMol) (R)-1-Brom-3,7-dimethyloctan in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran wird in der oben in Beispiel 10 beschriebenen Weise hergestellt. Zu dieser Lösung tropft man bei 0O 1,45 g (5,57 mMol) 2-[(S)-4-Brom.3-methylbut- oxy]-tetrahydro-2H-pyran zu, gefolgt von 0,3 ml einer 0,1 molaren Lösung von Li2CuCl4 in Tetrahydrofuran. Die Reaktionsmischung wird 3 Stunden bei 0 gerührt. Die Aufarbeitung sowie die Hydrolyse des erhaltenen Tetrahydro-2 ([(3R,7R)-3,7,11 -trimethyldodecyl]-oxy -2H-pyrans zu (3R,7R)-3,7,1 1-Trimethyl-1-dodecanol erfolgt in der oben in Beispiel 10 beschriebenen Weise.
Die Ausbeute an (3R,7R) 3,7,11 -Trimethyl- 1-dodecanol beträgt nach Kugelrohrdestilla tion bei 90 bis 950,05 Torr 0,5 g (43 % bezogen auf 2-[(S)-4 Brom-3-methylbutoxyj-tetrahydro-2H-pyran); [a]200 = +3 ,9s (c = 1,05, n-Octan).
3,1 g (13,6 mMol) (3R,7R)-3,7,11 -Trimethyl-l-dodecanol werden mit 4,02 g (15,3 mMol) N-Bromsuccinimid und 2,62 g (14,7 mMol) Triphenylphosphin in 13 ml Methylenchlorid nach der oben in Beispiel 10 beschriebenen Methode behan delt. Nach Chromatographie und Destillation erhält man
3,54 g (90%) (3R,7R)-Brom-3,7,11-trimethyldodecan. Sdp.
90O/0,05 Torr; [(t]20 = -3,6 (c = 1,005, n-Octan).
Das erhaltene (3R,7R)-1-Brom-3,7,1 1-trimethyldodecan kann gemäss Helv. Chem. Acta, Band 46 (1963), Seiten 650
675 in (2R,4'R,82)-(t-Tocopherol oder (2R,4'R,8'R)-ct
Tocopheryl-acetat umgewandelt werden.
Beispiel 12
250 ml etwa 11 n äthanolische Salzsäure werden tropfen weise mit 25,8 g (S)-Dihydro-3-methyl-2(3H)-furanon inner halb 10 Minuten versetzt. Die rasch schwarz werdende Lösung wird bei Raumtemperatur 10 Sekunden gerührt und anschlies send mit Methylenchlorid extrahiert. Die organische Phase wird nacheinander mit gesättigter, wässriger Bicarbonatlösung und Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem
Druck eingeengt. Nach Destillation des Rückstandes bei 15
Torr erhält man 39,7 g (94%) (S)-4-Chlor-2-methyl-butter säureäthylester als farbloses Öl; Siedepunkt: 77-780. [(t]20 = +26,90 (4,15% in Äthanol).
Eine Lösung von 4,9 g (30,0 mMol) (S)-4-Chlor-2-methyl buttersäureäthylester in 50 ml n-Hexan wird bei -70 unter
Argon mit 39 ml einer 20 %igen Lösung von Di-Isobutylalumi niumhydrid in n-Hexan tropfenweise versetzt. Nach beendeter
Reaktion wird das Reaktionsgemisch mit 5 ml Methanol bei - 300 versetzt, anschliessend mit eisgekühlter 1 n Salzsäure hydrolysiert, mit Äther extrahiert, mit Wasser neutral gewa schen, getrocknet und unter vermindertem Druck einge dampft. (30 Badtemperatur). Der Rückstand wird bei 55 bis 58 /15 Torr destilliert. Man erhält 2,3 g (64%) (S)-4-Chlor-2 methylbutyraldehyd als eine farblose Flüssigkeit, [ct]20 = -33,4" (4,21%, CHCl3).
Eine Lösung von 72,0 g Triphenylphosphin und 41,5 g
Isoamylbromid in 250 ml Dimethylformamid wird 2 Stunden unter Rückflussbedingungen erhitzt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert, der Rückstand zweimal aus Methanol/Äther kristallisiert und schliesslich 48 Stunden bei 110o unter stark vermindertem Druck getrocknet. Es verbleiben 70,3 g (61,9%) 3-Methylbutyl-triphenylphosphoniumbromid, Fp. 153 bis 1540 (unkorrigiert).
Zu einer Suspension von 20,4 g 3-Methylbutyl-trimethylphosphoniumbromid in 80 ml trockenem Äther tropft man unter Argon 23,5 ml n-Butyllithium (etwa 2 m in n-Hexan), wobei man durch leichtes Kühlen eine Reaktionstemperatur von etwa 20 einhält. Danach rührt man noch 2 Stunden bei Raumtemperatur. Man kühlt auf -10o und tropft eine Lösung von 5,4 g (S)-4-Chlor-2-methylbutyraldehyd in 5 ml trockenem Äther zu. Der ausfallende Niederschlag wird eine Stunde ohne Kühlbad gerührt, worauf man bei Raumtemperatur 100 ml Dimethylformamid zutropft. Man rührt 16 Stunden bei Raumtemperatur, hydrolysiert durch Zugabe von Eis und extrahiert mit Äther. Die Ätherphase wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt.
Der Rückstand wird durch Adsorption an Kieselgel sowie an neutralem Aluminiumoxid der Aktivitäten III und II gereinigt (Elutionsmittel: n-Hexan). Nach Destillation unter vermindertem Druck (13 mm Torr/90") erhält man 4,13 g (53%) (S)-cis 1-Chlor-3,7-dimethyl-4-octen [(t]20 = +32,6(2,15% in Chloroform).
Eine Lösung von 6,0 g (S)-cis-l -Chlor-3,7-dimethyl-4-octen und 10,8 g Triphenylphosphin in 40 ml Dimethylformamid wird 20 Stunden unter Rückflussbedingungen erhitzt. Man engt unter vermindertem Druck ein und wäscht mit trockenem Äther, bis im Dünnschichtchromatogramm nur noch Spuren von Triphenylphosphin sichtbar sind. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck zunächst bei 50O und später unter stark vermindertem Druck bei Raumtemperatur über Nacht getrocknet. Es verbleiben 9,0 g (60,0%) einer hellbraunen glasigen Masse. Man versetzt mit 20 ml trockenem Äther und tropft 10,5 ml 2 m n-Butyllithiumlösung langsam zu.
Nach einigen Stunden Rühren unter Argon hat sich eine dunkelrote
Suspension gebildet, die bei -10 tropfenweise mit einer Lösung von 2,45 g (S)-4-Chlor-2-methylbutyraldehyd in 3 ml trockenem Äther versetzt wird. Man rührt das Gemisch 1 Stunde ohne Kühlung, tropft dann bei Raumtemperatur 50 ml trockenes Dimethylformamid zu und rührt über Nacht weiter.
Das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von Eis hydrolysiert und mit Äther extrahiert. Der Extrakt wird durch Waschen von Dimethylformamid befreit, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: n-Hexan) gereinigt und im Kugelrohr destilliert (85o/0,05 Torr. Man erhält (3S,7S)-1-Chlor-3,7,11 -trimethyl-4-cis-trans-8-cis-dodeca- dien. Ausbeute 2,7 g (55%). [ct]o20 = -6,5o (4,07% in CHCl3).
Das cis/trans-Verhältnis und damit auch der Drehwert variiert von Ansatz zu Ansatz.
Die erhaltene Verbindung wird zum Beweis der optischen Reinheit an vorhydriertem Platindioxid zu (3R,7R)-1-Chlor
3,7,11 -trimethyldodecan hydriert; Siedepunkt 90 /0,07 Torr.
[(ti205 = -1,20 (4,08% in CHCl3). Das Hydrierungsprodukt wird durch Erhitzen mit trockenem Kaliumacetat in Dimethylformamid (4 Stunden bei 170 ) in den entsprechenden Ester übergeführt. Der Ester wird durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: n-Hexan/Äther 4 + 1) gereinigt, dann weiter umgesetzt zu (3R,7R)-3,7,1 1-Trimethyl-1-dodecanol durch Rühren mit 4n wässriger Kalilauge (30 Min. bei Raumtemperatur).
Man extrahiert, wäscht neutral, trocknet, engt ein, destilliert im Kugelrohr (1150/0,20 Torr) und erhält (3R,7R) 3,7,11-Trimethyl-1-dodecanol [Ausbeute 94% bezogen auf eingesetztes (3R,7R)-1-Chlor-3,7,11-trimethyl-dodecan]. Das Produkt hat einen optischen Drehwert von [U]20 = + 3,76 (4,14% in n-Octan) und ist damit identisch mit authentischem Material.
Das (3S,7S)-1 -Chlor-3,7,11 -trimethyl-4-cis/trans-8-cisdodecadien kann ebenfalls wie folgt hergestellt werden:
Eine Lösung von 4,4 g (S)-1-Chlor-3,7-dimethyl-4-octen in 30 ml Isobutylmethylketon wird mit 7,55 g Natriumjodid 37 Stunden bei 130 gerührt. Man setzt weitere 3,75 g Natriumjodid zu und rührt 4 Stunden weiter. Das Gemisch wird nach Abkühlen auf Raumtemperatur mit Äther verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: n-Hexan) vorgereinigt. Die reinen Fraktionen werden vereinigt und bei 1300/14 Torr destilliert. Man erhält 5,6 g (83,5%) (S)-cis-1-Jod-3,7-dimethyl-4-octen als farblose Flüssigkeit. [U]DO = + 14,30 (2,21% in CHCl3).
Eine Lösung von 6,1 g (S)-cis- 1 -Jod-3 ,7-dimethyl-4-octen und 7,2 g Triphenylphosphin in 40 ml Toluol wird 24 Stunden unter Rückfluss gehalten, dann unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wird solange mit absolutem Äther digeriert, bis im Dünnschichtchromatogramm nur noch Spuren von Triphenylphosphin sichtbar sind. Man erhält 11,8 g (97,4%) (S)-cis-3,7-Dimethyl-4-octen- 1-triphenylphosphoniumjodid. Dieses wird mit 20 ml trockenem Äther überschichtet und in einer Argonatmosphäre unter Rühren und leichtem Kühlen auf Zimmertemperatur tropfenweise mit 22,2 ml einer 2 m Lösung von n-Butyllithium in n-Hexan versetzt.
Man rührt 20 Sekunden bei Zimmertemperatur, kühlt auf -10 ab und tropft eine Lösung von 2,8 g (S)-4-Chlor-2-methylbutyraldehyd in 3 ml trockenem Äther zu. Man rührt 1 Stunde ohne Kühlung, engt unter vermindertem Druck auf kleines Volumen ein, versetzt den Rückstand mit 80 ml Dimethylformamid unter Abkühlung auf Raumtemperatur und rührt die Lösung anschliessend 20 Stunden bei Raumtemperatur. Das Reaktionsgemisch wird auf Eis gegossen, mit Äther extrahiert, durch Waschen mit Wasser von Spuren an Dimethylformamid befreit, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt.
Der Rückstand wird durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: n-Hexan) gereinigt und bei 1000/0,2 Torr destilliert.
Man erhält (3S,7S)-1-Chlor-3,7,11-trimethyl-4-cis/trans-8-cisdodecadien in einer Ausbeute von 1,7 g (30,1%). [a]20 = 5,2 (2,11% in Chloroform).
2,0 g (3S,7S)-1-Chlor-3,7, 1 1-trimethyl-4-cis/trans-8-cis- dodecadien werden mit 2,5 g Triphenylphosphin in 20 ml trockenem Dimethylformamid 24 Stunden unter Rückflussbedingungen erhitzt. Man zieht das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab und digeriert den Rückstand so lange mit trockenem Äther, bis im Dünnschichtchromatogramm nur noch Spuren von Triphenylphosphin sichtbar sind. Der im Feinvakuum getrocknete Rückstand wiegt 1,85 g (44,5% Ausbeute) und besteht aus (3S,7S)-3,7,11-trimethyl-4-cis/ trans-8-cis-dodecadien-1-triphenylphosphoniumchlorid. Unter Argon setzt man nun 10 ml trockenen Äther zu, gefolgt von 1,8 ml 2 m n-Butyllithium in n-Hexan.
Nach 5 Stunden ist eine braunrote Suspension entstanden. Bei -10 tropft man eine Lösung von 900 mg (S)-6-Acetoxy-2-formyl-2,5,7,8-tetrame- thylchroman in 5 ml trockenem Äther in 15 Minuten zu, rührt 1 Stunde ohne Kühlung und versetzt dann mit 30 ml trockenem Dimethylformamid. Das Gemisch wird 18 Stunden bei Raumtemperatur weiter gerührt, mit Eis hydrolysiert, nach Sättigung mit Kochsalz mit Äther extrahiert, von Dimethylformamid frei gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Man reinigt durch Adsorption an Kieselgel, engt ein und reacetyliert den Rückstand in 2 ml trockenem Pyridin mit 2 ml Acetanhydrid (17 Stunden bei Raumtemperatur). Man hydrolysiert das Reaktionsprodukt mit 3 n Salzsäure, Wasser und wässriger Natriumbicarbonatlösung.
Nach Trocknen und Konzentrieren unter vermindertem Druck wird der Rückstand durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: Chloroform) gereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und unter stark vermindertem Druck bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Man erhält 1,29 g (75 %) (2S)-2,5,7,8-Tetrame thyl)-2-[(4S,8S)-4,8,12-trimethyl-1-cis/trans-5-cis/trans-9-cis- tridecatrienyl]-6-chromanylacetat als ein blassgelbes, zähes Öl; [ttio2t = -60,7" (2,11% in CHCl3).
Das Produkt ist ein cis/trans-Isomeren-Gemisch, welches in jedem Ansatz eine andere Zusammensetzung hat und auch unterschiedliche Drehwerte aufweist.
Eine Lösung von 321 mg (2S)-2,5,7,8-Tetramethyl-2 [(4S,8S)-4, 8,12-trimethyl-l -cis/trans-5 -cis/trans-9-cis-trideca- trienyl]-6-chromanylacetat in 5 ml reinem Essigester wird mit Hilfe von 35 mg verhydriertem Platindioxid hydriert. Nach 25 Minuten sind 60,0 ml Wasserstoff aufgenommen. Man filtriert den Katalysator ab, engt das Filtrat unter vermindertem Druck ein und trocknet den Rückstand unter stark vermindertem Druck. Man erhält 319 mg (98,1% (2R,4'R,8iR)-(t-Tocophe- rylacetat als ein farbloses, zähes Öl [ ]DO = +2,20 (2,09% in Cyclohexan), identisch mit authentischem Material.
Ausgehend von (3S,7S)-1-Chlor-3,7,11-trimethyl-4-cis/ trans-8-cis-dodecadien kann man (2R,4'R,8'R)-cr-Tocopheryl- acetat auch auf folgende Weise gewinnen:
Eine Lösung von 1,6 g (3S,7S)-1-Chlor-3,7,11-dimethyl-4cis/trans-8-cis-dodecadien in 20 ml Isobutylmethylketon wird mit 3,0 g Natriumjodid 48 Stunden bei 1300 (Badtemperatur) gerührt. Das Reaktionsgemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, in Äther aufgenommen, mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: n-Hexan) gereinigt.
Nach Destillation bei 100o/0,07 Torr erhält man 1,98 g (90%) (3S,7S)-1-Jod-3,7, 1 1-trimethyl-4-cis/trans-8- cis-dodecadien als farbloses Produkt; [a]D = -7,3O (4,11 % in Chloroform).
Das Produkt ist ein cis/trans-Isomeren-Gemisch, welches in jedem Ansatz eine andere Zusammensetzung hat und auch unterschiedliche Drehwerte aufweist.
Die optische Reinheit des erhaltenen Produktes wird wie folgt geprüft:
Man hydriert an vorhydriertem Platinoxid und tauscht durch Erhitzen mit Kaliumacetat in Dimethylformamid und Verseifen mit 4n wässriger Natronlauge das Jodatom gegen die Hydroxygruppe aus. Das resultierende Produkt, (3R,7R)3,7,11-Trimethyl-1-dodecanol, hat eine Drehung von [(4025 = +40(4,14% in n-Octan) und ist damit identisch mit authentischem, optisch reinem Material.
Eine Lösung von 1,1 g (3S,7S)-1-Jod-3,7'11-trimethyl-4 cis/trans-8-cis-dodecadien, 1,0 g Triphenylphosphin und 10 ml Xylol wird 24 Stunden unter Rückflussbedingungen erhitzt, dann unter vermindertem Druck eingeengt. Man digeriert den Rückstand mit trockenem Äther, bis im Dünnschichtchromatogramm nur noch Spuren von Triphenylphosphin sichtbar sind. Der getrocknete Rückstand besteht aus (3S,7S)-3,7,11trimethyl-4-cis/trans-8-cis-dodecadien-1 -triphenylphosphoniumjodid und wiegt 1,9 g (97%).
Das Phosphoniumsalz wird mit 10 ml trockenem Äther überschichtet und tropfenweise mit 1,6 ml 2 m n-Butyllithium in n-Hexan versetzt und 2 Stunden bei Raumtemperatur nachgerührt. Bei -15 tropft man eine Lösung von 880 ml (S)-6 Acetoxy-2-formyl-2,5 ,7,8-tetramethyl-chroman in 10 ml trockenem Äther in 15 Minuten zu, rührt 1 Stunde ohne Kühlung nach und versetzt dann mit 30 ml trockenem Dimethylformamid. Das Gemisch wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, danach durch Zugabe von Eis hydrolysiert und nach Sättigung mit Kochsalz mit Äther extrahiert. Der Ätherextrakt wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt.
Man reinigt durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: Chloroform), engt ein und re-acetyliert den Rückstand in 2 ml trockenem Pyridin mit 2 ml Acetanhydrid (17 Stunden bei Raumtemperatur). Man hydrolysiert das erhaltene Produkt mit Eis, extrahiert mit Äther und wäscht die Ätherphase mit 3n Salzsäure, Wasser und wässriger Natriumbicarbonatlösung. Nach Trocknen und Konzentrieren unter vermindertem Druck wird der Rückstand erneut durch Adsorption an Kieselgel (Elutionsmittel: Chloroform) gereinigt, unter vermindertem Druck eingeengt und dann unter stark vermindertem Druck bis zur Gewichtskonstanz getrocknet.
Man erhält 459 mg (31%) (2S)-2,5,7,8-Tetramethyl-2 [(4S ,8S)-4,8,12-trimethyl-1 -cis/trans-5 -cis/trans-9-cis-trideca- trienyl]-6-chromanylacetat als ein blass gelbliches Öl. [ ]20 = -41,30 (0,75% in CHCb).
Das Produkt ist ein cis/trans-Isomeren-Gemisch, welches in jedem Ansatz eine andere Zusammensetzung hat und auch verschiedene Drehwerte aufweist.
Eine Lösung von 400 mg (2S)-2,5,7,8-Tetramethyl-2 [(4S,8S) -4,8,12-trimethyl- I -cis/trans-5 -cis/trans-9-cis-trideca- trienyl]-6-chromanylacetat in 5 ml reinem Essigester wird mit Hilfe von 50 mg vorhydriertem Platindioxid hydriert. Nach 40 Minuten sind 68 ml Wasserstoff aufgenommen. Man filtriert den Katalysator ab, engt das Filtrat unter vermindertem Druck ein und trocknet den Rückstand unter stark vermindertem Druck nach. Man erhält 396 mg (97,7%) (2R,4'R,8'R)-(t- Tocopherylacetat in 99,7% Reinheit. [(t]20 = + 2,20 + 0,5O (1,07% in Cyclohexan), identisch mit authentischem (2R,4'R, 8'R)- tt--Tocopherylacetat.
Beispiel 13
Zu 2,3 ml einer Lösung von 1,01 n Natriumäthylat in Äthanol in einem mit Rückflusskühler und Calciumchloridrohr versehenen Kolben, tropft man 300 mg (2,3 mMol) Acetessigsäureäthylester und anschliessend 671 mg (2,3 mMol) (3R,7R)-1-Brom-3,7,11-trimethyldodecan in 2 ml Äthanol zu.
Die Mischung wird unter Rühren 15 Stunden unter Rückflussbedingungen zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen setzt man soviel Eiswasser zu, dass das abgeschiedene Salz gerade gelöst wird, trennt im Scheidetrichter die organische Phase ab und schüttelt sie viermal mit Methylenchlorid aus. Nach Trocknen der vereinigten organischen Phasen über Magnesiumsulfat und Abdestillieren des Lösungsmittels erhält man 755 mg rohen (5R,9R)-2-Acetyl-5,9,13-trimethyl-tetradecan- säureäthylester.
Für analytische Zwecke wird eine Probe des rohen (5R,9R)-2-Acetyl-5,9,13-trimethyl-tetradecansäure- äthylesters an einer präparativen Kieselgelplatte mit Toluol/ Hexan/Essigsäureäthylester = 30:10:3 chromatographiert und der so erhaltene reine (5R,9R)-2-Acetyl-5,9,13-trimethyl- tetradecansäureäthylester bei 150 /0,03 Torr destilliert; [(t]36 5 -= -4,00(c = 1,04; CHCl3).
Eine Lösung von 154 mg (5R,9R)-2-Acetyl-5,9,13-trime- thyl-tetradecansäureäthylester in 5 ml Äthanol wird bei einer Temperatur von 80 tropfenweise mit 1 ml 10% Natronlauge versetzt. Die Reaktionsmischung wird anschliessend 3,5 Stunden unter Rückflussbedingungen zum Sieden erhitzt. Die kalte Reaktionsmischung wird mit in wässriger Salzsäure neutralisiert und viermal mit Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden zuerst mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen und dann über Magnesiumsulfat getrocknet.
Nach Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck und Destillieren bei 1500/0,03 Torr erhält man 118 mg (95%) (6R,10R)-(6R,10R)-14-Trimethylpentadeca- non-2 (Hexahydrofarnesylaceton). [(Liit3s = +7,55 (c = 1,57; n-Octan). Das ORD-Spektrum ist identisch mit demjenigen von (6R,lOR)-14-Trimethylpentadecanon-2 hergestellt aus natürlichem Phytol (Helv. Chem. Acta, 47, 1964, Seiten 221 ff).
Das erhaltene (6R, 1OR)-14-Trimethylpentadecanon-2 kann z.B. gemäss J. Chem. Soc. (C), 1966, Seiten 2144-2176 bzw.
Helv. Chim. Acta, 48, 1965 Seiten 1332-1347 in natürliches Vitamin Kl übergeführt werden.