CH625833A5 - Method for the determination of acid phosphatase - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft, in welchem ein Reagens zur Aktivierung der sauren Phosphatase Verwendung findet. The present invention relates to an improved method for determining the acid phosphatase of human origin, in which a reagent for activating the acid phosphatase is used.
Die saure Phosphatase ist ein Enzym, welches die Fähigkeit besitzt, im sauren pH-Bereich optimal Phosphomonoester zu spalten. Die saure Phosphatase menschlicher Herkunft kommt The acidic phosphatase is an enzyme which has the ability to optimally cleave phosphomonoesters in the acidic pH range. The acid phosphatase of human origin is coming
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
3 3rd
625 833 625 833
in verschiedenen Organen, wie z. B. in der Prostata, in der Leber, in der Milz oder in Blutzellen vor und geht bei Zellschädigungen in das Serum über. Die Bestimmung der sauren Phosphatase in Körperflüssigkeiten, insbesondere im Serum oder im Plasma spielt somit eine wichtige Rolle in der Diagnose von 5 Erkrankungen der betreffenden Organen. in various organs, such as B. in the prostate, in the liver, in the spleen or in blood cells and passes into the serum in case of cell damage. The determination of acid phosphatase in body fluids, especially in serum or plasma, therefore plays an important role in the diagnosis of 5 diseases of the organs in question.
Die Aktivität der sauren Phosphatase im Serum oder Plasma wird von allem beim Vorliegen eines Prostatakarzinoms oder einer Prostatahypertrophie wesentlich erhöht und die Bestimmung dieser Prostataphosphatase-Aktivität ermög- 10 licht die Diagnose dieser spezifischen Erkrankungen. The activity of the acid phosphatase in serum or plasma is significantly increased by everything in the presence of prostate cancer or prostate hypertrophy and the determination of this prostate phosphatase activity enables the diagnosis of these specific diseases.
In Chemical Abstracts Vol. 42, No. 22,1948,8838g wird erwähnt, dass Alkohole mit bis zu 3 C-Atomen die Aktivität der sauren Phosphatase zu erhöhen vermögen. Entsprechende Versuche haben gezeigt, dass dies nicht zutrifft und dass 15 In Chemical Abstracts Vol. 42, No. 22,1948,8838g it is mentioned that alcohols with up to 3 carbon atoms are able to increase the activity of the acid phosphatase. Appropriate experiments have shown that this is not the case and that 15
namentlich Methanol, Äthanol und n-Propanol keinen Einfluss auf die Aktivität der sauren Phosphatase haben. Demgegenüber wurde nun im Rahmen der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Aktivität der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft durch Zusatz eines geradkettigen Alkohols mit 4 bis 6 2o C-Atomen wesentlich erhöht werden kann. Da die Aktivität der sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in Körperflüssigkeiten relativ gering ist, bedeutet eine Erhöhung dieser Aktivität einen eindeutigen technischen Fortschritt im Hinblick auf die Bestimmung dieses wichtigen Enzyms. 25 especially methanol, ethanol and n-propanol have no influence on the activity of the acid phosphatase. In contrast, it has now been found within the scope of the present invention that the activity of the acid phosphatase of human origin can be significantly increased by adding a straight-chain alcohol having 4 to 6 20 carbon atoms. Since the activity of acidic phosphatase of human origin in body fluids is relatively low, an increase in this activity means a clear technical advance with regard to the determination of this important enzyme. 25th
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein verbessertes Verfahren zur Bestimmung der sauren Phosphatase unter Verwendung eines Aktivators enthaltend einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen. The present invention thus relates to an improved method for determining the acid phosphatase using an activator containing a straight-chain alcohol having 4 to 6 carbon atoms.
Genauer gesagt betrifft die vorliegende Erfindung ein Ver- 30 fahren zur Bestimmung einer sauren Phosphatase menschlicher Herkunft in einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Lösung, enthaltend als Substrat 50 jimol/1 bis 50 mmol/1 eines Phosphomonoesters, 50 bis 300 mmol/1 einer Puffersubstanz zum Einstellen eines pH-Wertes 35 zwischen 4,5 und 6,5 und 10 bis 300 mmol/1 eines Aktivators enthaltend mindestens einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen bei einer Inkubationstemperatur zwischen 20 °C und 45 °C der Phosphatase-Wirkung in der zu untersuchenden Körperflüssigkeit unterwirft und den Substrat-Umsatz misst. 40 More specifically, the present invention relates to a method for determining an acid phosphatase of human origin in a body fluid, characterized in that a solution containing 50 μmol / 1 to 50 mmol / 1 of a phosphomono ester, 50 to 300 mmol / 1 of a buffer substance for adjusting a pH 35 between 4.5 and 6.5 and 10 to 300 mmol / 1 of an activator containing at least one straight-chain alcohol with 4 to 6 C atoms at an incubation temperature between 20 ° C and 45 ° C the phosphatase effect in the body fluid to be examined and measures the substrate conversion. 40
Der als Substrat für die enzymatische Reaktion verwendete Phosphomonoester besitzt die allgemeine Formel The phosphomonoester used as the substrate for the enzymatic reaction has the general formula
R-O-PO3H2 R-O-PO3H2
45 45
worin R ein beliebiger organischer Rest ist. where R is any organic residue.
Vorzugsweise ist jedoch R ein Chromophor, wie z. B. 4-Nitrophenyl,Thymolphthalein, Phenolphthalein, 2-Chlor-4-nitrophenyl; oder ein Fluorophor wie z. B. 1-Naphthyl. Als R kann aber auch Adenosin, Glycerin oder Phenyl in Frage kom- 50 men. However, R is preferably a chromophore, such as. B. 4-nitrophenyl, thymolphthalein, phenolphthalein, 2-chloro-4-nitrophenyl; or a fluorophore such as e.g. B. 1-naphthyl. Adenosine, glycerol or phenyl can also be used as R 50.
Für die eingesetzte Substratmenge wird vorzugsweise eine optimale Konzentration gewählt, die bei den einzelnen Substraten verschieden ist und auch vom pH-Wert beeinflusst wird. Die optimale Substratkonzentration, die bei einem bestimmten 55 pH-Wert die maximal mögliche Enzym-Aktivität bewirkt, kann an Hand einer Substrat-Aktivitätskurve abgelesen werden. For the amount of substrate used, an optimal concentration is preferably selected, which is different for the individual substrates and is also influenced by the pH. The optimal substrate concentration, which causes the maximum possible enzyme activity at a specific pH value, can be read off using a substrate activity curve.
Die Substrat-Aktivitätskurve für ein bestimmtes Substrat wird dadurch erhalten, dass unter sonst gleichen Bedingungen die Enzym-Aktivität mit verschiedenen Substrat-Konzentratio- 60 nen gemessen wird. The substrate activity curve for a specific substrate is obtained by measuring the enzyme activity with different substrate concentrations under otherwise identical conditions.
Die Substratkonzentration für die saure Phosphatase liegt erfindungsgemäss zwischen 50 jimol/1 und 50 mmol/1; vorzugsweise 60 (imol/1 und 25 mmol/1. So beträgt bei einem pH-Wert von 5,5 die optimale Substratkonzentration ungefähr 25 mmol/165 für ß-Glycerophosphat, 2,5 mmol/1 für 4-Nitrophenylphosphat und 100 jimol/I für Phenolphthalein-diphosphat. According to the invention, the substrate concentration for the acid phosphatase is between 50 jimol / 1 and 50 mmol / 1; preferably 60 (imol / 1 and 25 mmol / 1. Thus, at a pH of 5.5, the optimal substrate concentration is approximately 25 mmol / 165 for β-glycerophosphate, 2.5 mmol / 1 for 4-nitrophenyl phosphate and 100 jimol / I for phenolphthalein diphosphate.
In dem erfindungsgemässen Verfahren wird der pH-Wert mittels einer Puffersubsjanz zwischen 4,5 und 6,5, vorzugsweise zwischen 5 und 6 eingestellt. Geeignete Puffersubstanzen sind z. B. Citratpuffer und Acetatpuffer. Die Pufferkonzentration liegt in der Regel zwischen 50 mmol/1 und 300 mmol/I, vorzugsweise 100mmol/I. In the method according to the invention, the pH is adjusted between 4.5 and 6.5, preferably between 5 and 6, by means of a buffer substance. Suitable buffer substances are e.g. B. citrate buffer and acetate buffer. The buffer concentration is usually between 50 mmol / 1 and 300 mmol / I, preferably 100 mmol / I.
Gemäss vorliegender Erfindung enthält der verwendete Aktivator einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise n-Butanol, n-Pentanol und 1,5-Pentandiol. Besonders bevorzugt sind 1-Pentanol und 2-Pentanol. According to the present invention, the activator used contains a straight-chain alcohol having 4 to 6 carbon atoms, preferably n-butanol, n-pentanol and 1,5-pentanediol. 1-Pentanol and 2-pentanol are particularly preferred.
Die Konzentration des Aktivators beträgt 10 bis 300 mmol/1, vorzugsweise 100 bis 200 mmol/1. The concentration of the activator is 10 to 300 mmol / 1, preferably 100 to 200 mmol / 1.
Der Aktivator kann einen oder mehrere geradkettige Alkohole mit 4 bis 6 C-Atomen enthalten. Mit Vorzug besteht jedoch der Aktivator aus einem einheitlichen, geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen. The activator can contain one or more straight-chain alcohols with 4 to 6 carbon atoms. However, the activator preferably consists of a uniform, straight-chain alcohol having 4 to 6 carbon atoms.
Nach Vermischen einer Probe der zu analysierenden Körperflüssigkeit mit der Testlösung erfolgt die enzymatische Reaktion durch Inkubieren der Lösung bei einer definierten Reaktionstemperatur, die zwischen 20 und 45 °C, vorzugsweise zwischen 30 bis 37 °C liegt. Die Inkubationsdauer beträgt in der Regel zwischen 5 und 60 Minuten. Vorzugsweise wird jedoch die Reaktion nach 30 Minuten mittels einem geeigneten Zusatz wie z. B. mittels Natronlauge oder einer Trinatriumphosphatlö-sung abgestoppt. After mixing a sample of the body fluid to be analyzed with the test solution, the enzymatic reaction is carried out by incubating the solution at a defined reaction temperature which is between 20 and 45 ° C., preferably between 30 and 37 ° C. The incubation period is usually between 5 and 60 minutes. However, the reaction is preferably carried out after 30 minutes by means of a suitable additive such as. B. stopped by means of sodium hydroxide solution or a trisodium phosphate solution.
Bei Auswahl eines geeigneten Substrates wie z. B. 2-Chlor-4-nitrophenylphosphat ist es auch möglich, die enzymatische Reaktion kinetisch zu messen. When choosing a suitable substrate such. B. 2-chloro-4-nitrophenyl phosphate, it is also possible to measure the enzymatic reaction kinetically.
Der Substrat-Umsatz ist die Messgrösse für die Enzym-Aktivität. Er wird gemessen, indem die Abnahme des eingesetzten Phosphomonoesters oder die Zunahme des freigesetzten organischen Restes bestimmt wird. Da die Aktivierung der sauren Phosphatase durch eine Transphosphorylierung, d. h. eine Phosphatübertragung vom eingesetzten Phosphomonoester auf den als Aktivator eingesetzten Alkohol erfolgt, entspricht die Menge des freien Phosphats nach der enzymatischen Reaktion nicht dem Substratumsatz und kann dementsprechend nicht als dessen Mass genommen werden. The substrate turnover is the measure of the enzyme activity. It is measured by determining the decrease in the phosphomonoester used or the increase in the organic residue released. Since the activation of the acid phosphatase by transphosphorylation, i.e. H. a phosphate transfer from the phosphomonoester used to the alcohol used as an activator, the amount of free phosphate after the enzymatic reaction does not correspond to the substrate conversion and accordingly cannot be taken as its measure.
Die Art der Messung hängt vom eingesetzten Substrat ab. So kann bei Verwendung von 4-Nitro-phenylphosphat, Thy-molphthaleinphosphat, Phenolphthaleinphosphat oder bei Verwendung von Naphthylphosphat die Zunahme des freigesetzten organischen Rests nach geeignetem Abstoppen der enzymatischen Reaktion direkt photometrisch bzw. fluorimetrisch bestimmt werden. The type of measurement depends on the substrate used. For example, when using 4-nitrophenylphosphate, thymolphthaleinphosphate, phenolphthaleinphosphate or when using naphthylphosphate, the increase in the organic residue released can be determined directly photometrically or fluorimetrically after the enzymatic reaction has been appropriately stopped.
Bei Verwendung anderer Substrate wie z. B. ß-Glycerophosphat, Phenylphosphat oder Adenosinmonophosphat erfolgt die Messung des Substratumsetzes in der Weise, dass der freigesetzte organische Rest chemisch oder enzymatisch in eine Substanz umgewandelt wird, die photometrisch gemessen werden kann. When using other substrates such. B. β-glycerophosphate, phenyl phosphate or adenosine monophosphate, the substrate conversion is measured in such a way that the released organic residue is converted chemically or enzymatically into a substance that can be measured photometrically.
So wird z. B. bei Verwendung von Phenylphosphat, das freigesetzte Phenol mit Hilfe des Phenolreagens [Folin-Ciocalteus, Merck 9001] in einen blauen Farbstoff umgewandelt. So z. B. when using phenyl phosphate, the released phenol is converted into a blue dye using the phenol reagent [Folin-Ciocalteus, Merck 9001].
Das erfindungsgemässe Verfahren eignet sich sowohl für manuelle wie für automatische Bestimmungen der sauren Phosphatase. Als Bestimmungsgut können z. B. Serum, Plasma, Blut, Liquor oder Urin verwendet werden. The method according to the invention is suitable for both manual and automatic determinations of acid phosphatase. As a destination, z. B. serum, plasma, blood, cerebrospinal fluid or urine can be used.
Den zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Reagenzien, nämlich Phosphomonoester, Puffer und Aktivator, können für diagnostische Zwecke geeignete Zusätze wie z. B. Detergentien wie Brij-35 (Polyoxyäthylenlau-ryläther) oder Stabilisatoren wie Magnesium-Ionen zugesetzt werden. The reagents necessary for carrying out the method according to the invention, namely phosphomonoesters, buffers and activators, can be used for diagnostic purposes, such as suitable additives such. B. Detergents such as Brij-35 (Polyoxyäthylenlau-ryläther) or stabilizers such as magnesium ions can be added.
Die Reagentien werden vorzugsweise in eine Reagenziengarnitur verpackt. Eine für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignete Reagenziengarnitur enthält mit Vorteil in einem oder in mehreren Behältern a) einen Phosphomonoester, The reagents are preferably packaged in a reagent set. A reagent set suitable for the purposes of the present invention advantageously contains a phosphomonoester in one or more containers a),
625833 625833
4 4th
b) eine Puffersubstanz zum Erstellen eines pH-Wertes zwischen 4,5 und 6,5, b) a buffer substance for establishing a pH value between 4.5 and 6.5,
c) einen geradkettigen Alkohol mit 4 bis 6 C-Atomen als Aktivator. c) a straight-chain alcohol with 4 to 6 carbon atoms as an activator.
Die Reagenziengarnitur kann auch noch zusätzlich einen Behälter mit einer Kontroll- oder Eichlösung und/oder einen Behälter mit einem Reagens zum Abstoppen der Reaktion und/ oder einen Behälter mit einem zur weiteren Umwandlung des freigesetzten organischen Rests und/oder einen Behälter mit den erwähnten, für diagnostische Zwecke geeigneten Zusätze wie Detergentien oder Stabilisatoren, enthalten. The reagent set can also additionally contain a container with a control or calibration solution and / or a container with a reagent to stop the reaction and / or a container with one for further conversion of the released organic residue and / or a container with the mentioned, for suitable additives for diagnostic purposes such as detergents or stabilizers.
Es ist jedoch nicht notwendig, Reagenzien und Zusätze in separaten Behältern aufzubewahren. Die vorliegende Erfindung umfasst auch eine Reagenziengarnitur, worin einige der zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens notwendigen Bestandteile gemeinsam im gleichen Behälter aufbewahrt werden. However, it is not necessary to store reagents and additives in separate containers. The present invention also comprises a reagent set, in which some of the components necessary for carrying out the method according to the invention are kept together in the same container.
So kann z. B. die Puffersubstanz zusammen mit dem Aktivator in gelöster Form in einem einzigen Behälter aufbewahrt werden. So z. B. the buffer substance can be stored together with the activator in dissolved form in a single container.
Mit Ausnahme des Aktivators, welcher stets in flüssiger Form vorliegt, können die verschiedenen Reagenzien und Zusätze sowohl in flüssiger als auch in fester Form, wie z. B. als Pulver, Granulat, Tabletten oder Lyophilisat verpackt werden. With the exception of the activator, which is always in liquid form, the various reagents and additives can be in both liquid and solid form, e.g. B. packed as powder, granules, tablets or lyophilisate.
Die Erfindung wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert. The invention is illustrated by the examples below.
Beispiel 1 example 1
Zu 2,0 ml Substratpufferlösung, bestehend aus 0,1 mol/1 Citratpuffer (pH 5,25), 5 g/1 Brij-35 und 5 mmol/14-Nitrophenyl-phosphat, mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,1 ml saure Prostataphosphataselösung (isoliert nach der Methode von Lam et al., Clin. Chem. 19,483,1973) zugemischt und bei 37 °C während 30 Minuten inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 1,0 ml 1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitro-Phenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch gemessen. To 2.0 ml of substrate buffer solution, consisting of 0.1 mol / 1 citrate buffer (pH 5.25), 5 g / 1 Brij-35 and 5 mmol / 14-nitrophenyl phosphate, with different contents of 1-pentanol, 1 ml of acidic prostate phosphatase solution (isolated according to the method of Lam et al., Clin. Chem. 19, 483, 1973) was mixed in and incubated at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction is stopped by adding 1.0 ml of 1N sodium hydroxide solution and the released 4-nitro-phenolate is measured photometrically at a wavelength of 405 nm.
Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle I in % der Prostataphosphatase-Aktivität ohne Zusatz von 1-Pentanol wiedergegeben. The test results are shown in Table I below in% of the prostate phosphatase activity without the addition of 1-pentanol.
1-Pentanol 1-pentanol
Aktivität der Activity of
Konzentration concentration
Prostataphosphatase in der Testlösung Prostate phosphatase in the test solution
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
50 mmol/1 50 mmol / 1
137% 137%
100 mmol/1 100 mmol / 1
173% 173%
150 mmol/1 150 mmol / 1
189% 189%
200 mmol/1 200 mmol / 1
139% 139%
Beispiel 2 Example 2
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 2-Penta nol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle I The procedure of Example 1 is repeated with 2-penta nol instead of 1-pentanol. The test results are shown in Table I below
I in gleicher Weise wiedergegeben. I reproduced in the same way.
2-Pentanol 2-pentanol
Aktivität der Activity of
Konzentration concentration
Prostataphosphatase in der Testlösung Prostate phosphatase in the test solution
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
50 mmol/1 50 mmol / 1
138% 138%
100 mmol/1 100 mmol / 1
172% 172%
150 mmol/1 150 mmol / 1
190% 190%
200 mmol/1 139% 200 mmol / 1 139%
Beispiel 3 Example 3
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1,5-Pen-tandiol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle III wiedergegeben. The procedure of Example 1 is repeated with 1,5-pentanediol instead of 1-pentanol. The test results are shown in Table III below.
1,5-Pentandiol Konzentration in der Testlösung 1,5-pentanediol concentration in the test solution
Aktivität der Prostataphosphatase Prostate phosphatase activity
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
50 mmol/1 50 mmol / 1
120% 120%
100 mmol/1 100 mmol / 1
131% 131%
150 mmol/1 150 mmol / 1
140% 140%
200 mmol/1 200 mmol / 1
148% 148%
Beispiel 4 Example 4
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1-Buta-nol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle IV wiedergegeben. The procedure of Example 1 is repeated with 1-butanol instead of 1-pentanol. The test results are shown in Table IV below.
1-Butanol Konzentration in der Testlösung 1-butanol concentration in the test solution
Alktivität der Prostataphosphatase Alactivity of prostate phosphatase
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
50 mmol/1 50 mmol / 1
119% 119%
100 mmol/1 100 mmol / 1
131% 131%
150 mmol/1 150 mmol / 1
131% 131%
200 mmol/1 200 mmol / 1
116% 116%
Beispiel 5 Example 5
Das Verfahren nach Beispiel 1 wird wiederholt mit 1-Hexa-nol anstatt 1-Pentanol. Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle V wiedergegeben. The procedure of Example 1 is repeated with 1-hexanol instead of 1-pentanol. The test results are shown in Table V below.
1-Hexanol 1-hexanol
Aktivität der Activity of
Konzentration concentration
Prostataphosphatase in der Testlösung Prostate phosphatase in the test solution
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
25 mmol/1 25 mmol / 1
107% 107%
50 mmol/1 50 mmol / 1
114% 114%
100 mmol/1 100 mmol / 1
120% 120%
Beispiel 6 Example 6
Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH 5,5 mit 62 |imol/l Phe-nolphthalein-di-Phosphat mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml Prostataphosphataselösung zugegeben und die Lösung während 15 Minuten bei 37 °C inkubiert. Zum Abstoppen der Reaktion sowie zur Farbentwicklung werden 2,0 ml 0,4 mol/1 Natriumphosphatpuffer, pH 10 zugemischt und die Farbintensität bei der Wellenlänge 546 nm gemessen. 0.05 ml of prostate phosphatase solution are added to 2.0 ml of 0.1 mol / 1 acetate buffer, pH 5.5 with 62 μmol / l of phenolphthalein di-phosphate with different contents of 1-pentanol, and the solution over 15 minutes incubated at 37 ° C. To stop the reaction and to develop the color, 2.0 ml of 0.4 mol / 1 sodium phosphate buffer, pH 10 are mixed in and the color intensity is measured at the wavelength of 546 nm.
Die Versuchsergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle VI wiedergegeben. The test results are shown in Table VI below.
1-Pentanol Konzentration in derTestlösung 1-pentanol concentration in the test solution
Aktivität der Prostataphosphatase Prostate phosphatase activity
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
50 mmol/1 50 mmol / 1
154% 154%
100 mmol/1 100 mmol / 1
174% 174%
150 mmol/I 150 mmol / l
177% 177%
200 mmol/1 200 mmol / 1
131% 131%
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
5 5
625 833 625 833
Beispiel 7 Example 7
Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer (pH 5,5) 5 mmol/14-Nitro-phenylphosphat und 5 g/I Brij-35 mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,1 ml Erythrozytenphosphatase zugemischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 1,0 ml 1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitrophenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch bestimmt. 0.1 ml of erythrocyte phosphatase is mixed into 2.0 ml of 0.1 mol / 1 acetate buffer (pH 5.5), 5 mmol / 14-nitrophenyl phosphate and 5 g / l Brij-35 with different contents of 1-pentanol. After 30 minutes of incubation at 37 ° C., the enzyme reaction is stopped by adding 1.0 ml of 1 N sodium hydroxide solution and the released 4-nitrophenolate is determined photometrically at the wavelength 405 nm.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII wiedergegeben. The test results are shown in Table VII below.
1-Pentanol Konzentration in der Testlösung 1-pentanol concentration in the test solution
Aktivität der Activity of
Erythrozytenphosphatase Erythrocyte phosphatase
0 mmol/1 0 mmol / 1
100% 100%
50 mmol/1 50 mmol / 1
132% 132%
100 mmol/1 100 mmol / 1
153% 153%
150 mmol/1 150 mmol / 1
162% 162%
200 mmol/1 200 mmol / 1
136% 136%
Beispiel 8 Example 8
Zu 0,5 ml 0,1 mol/1 Citratpuffer, pH 5,5 und 5 mmol/14-Nitro-phenylphosphat werden 0,1 ml Serum zugemischt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,5 ml 0,1 N Natronlauge abgestoppt und das freigesetzte 4-Nitrophenolat bei der Wellenlänge 405 nm photometrisch gemessen. Diese Aktivitätsbestimmung der sauren Phosphatase wird einmal ohne 1-Pentanol und einmal mit 150 mmol/11-Pentanol durchgeführt. 0.1 ml of serum is added to 0.5 ml of 0.1 mol / 1 citrate buffer, pH 5.5 and 5 mmol / 14-nitrophenylphosphate. After 30 minutes of incubation at 37 ° C., the enzyme reaction is stopped by adding 2.5 ml of 0.1N sodium hydroxide solution and the released 4-nitrophenolate is measured photometrically at a wavelength of 405 nm. This activity determination of the acid phosphatase is carried out once without 1-pentanol and once with 150 mmol / 11-pentanol.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII wiedergegeben. The test results are shown in Table VIII below.
Probe sample
Aktivität ohne 1-Pentanol (U/1) Activity without 1-pentanol (U / 1)
Aktivität mit 150 mmol/1 an 1 -Pentanol (U/1) Activity with 150 mmol / 1 of 1 -pentanol (U / 1)
Serum 1 Serum 1
1,12 1.12
2,10 2.10
Serum 2 Serum 2
16,63 16.63
24,55 24.55
Serum 3 Serum 3
18,41 18.41
31,53 31.53
Serum 4 Serum 4
20,65 20.65
33,59 33.59
Beispiel 9 Example 9
Zu 2,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH 5,5 und verschiedenen Konzentrationen an Phenylphosphat werden 0,1 ml Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 37 °C werden 0,5 ml Phenolreagens [Folin-Ciocalteus] und 1,0 ml 20%ige NazCOä-Lösung zupipettiert und die Mischung weitere 10 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Intensität des blauen Farbstoffes, der der Konzentration an freigesetztem Phenol entspricht, wird bei der Wellenlänge 578 nm bestimmt. Die Versuche werden parallel einmal ohne 1-Pentanol und einmal mit 150 mmol/1 Pentanol-1 in der Substratpufferlösung durchgeführt. 0.1 ml of prostate phosphatase solution is added to 2.0 ml of 0.1 mol / l acetate buffer, pH 5.5 and various concentrations of phenyl phosphate. After 5 minutes of incubation at 37 ° C., 0.5 ml of phenol reagent [Folin-Ciocalteus] and 1.0 ml of 20% NazCOa solution are pipetted in and the mixture is incubated at 37 ° C. for a further 10 minutes. The intensity of the blue dye, which corresponds to the concentration of released phenol, is determined at the wavelength of 578 nm. The experiments are carried out in parallel once without 1-pentanol and once with 150 mmol / 1 pentanol-1 in the substrate buffer solution.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX wiedergegeben. The test results are shown in Table IX below.
Phenylphosphat- ohne 1-Pentanol AE 578 mit 150 mmol/1 konzentrationin nm/5mjn Pentanol-1 AE 578 nm/5min der Testlösung Phenylphosphate - without 1-pentanol AE 578 with 150 mmol / 1 concentration in nm / 5mjn pentanol-1 AE 578 nm / 5min of the test solution
0,078 mmol/1 0.078 mmol / 1
0,105 0.105
0,169 0.169
0,155 mmol/1 0.155 mmol / 1
0,150 0.150
0,280 0.280
0,312 mmol/1 0.312 mmol / 1
0,198 0.198
0,390 0.390
0,625 mmol/1 0.625 mmol / 1
0,245 0.245
0,490 0.490
1,25 mmol/1 1.25 mmol / 1
0,275 0.275
0,550 0.550
2,50 mmol/1 2.50 mmol / 1
0,280 0.280
0,590 0.590
5,00 mmol/1 5.00 mmol / 1
0,280 0.280
0,590 0.590
Beispiel 10 Example 10
Zu 1,0 ml 0,1 mol/1 Acetatpuffer (pH 5,5) und 0,5 mmol/1 Phe-nolphthalein-Monophosphat mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml gereinigte Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,4 mol/1 Natriumphosphatpuffer vom pH abgestoppt und das freigesetzte Phenolphthalein bei der Wellenlänge 546 nm photometrisch bestimmt. 0.05 ml of purified prostate phosphatase solution are mixed into 1.0 ml of 0.1 mol / 1 acetate buffer (pH 5.5) and 0.5 mmol / 1 phenolphthalein monophosphate with different contents of 1-pentanol. After 10 minutes of incubation at 37 ° C., the enzyme reaction is stopped by adding 2.0 ml of 0.4 mol / 1 sodium phosphate buffer and the released phenolphthalein is determined photometrically at a wavelength of 546 nm.
Die Versuchsergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle X wiedergegeben. The test results are shown in Table X below.
1-Pentanolkonzentration Aktivität der Prostata in der T estlösung phosphatase 1-Pentanol concentration Activity of the prostate in the test solution phosphatase
0 mmol/1 100% 0 mmol / 1 100%
50 mmol/1 125% 50 mmol / 1 125%
100mmol/l 135% 100mmol / l 135%
150 mmol/1 140% 150 mmol / 1 140%
Beispiel 11 Example 11
Zu 1,0 ml 0,1 mol/1 Citratpuffer (pH 5,75), 1,2 mmol/1 Thy-molphthaleinphosphat, 5 g/I Barij-35 mit unterschiedlichem Gehalt an 1-Pentanol werden 0,05 ml gereinigte Prostataphosphataselösung zugemischt. Nach 10 Minuten Inkubation bei 37 °C wird die Enzymreaktion durch Zugabe von 2,0 ml 0,2 mol/1 Bicarbonatpuffer vom pH 10 abgestoppt und das freigesetzte Thymolphthalein bei der Wellenlänge 578 nm photometrisch gemessen. To 1.0 ml of 0.1 mol / 1 citrate buffer (pH 5.75), 1.2 mmol / 1 of thymolphthalein phosphate, 5 g / l of Barij-35 with different contents of 1-pentanol, 0.05 ml of purified prostate phosphatase solution added. After 10 minutes of incubation at 37 ° C., the enzyme reaction is stopped by adding 2.0 ml of 0.2 mol / 1 bicarbonate buffer of pH 10 and the released thymolphthalein is measured photometrically at the wavelength of 578 nm.
Die Resultate sind in der folgenden Tabelle XI zusammengestellt. The results are summarized in Table XI below.
1-Pentanolkonzentration Aktivität der Prostata in der Testlösung phosphatase 1-Pentanol concentration Activity of the prostate in the test solution phosphatase
0 mmol/1 100% 0 mmol / 1 100%
50 mmol/1 117% 50 mmol / 1 117%
100 mmol/1 125% 100 mmol / 1 125%
150 mmol/1 140% 150 mmol / 1 140%
5 5
10 10th
15 15
20 20th
25 25th
30 30th
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
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