CH624924A5 - - Google Patents
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Description
La présente invention est relative a un procédé de fabrication de nouveaux polypeptides et des sels d'addition d'acide non toxiques de ces composés.
L'abréviation LRH ou LH-RH désigne l'hormone naturelle de libération de la LH (hormone lutéinisante) et de la FSH (hormone folliculostimulante).
On a produit et essayé récemment de nombreux analogues de la LRH à titre d'agents provoquant l'ovulation. Une modification de la séquence des aminoacides de LRH, qui a été la plus avantageuse jusqu'à présent, a consisté en l'enlèvement du groupe Gly10 et en la production de la terminaison Pro-NHC2H5, pour former ainsi un composé qui, d'après ce qui a été signalé, est de 3 à 5 fois plus actif que la LRH elle-même. [Fujino et col. «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 49 863 (1972).] On a ensuite démontré que la D-Ala6-LRH est plus puissante que la LRH ((Monahan et col., Biochemis-try 12 4616 (1973)). On a introduit divers autres D-aminoacides à la position 6 de la LRH et de la des-Glyl0-Pro-NHC2H5-LRH pour former des produits présentant des propriétés améliorées pour le déclenchement de l'ovulation. [Brevet des Etats-Unis d'Amérique N» 3913412 et Vilchez-Martinez et col.. «Biochem. Biophys. Res. Commun.», 59 1226(1974).]
L'activité du D-Ala'1, des-Gly10-LRH éthylamide est, d'après Coy et col., «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 57 335 (1974), égale à environ deux fois celle de la D-Ala6-LRH pour stimuler la sécrétion de LH. Ling et col., «Biochem. Biophys. Res. Comm.», 63 801 (1975) ont décrit la synthèse et l'activité biologique (dans la stimulation de la sécrétion de la LH) de la D-Ala6, (N'-Me)Leu7-LRH qui, d'après ce que l'on a trouvé, a une activité qui corresponde à 560% de l'activité de la LRH, ce qui la place dans la même gamme de puissance d'activité que la D-Ala6-LRH.
Suivant la présente invention, le procédé de fabrication de nouveaux polypeptides et des sels d'addition d'acide non toxiques de ces composés, ayant une activité claudogène/interceptrice et répondant à la formule:
L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-Y-L-Arg-L-Pro-NHC2H5 (I)
dans laquelle X représente D-Trp ou D-2-( 1,4-cyclohexydiényl)Gly, et Y représente L-(N-méthyl)Leu ou L-(N-méthyl)Ile, est caractérisé en ce que les aminoacides nécessaires à la formation du polypeptide ou leurs dérivés activés sont condensés avec formation de liaisons de peptide dans un ordre quelconque désiré de succession, et de telle manière que les groupes de réaction qui ne participent pas à la réaction soient protégés au cours des phases intermédiaires et qu'on transforme le cas échéant les produits en leurs sels d'addition d'acide non toxiques.
Parmi ces composés préparés selon le procédé inventif, la (D-Trp6, L-(N-méthyl)Leu7, des-Gly-NH210, Pro-éthylamide)LRH est l'espèce préférée du point de vue de l'activité. Ces composés provoquent par exemple l'ovulation chez les animaux et sont des agents claudogènes/intercepteurs, intéressants dans la prévention (claudogène) ou l'arrêt (intercepteur) de la grossesse chez les mammifères. En considérant plus particulièrement ces composés du point de vue de leur utilisation, ils agissent en général comme agent claudogène/intercepteur lorsqu'on les administre après le coït à un mammifère femelle après ovulation, en ce sens qu'ils interrompent les processus physiologiques normaux nécessaires à l'implantation (claudogène) et/ou à l'entretien (intercepteur) d'un ovule fertile.
Les intermédiaires utilisés dans la production des nonapeptides sont en général les polypeptides sur résine, totalement ou partiellement protégés, et les éthylamides de polypeptides, totalement ou partiellement protégés, de la formule:
p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R1)-Tyr(R2)-X-Y-Arg(R3)-Pro-Z
dans laquelle Z représente OH ou un dérivé d'acylation de celui-ci, notamment un ester, par exemple un eter d'alcoyle inférieur, un ester benzylique ou un ester de la formule — OCH2 (support de résine de polystyrène), ou bien Z représente — NHC2HS. X et Y ont la définition donnée précédemment, X représentant de préférence D-Trp et Y représentant de préférence L-(N-méthyl)Leu. R est de préférence de l'hydrogène ou un groupe protecteur pour l'azote d'imino du fragment histidyle, et R3 est de l'hydrogène ou un groupe protecteur de la fonction guanyle du fragment arginyle, par exemple tosyle, acétyle, benzoyle, t-butyle, trityle, benzyle, benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou nitro. On préfère le groupe tosyle comme groupe protecteur à la fois pour R et pour R3. Toutefois, le groupe guanyle du fragment arginyle peut être protégé par l'intermédiaire des atomes d'azote N" ou N"1 par les groupes protecteurs nitro ou tosyle et, par l'intermédiaire de l'atome d'azote N" ou de l'un ou l'autre des atomes d'azote N" ou Nwl, par le groupe benzyloxycarbonyle, adamantyloxycarbonyle ou trityle. R! et R2 représentent en règle chacun de l'hydrogène ou un groupe protecteur pour les hydroxyles de la sérine et de la tyrosine. Les groupes protecteurs d'hydroxyles, utilisés traditionnellement à cet effet, sont par exemple: acétyle, tosyle, benzoyle, t-butyle, trityle, benzyle, benzyloxycarbonyle, 2,6-dichlorobenzyle, etc., avec une préférence pour les groupes benzyle et 2,6-dichlorobenzyle à cet effet, à la condition qu'au moins un des R, R1, R2 et R3 soit différent de l'hydrogène.
R et R3 sont de préférence le tosyle. R1 est de préférence le benzyle et R2 est de préférence le 2,6-dichlorobenzyle.
Le procédé de préparation des nonapeptides de la formule I définie précédemment comprend la suppression de la protection sur un nonapeptide correspondant de la formule:
p-Glu-His(R)-Trp-Ser(RI)-Tyr(R2)-X-Y-Arg(R3)-
Pro-NHEt (lia)
dans laquelle R, R1, R2, R3, X et Y ont la définition déjà donnée. Cette suppression de protection peut être réalisée par des techniques connues, de préférence en une seule phase, en utilisant de l'acide fiuorhydrique liquide en présence d'anisole.
Le peptide protégé de formule lia peut être préparé par acylation d'éthylamine avec un nonapeptide convenablement protégé de la formule:
p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R1 )-Tyr(R2)-X-Y-Arg(R3)-
Pro-Z1 (IIb)
dans laquelle R, R1, R2, R3, X et Y ont la définition donnée
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précédemment, et Z1 représente OH ou un dérivé fonctionnel d'acylation de celui-ci. Des exemples de dérivés d'acylation sont les esters, par exemple les esters d'alcoyles inférieurs ou l'ester benzyli-que, ou encore un ester formé avec un support de résine, auquel cas Z1 représente — OCH2 (support de résine de polystyrène). L'acyla-tion peut être réalisée par des procédés connus; par exemple,
lorsque Z1 représente OH, on peut réaliser l'acylation en utilisant un agent de condensation, tel que du dicyclohexylcarbodiimide.
Les composés de formule IIb, dans laquelle Z1 représente OH ou un dérivé fonctionnel d'acylation de celui-ci, peuvent être préparés par des procédés connus pour la création de séquences d'aminoacides (voir les manuels classiques concernant la synthèse des peptides). Lorsqu'on veut un nonapeptide, dans la formule duquel Z1 représente — OCH2 (support de résine de polystyrène), ce composé peut alors être préparé par une méthodologie en phase solide, en suivant les techniques connues d'une façon générale pour la création de séquences d'aminoacides au départ d'un aminoacide initial supporté par une résine. La technique en cause a été décrite d'une manière générale par exemple par «Merrifield, J.A.C.S.», 85, 2149 (1963).
Le support de résine utilisé peut être constitué par n'importe quelle résine appropriée que l'on emploie de manière traditionnelle dans la technique de la préparation en phase solide de polypeptides, un tel support étant de préférence du polystyrène réticulé avec de 0,5 à 3% de divinylbenzène et chlorométhylé pour créer des sites de formation d'ester avec l'aminoacide protégé, introduit au départ. La proline protégée en amino peut être combinée avec la résine chlorométhylée suivant le procédé de «Gisin, Helv. Chim. Acta.», 56,1476 (1973). Après la combinaison de la proline protégée en amino avec le support de résine, le groupe protecteur d'amino est séparé par exemple par des méthodes traditionnelles en utilisant de l'acide trifluoroacétique dans du chlorure de méthylène, de l'acide trifluoroacétique seul ou du HCl dans du dioxanne. La suppression de la protection est réalisée de préférence à une température comprise entre environ 0°C et la température ambiante. Après séparation du groupe protecteur d'amino, les aminoacides restants protégés ena-amino et, si nécessaire, protégés en chaîne latérale sont combinés en série dans l'ordre désiré pour obtenir le produit. A titre de variante, des groupes d'aminoacides multiples peuvent être combinés par le procédé en solution avant la combinaison avec la séquence des aminoacides se trouvant sur un support de résine. Le choix d'un réactif de combinaison approprié est en règle une question d'expérience pratique. Un réactif de combinaison particulièrement intéressant est par exemple le N,N'-diisopropylcarbodiimide. Un autre agent de combinaison applicable est par exemple le N,N'-dicyclohexylcarbodiimide.
Chaque aminoacide protégé ou chaque séquence d'aminoacides protégée est introduit en général dans le mélange de réaction en phase solide en un excès de 2 à 6 fois, et la combinaison est réalisée dans un milieu de diméthylformamide/chlorure de méthylène, ou bien dans du diméthylformamide seul ou du chlorure de méthylène seul. Dans les cas où une combinaison incomplète se produit, le processus de combinaison est répété en règle avant séparation du groupe protecteur de a-amino et avant l'introduction de l'aminoacide suivant dans le mélange de réaction en phase solide. Le succès de la réaction de combinaison à chaque stade de la synthèse est surveillé et déterminé par exemple par la réaction à la ninhydrine, tel que décrite par E. Kaiser et col., «Analyt. Biochem.», 34, 595 (1970).
Le groupe protecteur de a-amino nécessaire, utilisé pour chaque aminoacide introduit dans le polypeptide, est de préférence le t-butyloxycarbonyle, bien que l'on puisse utiliser n'importe quel groupe protecteur de ce genre, pour autant qu'il ne soit pas séparé sous les conditions de combinaison et qu'il soit par contre aisément séparé de façon sélective par rapport aux autres groupes protecteurs présents dans la molécule, sous des conditions qui, à part cela, n'influencent pas la molécule formée. Des exemples supplémentaires de groupes protecteurs de a-amino de ce genre, parmi lesquels un choix peut être fait après avoir pris en considération le restant de la molécule de polypeptide, sont: trilyle, phtalyle, tosyle, allyloxycar-bonyle, cyclopentyloxycarbonyle, t-amyloxycarbonyle, benzyloxycarbonyle, o- ou p-nitrobenzyloxycarbonyle, etc.
Les critères de sélection des groupes protecteurs pour R-R3 sont par exemple: a) le groupe protecteur doit être stable vis-à-vis du réactif et sous les conditions de réaction choisies pour la préparation du groupe protecteur de a-amino à chaque étape de la synthèse; b) le groupe protecteur doit conserver ses propriétés de protection (c'est-à-dire ne pas être séparé sous les conditions de combinaison); et c) le groupe protecteur doit être aisément amovible à la fin de la synthèse du polypeptide, sous des conditions qui, à part cela, n'influencent pas la structure de ce polypeptide.
Les nonapeptides supportés sur résine, totalement protégés, présentent la séquence suivante d'aminoacides:
p-Glu-His(R)-Trp-Ser(R1)-Tyr(R2)-Pro-0 CH2
(support de résine de polystyrène) (Ile)
dans laquelle le groupe — OCH2 (support de résine de polystyrène) représente de préférence le fragment d'ester de l'un des nombreux groupes fonctionnels présents dans la résine de polystyrène.
Les nonapeptides totalement protégés sont de préférence séparés de leur support de résine par traitement avec de l'éthylamine à la température ambiante, avec ensuite séparation de tout excès quelconque d'éthylamine pour obtenir l'intermédiaire:
p-Gly-His(R)-T rp-Ser(R1 )-T y r(R2 )-X-Y-Arg(R3)-
Pro-NHC2Hs (IIa)
L'intermédiaire totalement protégé, décrit dans le paragraphe précédent, est de préférence débarrassé de sa protection en utilisant de l'acide fluorhydrique liquide en présence d'anisole, pour obtenir ainsi les agents nonapeptides claudogènes/intercepteurs suivant l'invention.
A titre de variante, le nonapeptide supporté sur résine de la formule Ile peut être scindé par transestérification pour donner un ester, par exemple un ester d'alcoyle inférieur ou un ester benzylique, par transestérification avec un alcanol inférieur ou de l'alcool benzylique, en présence d'une base, telle que de la triéthylamine. Ces dérivés d'ester de formule IIb peuvent être utilisés pour préparer les intermédiaires de formule Ha tels que décrits précédemment.
Un autre procédé de préparation des nonapeptides protégés de formule Ha comprend en général la combinaison des aminoacides requis, si nécessaire convenablement protégés et/ou activés, et d'éthylamine dans un ordre quelconque de succession pour donner la séquence désirée de peptide.
La combinaison des aminoacides et de l'éthylamine dans le procédé précédent peut être réalisée par les méthodes traditionnelles utilisées dans la chimie des peptides. De tels méthodes ont été décrites dans la littérature, par exemple dans les manuels classiques sur la synthèse des peptides, et on peut se reporter par exemple à Schröder et Lubke, The Peptides, Academic Pres (1965) et à Greenstein et Winitz, Chemistrv ofthe Amino Acids, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc. (1961). Un exemple de procédé de préparation d'un composé de la formule lia, en partant d'aminoacides et d'éthylamine est illustré par le schéma suivant. On a utilisé en règle dans ce schéma les abréviations habituelles pour les aminoacides, les groupes protecteurs et les agents de combinaison (voir, par exemple, Schröder et Lubke, supra, pp xiii-xxix. Le terme azide utilisé dans ce schéma se réfère en règle à la méthode à l'azide pour la combinaison d'aminoacides. C'est ainsi que la première phase opératoire comprend de préférence la formation du dipeptide p-Glu-His-OMe par condensation, en utilisant du DCC (dicyclohexylcarbodiimide), de p-GluOH et de His-OMe. On fait réagir en général le dipeptide avec de l'hydrazine pour donner l'hydrazide p-Glu-His-NHNH2, ce composé étant combiné avec du HTrp-OBzl en utilisant la méthode à l'azide pour obtenir le tripeptide p-Glu-His-Trp-OBzl. Par combinaison d'autres fragments de peptide, le peptide protégé par
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N02 de formule lia est formé, ce peptide étant débarrassé de sa protection, comme illustré dans la phase finale, pour donner en un composé de formule I. ^
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Les sels d'addition d'acide des nonapeptides préparés selon la présente invention sont produits par exemple par des techniques connues, au départ d'acides organiques ou minéraux, qui sont connus comme donnant des produits d'addition non toxiques, acceptables en pharmacie par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, l'acide sulfurique, l'acide phosphorique, l'acide maléique, l'acide acétique, l'acide citrique, l'acide benzoïque, l'acide succinique, l'acide malique, l'acide ascorbique, etc.
Les agents claudogènes/intercepteurs lorsqu'on les administre à des mammifères femelles, après le coït suivant une posologie journalière d'au moins environ 3 jxg par jour par kilo de poids de corps sur une période d'au moins 3 jours, empêchent en règle totalement la grossesse.
On propose et croit, en se basant sur des études menées sur toute une série d'animaux, que les nonapeptides préparés selon la présente invention exercent une action claudogène/interceptrice en règle par l'intermédiaire d'une stimulation de l'axe stéroïde ovarien-hypophyse.
Quelle que soit la voie physiologique jusqu'au résultat final, les nonapeptides préparés selon la présente invention empêchent en général en tout cas de façon efficace la grossesse chez-les femelles de mammifère, lors d'une administration après le coït.
De ce fait, les nonapeptides préparés selon la présente invention sont intéressants par exemple à titre de contraceptifs du type du lendemain matin pour empêcher ou arrêter une grossesse chez les femelles de mammifère. Sous ce rapport, les nonapeptides peuvent s'utiliser comme agents anti-fertilité pour lutter contre les populations de rongeurs sans qu'il faille utiliser des agents de destruction de ceux-ci car de tels agents peuvent avoir un effet indésirable sur d'autres animaux vivants dans le même environnement.
On évite en général une gravidité chez les animaux d'essai par une administration journalière d'un nonapeptide préparé selon l'invention, sur la période allant du jour 1 jusqu'au jour 7 après le coït, de même que par une administration journalière sur la période post-coïtale allant du jour 7 au jour 12. De ce fait, on crée par exemple un type d'action claudogène (préimplantation) aussi bien qu'un type intercepteur (postimplantation) dans le cas d'une grossesse déjà existante.
Le procédé suivi dans l'estimation des propriétés antigravidité des nonapeptides préparés selon l'invention a été en général le suivant: Des rates adultes Sprague-Dawley (poids de corps de 350+30 g), maintenues suivant un programme lumière/obscurité de 14/10, ont été mises en cage avec des rats mâles fertiles le soir du préœstrus: la présence de sperme dans le vagin le matin suivant a été considérée comme désignant le jour 1 de la gravidité. L'éthylamide de nonapeptide, produit selon les exemples suivants et qui est représentatif de groupe entier des composés suivant l'invention, a été administré par voie sous-cutanée dans un véhicule d'huile de maïs les jours 1-7, ou les jours 7-12 de la période de gravidité à un taux n'atteignant que 1 ug/rate/jour. On a administré la moitié de la dose journalière à 9 heures du matin et à 3 heures de l'après-midi chaque jour. Les animaux ayant subi le traitement des jours 1-7 ont été autopsiés le 14e jour. Les animaux ayant reçu le traitement des jours 7-12 ont été autopsiés le 18« jour de la gravidité. L'efficacité de l'éthylamide et sa dose efficace ont été confirmées par l'absence de sites d'implantation utérins et de fœtus. La présence d'au moins un fœtus normal a été considérée comme étant le critère de la gravidité. L'activité claudogène/interceptrice des nonapeptides de l'invention a été ainsi établie à une dose journalière n'attaignant qu'environ 3 ng par kilo de poids de corps, le traitement étant efficace 100% à une dose de 1 ag rate/jour pour un lot de 5 rates pour la période des jours 1-7, et à une dose de 10 (ig pour la période des jours 7-12.
Pour définir les stades post-coïtaux de la gravidité chez la rate pour les besoins expérimentaux, on a prévu en règle le développement suivant dans la définition de l'activité antigravidité post-coïtale qui, pour les besoins de la présente description, est une expression destinée à englober une activité contraceptive aussi bien de préimplantation (claudogène) que de postimplantation (intercep-
trice): jour 1 : sperme dans le vagin; jours 3-5: transfert d'ovules dans les oviductes, fertilisation; jours 3-5: pas de blastocyte dans le passage utérin; jours 5-7: implantation dans la paroi utérine; jours au-delà de 7: postimplantation.
En se basant sur les découvertes d'activité dans la prévention du développement d'une gravidité chez les rats d'essai et sur le fait que les indications actuelles montrent que la situation hormonale en rapport avec le cycle reproducteur jusqu'à y compris l'ovulation, est fondamentalement la même chez toutes les femelles de vertébrés, le cycle reproducteur humain étant par exemple physiologiquement analogue à celui du rat, l'activité des nonapeptides de l'invention peut empêcher de façon efficace le développement du blastocyte de pré-implantation et de post-implantation dans l'utérus de tous les mammifères, y compris de l'être humain.
De ce fait, en considérant l'aspect d'utilisation de la présente invention, on prévoit une composition destinée à être administrée aux mammifères pour empêcher de préférence la gravidité ou la grossesse, cette composition comprenant un composé répondant à la formule I, de préférence du L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-seryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-L-(N-méthyl)leucyl-L-arginyl-L-prolyléthylamide, du L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-séryl-L-tyrosyl-D-2-(l,4-cyclohexadiényl)glycyl-L-(N-méthyl)leu-cyl-L-arginyl-L-prolyléthylamide ou l'analogue (N-méthyl)isoleucyle7 de l'un ou l'autre de ces composés, cette administation s'utilisant après coït suivant une posologie journalière comportant au moins environ ag par kilo de poids de corps sur une période de temps suffisante pour arrêter la grossesse ou la gravidité. Lors de son utilisation, le composé antigravidité préparé selon l'invention nuit au mécanisme de la gestation, que ce mécanisme soit par exemple un mécanisme post-coïtal immédiat, un mécanisme contraceptif de préimplantation ou un mécanisme intercepteur de postimplantation. De ce fait, la période efficace d'administration journalière chez les êtres humains va en règle du jour 1 d'ovulation-fertilisation jusqu'aux environs du jour 6 pour assurer à ce moment une réaction claudogène, ou bien depuis le jour 6 jusqu'aux environs du jour 14 après l'ovulation-fertilisation pour assurer une activité interceptrice au cours de la période de gestation. La dose pour les êtres humains, en se basant sur la posologie des animaux d'essai, est par exemple d'environ 1,5 mg par jour pour 50 kilos de poids. Pour des besoins pratiques, la dose sous-cutanée applicable chez l'être humain est par exemple d'environ 50 ixg/kg/jour ou de 2,5 mg/50 kg de poids pour un effet claudogène et d'environ 500 u.g/kg/jour ou de 25 mg/50 kg de poids/ jour pour un effet intercepteur.
On peut administrer les nonapeptides préparés selon la présente invention sous n'importe quelle forme appropriée, par voie orale ou parentérale, avec ou sans adjuvants pharmaceutiques traditionnels, connus en pratique. En outre, on peut employer les produits d'addition traditionnels des nonapeptides pour prolonger leur efficacité, par exemple la protamine zinc ou des produits d'addition d'aluminium que l'on prépare par des techniques traditionnelles.
Une méthode préférée pour arrêter la grossesse ou la gravidité consiste en général à administrer le nonapeptide par voie orale ou parentérale aux mammifères en suivant un régime journalier commençant le jour 1 après le coït et s'étendant sur environ les 8 premiers jours après l'implantation, ou jusqu'aux environs du jour 7 après le coït.
Les propriétés, permettant de provoquer l'ovulation des nonapeptides préparés selon la présente invention ont été déterminées en utilisant par exemple le composé préféré, à savoir la [D-Trp6, (N-méthyl)Leu7, des -Gly-NH,10, Pro-éthylamide]LRH, et ce de la façon suivante:
On a injecté à des rates Sprague-Dawley en période de préœstrus, dans le péritoine, une dose hypnotique de Nembutal (50 mg/kg) à 13.30 h. Entre 13.40 et 13.50 h, les rates ont reçu le composé d'essai par la voie de la veine jugulaire. Le matin suivant, les animaux ont été sacrifiés et on a examiné les trompes de Fallope pour déterminer le nombre des ovules, sous un microscope de
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dissection. Les résultats de cet essai ont montré une activité provoquant l'ovulation chez 100% des rates à une dose de 0,1 mg par rate, comparativement à la LRH qui exige environ 3 mg par rate pour obtenir 100% d'ovulation et à la [D-Ala6, des -Gly-NH210, Proéthylamide]LRH, qui exige environ 1 mg par rate pour la même activité. De ce fait, dans son action provoquant l'ovulation, le composé préféré de la présente invention est environ 10 fois plus actif que ses analogues les plus proches.
Les exemples suivants illustrent la préparation de p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-(N-méthyl)Leu-Arg-Pro-NHC2H5 qui est l'agent claudogène/intercepteur préféré. Il doit être entendu que les autres nonapeptides envisagés dans le cas présent se préparent de la même manière en substituant simplement l'amino/'acide spécifique indiqué dans la séquence de préparation à la position appropriée. De la sorte, les exemples suivants sont illustratifs mais nullement limitatifs du cadre de l'invention.
Exemple l :
Préparation de t-hutyloxycarbonylproline-rêsine [méthode de Gisin, «Helv. Chim. Acta», 56, 1476 (1973)].
De la t-butyloxycarbonylproline (18,65 g; 86,3 mmol) dans un mélange de 112 ml d'éthanol et de 48 ml d'eau est traitée avec une solution aqueuse concentrée de bicarbonate de césium jusqu'à ce que le pH de la solution atteigne 7. Le mélange de réaction est épuré et séché en utilisant des épurations répétées, employant de l'éthanol, de I'éthanol-benzène et du benzène (3 fois). On dessèche le reste sur du pentoxyde de phosphore sous vide à la température ambiante pendant la nuit.
Le produit total dans 880 ml de diméthylformamide est agité pendant la nuit à 50 C sous azote avec 80 g de résine Bio-Beads S.X. 1 (capacité de chlorométhylation de 0,89 méq/g). La résine filtrée est lavée à fond avec du diméthylformamide (2 fois), du diméthylformamide-10% d'eau (2 fois), du diméthylformamide (2 fois), du méthanol (2 fois) du chloroforme (3 fois), puis on sèche sur P,Os. Une analyse des aminoacides montre une substitution sur la résine de 0,56 méq/g.
Exemple 2:
L-Pyroglutamyl-N''"-tosyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L-sérvl-O-l 2,6-dichlorohen:yl)-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-mêthyl-L-leucyl-Nx-tosyl-L-arginyl-L-prolylacyl résine ester.
Y™'1"08™™ F'6-diC1Bzl Ns-Tosyle
I ?BZI I I
p-Glu-His-Trp-Ser- Tyr-D-Trp-N-Me-Leu-Àrg-Pro-O-Résine
La résine -t-butyloxycarbonylproline (4,725 g) provenant de l'exemple 1 est placée dans un synthétiseur de peptide Beckman 990 et traitée de la façon suivante:
1. Lavage au méthanol.
2. Lavage au chlorure de méthylène.
3. Lavage au méthanol (2 fois).
4. Lavage au chlorure de méthylène (2 fois).
5. Prélavage avec de l'acide chlorhydrique/chlorure de méthyle (1.1 en volumes/volume), contenant 0,5% de dithioêrythritol.
6. Suppression de la protection avec le solvant provenant de la phase 5 (2 fois pendant 15 mn chaque fois).
7. Lavage au chlorure de méthylène.
8. Lavage au diméthylformamide.
9. Lavage avec 12,5% de triéthylamine dans du diméthylformamide (en volumes/volume) pendant 10 mn (2 fois).
10. Lavage au diméthylformamide.
11. Lavage au chlorure de méthylène (2 fois).
12. Lavage au méthanol (2 fois).
13. Lavage au chlorure de méthylène (3 fois).
14. La résine-peptide est ensuite agitée modérément avec 9 mol de l'aminoacide-t-butyloxycarbonyle désiré dans environ 30 ml de diméthylformamide,'chlorure de méthylène (1/1 en volume/volume) comme solvants.
15. On ajoute en deux portions, sur 30 mn, du diisopropylcar-boxyimide 1M dans du chlorure de méthylène (10 mmol).
16. On agite le mélange de réaction pendant 7 h.
On prévoit une durée de contact de 1,5 mn pour chaque phase, à moins d'indications contraires.
Les phases précitées sont répétées jusqu'à addition de tous les aminoacides désirés.
Les restes d'aminoacides suivants sont ensuite introduits successivement: t-Boc-Ns-tosyl-L-arginine (9 mmol), t-Boc-N-méthyl-L-leucine (9 mmol), t-Boc-D-tryptophane (9 mmol), ensuite, sans déblocage, on laisse réagir une seconde portion t-Boc-D-tryptophane (9 mmol). Ensuite, en reprenant la séquence normale, on ajoute: t-Boc-2,6-dichlorobenzyl-L-tyrosine (9 mmol), t-Boc, O-benzyl-L-sérine (9 mmol), t-Boc-L-tryptophane (9 mmol), t-Boc-im-tosyl-L-histidine (9 mmol), et acide L-2-pyrolidone-5-carboxylique (9 mmol). La résine-peptide lavée est séchée sous vide et pèse 8,422 g.
Exemple 3:
L-Pyroglutamyl-Nim-L-histidyl-L-tryptophyl-0-benzyl-L-séryl-O- (2,6-dichlorobenzyl) -L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-mêthyl-L-leucyl-W-tosyl-L-arginylprolinêthylamide.
On agite pendant la nuit, dans une bouteille sous pression en verre, 8,44 g de résine-peptide protégé provenant de l'exemple 2 et 120 ml d'éthylamine. On sépare l'éthylamine sous pression réduite et on lave le reste avec du méthanol-diméthylformamide (4 fois), du méthanol et du chlorure de méthylène. On évapore sous vide les filtrats combinés, en dessous de 35GC, pour obtenir le composé en rubrique (3,277 g).
Exemple 4:
L-Pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-sèryl-L-tyrosyl-D-îryptophyl-N-méthyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinéthylamide. On traite le produit de l'exemple 3 sous vide avec de l'acide fluorhydrique liquide anhydre ( 120 ml) et de l'anisole (35 ml) pendant 50 mn à 0°C. On sépare l'acide fluorhydrique sous pression réduite et on répartit le reste entre de l'éther diéthylique et de l'acide acétique aqueux à 10%. Une lyophilisation de la couche acide donne le produit en rubrique à l'état brut (2,404 g).
Exemple 5:
Purification et caractérisation du L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-
tryptophyl-L-séryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-mèthyl-L-leucyl-L-
arginyl-L-prolinéthylamide.
On applique le peptide brut (404 g) dans un volume minimal d'acide acétique 0,2N, sur une colonne de Bio-Gel P-2, préalablement équilibrée avec de l'acide acétique 0,2N, et on élue ensuite avec le même solvant. On récolte des fractions de 9 ml chacune. La matière peptide est localisée par l'essai de taches d'Ehrlich et par une analyse dans l'ultraviolet. On obtient une fraction principale, 34-50 (2,234 g). Une seconde colonne de Bio-Gel P-2 donne 1,928 g de la matière désirée. On rechromatographie cette matière sur une colonne de partage de Sephadex G-25 de type fin (2,5 x 100 cm), préparée par mise en équilibre avec une phase inférieure et ensuite une phase supérieure du système (n-butanol/acide acétique/eau), (4/1/5). Une élution avec la phase supérieure donne les fractions A 36-48 (820 mg) et B 49-64 (633 mg). On rechromatographie la fraction A en utilisant le même système, ce qui donne 295 mg du peptide désiré.
La valeur Rf du peptide (charge de 30 jxg) dans le système en couche mince (silice, plaques de Brinkman): n-butanol/acide acétique/eau (4/1/5, phase supérieure) est de 0,21, et, dans le système n-butanol/acide acétique/acétate d'éthyle/eau (1/1/1/1), cette valeur est de 0,57.
La rotation optique mesurée sur un polarimètre photoélectrique de précision Cari Zeiss LEP A-2 [x]D26 = — 80,91: (c=0,98, acide acétique à 1 %).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
7 624 924
L'hydrolyse du peptide dans de l'acide méthanesulfonique fermé sous vide a montré que tous les aminoacides demandés sont
(0,2 ml/1 mg de peptide) pendant 20 h à 110°C dans un système présents.
r
Claims (2)
1. Procédé de fabrication de nouveaux polypeptides et des sels d'addition d'acide non toxiques de ces composés, ayant une activité claudogène/interceptrice et répondant à la formule:
L-p-Glu-L-His-L-Trp-L-Ser-L-Tyr-X-Y-L-Arg-
L-Pro-NHC2H5 (I)
dans laquelle X représente D-Trp ou D-2-(l,4-cyclohexadiényl)Gly, et Y représente L-(N-méthyl)Leu ou L-(N-méthyl)Ile, caractérisé en ce que les aminoacides nécessaires à la formation du polypeptide ou leurs dérivés activés sont condensés avec formation de liaisons de peptide dans un ordre quelconque désiré de succession, et de telle manière que les groupes de réaction qui ne participent pas à la réaction soient protégés au cours des phases intermédiaires et qu'on transforme le cas échéant les produits en leurs sels d'addition d'acide non toxiques.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on prépare le L-pyroglutamyl-L-histidyl-L-tryptophyl-L-séryl-L-tyrosyl-D-tryptophyl-N-méthyl-L-leucyl-L-arginyl-L-prolinéthyl-amide ou un sel chlorhydrate, bromhydrate, sulfate, phosphate, maléate, acétate, citrate, benzoate, succinate, malate ou ascorbate de ce composé.
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