La présente invention a pour objet un procédé de détermination des propriétés des cellules biologiques naissantes dans un liquide d'expérimentation contenant lesdites cellules biologiques en suspension, comprenant le fait de produire un courant électrique dans ledit liquide d'expérimentation et de faire passer un courant de cellules biologiques le long d'une partie de la trajectoire suivie par ledit courant.
L'invention a également pour objet une installation pour la mise en oeuvre de ce procédé, comprenant: des moyens de commande comportant des moyens de comptage de particules pour compter et classifier les cellules en suspension dans le liquide d'expérimentation, ces moyens de comptage comprenant deux récipients pour contenir le liquide d'expérimentation, et qui sont en communication l'un avec l'autre par une petite ouverture de mesure, des moyens d'écoulement pour faire circuler le liquide d'expérimentation dans ladite ouverture de mesure en même temps que les cellules biologiques en suspension, d'un récipient dans l'autre, des électrodes immergées dans le liquide d'expérimentation dans l'un desdits récipients, ces moyens de commande comportant des moyens permettant l'application d'un potentiel électrique,
reliés entre lesdites électrodes pour produire une différence de potentiel entre celles-ci, ces moyens de commande comprenant des moyens de mesure électrique, reliés entre les électrodes pour mesurer le courant qui s'écoule entre elles.
Un procédé de mesure électronique, portant le nom de son inventeur - Coulter , est connu pour la détermination des volumes de particules en suspension dans un liquide d'analyse électrolytique: il utilise deux réservoirs, reliés par un petit orifice de mesure. Le liquide d'analyse circule d'un réservoir dans l'autre, à travers cet orifice de mesure. Des électrodes, portées à des potentiels différents et reliées à un circuit de mesure électrique, plongent dans le liquide d'analyse, de part et d'autre de l'orifice de mesure. La conductibilité du liquide d'analyse entre les électrodes varie, lors du passage d'une particule dans l'orifice de mesure, proportionnellement au volume de cette particule et permet ainsi une détermination du volume des particules en suspension dans le liquide d'analyse.
Le montage indiqué par Coulter pour la mise en oeuvre de son procédé a été développé depuis. C'est ainsi par exemple que le brevet de la République fédérale d'Allemagne N" 1806512 décrit un montage fonctionnant selon le procédé de Coulter et dans lequel les particules ne sont pas ajoutées au liquide d'analyse dans le réservoir, en amont de l'orifice de mesure, mais dirigées vers ce dernier par un dispositif d'alimentation spécial, comportant un orifice de sortie à très faible distance de l'orifice de mesure, de sorte que l'électrolyte s'écoulant dans l'orifice de mesure aspire une suspension de l'échantillon (suspension de particules) provenant de l'orifice de sortie du dispositif d'alimentation.
Il se produit alors un phénoméne de concentration hydrodynamique. qui fait passer toutes les particules à déterminer pratiquement au centre de l'orifice de mesure. Un tel montage accroît notablement la précision de mesure par rapport à celle réalisable avec le montage initialement indiqué par Coulten
Lors de la détermination du volume moyen de cellules vivantes, et notamment d'érythrocytes de mammifére, on constatait jusqu'à présent des différences entre les résultats de la détermination de volume électronique selon le procédé de Coulter et les résultats de la détermination physique, au moyen de l'hématocrite et du nombre de cellules: on constatait une sous-évaluation du volume cellulaire lors de la mesure par le procédé de Coulter.
A l'origine. ce phénomène était attribué uniquement à la forme et à l'aptitude au polymorphisme des cellules étudiées et les résultats de mesure étaient affectés de corrections appropriées. car il est certain que la forme et l'aptitude au polymorphisme des cellules exercent une influence. En dépit de ces corrections, la mesure de cellules naissantes faisait toujours apparaître des différences du type cité. contrairement à la mesure de cellules fixées.
Lors de l'analyse du volume de particules par le procédé de
Coulter, le circuit de mesure électrique d'un montage de Coulter donne, comme précédemment indiqué, des variations de courant proportionnelles ou pratiquement proportionnelles au volume, lors du passage d'une particule dans l'orifice de mesure. En pratique, une différence de potentiel prédéterminée est ajustée entre les deux électrodes disposées dans l'électrolyte, de part et d'autre de l'orifice de mesure, afin d'obtenir un courant donné, circulant d'une électrode à l'autre dans l'électrolyte, à travers l'orifice de mesure. Pour une différence de potentiel constante entre les deux électrodes, le passage d'une particule dans l'orifice de mesure fait varier cette intensité si la conductibilité de la particule est différente de celle de l'électrolyte environnant la particule.
Le principe est donc celui de la mesure entre les deux électrodes d'une résistance électrique donnée, qui varie quand une particule se trouve dans l'orifice de mesure. Cette résistance dépend évidemment de la nature de l'électrolyte utilisé, ainsi que de la nature, la taille et le nombre des particules en suspension dans cet électrolyte.
Une augmentation de la différence de potentiel entre les deux électrodes produit un accroissement linéaire du courant dans l'électrolyte, dans la mesure où sa conductibilité n'est pas modifiée par un échauffement résultant d'un courant trop intense.
Il est de même possible d'ajuster un courant de mesure constant entre les deux électrodes, le passage d'une particule dans l'orifice de mesure faisant alors varier la différence de potentiel électrique entre les électrodes.
Les différences de courant produites dans le circuit de mesure par le passage d'une particule dans l'orifice de mesure augmentent avec le courant dans l'électrolyte. L'addition de particules de latex par exemple à l'électrolyte montre que les variations de courant croissent linéairement avec le courant dans le circuit de mesure.
Lorsque seul le rapport des variations de courant au courant dans le circuit de mesure est utilisé pour l'interprétation, la résistivité absolue du circuit de mesure, c'est-à-dire la partie électrolyte du circuit de mesure, n'intervient plus dans la mesure. Les influences des élévations de température de l'électrolyte sont ainsi éliminées. Il y a par suite interprétation de la variation relative de la résistivité de l'électrolyte dans l'orifice de mesure.
Il est possible, conformément à l'esprit du brevet de la République fédérale d'Allemagne N" 1806512, de réduire la distance de l'orifice de sortie du dispositif d'alimentation par rapport à l'orifice de mesure, de façon que l'électrolyte pénétrant dans ce dernier aspire la suspension de l'échantillon à l'orifice du dispositif d'alimentation, afin d'obtenir une concentration particulièrement bonne au centre de l'orifice de mesure. La concentration hydrodynamique produit une augmentation notable de la précision de mesure, car pratiquement toutes les cellules franchissent le même champ suivant l'axe médian de l'orifice de mesure, de sorte que le début du flux ionique transcellulaire produit un coude prononcé.
Le procédé suivant l'invention est caractérisé par le fait qu'on fait varier la tension le long de la trajectoire dudit courant électrique en même temps que l'on fait circuler les cellules biologiques entre une série de valeurs discrétes s'étendant sur une plage comprenant la valeur du courant à laquelle un changement de résistivité des cellules biologiques naissantes se produit. ce qui a pour effet de modifier la résistivité du liquide d'expérimentation contenant les cellules en suspension, et par le fait qu'on contrôle la résistance du chemin que parcourt le courant électrique dans le liquide d'expérimentation et obtient une indication des changements de résistivité des cellules naissantes.
L'installation suivant l'invention est caractérisée par le fait que lesdits moyens de commande comprennent des moyens reliés auxdits moyens d'application d'un potentiel pour faire varier la tension du courant électrique dans le liquide d'expérimentation alors que ce liquide et les cellules qui y sont en suspension traversent ladite ouverture, entre une série de valeurs discrètes s'étendant sur une plage comportant la valeur du courant à laquelle un changement de résistivité des cellules biologiques naissantes se produit, grâce à quoi la mesure produite par lesdits moyens de mesure fournit une indication desdits changements de résistivité.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à l'aide de la description détaillée ci-dessous de montages pour la mise en oeuvre du procédé et des dessins annexés sur lesquels:
la fig. 1 représente la variation d'un électrolyte contenant des cellules sanguines, en fonction de l'intensité:
la fig. 2 représente un montage fonctionnant selon le procédé de Coulter, avec alimentation séparée en particules;
la fig. 3 représente le schéma d'un générateur de courant alimentant le détecteur de cellules, avec un diviseur de tension:
la fig. 4 représente le réglage du générateur de courant de mesure au moyen d'un potentiomètre entraîné par un moteur pas à pas;
la fig. 5 représente le schéma d'un générateur de tension alimentant le détecteur de cellules, avec un diviseur de tension:
:
la fig. 6 représente le réglage du générateur de tension de mesure au moyen d'un potentiométre entraîné par un moteur pas à pas:
la fig. 7 représente le schéma synoptique d'un analyseur de hauteur d'impulsion, et
la fig. 8 représente les courbes d'amplitude A des variations du courant en fonction de l'intensité I du courant de mesure, pour diverses particules.
La fig. I représente la courbe de la résistance d'un électrolyte contenant des cellules sanguines, dans des conditions données et pour diverses intensités. On observe une variation soudaine de la résistance à diverses intensités, désignées par li et 12 sur la fig. 1.
La cause en est, comme précédemment indiqué, I'augmentation de conductibilité des cellules sanguines. diminuant la résistance de l'ensemble du liquide analysé.
La fig. 2 représente un montage fonctionnant selon le procédé de Coulter, avec alimentation séparée en particules. L'électrolyte 2 circule d'un compartiment I vers un compartiment 4 du réservoir, à travers un petit orifice de mesure 3. A faible distance de ce dernier se trouve l'orifice de sortie d'un dispositif d'alimentation 5, contenant un échantillon de sang. L'électrolyte 2 qui pénètre dans l'orifice de mesure 3 aspire, en s'écoulant devant l'orifice de sortie du dispositif d'alimentation 5. I'échantillon de sang contenu dans ce dernier, puis le transporte à travers l'orifice de mesure 3, en son centre. Des électrodes 6 et 7, portées chacune à un potentiel différent et reliées à un circuit de mesure électrique, plongent dans l'électrolyte, de part et d'autre de l'orifice de mesure.
Un tel montage est décrit par exemple dans le brevet de la
République fédérale d'Allemagne N" 1806512. Pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, le dispositif électrique 8, qui sert à effectuer les mesures, comprend toutefois un dispositif permettant de faire varier la différence de potentiel ou le courant de mesure entre les électrodes 6 et 7. Le dispositif 8 comporte en outre des moyens permettant de conserver les variations de courant produites par le passage de particules dans l'orifice de mesure 3, pour chaque différence de potentiel ajustée ou chaque courant de mesure, afin de pouvoir les affecter aux divers types de cellules sanguines.
Le dispositif 8 comporte en outre des moyens enregistrant les variations de courant absolues ou relatives en fonction de la différence de potentiel entre les électrodes 6 et 7 ou du courant de mesure, pour les divers types de cellules sanguines.
et conservant les paramètres qui sont importants pour apprécier les diverses propriétés cellulaires à partir de la variation soudaine du comportement en fonction du courant.
Le dispositif électrique 8 de la fig. 2 comprend d'une part un générateur de courant ou de tension, qui alimente le détecteur et dont les valeurs de sortie sont de préférence ajustables par télécommande, et d'autre part un préamplificateur pour les impulsions du détecteur et un analyseur de hauteur d'impulsion de type classique, comportant un amplificateur principal pour les signaux impulsionnels, un convertisseur analogique-numérique pour la pondération de la hauteur d'impulsion par une valeur numérique.
une mémoire pour le triage et la conservation de ces valeurs numériques, un calculateur de la courbe de distribution numérique obtenue et le cas échéant un oscillographe, un enregistreur ou une imprimante pour l'observation ou l'enregistrement direct de la courbe de distribution.
La fig. 3 représente un exemple de réalisation d'un générateur de courant pour l'alimentation du détecteur de cellules. avec courant de mesure télécommandé, préamplificateur sensible en courant et amplification télécommandée par un diviseur de tension.
La fig. 4 représente une autre possibilité de réglage du générateur de courant de mesure au moyen d'un potentiométre entraîné par un moteur pas à pas.
La fig. 5 représente un exemple de réalisation d'un générateur de tension pour l'alimentation du détecteur de cellules, avec tension de mesure télécommandée, préamplificateur sensible en tension et amplification télécommandée par un diviseur de tension.
La fig. 6 représente une autre possibilité de réglage du générateur de tension de mesure au moyen d'un potentiomètre entraîné par un moteur pas à pas. pour le réglage de la tension de référence.
La fig. 7 représente le schéma synoptique d'un analyseur de hauteur d'impulsion, avec calculateur numérique on-line ou offline, télécommande directe possible du courant ou de la tension de mesure et amplification des impulsions du détecteur.
L'alimentation du détecteur de cellules par un courant constant et la préamplification des impulsions avec sensibilité en courant selon la fig. 3 sont avantageuses pour le problème considéré, car la conductibilité de l'électrolyte, fonction de la température, n'intervient pas dans le résultat de la mesure. La fig. 3 représente un exemple de réalisation d'un circuit approprié. Un transistor à courant constant T, est alimenté par une tension de base négative fixe - V11 (-30 à - 100 V). de sorte que la tension collecteur-base du transistor npn ou d'un transistor à effet de champ équivalent est positive pendant la mesure et satisfait ainsi à la conditibn d'une résistance interne élevée au collecteur pour la génération d'un courant constant.
La valeur du courant constant est déterminée par la tension du point bas -V, (-100 à -500 V) et la valeur de la résistance d'émetteur Rl. R2, R3 ou R4 par le potentiel d'émetteur, constitué par la somme de la tension de base Vo et de la tension base-émetteur de Tl. Il est avantageux d'adopter une grande tension du point bas - Vo. afin de réduire l'influence de la tension base-émetteur de T1 sur le courant de mesure. en fonction de la température.
Le détecteur est très simplifié sur la fig. 3, car seule la résistance formée par les électrodes 37 et 36 immergées dans l électro- lyte 32 du réservoir 31 est importante pour la compréhension du circuit.
Un condensateur de couplage C transmet le signal de l'électrode I à un préamplificateur sensible en courant. tandis que l'électrode 36 est au potentiel de masse. Le préamplificateur sensible en courant est constitué de préférence avec un amplificateur opérationnel 35 à résistance R de contre-réaction.
Le réglage du courant de mesure, télécommandé et par suite
intégralement automatisable. pour la production des divers points
de fonctionnement du détecteur peut s'effectuer selon la fig. 3 soit au moyen du commutateur télécommandé Sl. sous forme d'un
relais, et du branchement de diverses résistances d'émetteur Rl.
R2, R3 ou R4. soit par variation de la tension continue -V1 depuis le générateur de tension, ainsi que par variation de la tension de base -V,0. cette dernière possibilité étant fortement
limitée par l'exigence d'une tension collecteur-base suffisamment positive pour le fonctionnement de T1 à courant constant.
Le
réglage de l'amplification d'impulsion, télécommandé et par suite intégralement automatisable selon l'invention, peut se faire selon la fig. 3 au moyen du diviseur de tension Rs, Rg, R7, R8, prévu sur le trajet d'amplification. en aval du préamplificateur, le commutateur S2 télécommandé étant manoeuvré au synchronisme et en correspondance avec le commutateur S1 de réglage du courant de mesure, comme l'indiquent les lignes d'action en tirets. Le signal impulsionnel divisé est alors appliqué à l'entrée de l'amplificateur principal d'un analyseur de hauteur d'impulsion.
Le réglage de l'amplification d'impulsion peut s'obtenir aussi différemment, par commutation par exemple de résistances de contre-réaction dans le préamplificateur ou de diviseurs de tension ou de résistances de contre-réaction dans l'amplificateur principal de l'analyseur de hauteur d'impulsion.
La fig. 4 représente une autre possibilité de réglage du courant de mesure dans un circuit à transistors à courant constant selon la fig. 3, la résistance d'émetteur étant formée par une résistance fixe R1' de limitation du courant et un potentiomètre R2, télécommandé par un moteur pas à pas M.
La fig. 5 représente une autre possibilité d'alimentation du détecteur, I'influence en fonction de la température de la conductibilité de l'électrolyte sur la hauteur d'impulsion étant supprimée par une alimentation du détecteur à tension constante et une préamplification sensible en tension.
Ce montage comporte une source de tension continue commandée 43 qui, par la résistance de charge Rg, fait circuler un courant dans le détecteur, entre les électrodes 37 et 36 plongeant dans l'électrolyte 32 du réservoir 31. La chute de tension aux bornes de R9 permet de déterminer le courant de mesure effectif dans ce montage. Afin de stabiliser la tension du détecteur, indépendamment de la conductibilité de l'électrolyte, la tension de l'électrode 37 est appliquée par Rn, à un amplificateur différentiel 42, qui la compare à une tension de référence et corrige un écart possible entre les deux tensions par réglage de la source de tension continue commandée 43.
La constante de temps Ri,î.C2 rend la boucle de régulation insensible à des variations rapides, afin d'éviter que les signaux en tension désirés ne soient corrigés lors du passage d'une cellule dans l'orifice de mesure.
La valeur de la tension de référence détermine la tension égale appliquée au détecteur: elle est réglable par division de la tension V,, par le diviseur à résistances R,3, R,4, R,5, R,6 et commutation par le commutateur télécommandé Si. La tension de différence pourrait également être produite selon la fig. 6 par le diviseur de tension Ri?, R,, et un potentiomètre R19 télécommandé, entraîné par un moteur pas à pas M'.
La fig. 5 représente en outre le raccordement du préamplificateur 35 sensible en tension à l'électrode 37 par le condensateur de couplage Cl. pour la transmission des impulsions de tension produites par des variations de résistance dans l'orifice de mesure.
La sortie du préamplificateur comprend aussi un diviseur de tension R20 à R23, dont les prises sont sélectées par le commutateur télécommandé S2', manoeuvré au synchronisme avec S1, pour le réglage synchrone selon l'invention de l'amplification des impulsions avant la connexion avec l'amplificateur principal en aval de l'analyseur de hauteur d'impulsion.
L'analyseur de hauteur d'impulsion, de type classique, comporte -- comme le montre le schéma synoptique de la fig. 7 un amplificateur principal 24. un convertisseur analogique-numérique 25, une mémoire numérique 26 et un calculateur 27 pour la traduction des résultats de mesure. La mémoire numérique 26 comprend en outre, dans de nombreuses applications, une indication oscillographique directe connue de l'information mémorisée, secondaire pour la compréhension et la mise en oeuvre de l'invention et supprimée par suite sur la fig. 7.
L'amplificateur principal 24 porte les impulsions du détecteur délivrées par le préamplificateur 35 à un niveau approprié à la conversion analogique-numérique en aval: le convertisseur analogique-numérique 25 convertit en quelques microsecondes la hauteur d'impulsion analogique en une valeur numérique: la mémoire numérique 26 trie ces valeurs numériques en enregistrant chacune d'elles après addition d'un un et en présentant de façon claire la fonction de distribution des hauteurs d'impulsion ou, dans cette application particulière, des volumes cellulaires, sous forme de uns totalisés et mémorisés, le nombre de cellules, en fonction de la valeur numérique délivrée par le convertisseur analogique-numérique ou volume cellulaire.
Une télécommande par le calculateur 27 pour diverses valeurs du courant de mesure inférieures et supérieures au courant de coude permet, selon la fig. 7, le transfert numérique on-line ou off-line des fonctions de distribution correspondantes de la mémoire au calculateur, pour le calcul automatique des propriétés cellulaires relatives à la membrane et au plasma. Le calculateur peut déterminer automatiquement le courant de coude, puis optimiser les autres valeurs mesurées.
L'idée de base de l'invention permet naturellement aussi un dépouillement semi-automatique ou manuel.
La fig. 8 représente, pour diverses particules étudiées avec un montage utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, la courbe correspondante des amplitudes A de variation du courant en fonction de l'intensité I, c'est-à-dire du courant de mesure. La courbe en tirets 9 représente la variation normalement prévue pour des érythrocytes naissants. On constate que la variation ne correspond pas aux prévisions à partir d'une intensité Ik donnée. Les amplitudes A de variation du courant n'augmentent plus dans la même proportion que l'intensité. La courbe présente un coude net, indiqué par une flèche sur la figure. La courbe correspondante est désignée par 10. La courbe 11 en points et tirets est celle obtenue par la mesure d'érythrocytes fixés.
L'effet mentionné n'est pas observé dans le cas de ces cellules: les amplitudes de variation du courant croissent linéairement avec l'intensité ajustée lors du passage des particules dans l'orifice de mesure.
La courbe en pointillés 12 enfin est enregistrée lors de la mesure de particules de latex. Ces particules sont parfaitement neutres. de sorte que la courbe est rigoureusement linéaire. Dans le cas d'érythrocytes naissants, la position du coude renseigne sur la cellule étudiée, comme précédemment indiqué. La pente de la courbe au-delà du coude offre en outre une autre possibilité d'appréciation du type de cellules sanguines étudiées.
REVENDICATION I
Procédé de détermination des propriétés des cellules biologiques naissantes dans un liquide d'expérimentation contenant lesdites cellules biologiques en suspension, comprenant le fait de produire un courant électrique dans ledit liquide d'expérimentation et de faire passer un courant de cellules biologiques le long d'une partie de la trajectoire suivie par ledit courant, caractérisé par le fait qu'on fait varier la tension le long de la trajectoire dudit courant électrique en même temps que l'on fait circuler les cellules biologiques entre une série de valeurs discrètes s'étendant sur une plage comprenant la valeur du courant à laquelle un changement de résistivité des cellules biologiques naissantes se produit, ce qui a pour effet de modifier la résistivité du liquide d'expérimentation contenant les cellules en suspension.
et par le fait qu'on contrôle la résistance du chemin que parcourt le courant électrique dans le liquide d'expérimentation et obtient une indication des changements de résistivité des cellules naissantes.
SOUS-REVENDICATIONS
1. Procédé suivant la revendication 1, caractérisé par le fait qu'une série d'au moins trois valeurs discrètes différentes est réalisée dans le liquide d'expérimentation, au moins une de ces valeurs étant inférieure et au moins deux autres de ces valeurs étant supérieures à celle à laquelle se produit un changement de résistivité.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
The present invention relates to a method for determining the properties of nascent biological cells in an experimental liquid containing said biological cells in suspension, comprising the fact of producing an electric current in said experimental liquid and passing a current of biological cells along part of the path followed by said current.
The subject of the invention is also an installation for implementing this method, comprising: control means comprising particle counting means for counting and classifying the cells in suspension in the experimental liquid, these counting means comprising two vessels for containing the test liquid, and which are in communication with each other by a small measuring opening, flow means for circulating the test liquid in said measuring opening at the same time for the biological cells in suspension, from one container to the other, of the electrodes immersed in the experimental liquid in one of said containers, these control means comprising means allowing the application of an electric potential,
connected between said electrodes to produce a potential difference between them, these control means comprising electrical measuring means, connected between the electrodes to measure the current which flows between them.
An electronic measurement process, named after its inventor - Coulter, is known for determining the volumes of particles suspended in an electrolytic analysis liquid: it uses two reservoirs, connected by a small measurement orifice. The analysis liquid circulates from one tank to the other, through this measuring orifice. Electrodes, brought to different potentials and connected to an electrical measurement circuit, immerse in the analysis liquid, on either side of the measurement orifice. The conductivity of the analysis liquid between the electrodes varies, during the passage of a particle through the measurement orifice, in proportion to the volume of this particle and thus makes it possible to determine the volume of the particles in suspension in the analysis liquid.
The assembly indicated by Coulter for the implementation of his process has since been developed. Thus, for example, patent of the Federal Republic of Germany N "1806512 describes an assembly operating according to the Coulter method and in which the particles are not added to the analysis liquid in the tank, upstream of the tank. 'measuring orifice, but directed towards the latter by a special supply device, having an outlet opening at a very short distance from the measuring orifice, so that the electrolyte flowing into the measuring orifice sucks a suspension of the sample (suspension of particles) from the outlet of the feeder.
A hydrodynamic concentration phenomenon then occurs. which passes all the particles to be determined practically to the center of the measuring orifice. Such an assembly significantly increases the measurement accuracy compared to that achievable with the assembly initially indicated by Coulten.
When determining the average volume of living cells, and in particular mammalian erythrocytes, differences have so far been observed between the results of the electron volume determination according to the Coulter method and the results of the physical determination, at average hematocrit and cell number: there was an underestimation of cell volume when measured by the Coulter method.
Originally. this was attributed only to the shape and polymorphism of the cells studied and the measurement results were appropriately corrected. for it is certain that the shape and the capacity for polymorphism of the cells exert an influence. Despite these corrections, the measurement of nascent cells still showed differences of the type cited. unlike the measurement of fixed cells.
When analyzing the volume of particles by the method of
Coulter, the electrical measuring circuit of a Coulter assembly gives, as previously indicated, current variations proportional or practically proportional to the volume, during the passage of a particle in the measuring orifice. In practice, a predetermined potential difference is adjusted between the two electrodes placed in the electrolyte, on either side of the measurement orifice, in order to obtain a given current, flowing from one electrode to the other. in the electrolyte, through the measuring port. For a constant potential difference between the two electrodes, the passage of a particle through the measurement orifice causes this intensity to vary if the conductivity of the particle is different from that of the electrolyte surrounding the particle.
The principle is therefore that of measuring between the two electrodes of a given electrical resistance, which varies when a particle is in the measuring orifice. This resistance obviously depends on the nature of the electrolyte used, as well as on the nature, size and number of particles in suspension in this electrolyte.
An increase in the potential difference between the two electrodes produces a linear increase in the current in the electrolyte, insofar as its conductivity is not modified by heating resulting from too intense a current.
It is likewise possible to adjust a constant measurement current between the two electrodes, the passage of a particle through the measurement orifice then causing the difference in electric potential between the electrodes to vary.
The current differences produced in the measuring circuit by the passage of a particle through the measuring opening increase with the current in the electrolyte. The addition of latex particles, for example, to the electrolyte shows that the current variations increase linearly with the current in the measuring circuit.
When only the ratio of the current variations to the current in the measuring circuit is used for the interpretation, the absolute resistivity of the measuring circuit, that is to say the electrolyte part of the measuring circuit, is no longer involved in measurement. The influences of the temperature rise of the electrolyte are thus eliminated. There is therefore an interpretation of the relative variation of the resistivity of the electrolyte in the measuring orifice.
It is possible, in accordance with the spirit of Federal Republic of Germany patent No. 1806512, to reduce the distance of the outlet of the supply device from the measuring orifice, so that the The electrolyte entering the latter sucks the suspension of the sample from the orifice of the feed device, in order to obtain a particularly good concentration in the center of the measurement orifice. The hydrodynamic concentration produces a notable increase in accuracy measurement, because practically all cells cross the same field along the median axis of the measurement orifice, so that the onset of transcellular ion flow produces a pronounced bend.
The method according to the invention is characterized by the fact that the voltage is varied along the path of said electric current at the same time as the biological cells are made to circulate between a series of discrete values extending over a range comprising the value of the current at which a change in resistivity of nascent biological cells occurs. which has the effect of modifying the resistivity of the experimental liquid containing the cells in suspension, and by controlling the resistance of the path that the electric current travels in the experimental liquid and obtaining an indication of the changes in resistivity of nascent cells.
The installation according to the invention is characterized by the fact that said control means comprise means connected to said means for applying a potential to vary the voltage of the electric current in the experimental liquid while this liquid and the cells suspended therein pass through said opening, between a series of discrete values extending over a range comprising the value of the current at which a change in resistivity of the nascent biological cells occurs, whereby the measurement produced by said means of measurement provides an indication of said changes in resistivity.
Other characteristics and advantages of the invention will be better understood with the aid of the detailed description below of arrangements for implementing the method and of the appended drawings in which:
fig. 1 represents the variation of an electrolyte containing blood cells, depending on the intensity:
fig. 2 shows an assembly operating according to the Coulter process, with separate feed of particles;
fig. 3 represents the diagram of a current generator supplying the cell detector, with a voltage divider:
fig. 4 shows the adjustment of the measurement current generator by means of a potentiometer driven by a stepping motor;
fig. 5 represents the diagram of a voltage generator supplying the cell detector, with a voltage divider:
:
fig. 6 shows the adjustment of the measurement voltage generator by means of a potentiometer driven by a stepping motor:
fig. 7 shows the block diagram of a pulse height analyzer, and
fig. 8 represents the curves of amplitude A of the variations of the current as a function of the intensity I of the measurement current, for various particles.
Fig. I represents the resistance curve of an electrolyte containing blood cells, under given conditions and for various intensities. A sudden change in resistance is observed at various intensities, denoted by li and 12 in FIG. 1.
The cause is, as previously indicated, the increased conductivity of blood cells. reducing the resistance of all the liquid analyzed.
Fig. 2 shows an assembly operating according to the Coulter process, with a separate feed of particles. The electrolyte 2 circulates from a compartment I to a compartment 4 of the reservoir, through a small measuring orifice 3. A short distance from the latter is the outlet orifice of a supply device 5, containing a blood sample. The electrolyte 2 which enters the measuring orifice 3 aspirates, flowing past the outlet of the supply device 5, the blood sample contained in the latter, then transports it through the orifice. of measure 3, in its center. Electrodes 6 and 7, each brought to a different potential and connected to an electrical measurement circuit, immerse in the electrolyte, on either side of the measurement orifice.
Such an assembly is described for example in the patent of
Federal Republic of Germany N "1806512. For the implementation of the method according to the invention, the electrical device 8, which is used to carry out the measurements, however comprises a device making it possible to vary the potential difference or the measurement current. between the electrodes 6 and 7. The device 8 further comprises means making it possible to conserve the current variations produced by the passage of particles through the measurement orifice 3, for each adjusted potential difference or each measurement current, in order to be able to assign them to various types of blood cells.
The device 8 further comprises means for recording the absolute or relative current variations as a function of the potential difference between the electrodes 6 and 7 or of the measurement current, for the various types of blood cells.
and retaining the parameters which are important for appreciating the various cellular properties from the sudden change in behavior as a function of current.
The electrical device 8 of FIG. 2 comprises on the one hand a current or voltage generator, which supplies the detector and whose output values are preferably adjustable by remote control, and on the other hand a preamplifier for the detector pulses and a height analyzer. Pulse of conventional type, comprising a main amplifier for the pulse signals, an analog-to-digital converter for weighting the height of the pulse by a digital value.
a memory for sorting and storing these digital values, a calculator for the digital distribution curve obtained and, where appropriate, an oscillograph, a recorder or a printer for direct observation or recording of the distribution curve.
Fig. 3 shows an exemplary embodiment of a current generator for powering the cell detector. with remote-controlled measurement current, current-sensitive preamplifier and remote-controlled amplification by a voltage divider.
Fig. 4 shows another possibility of adjusting the measurement current generator by means of a potentiometer driven by a stepping motor.
Fig. 5 represents an exemplary embodiment of a voltage generator for supplying the cell detector with remote-controlled measuring voltage, voltage-sensitive preamplifier and amplification remotely controlled by a voltage divider.
Fig. 6 shows another possibility of adjusting the measurement voltage generator by means of a potentiometer driven by a stepping motor. for setting the reference voltage.
Fig. 7 represents the synoptic diagram of a pulse height analyzer, with on-line or offline digital computer, possible direct remote control of the measurement current or voltage and amplification of the detector pulses.
The supply of the cell detector with a constant current and the preamplification of the pulses with current sensitivity according to fig. 3 are advantageous for the problem considered, because the conductivity of the electrolyte, a function of the temperature, does not intervene in the result of the measurement. Fig. 3 shows an exemplary embodiment of a suitable circuit. A constant current transistor T, is supplied by a fixed negative base voltage - V11 (-30 to - 100 V). so that the collector-base voltage of the npn transistor or an equivalent field-effect transistor is positive during the measurement and thus satisfies the condition of a high internal resistance at the collector for the generation of a constant current.
The value of the constant current is determined by the low point voltage -V, (-100 to -500 V) and the value of the emitter resistance Rl. R2, R3 or R4 by the emitter potential, formed by the sum of the base voltage Vo and the base-emitter voltage of Tl. It is advantageous to adopt a large low point voltage - Vo. in order to reduce the influence of the base-emitter voltage of T1 on the measurement current. depending on the temperature.
The detector is very simplified in fig. 3, because only the resistance formed by the electrodes 37 and 36 immersed in the electrolyte 32 of the reservoir 31 is important for understanding the circuit.
A coupling capacitor C transmits the signal from electrode I to a current sensitive preamplifier. while electrode 36 is at ground potential. The current sensitive preamplifier is preferably formed with a feedback resistance R operational amplifier.
The adjustment of the measurement current, remotely controlled and therefore
fully automatable. for the production of the various points
operation of the detector can be carried out according to fig. 3 or by means of the remote-controlled switch Sl. as a
relay, and the connection of various emitter resistors Rl.
R2, R3 or R4. either by variation of the direct voltage -V1 from the voltage generator, as well as by variation of the base voltage -V, 0. this last possibility being strongly
limited by the requirement of a sufficiently positive collector-base voltage for the operation of T1 at constant current.
The
adjustment of the pulse amplification, remotely controlled and therefore fully automated according to the invention, can be done according to FIG. 3 by means of the voltage divider Rs, Rg, R7, R8, provided on the amplification path. downstream of the preamplifier, the remote-controlled switch S2 being operated synchronously and in correspondence with the measuring current adjustment switch S1, as indicated by the action lines in dashed lines. The divided pulse signal is then applied to the input of the main amplifier of a pulse height analyzer.
The setting of the pulse amplification can be achieved also differently, for example by switching feedback resistors in the preamplifier or voltage dividers or feedback resistors in the main amplifier of the analyzer. pulse height.
Fig. 4 shows another possibility of adjusting the measurement current in a circuit with constant current transistors according to FIG. 3, the emitter resistance being formed by a fixed current limiting resistor R1 'and a potentiometer R2, remotely controlled by a stepper motor M.
Fig. 5 shows another possibility of supplying the detector, the influence as a function of the temperature of the conductivity of the electrolyte on the pulse height being suppressed by a supply of the detector at constant voltage and a sensitive preamplification in voltage.
This assembly comprises a controlled direct voltage source 43 which, by the load resistance Rg, causes a current to flow in the detector, between the electrodes 37 and 36 immersed in the electrolyte 32 of the reservoir 31. The voltage drop across the terminals of R9 is used to determine the effective measurement current in this assembly. In order to stabilize the voltage of the detector, independently of the conductivity of the electrolyte, the voltage of the electrode 37 is applied by Rn, to a differential amplifier 42, which compares it to a reference voltage and corrects a possible deviation between them. two voltages by adjustment of the controlled direct voltage source 43.
The time constant Ri, î.C2 makes the regulation loop insensitive to rapid variations, in order to prevent the desired voltage signals from being corrected when a cell passes through the measurement orifice.
The value of the reference voltage determines the equal voltage applied to the detector: it is adjustable by dividing the voltage V ,, by the resistor divider R, 3, R, 4, R, 5, R, 6 and switching by the remote control switch Si. The difference voltage could also be produced according to fig. 6 by the voltage divider Ri ?, R ,, and a remote-controlled potentiometer R19, driven by a stepping motor M '.
Fig. 5 further shows the connection of the voltage-sensitive preamplifier 35 to the electrode 37 by the coupling capacitor C1 for the transmission of the voltage pulses produced by resistance variations in the measuring port.
The output of the preamplifier also includes a voltage divider R20 to R23, the taps of which are selected by the remote-controlled switch S2 ', operated in synchronism with S1, for the synchronous adjustment according to the invention of the amplification of the pulses before connection with the main amplifier downstream of the pulse height analyzer.
The pulse height analyzer, of conventional type, comprises - as shown in the block diagram in fig. 7 a main amplifier 24. an analog-to-digital converter 25, a digital memory 26 and a computer 27 for translating the measurement results. The digital memory 26 further comprises, in numerous applications, a known direct oscillographic indication of the stored information, secondary for the understanding and the implementation of the invention and consequently deleted in FIG. 7.
The main amplifier 24 carries the detector pulses delivered by the preamplifier 35 to a level suitable for the downstream analog-to-digital conversion: the analog-to-digital converter 25 converts the analog pulse height in a few microseconds into a digital value: the digital memory 26 sorts these digital values by recording each of them after adding a one and clearly presenting the function of distributing pulse heights or, in this particular application, cell volumes, as summed ones and stored, the number of cells, as a function of the digital value delivered by the analog-to-digital converter or cell volume.
A remote control by the computer 27 for various values of the measurement current lower and higher than the knee current allows, according to FIG. 7, the on-line or off-line digital transfer of the corresponding distribution functions from the memory to the computer, for the automatic calculation of cellular properties relating to the membrane and to the plasma. The computer can automatically determine the knee current and then optimize the other measured values.
The basic idea of the invention naturally also allows a semi-automatic or manual analysis.
Fig. 8 represents, for various particles studied with an assembly which can be used for the implementation of the method according to the invention, the corresponding curve of the amplitudes A of variation of the current as a function of the intensity I, that is to say of the current of measurement. The dashed curve 9 represents the variation normally expected for nascent erythrocytes. It can be seen that the variation does not correspond to the forecasts from a given intensity Ik. The amplitudes A of variation of the current no longer increase in the same proportion as the intensity. The curve has a sharp bend, indicated by an arrow in the figure. The corresponding curve is designated by 10. The curve 11 in dots and dashes is that obtained by measuring fixed erythrocytes.
The effect mentioned is not observed in the case of these cells: the current variation amplitudes increase linearly with the intensity adjusted when the particles pass through the measurement orifice.
Finally, the dotted curve 12 is recorded during the measurement of latex particles. These particles are perfectly neutral. so that the curve is strictly linear. In the case of nascent erythrocytes, the position of the elbow provides information on the cell studied, as previously indicated. The slope of the curve beyond the bend also offers another possibility of judging the type of blood cells studied.
CLAIM I
A method of determining the properties of nascent biological cells in an experimental liquid containing said suspended biological cells, comprising generating an electric current in said testing liquid and passing a current of biological cells along a part of the path followed by said current, characterized by the fact that the voltage is varied along the path of said electric current at the same time as the biological cells are made to circulate between a series of discrete values extending over a range comprising the value of the current at which a change in resistivity of the nascent biological cells occurs, which has the effect of modifying the resistivity of the test liquid containing the cells in suspension.
and by controlling the resistance of the path that the electric current travels through the experimental liquid and obtaining an indication of the changes in resistivity of the nascent cells.
SUB-CLAIMS
1. Method according to claim 1, characterized in that a series of at least three different discrete values is produced in the experiment liquid, at least one of these values being lower and at least two others of these values being greater than that at which a change in resistivity occurs.
** ATTENTION ** end of DESC field can contain start of CLMS **.