La présente invention concerne un procédé pour la préparation des isomères L, D et DL de l'acide N-/p{/(2,4 diamino-6-ptéridinyle)méthyle/-N1 -méthyle-amino} -benzo- yle-glutamique répondant à la formule I, utilisés comme médicaments pour le traitement du cancer.
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Il est connu de préparer l'acide N-p(/(2,4-diamino-6- ptéridinyle)méthyle/-N10-méthyle-amino}-benzoyle-glutamique par un procédé en une seule étape, à savoir par la condensation d'un sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine et de l'acide N-/p-(N-méthyle-amino)benzoyle/-L- glutamique, soit avec une 1 ,2-di-halogéno-propionaldéhyde, soit avec une 1,1,3-tri-halogéno-acétone. Selon ces procédés, la réaction est effectué en milieu aqueux à un pH de 3-4.
Les rendements en produits purs, pour le cas de l'utilisation de la 1 ,2-di-halogéno-propionaldéhyde ne sont pas indiqués dans la littérature. Ce procédé présente, d'après nos travaux, des inconvénients, en ce sens que la condensation simultanée des trois composés mène, avec de petits rendements, à un produit brut de faible teneur en composé I. La purification de ce produit brut impose l'utilisation des méthodes très laborieuses comportant des grosses pertes de rendement.
Par le procédé qui utilise la 1,1,3-tri-chloro-acétone, on obtient le composé I brut à environ 70% purité avec un rendement de 46%, c'est-à-dire un rendement total de 32% par rapport à l'acide N-/p-(N-méthyle-amino)-benzoyle/-L-glutamique [voir B. M. Berezowski et al., Him. Pharm. Jur. 2 (12), 15 (1968)]. Selon ladite littérature, après une précipitation fractionnée et deux chromatographies successives sur colonne, on obtient le composé I à 90% de pureté, avec un rendement de 6-7%.
Par contre, selon nos observations, ce produit est composé d'un mélange d'acide N-p(/(2,4-diamino-6-ptéridiny- le)méthyle/-N10-méthyle-amino}-benzoyle-glutamique (I) et d'acide N-p{i(2,4-diamino-7-ptéridinyle)méthyle/-NiO méthyle-amino}-benzoyle-glutamique, dont seulement le composé I est biologiquement actif. Aucun procédé de séparation de ces deux isomères n'est mentionné dans la littérature.
La présente invention propose un nouveau procédé, particulièrement intéressant, présentant l'avantage de fournir avec des meilleurs rendements le composé I dépourvu de l'isomère-7 biologiquement inactif.
Le procédé suivant Invention consiste à synthétiser un des isomères L-, D- ou DL- du composé I en trois étapes, à savoir: le composé de départ est un sel de la 2,4,5,6-tétra-aminopyrimidine qui est traité avec de la 1,3-di-hydroxy-acétone sous forme de composé bisulfitique en présence d'un agent oxydant en solution aqueuse, ensuite la 2,4-di-amino-6hydroxyméthyle-ptéridine ainsi obtenue est traitée avec un agent de halogénation en présence d'une base organique dans un milieu organique inerte et finalement la 2,4-di-amino-6halogénométhyle-ptéridine ainsi obtenue est condensée avec l'acide N-/p-(N-méthyle-amino)-benzoyle/-L-glutamique en milieu aqueux tamponné au moyen d'un acétate de métal alcalin. Le produit brut de la réaction est séparé par filtration et purifié.
La réaction de condensation peut être effectuée à des températures très variables, dont dépend la durée de la réaction.
Cette durée est de quelques heures à plusieurs dizaines d'heures. Généralement, on opère entre 20 et 100oC, notamment entre 45 et 750C, mais la meilleure façon de conduire la réaction consiste à augmenter graduellement la température de 20oC jusqu'à 750C dans l'espace de 50 heures.
En ce qui concerne le pH, on effectue la réaction en milieu aqueux acide tamponné, avantageusement à un pH compris entre 3 et 6.
Par le procédé suivant l'invention, on obtient le composé I à 95% de pureté (déterminée par chromatographie et spectrophotométrie), entièrement libre de l'isomère-7, avec un rendement de 10 à 15% par rapport à l'acide N-/p-(N-méthyle amino)-benzoyle/-glutamique.
En ce qui concerne la synthèse de la 2,4-diamino-6hydroxyméthyle-ptéridine, la meilleure méthode parmi plusieurs procédés de préparation consiste dans la condensation du chlorhydrate de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine avec la 1,3-dihydroxy-acétone, en présence de cystéine et en utilisant comme agent oxydant l'air. Le principal désavantage de ce procédé consiste dans la nécessité d'utiliser une 1,3-dihydroxy- acétone totalement dépourvue de méthyle-glyoxale, ce dernier, dans les conditions de la réaction, conduisant à la formation de la 2,4-diamino-6-méthyle-ptéridine. La purification de la 1,3di-hydroxy-acétone est une opération laborieuse, comportant la transformation de celle-ci en composé bisulfitique, une purification intermédiaire, reconversion en cétone et une purification finale par distillation sous un vide très poussé.
Le procédé conformément à l'invention évite ces inconvénients en obtenant la 2,4-diamino-6-hydroxyméthyle-ptéridine par la condensation d'un sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine avec la 1,3-di-hydroxy-acétone sous la forme du composé bisulfitique, en milieu aqueux tamponné, en présence de certains thioalcools, tel que le chlorhydrate de cystéine, sous barbotage d'un courant continu d'air et en présence du bioxyde de sélénium comme agent oxydant.
Les températures réactionnelles peuvent varier dans une assez large gamme, jusqu'à la température d'ébullition du solvant, mais on opère de préférence à la température de la chambre. Dans ce cas, la durée de la réaction est d'environ 24 heures.
Il est avantageux d'ajouter l'agent oxydant au milieu réactionnel en minimum deux portions, dont l'une au début de la réaction et l'autre quelques heures après.
En ce que concerne le pH du milieu réactionnel, on opère avantageusement en tamponnant la solution aqueuse à un pH compris entre 3 et 7,5, au moyen d'un acétate d'un métal alcalin. Il convient aussi, d'utiliser un rapport molaire entre le sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3-di-hydroxy-acétone de 0,2:1 à 1 : 1.
La présente invention est illustré par les exemples suivants.
Exemple 1 a) Préparation de la 2,4-di-amino-6-hydroxyméthyleptéridine
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A une suspension de 7,6 g de sulfate de 2,4,5,6-tétra-aminopynmidine dans 104 ml d'eau, chauffée à 70-80 C, on ajoute sous agitation 6,4 g de chlorure de barium dihydrée, dissoute dans une quantité minimum d'eau chaude. La suspension est agitée pendant 30 minutes à la même température et puis filtrée. Le précipité de sulfate de barium est lavé deux fois avec 26 ml d'eau à 70 C et le filtrat qui contient le chlorhydrate de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine est dilué avec de l'eau.
jusqu'à un volume final de 400 ml.
Dans un tricol à réaction, d'une contenance de 2 litres, muni d'un agitateur et d'un système de barbotage, on introduit une solution de 128 g d'acétate de sodium en 390 ml d'eau. On dissout dans cette solution, à la température de la chambre, 19,6 g de composé bisulfitique de la 1,3-di-hydroxy-acétone (dépourvue de méthyle-glyoxale) et 4,6 g de chlorhydrate de cystéine. On ajoute à cette solution, sous agitation énergique et barbotage d'air, les 400 ml de solution du chlorhydrate de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine obtenue plus haut. Immédiate- ment après, on ajoute une solution de 8 g de bioxyde de sélénium dans une quantité minimum d'eau. On continue l'agitation et le barbotage d'air et après 4 heures on ajoute une nouvelle portion de solution aqueuse de 8 g de bioxyde de sélénium.
On maintient le mélange réactionnel à la température de la chambre encore 20 heures.
On refroidit la solution jusqu'à 1-4 C dans l'espace d'une heure. Le précipité formé est filtré, essoré, lavé avec de petites portions refroidies d'alcool éthylique, d'un mélange alcool éthylique - éther éthylique 1 : 1 et d'éther éthylique, de nouveau bien essoré et séché sous vide à 50oC pendant 24 heures.
On obtient 3,8 g de 2,4-di-amino-6-hydroxy-méthyle-ptéridine, ce qui correspond à un rendement de 72% par rapport au sel de la tétra-amino-pyrimidine.
b) Préparation de la 2,4-di-amino-6-chlorométhyleptéridine
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Dans un ballon à réaction muni d'un agitateur et d'un réfrigérent à reflux, on introduit 175 ml de chloroforme anhydre, 7 g de 2,4-di-amino-6-hydroxyméthyle-ptéridine séché et finement broyée, 2,1 ml de pyridine anhydre et 14 ml de chlorure de thionyle. Sous forte agitation, on porte la température du mélange au reflux et on maintient le reflux pendant une heure. On refroidit jusqu'à la température de la chambre, on filtre le produit brut, on le lave avec une petite quantité de chloroforme anhydre et on le sèche à l'air sur le filtre. On obtient 8,4 g de produit chloruré brut.
c) Préparation de l'acide N-/p{/(2,4-di-amino-6 ptéridinyle)-méthyle/-NI -méthyle-amino} -benzoyle/-
L-glutamique
Dans un ballon à réaction d'une contenance de 500 ml,
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muni d'un agitateur, d'un réfrigérent à reflux et d'un entonnoir à robinet, on prépare une solution de 20 g d'acétate de sodium dans 250 ml d'eau. On ajoute le pH de la solution à 4, au moyen d'acide chlorhydrique N. Dans cette solution on fait dissoudre 2,8 g d'acide N-/p-(N-méthyle-amino)benzoyle/-L- glutamique. On ajoute goutte à goutte, sous forte agitation, dans l'espace d'une heure, une solution de 2 g de 2,4-diamino-6-chlorométhyle-ptéridine dans 15 ml d'acide formique concentré. On maintient le pH de la solution à 4, au moyen de petites quantités d'une solution normale d'hydroxyde de sodium.
On continue la réaction à 450C pendant 40 heures, à 550C pendant 2 heures, à 650C pendant 2 heures et finalement à 750C pendant une heure.
On sépare par filtration le solide ainsi obtenu et on le dissout dans 150 ml de solution de carbonate de sodium de pH 11-12. On porte la température de la solution à 60 C et on ajuste de nouveau le pH à 11-12 au moyen du carbonate de sodium. La solution est filtrée, on ajuste le pH à 7, au moyen de HCI N et on laisse au repos pendant 24 heures à 4 C. La solution est additionnée de charbon actif, agitée pendant 15 minutes et filtrée. On ajuste le pH du filtrat à 3-4 au moyen de HCI N et on laisse au repos à 40C pendant la nuit.
Le précipité est filtré, lavé avec 10 ml d'eau froide et avec 10 ml d'alcool éthylique refroidi. Le précipité bien essoré est séché sous vide à 500C pendant 24 heures. On obtient 1,3 g de produit brut avec un contenu d'environ 60% d'acide N-/p{/ (2,4-di-amino-6-ptéridinyle)méthyle/-N1 -méthyle-amino} - benzoyle-L-glutamique (déterminé par chromatographie et spectrophotométrie).
La purification de ce produit brut, effectuée par des méthodes décrites dans la littérature, conduit à un rendement globale de 10-15% en acide N-/p(/(2,4-di-amino-6-pténdi- nyle) -méthyle/-N'O-méthyle-amino) -benzoyle/-L-glutamique de pureté supérieure à 95 %.
Exemple 2
En opérant comme à l'exemple 1, mais en utilisant dans la troisième étape (c), I'acide N-/p-(N-méthyle-amino)benzoyle/-D-glutamique, les autres conditions opératoires restant inchangés, on obtient l'acide N-/p{/(2,4-diamino-6-ptéridinyle)-méthyle/-N10-méthyle-amino} -benzo yle/D-glutamique.
Exemple 3
En opérant comme à l'exemple 1, mais en utilisant dans la troisième étape (c), I'acide N-/p-(N-méthyle-amino) benzoyle/-DL-glutamique, les autres conditions restant inchangés, on obtient l'acide N-/p(/(2,4-di-amino-6- ptéridinyle)-méthyle/-Nio-méthyle-amino} -benzoyle/-DL- glutamique.
REVENDICATIQN
Procédé de préparation de l'acide N-/p{/(2,4-di-amino 6-ptéridinyle)-méthyle/-N1 0-méthyle-amino} -benzoyle/-L- glutamique, caractérisé en ce que la synthèse est réalisé en trois étapes, le composé de départ étant un sel de la 2,4,5,6tétra-amino-pyrimidine qui est traité avec de la 1,3-dihydroxy-acétone sous forme de composé bisulfitique en présence d'un agent oxydant en solution aqueuse, ensuite la 2,4 di-amino-6-hydroxyméthyle-ptéridine ainsi obtenue est traitée avec un agent de halogénation en présence d'une base organique dans un milieu organique inerte et finalement la 2,4-di amino-6-halogénométhyle-ptéridine ainsi obtenue est condensé avec l'acide N-/p-(N-méthyle-amino)-benzoyle/-Lglutamique en milieu aqueux tamponné au moyen d'un acétate de métal alcalin,
le produit brut de la réaction étant ensuite séparé par filtration et purifié.
SOUS-REVENDICATIONS
1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on prépare l'acide N-/p{/(2,4-di-amino-6-ptéridinyle) méthyle/-N90-méthyle-amino}-benzoyle/-D-glutamique.
2. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce qu'on prépare l'acide N-/p(/(2,4-di-amino-6-ptéridinyle)- méthyle/-Nt -méthyle-amino} -benzoyle/-DL-glutamique.
3. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent oxydant le bioxyde de sélénium sous un barbotage d'air dans le milieu réactionnel.
4. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on conduit la réaction entre le sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3-di-hydroxy-acétone à des températures de 20oC à 1000C.
5. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le pH du milieu réactionnel, pendant la réaction entre le sel de la 2,4,5,6-tétraamino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3-dihydroxy-acétone, est compris entre 3 et 7,5.
6. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le rapport molaire entre le sel de la 2,4,5,6-tétra-amino-pyrimidine et le composé bisulfitique de la 1,3-di-hydroxy-acétone est de 0,2 : 1 à 1 1.
7. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme agent de halogénation, dans la seconde étape du procédé, le chlorure de thionyle ou le trichlorure de phosphore.
8. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise comme base organique, dans l'étape de halogénation, la pyridine ou la triéthyle-amine.
9. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la réaction de halogénation est effectué au sein d'un solvant organique inerte, plus particulièrement dans du chloroforme ou du chlorure de méthylène.
10. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la réaction de halogénation a lieu à la température d'ébullition du solvant.
11. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on utilise un rapport molaire entre le dérivé ptéridinique et l'agent de halogénation de 0,2 1 à 1,2 1 et un rapport molaire entre le dérivé ptéridinique et la base organique de 1:1 à 10: 1.
12. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la réaction finale de condensation est effectué en milieu aqueux tamponné à un pH compris entre 3 et 6.
13. Procédé suivant la revendication et l'une des sous-revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on conduit la réaction finale de condensation à des températures augmentant graduellement pendant la réaction de 200C à 100C dans l'espace de 50 heures.
**ATTENTION** fin du champ DESC peut contenir debut de CLMS **.
The present invention relates to a process for the preparation of the L, D and DL isomers of N- / p {/ (2,4 diamino-6-pteridinyl) methyl / -N1 -methyl-amino} -benzoyl- acid. glutamic acid of formula I, used as medicaments for the treatment of cancer.
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It is known to prepare Np (/ (2,4-diamino-6-pteridinyl) methyl / -N10-methyl-amino} -benzoyl-glutamic acid by a one-step process, namely by the condensation of a salt of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine and N- / p- (N-methyl-amino) benzoyl / -L-glutamic acid, or with a 1, 2-di- halo-propionaldehyde or with a 1,1,3-tri-halo-acetone According to these processes, the reaction is carried out in aqueous medium at a pH of 3-4.
The yields of pure products, for the case of the use of 1, 2-di-halo-propionaldehyde, are not indicated in the literature. This process has, according to our work, drawbacks, in that the simultaneous condensation of the three compounds leads, with small yields, to a crude product with a low content of compound I. The purification of this crude product requires the use of very laborious methods involving large yield losses.
By the process which uses 1,1,3-tri-chloro-acetone, the crude compound I is obtained at about 70% purity with a yield of 46%, i.e. a total yield of 32% by to N- / p- (N-methyl-amino) -benzoyl / -L-glutamic acid [see BM Berezowski et al., Him. Pharm. Jur. 2 (12), 15 (1968)]. According to said literature, after fractional precipitation and two successive column chromatographies, compound I is obtained at 90% purity, with a yield of 6-7%.
On the other hand, according to our observations, this product is composed of a mixture of Np (/ (2,4-diamino-6-pteridiny- le) methyl / -N10-methyl-amino} -benzoyl-glutamic acid (I) and Np {i (2,4-diamino-7-pteridinyl) methyl / -NiO methyl-amino} -benzoyl-glutamic acid, of which only compound I is biologically active. No process for the separation of these two isomers is carried out. is mentioned in the literature.
The present invention provides a novel process, which is particularly advantageous, having the advantage of providing with better yields the compound I devoid of the biologically inactive 7-isomer.
The process according to the invention consists in synthesizing one of the L-, D- or DL- isomers of compound I in three steps, namely: the starting compound is a salt of 2,4,5,6-tetra-aminopyrimidine which is treated with 1,3-di-hydroxy-acetone as a bisulfite compound in the presence of an oxidizing agent in aqueous solution, then the 2,4-di-amino-6hydroxymethyl-pteridine thus obtained is treated with a halogenation in the presence of an organic base in an inert organic medium and finally the 2,4-di-amino-6halomethyl-pteridine thus obtained is condensed with N- / p- (N-methyl-amino) -benzoyl / -L-glutamic acid in an aqueous medium buffered with an alkali metal acetate. The crude reaction product is filtered off and purified.
The condensation reaction can be carried out at widely varying temperatures, on which the duration of the reaction depends.
This duration is from a few hours to several tens of hours. Generally, the operation is carried out between 20 and 100oC, especially between 45 and 750C, but the best way to carry out the reaction is to gradually increase the temperature from 20oC to 750C over the course of 50 hours.
As regards the pH, the reaction is carried out in a buffered acidic aqueous medium, advantageously at a pH of between 3 and 6.
By the process according to the invention, compound I is obtained at 95% purity (determined by chromatography and spectrophotometry), completely free of the 7-isomer, with a yield of 10 to 15% relative to the N acid. - / p- (N-methyl amino) -benzoyl / -glutamic.
Regarding the synthesis of 2,4-diamino-6hydroxymethyl-pteridine, the best method among several methods of preparation consists in the condensation of the hydrochloride of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine with 1 , 3-dihydroxy-acetone, in the presence of cysteine and using air as an oxidizing agent. The main disadvantage of this process consists in the need to use a 1,3-dihydroxyacetone completely devoid of methyl-glyoxal, the latter, under the reaction conditions, leading to the formation of 2,4-diamino- 6-methyl-pteridine. The purification of 1,3di-hydroxy-acetone is a laborious operation, comprising the transformation of it into bisulfite compound, intermediate purification, reconversion to ketone and final purification by distillation under a very high vacuum.
The process according to the invention avoids these drawbacks by obtaining 2,4-diamino-6-hydroxymethyl-pteridine by the condensation of a salt of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine with 1, 3-di-hydroxy-acetone in the form of the bisulfite compound, in a buffered aqueous medium, in the presence of certain thioalcohols, such as cysteine hydrochloride, under bubbling of a continuous stream of air and in the presence of selenium dioxide as oxidizing agent.
The reaction temperatures can vary over a fairly wide range, up to the boiling point of the solvent, but the operation is preferably carried out at the temperature of the chamber. In this case, the reaction time is about 24 hours.
It is advantageous to add the oxidizing agent to the reaction medium in at least two portions, one of which is at the start of the reaction and the other a few hours later.
As regards the pH of the reaction medium, the procedure is advantageously buffered by buffering the aqueous solution to a pH of between 3 and 7.5, using an acetate of an alkali metal. It is also appropriate to use a molar ratio between the salt of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine and the bisulfite compound of 1,3-di-hydroxy-acetone of 0.2: 1 to 1: 1.
The present invention is illustrated by the following examples.
Example 1 a) Preparation of 2,4-di-amino-6-hydroxymethyl pteridine
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To a suspension of 7.6 g of 2,4,5,6-tetra-aminopynmidine sulfate in 104 ml of water, heated to 70-80 C, is added with stirring 6.4 g of dihydric barium chloride, dissolved in a minimum quantity of hot water. The suspension is stirred for 30 minutes at the same temperature and then filtered. The precipitate of barium sulfate is washed twice with 26 ml of water at 70 ° C. and the filtrate which contains 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine hydrochloride is diluted with water.
up to a final volume of 400 ml.
In a three-necked reaction flask, with a capacity of 2 liters, fitted with a stirrer and a bubbling system, a solution of 128 g of sodium acetate in 390 ml of water is introduced. 19.6 g of bisulfitic compound of 1,3-di-hydroxy-acetone (free of methyl-glyoxal) and 4.6 g of cysteine hydrochloride are dissolved in this solution at room temperature. To this solution is added, with vigorous stirring and air bubbling, the 400 ml of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine hydrochloride solution obtained above. Immediately thereafter, a solution of 8 g of selenium dioxide in a minimum quantity of water is added. Stirring and air bubbling are continued and after 4 hours a new portion of aqueous solution of 8 g of selenium dioxide is added.
The reaction mixture is maintained at chamber temperature for a further 20 hours.
The solution is cooled to 1-4 ° C over an hour. The precipitate formed is filtered, drained, washed with small cooled portions of ethyl alcohol, a mixture of ethyl alcohol - ethyl ether 1: 1 and ethyl ether, again well drained and dried under vacuum at 50oC for 24 hours. .
3.8 g of 2,4-di-amino-6-hydroxy-methyl-pteridine are obtained, which corresponds to a yield of 72% relative to the salt of tetra-amino-pyrimidine.
b) Preparation of 2,4-di-amino-6-chloromethylpteridine
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175 ml of anhydrous chloroform, 7 g of dried and finely ground 2,4-di-amino-6-hydroxymethyl-pteridine are introduced into a reaction flask fitted with a stirrer and a reflux condenser, 2.1 ml of anhydrous pyridine and 14 ml of thionyl chloride. With vigorous stirring, the temperature of the mixture is brought to reflux and the reflux is maintained for one hour. Cool to room temperature, the crude product is filtered, washed with a small amount of anhydrous chloroform and air dried on the filter. 8.4 g of crude chlorinated product are obtained.
c) Preparation of N- / p {/ (2,4-di-amino-6 pteridinyl) -methyl / -NI -methyl-amino} -benzoyl / - acid
L-glutamic
In a reaction flask with a capacity of 500 ml,
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provided with a stirrer, a reflux condenser and a funnel with a tap, a solution of 20 g of sodium acetate in 250 ml of water is prepared. The pH of the solution is added to 4, using N hydrochloric acid. 2.8 g of N- / p- (N-methyl-amino) benzoyl / -L-glutamic acid are dissolved in this solution. A solution of 2 g of 2,4-diamino-6-chloromethyl-pteridine in 15 ml of concentrated formic acid is added dropwise, with vigorous stirring, over the course of one hour. The pH of the solution is maintained at 4, using small amounts of normal sodium hydroxide solution.
The reaction is continued at 450C for 40 hours, at 550C for 2 hours, at 650C for 2 hours and finally at 750C for one hour.
The solid thus obtained is separated by filtration and dissolved in 150 ml of sodium carbonate solution of pH 11-12. The temperature of the solution is brought to 60 ° C. and the pH is again adjusted to 11-12 using sodium carbonate. The solution is filtered, the pH is adjusted to 7 by means of N HCl and the mixture is left to stand for 24 hours at 4 C. The solution is added with activated carbon, stirred for 15 minutes and filtered. The pH of the filtrate is adjusted to 3-4 by means of N HCl and the mixture is left to stand at 40 ° C. overnight.
The precipitate is filtered off, washed with 10 ml of cold water and with 10 ml of cooled ethyl alcohol. The well-drained precipitate is dried under vacuum at 500C for 24 hours. 1.3 g of crude product are obtained with a content of about 60% of N- / p {/ (2,4-di-amino-6-pteridinyl) methyl / -N1 -methyl-amino} - benzoyl acid. -L-glutamic acid (determined by chromatography and spectrophotometry).
The purification of this crude product, carried out by methods described in the literature, leads to an overall yield of 10-15% of N- / p (/ (2,4-di-amino-6-ptendinyl) - acid. methyl / -N'O-methyl-amino) -benzoyl / -L-glutamic with a purity greater than 95%.
Example 2
By operating as in Example 1, but by using in the third step (c), N- / p- (N-methyl-amino) benzoyl / -D-glutamic acid, the other operating conditions remaining unchanged, it is possible to obtains N- / p {/ (2,4-diamino-6-pteridinyl) -methyl / -N10-methyl-amino} -benzo yl / D-glutamic acid.
Example 3
By operating as in Example 1, but using in the third step (c), N- / p- (N-methyl-amino) benzoyl / -DL-glutamic acid, the other conditions remaining unchanged, one obtains N- / p (/ (2,4-di-amino-6-pteridinyl) -methyl / -Nio-methyl-amino} -benzoyl / -DL-glutamic acid.
CLAIMS
Process for the preparation of N- / p {/ (2,4-di-amino 6-pteridinyl) -methyl / -N1 0-methyl-amino} -benzoyl / -L-glutamic acid, characterized in that the synthesis is carried out in three stages, the starting compound being a salt of 2,4,5,6tetra-amino-pyrimidine which is treated with 1,3-dihydroxy-acetone in the form of a bisulfitic compound in the presence of an agent oxidant in aqueous solution, then the 2,4-di-amino-6-hydroxymethyl-pteridine thus obtained is treated with a halogenating agent in the presence of an organic base in an inert organic medium and finally 2,4-di amino- 6-halogenomethyl-pteridine thus obtained is condensed with N- / p- (N-methyl-amino) -benzoyl / -Lglutamic acid in an aqueous medium buffered by means of an alkali metal acetate,
the crude reaction product then being separated by filtration and purified.
SUB-CLAIMS
1. Method according to claim, characterized in that the acid N- / p {/ (2,4-di-amino-6-pteridinyl) methyl / -N90-methyl-amino} -benzoyl / -D is prepared -glutamic.
2. Method according to claim, characterized in that the acid is prepared N- / p (/ (2,4-di-amino-6-pteridinyl) - methyl / -Nt -methyl-amino} -benzoyl / - DL-glutamic.
3. A method according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the oxidizing agent used is selenium dioxide under air bubbling in the reaction medium.
4. Process according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the reaction is carried out between the salt of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine and the bisulfite compound of 1,3-di-hydroxy-acetone at temperatures of 20oC to 1000C.
5. Process according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the pH of the reaction medium, during the reaction between the salt of 2,4,5,6-tetraamino-pyrimidine and the compound bisulfite of 1,3-dihydroxy-acetone, is between 3 and 7.5.
6. Method according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the molar ratio between the salt of 2,4,5,6-tetra-amino-pyrimidine and the bisulfite compound of 1 , 3-di-hydroxy-acetone is 0.2: 1 to 1 1.
7. Process according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that thionyl chloride or phosphorus trichloride or thionyl chloride or phosphorus trichloride is used as halogenating agent in the second stage of the process.
8. Process according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that pyridine or triethyl-amine is used as organic base in the halogenation step.
9. Method according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the halogenation reaction is carried out in an inert organic solvent, more particularly in chloroform or methylene chloride.
10. The method of claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the halogenation reaction takes place at the boiling point of the solvent.
11. Method according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that a molar ratio between the pteridin derivative and the halogenating agent of 0.2 1 to 1.2 1 and a molar ratio between the pteridin derivative and the organic base from 1: 1 to 10: 1.
12. Process according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that the final condensation reaction is carried out in an aqueous medium buffered at a pH of between 3 and 6.
13. A method according to claim and one of sub-claims 1 and 2, characterized in that one carries out the final condensation reaction at temperatures gradually increasing during the reaction from 200C to 100C within 50 hours.
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