CH551009A - In vitro determination of allergen hypersensitivity - Google Patents

In vitro determination of allergen hypersensitivity

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Abstract

Process for detection or assay of immunoglobulin-reagins antagonists to certain allergens, wherein the sample, e.g. a body fluid such as blood plasma or serum, is mixed with particles of an insol. polymer (e.g.Sephadex) to which the test allergen(s) has been firmly (covalently) fixed. The polymer, with the reagin now attached to the allergen, is brought into contact with specific antibodies to the reagin which have been marked (e.g. with a radiolabel such as 125I, or contg. a fluorescent gp.) and the polymer (or supernatant fluid) assayed for the marker. Alternatively, reagin may be marked instead of the antibodies and the polymer finally treated with this. For in vitro diagnosis of hypersensitivity.

Description

  

  
 



   Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung markierter Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline oder gegen Fragmente von Reagin-Immunoglobuline, dadurch gekennzeichnet, dass man ein radioaktives Atom oder eine fluoreszierende Gruppe in Antikörper gegen Reagin Immunoglobuline oder Fragmente davon einführt.



   In der österr. Patentschrift Nr. 288 593 ist ein Verfahren zur Bestimmung von Reagin-Ig in wässerigen Testproben beschrieben, welches im wesentlichen dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Probe, z. B. eine Körperflüssigkeit wie Blutserum oder Blutplasma in vitro mit einem wasserunlöslichen Polymer, welches vorzugsweise in Teilchenform vorliegt, und an welches ein Testallergen gebunden ist, zusammenbringt, worauf man das Polymer mit dem   Testallergen    und dem Reagin-Ig entweder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig, die mit einem radioaktiven Atom bzw.

   einer radioaktiven Gruppe markiert sind, oder mit Antikörpern gegen das Reagin-Ig und Reagin-Ig, welches mit einem radioaktiven Atom oder einer radioaktiven Gruppe markiert ist, zusammenbringt, anschliessend das unlösliche Polymer mit den daran befindlichen Substanzen aus der Flüssigkeit abtrennt und schliesslich die Strahlung, die von dem unlöslichen Polymer mit den daran befindlichen Substanzen ausgestrahlt wird, oder die Strahlung, die von der abgetrennten Flüssigkeit ausgestrahlt wird, misst oder die Wirkung derselben untersucht.



   Ist in der Probe ein Reagin-Ig vorhanden, welches gegen das Allergen gerichtet ist, so wird markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden, die anschliessend eine Strahlung emittieren wird. Die letztere erhöht sich, wenn die Konzentration an Reagin-Ig in der Testprobe zunimmt. Die Strahlung der flüssigen Phase wird im Gegensatz dazu bei sich erhöhender Konzentration an Reagin-Ig abnehmen, weil mehr markiertes Reagenz an die unlösliche Phase gebunden wird.



  Die gemessenen Strahlungswerte, die bei dieser Methode für die Testprobe erhalten werden, können mit den Werten von Kontrollproben verglichen werden.



   Reagin-Ig kann aus dem Serum allergischer Patienten sowie in seltenen Fällen aus dem Serum von Patienten, die Reagin-Ig-bildende Tumore im Gewebe aufweisen, gewonnen werden. Reagin-Ig kann mit den verschiedenen Methoden zur Abtrennung von Proteinen gereinigt werden, z. B. durch Gelfiltration,   Ionenaustauscher-Chromatographie    und Elek   trophorese. Ahnlich    wie andere Immunoglobuline kann Reagin-Ig chemisch oder enzymatisch in ein Antigenbindendes Fragment und ein Fragment, welches die Trägersubstanz für die klassenspezifisch bestimmenden Gruppen ist, gespalten werden.



   Die markierten Antikörper sind in radioimmunologischen Methoden verwendbar, z. B., wie oben ausgeführt ist, für die Bestimmung der Anwesenheit von Reagin-Ig.



   Antikörper gegen Reagin-Ig können nach bekannten Methoden zur Immunisierung von Versuchstieren hergestellt werden, z. B. durch wiederholte subkutane Injektionen kleiner Mengen von Antigenen in Mischung mit einem geeigneten Zusatzmittel, z. B. Freundscher Mineralölsuspension. Die Antikörper, die von dem Tier, z. B. einem Kaninchen, gebildet werden, können aus dem Blutserum des Tieres gewonnen werden.



   Spezifische Antikörper, das sind Antikörper, die gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen des Reagin-Ig gerichtet sind, können erhalten werden, indem man die Immunisierung mit den aus den Reagin-Ig-Molekülen abgespalteten Fragmenten, die die bestimmenden Gruppen enthalten, vornimmt oder indem man die spezifischen Antikörper aus einer Mischung von Antikörpern isoliert, die durch Immunisieren mit nativem Reagin-Ig gewonnen worden sind.



   Spezifische Antikörper, die gegen Reagin-Ig gerichtet sind, können gegebenenfalls aus dem Antiserum auch durch übliche immunosorbierende Techniken isoliert werden; beispielsweise kann Reagin-Ig mit Bromacetylcellulose gekuppelt werden, worauf die Antikörper, die an das gekuppelte Reagin-Ig gebunden sind, durch Erniedrigung des pH-Wertes freigesetzt werden.



   Es ist in einigen Fällen vorteilhaft, spezifische Antikörper gegen die klassenspezifischen bestimmenden Gruppen in dem Reagin-Ig zu verwenden, damit eine besonders hohe Sicherheit und Genauigkeit während der Versuche erreicht werden.



   Die Markierung von Reagin-Ig und Antikörpern gegen   keagin-Ig    mit radioaktiven Isotopen kann in üblicher Weise vorgenommen werden, wobei ein für diese Zwecke geeignetes Isotop z. B. aus 125J besteht (Methode nach Hunter und Greenwood). Auch die Markierung mit einer fluoreszierenden Gruppe kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B.



  mit einem Fluoreszeinderivat wie Fluoreszeinisothiocyanat.



   Die Bestimmung der Radioaktivität kann in üblicher Weise durchgeführt werden, z. B. mit Hilfe von Leuchtdetektoren. Auch die Fluoreszenz kann in üblicher Weise gemessen werden.



   Das Verfahrensprodukt kann auch zur quantitativen Be   stimmung    von Reagin-Ig dienen. Für diesen Zweck wird eine serielle Verdünnung des Testserums analysiert; das Ergebnis ergibt sich durch Vergleich mit der Wirkung einer Standardlösung, die in analoger Weise analysiert worden ist.



   Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.



   Beispiel 1
A) Herstellung von Antikörpern gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig
Kaninchen wurden intramuskulär mit einer Mischung aus 0,5 mg Fc-Fragment des Reagin-Ig (hergestellt nach Schweizer Patent 534 878) in 0,2 ml 0,15 m Natriumchloridlösung und 0,8 ml vollständiger Freundscher Zusatzlösung injiziert.



  Die Immunisierung wurde nach 14 Tagen und dann jede Woche drei Wochen lang wiederholt. Nachdem weitere 10 Tage vergangen waren, wurde den Kaninchen Blut entnommen, aus welchem das Antiserum durch Koagulieren und Entfernung des Koagulates gewonnen wurde.



   Das Antiserum wurde durch Adsorption während einer Stunde bei 370 C und 16 Stunden bei 40 C spezifisch gemacht.



  Nach dem Abzentrifugieren wurde die Spezifität des Antiserums durch   Immunoelektrophorese    gegen normales Menschenserum und durch   Ochtorlony-Geldiffusionsanalyse    gegen reine Immunoglobuline A, G und M, sogenannte leichte Polypeptidketten aus normalem Immunoglobulin G und Bence-Jones-Proteine getestet; dabei konnte die Spezifität gegen Reagin-Ig festgestellt werden.



   Antikörper gegen das Fc-Fragment wurden aus diesem Antiserum isoliert, in folgender Weise: 2 g eines Komplexes aus Bromacetylcellulose und Reagin-Ig wurden mit 34 ml einer Lösung vermischt, die etwa 95 mg Immunoglobulin enthielt, die aus dem Antiserum durch Ionenaustauscherchroma   tographie    isoliert worden war. Die gewonnene Suspension wurde bei pH 7 und 40 C zwei Stunden aktiviert und anschliessend mit 20 000   xg    20 Minuten bei 100 C zentrifugiert.

 

  Die überstehende Flüssigkeit wurde entfernt, die Cellulose wurde mit 0,15 m   NaCl-8    m Harnstoff (pH 6-7) gewaschen, anschliessend wurde wieder zentrifugiert, worauf die überstehende Flüssigkeit entfernt wurde. Dieses Waschverfahren wurde solange wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit frei von Protein war. Der Cellulose-Protein-Komplex wurde zu 9   ml    0,1 m Glycin-HCl-Puffer (pH 3,1) gegeben und unter Rühren bei 370 C 40 Minuten inkubiert. Die ganze Lösung wurde dann zentrifugiert; die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 1200   ml    0,01 m Tris-HCl, 0,1 m NaCl   (pH 7,1) bei 40 C 48 Stunden dialysiert. Diese Lösung enthiet Antikörper in einer Menge von ungefähr 1 mg pro ml, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig und damit also auch für das gesamte Reagin-Ig spezifisch sind.

  Dieses Antikörpermaterial reicht zur Durchführung von mehr als 10 Millionen Bestimmungen aus.



   B) Markierung von Antikörpern, die gegen das Fc-Fragment des Reagin-Ig spezifisch sind.



   Die Markierung wurde mit   125J    nach der Methode von Hunter und Greenwood,  Nature  194 (1962), Seite 495, durchgeführt.



   Die Markierung kann auch in entsprechender Weise durchgeführt werden, wie dies im Beispiel 2 für Antikörper gegen Reagin-Ig beschrieben ist.



   Die markierten Antikörper können für das Bestimmungsverfahren nach Patent 534 878 verwendet werden.



   Beispiel 2
Markierung von Antikörpern gegen Reagin-Ig
A) Herstellung von Antikörpern gegen Reagin-Ig
Antikörper gegen Reagin-Ig wurden hergestellt durch Immunisierung von Kaninchen mit Reagin-Ig auf gleiche Weise wie unter Beispiel 1 A beschrieben.



   B) Radioaktives Jod   (12sJ)   
Jod-125, trägerfrei, gelöst als NaJ in 0,1 m NaOH und frei von Reduktionsmitteln wurde verwendet.



   C) Herstellung von Jodmonochlorid
Jodmonochlorid wurde hergestellt gemäss J. L. Izzo, W.



  F. Bale, M. J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Chem., 239, Nr. 11, 3742 (1964) und der Jodgehlat wurde bestimmt durch Reduktion des gesamten Jods zu Jodid mit Hilfe von Arsentrioxyd und nachfolgende Titration mit 0,1 m AgNO3. Die   JC1-Stammlösung    enthielt 2,54 mg J/ml in 0,02 m   KCI,    2,0 m NaCI und 1,0 m   HC1    und ist bei Raumtemperatur wenigstens 18 Monate lang stabil. Vor Gebrauch wurde die   JC1-Stammlösung    auf die gewünschte Konzentration verdünnt. Als Verdünnungsmittel wurde eine   HCl-NaCl-Lösung    bereitet, deren Konzentration für jeden Versuch individuell eingestellt wurde, um verlässlich Werte oberhalb der Minimalkonzentration an   HC1    und NaCl zu erhalten, bei welchen JCI als Stabil bekannt ist   IR.    W. Helmkamp, M. A.

  Conteras und W. F. Bale: Int. J. appl. Radiat. Isotopes, 18, 737 (1967)].



   D) Markierungsverfahren
Die Jodierung beruht auf   Helmkamps    Modifizierung der Jodmonochloridmethode nach McFairlane   [A.    S. McFairlane, Nature, 182, 53 (1958)], mit weiteren Abänderungen [J. L.



  Izzo, W. F. Bale, M. J. Izzo und A. Roncone, J. Biol. Chem.



  239, Nr. 11 (1964), 3743, W. F. Bale, R. W. Helmkamp, T. P. Davis, M. J. Izzo, R. L. Gooland, M. A. Contreras und I. L. Spar, Proc. Soc. Exp. Med., 122 (1966), 407, und R. W.



  Helmkamp, M. A. Contreras und W. F. Bale, Int. J. appl.



     Radial    Isotops, 18 (1967), 737].



   Antikörper gegen Reagin-Ig (100   ,zug)    wurden markiert in einem Molverhältnis von   JCl    zu Antikörper gegen Reagin-Ig von 2:1 und JC1 zu   125J    von 1:1. Folgende Lösungen wurden verwendet:
Lösung I: Antikörper gegen Reagin-Ig wurde in 0,2   m      tris-HC1-Puffer,    pH 8, mit einer Konzentration von 10,0 mg/ml gelöst.



   Lösung II: Das Verdünnungsmittel für die   JC1-Stamm-    lösung wurde durch Auflösen von 5,84 g   NaC1    in 35 ml 2,0 m HC1 und 65 ml destilliertem Wasser bereitet.



   Lösung III: Die Endlösung von Jodmonochlorid wurde bereitet durch Verdünnen von 100   ,cel    der JCl-Stammlösung mit 20,2 ml Lösung II.



   Lösung IV: 44,29   ,ul    von Radiojodid (4,0 mCi) wurden zu 25   zur    Lösung III zugegeben und vor Gebrauch in einem Eisbad belassen. Alle Lösungen wurden kühlgehalten und die Jodierungsreaktion wurde bei Eistemperatur durchgeführt.



  Die Reagentien wurden in der folgenden Reihenfolge in kleine Glasröhrchen gegeben:
Zu 200   ul    Borat-Carbonat-Puffer (0,4 m, pH = 9,1) und 10   fzl    Lösung I (100   g    Antikörper gegen Reagin-Ig) wurden 50   ,ul    Lösung IV zugesetzt und sofort kräftig gemischt. Nach 60 sec wurden 20   ,6ll    0,1 m   Na2S203,    50   zur    20/oiges KJ und 200   yl      50/obiges    Human-Serum-Albumin-Blau (HSA-Blau) zugesetzt. Das HSA-Blau wurde gemäss Melani [F. Melani,   K M.    Bartelt, R. Conrads, E. F. Pfeiffer, Z. klin. Chem., 4.



  Jahrg. 1966 (Heft 4)] bereitet. Letzteres wurde zur Verminderung von Strahlenschäden und zur Verminderung der Adsorption von Antikörpern gegen Reagin-Ig an den Glaswänden zugegeben. Zubereitungen von mit 125J jodierten Antikörpern gegen Reagin-Ig können gereinigt werden durch Sephadex (R) (vernetztes Dextran) oder Sepharose (R) (Agargel), u. zw. durch Gelfiltration oder durch Ionenaustauscher wie Dowex (R) oder Amberlite (R). Fraktionen aus der Kolonne wurden gewonnen bei   +40    C in 0,1 m   tris-HC1-Puffer,    pH = 7,72, mit einem Gehalt von 5   o/o    HSA. Fraktionen, die die markierten Antikörper gegen Reagin-Ig enthielten, wurden gesammelt und in gefrorenem Zustand aufbewahrt.

 

   Diese Methode ergab 81,34   o/o    Bindung von gesamten jodierten Antikörpern gegen Reagin-Ig. Das markierte Immunoglobulin enthielt etwa 1 Atom 125J und etwa 1 Atom 127J pro Molekül (MW 150 000) und hatte eine spezifische Aktivität von etwa 16 mCi/Mg. 



  
 



   The invention relates to a method for producing labeled antibodies against reagin immunoglobulins or against fragments of reagin immunoglobulins, characterized in that a radioactive atom or a fluorescent group is introduced into antibodies against reagin immunoglobulins or fragments thereof.



   In the Austrian patent specification No. 288 593 a method for the determination of reagin-Ig in aqueous test samples is described, which is essentially characterized in that the sample, e.g. B. a body fluid such as blood serum or blood plasma in vitro with a water-insoluble polymer, which is preferably in particle form, and to which a test allergen is bound, whereupon the polymer with the test allergen and the reagin-Ig either with antibodies against the reagent Ig associated with a radioactive atom or

   a radioactive group are marked, or with antibodies against the reagin-Ig and reagin-Ig, which is marked with a radioactive atom or a radioactive group, brings together, then separates the insoluble polymer with the substances on it from the liquid and finally the radiation which is emitted from the insoluble polymer with the substances attached, or measures the radiation emitted from the separated liquid or examines the effect thereof.



   If the sample contains a Reagin-Ig which is directed against the allergen, the labeled reagent is bound to the insoluble phase, which will then emit radiation. The latter increases as the concentration of reagin-Ig in the test sample increases. In contrast, the radiation of the liquid phase will decrease as the concentration of Reagin-Ig increases, because more labeled reagent is bound to the insoluble phase.



  The measured radiation values that are obtained for the test sample using this method can be compared with the values of control samples.



   Reagin-Ig can be obtained from the serum of allergic patients and, in rare cases, from the serum of patients who have reagin-Ig-forming tumors in the tissue. Reagin-Ig can be purified using various methods for separating proteins, e.g. B. trophoresis by gel filtration, ion exchange chromatography and electrophoresis. Similar to other immunoglobulins, Reagin-Ig can be cleaved chemically or enzymatically into an antigen-binding fragment and a fragment which is the carrier substance for the class-specific determining groups.



   The labeled antibodies can be used in radioimmunological methods, e.g. B., as stated above, for the determination of the presence of reagin-Ig.



   Antibodies against Reagin-Ig can be produced by known methods for the immunization of test animals, e.g. B. by repeated subcutaneous injections of small amounts of antigens in admixture with a suitable additive, e.g. B. Freund's mineral oil suspension. The antibodies raised by the animal, e.g. B. a rabbit, can be obtained from the blood serum of the animal.



   Specific antibodies, that is, antibodies which are directed against the class-specific determining groups of the reagin-Ig, can be obtained by immunizing with the fragments cleaved from the reagin-Ig molecules, which contain the determining groups, or by isolated the specific antibodies from a mixture of antibodies obtained by immunizing with native reagin-Ig.



   Specific antibodies which are directed against Reagin-Ig can optionally also be isolated from the antiserum by customary immunosorbing techniques; for example, Reagin-Ig can be coupled with bromoacetyl cellulose, whereupon the antibodies which are bound to the coupled Reagin-Ig are released by lowering the pH.



   In some cases it is advantageous to use specific antibodies against the class-specific determining groups in the Reagin-Ig, so that a particularly high level of safety and accuracy can be achieved during the experiments.



   The labeling of reagin-Ig and antibodies against keagin-Ig with radioactive isotopes can be carried out in the usual way, an isotope suitable for this purpose, for. B. consists of 125J (Hunter and Greenwood method). The labeling with a fluorescent group can also be carried out in the usual way, e.g. B.



  with a fluorescein derivative such as fluorescein isothiocyanate.



   The determination of the radioactivity can be carried out in the usual way, e.g. B. with the help of light detectors. The fluorescence can also be measured in the usual way.



   The process product can also be used for the quantitative determination of Reagin-Ig. For this purpose a serial dilution of the test serum is analyzed; the result is obtained by comparison with the effect of a standard solution that has been analyzed in an analogous manner.



   The following examples serve to further illustrate the invention.



   example 1
A) Production of antibodies against the Fc fragment of Reagin-Ig
Rabbits were injected intramuscularly with a mixture of 0.5 mg Fc fragment of Reagin-Ig (manufactured according to Swiss patent 534 878) in 0.2 ml 0.15 M sodium chloride solution and 0.8 ml complete Freund's additional solution.



  The immunization was repeated after 14 days and then every week for three weeks. After a further 10 days had passed, blood was taken from the rabbits, from which the antiserum was obtained by coagulating and removing the coagulate.



   The antiserum was made specific by adsorption for one hour at 370.degree. C. and 16 hours at 40.degree.



  After centrifugation, the specificity of the antiserum was tested by immunoelectrophoresis against normal human serum and by Ochtorlony gel diffusion analysis against pure immunoglobulins A, G and M, so-called light polypeptide chains from normal immunoglobulin G and Bence Jones proteins; the specificity against Reagin-Ig could be determined.



   Antibodies against the Fc fragment were isolated from this antiserum in the following manner: 2 g of a complex of bromoacetyl cellulose and reagin-Ig were mixed with 34 ml of a solution containing about 95 mg of immunoglobulin which had been isolated from the antiserum by ion exchange chroma tography was. The suspension obtained was activated at pH 7 and 40 ° C. for two hours and then centrifuged at 20,000 × g for 20 minutes at 100 ° C.

 

  The supernatant liquid was removed, the cellulose was washed with 0.15 M NaCl-8 M urea (pH 6-7), followed by centrifugation again, whereupon the supernatant liquid was removed. This washing procedure was repeated until the supernatant was free of protein. The cellulose-protein complex was added to 9 ml of 0.1 M glycine-HCl buffer (pH 3.1) and incubated with stirring at 370 ° C. for 40 minutes. The whole solution was then centrifuged; the supernatant liquid was dialyzed against 1200 ml of 0.01 M Tris-HCl, 0.1 M NaCl (pH 7.1) at 40 ° C. for 48 hours. This solution contains antibodies in an amount of approximately 1 mg per ml, which are specific against the Fc fragment of the reagin-Ig and thus also for the entire reagin-Ig.

  This antibody material is sufficient to carry out more than 10 million determinations.



   B) Labeling of antibodies which are specific against the Fc fragment of Reagin-Ig.



   The labeling was carried out with 125J according to the method of Hunter and Greenwood, Nature 194 (1962), p. 495.



   The labeling can also be carried out in a corresponding manner as described in Example 2 for antibodies against Reagin-Ig.



   The labeled antibodies can be used for the determination method according to patent 534,878.



   Example 2
Labeling of antibodies against Reagin-Ig
A) Production of antibodies against Reagin-Ig
Antibodies against Reagin-Ig were produced by immunizing rabbits with Reagin-Ig in the same way as described in Example 1A.



   B) radioactive iodine (12sJ)
Iodine-125, carrier-free, dissolved as NaI in 0.1 M NaOH and free from reducing agents was used.



   C) Production of iodine monochloride
Iodine monochloride was prepared according to J. L. Izzo, W.



  F. Bale, MJ Izzo and A. Roncone, J. Biol. Chem., 239, No. 11, 3742 (1964) and the iodine content was determined by reducing all of the iodine to iodide with the aid of arsenic trioxide and subsequent titration with 0, 1 m AgNO3. The JC1 stock solution contained 2.54 mg I / ml in 0.02 M KCI, 2.0 M NaCI and 1.0 M HCl and is stable at room temperature for at least 18 months. The JC1 stock solution was diluted to the desired concentration before use. An HCl-NaCl solution was prepared as a diluent, the concentration of which was set individually for each experiment in order to reliably obtain values above the minimum concentration of HCl and NaCl, for which JCI is known as stable IR. W. Helmkamp, M. A.

  Conteras and W. F. Bale: Int. J. appl. Radiate. Isotopes, 18, 737 (1967)].



   D) marking method
The iodination is based on Helmkamp's modification of the McFairlane iodine monochloride method [A. S. McFairlane, Nature, 182, 53 (1958)], with further modifications [J. L.



  Izzo, W. F. Bale, M. J. Izzo and A. Roncone, J. Biol. Chem.



  239, No. 11 (1964), 3743, W. F. Bale, R. W. Helmkamp, T. P. Davis, M. J. Izzo, R. L. Gooland, M. A. Contreras and I. L. Spar, Proc. Soc. Exp. Med., 122, 407 (1966) and R. W.



  Helmkamp, M. A. Contreras and W. F. Bale, Int. J. appl.



     Radial Isotops, 18, 737 (1967)].



   Antibodies against Reagin-Ig (100, Zug) were labeled in a molar ratio of JCl to antibodies against Reagin-Ig of 2: 1 and JC1 to 125J of 1: 1. The following solutions were used:
Solution I: Antibodies against Reagin-Ig were dissolved in 0.2 M tris-HCl buffer, pH 8, with a concentration of 10.0 mg / ml.



   Solution II: The diluent for the JC1 stock solution was prepared by dissolving 5.84 g of NaC1 in 35 ml of 2.0 M HCl and 65 ml of distilled water.



   Solution III: The final solution of iodine monochloride was prepared by diluting 100 cel of the JCl stock solution with 20.2 ml of solution II.



   Solution IV: 44.29 µl of radioiodide (4.0 mCi) was added to 25 to solution III and left in an ice bath before use. All solutions were kept cool and the iodination reaction was carried out at ice temperature.



  The reagents were placed in small glass tubes in the following order:
50 μl of solution IV were added to 200 μl of borate carbonate buffer (0.4 m, pH = 9.1) and 10 μl of solution I (100 g of antibodies against Reagin-Ig) and immediately mixed vigorously. After 60 seconds, 20.6 l of 0.1 m Na2S203, 50 to 20% KI and 200 µl of 50% human serum albumin blue (HSA blue) were added. The HSA blue was determined according to Melani [F. Melani, K M. Bartelt, R. Conrads, E. F. Pfeiffer, Z. klin. Chem., 4.



  Year 1966 (issue 4)]. The latter was added to reduce radiation damage and to reduce the adsorption of antibodies against Reagin-Ig on the glass walls. Preparations of antibodies against Reagin-Ig, iodinated with 125 I, can be purified by Sephadex (R) (cross-linked dextran) or Sepharose (R) (agar gel), and the like. between gel filtration or ion exchangers such as Dowex (R) or Amberlite (R). Fractions from the column were obtained at +40 ° C. in 0.1 m tris-HCl buffer, pH = 7.72, with a content of 5 o / o HSA. Fractions containing the labeled antibodies to Reagin-Ig were collected and stored in the frozen state.

 

   This method resulted in 81.34% binding of total iodinated antibodies against reagin-Ig. The labeled immunoglobulin contained about 1 atom of 125I and about 1 atom of 127J per molecule (MW 150,000) and had a specific activity of about 16 mCi / Mg.

 

Claims (1)

PATENTANSPRUCH PATENT CLAIM Verfahren zur Herstellung markierter Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline oder gegen Fragmente von Reagin Immunoglobulinen, dadurch gekennzeichnet, dass man ein radioaktives Atom oder eine fluoreszierende Gruppe in Antikörper gegen Reagin-Immunoglobuline oder Fragmente davon einführt. Process for the production of labeled antibodies against reagin immunoglobulins or against fragments of reagin immunoglobulins, characterized in that a radioactive atom or a fluorescent group is introduced into antibodies against reagin immunoglobulins or fragments thereof. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass das radioaktive Atom ein Jodisotop ist. SUBCLAIMS 1. The method according to claim, characterized in that the radioactive atom is an iodine isotope. 2. Verfahren nach Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Jodisotop 125J ist. 2. The method according to dependent claim 1, characterized in that the iodine isotope is 125J.
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