Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Anti-Rh-y-Globulin.
Fetale Erythroblastose ist eine hämolytische Krankheit, die bei Neugeborenen Gehirnschäden, Herzschäden oder den
Tod verursachen kann. Diese Krankheit wird verursacht durch Antikörper gegen fötale Erythrozyten, die durch die
Plazenta der Mutter zur Frucht gelangen. Dieses Krankheits bild tritt allgemein auf bei Kindern von Eltern, deren Blut verschiedene Rhesusfaktoren hat, z. B. bei den Kindern einer
Rh-negativen Mutter und eines Rh-positiven Vaters.
Wenn eine Frau, deren Rhesusfaktor von dem ihres Man nes verschieden ist, zum ersten Mal schwanger wird, können rote Blutkörperchen aus der Frucht in ihren Kreislauf gelan gen. Wenn die Frau Rh-negativ und ihr Mann Rh-positiv ist, sind die fötalen roten Blutkörperchen gewöhnlich Rh-positiv.
Antikörper zu den Rh-positiven roten Blutkörperchen bilden sich nur selten während der ersten Schwangerschaft im Kreis lauf der Mutter, und das erste Kind bleibt unbeeinflusst. Nach der Schwangerschaft können die im Kreislauf der Mutter ver bleibenden Rh-positiven fötalen Erythrozyten die Mutter so immunisieren, dass sie eine etwa 9- bis 20%ige Aussicht hat, Rh-Antikörper zu bilden. Während der folgenden Schwanger schaften gelangen die Rh-positiven Antikörper im Kreislauf der Mutter durch die Plazenta in den Kreislauf der Frucht und zerstören die fötalen roten Blutkörperchen und verursachen fetale Erythroblastose. Da etwa 15 % der Bevölkerung Rh negativ sind, ist die Krankheit nicht selten.
Freda, Gorman und Pollack berichteten, dass bei einer
Rh-negativen Mutter durch intramuskuläre Injektion von
Anti-Rh-y-Globulin innerhalb von 72 Stunden nach der Ge burt die Bildung von Antikörpern, die fetale Erythroblastose bei der Frucht der nächsten Schwangerschaft verursachen können, im Kreislauf verhindert wird (Science, 18.2.1966,
Band 151, Nr. 3712, Seite 838-830).
Cohn beschreibt in der USA-Patentschrift 2 390 074 ein
Verfahren zur Fraktionierung von Blut, bei dem y-Globuline hergestellt werden. Die nach dem Verfahren von Cohn hergestellten y-Globuline enthalten 19 S-Globulin, Plasminogen und Lipide. Dieses y-Globulin eignet sich zwar ausgezeichnet für die Prophylaxe von Krankheiten, wie Masern und Teta nus, jedoch sind das 19 S-Globulin, das Plasminogen und die Lipoide unnötige Verunreinigungen, die die Wirksamkeit hinsichtlich der Verhinderung der Immunisierung gegen den Rh-Faktor an den fötalen Erythrozyten verringern.
Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein Verfahren zur Herstellung von Anti-Rh-y-Globulin aus menschlichem Blutplasma zu entwickeln, wobei dieses Blutplasma noch weitere Komponenten, beispielsweise Albumin, Plasminogen, a- und ss-Globuline und verschiedene Lipide enthält. Das nach dem erfindungsgemässen Verfahren herzustellende Anti-Rhy-Globulin ist ein spezielles y-G-Globulin, wobei das menschliche Blutplasma ausser diesem speziellen erwünschten y-Globulin im allgemeinen noch andere y-Globuline enthält.
Es wurde überraschenderweise gefunden, dass die Herstellung von Anti-Rh-y-Globulin aus menschlichem Blutplasma durch ein spezielles Fraktionierverfahren erreicht werden kann.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Anti-Rh-y-Globulin aus menschlichem Blutplasma, das sich dadurch auszeichnet, dass man menschliches Blutplasma, das dieses Anti-Rh-y-Globulin enthält, in einer
1. Stufe auf eine Temperatur zwischen 0 und +2 C kühlt, und das Plasma in eine erste flüssige Phase und einen ersten Niederschlag auftrennt, in einer
2. Stufe Methanol der in der 1. Stufe gewonnenen flüssigen Phase zu setzt und deren Temperatur auf einen Wert von -5,5 bis -4,5 C einstellt, wobei die Menge an zugesetztem Methanol 10,6 bis 10,8 Vol.% beträgt und der pH-Wert auf einen Wert von 7,0 bis 7,4 und die Ionenstärke auf 0,136 gill eingestellt wird und man das so erhaltene System in einen zweiten Niederschlag und eine zweite flüssige Phase aufteilt, dann in einer
3.
Stufe Methanol bis zu einem Gehalt von 33,25 bis
33,35 Vol. % der in der 2. Stufe gewonnenen flüssigen Phase zusetzt und die Temperatur auf -5,5 bis -4,5 C und den pH-Wert auf 6,7 bis 7,1 einstellt und die Ionenstärke auf einem Wert von 0,081 bis 0,091 gill aufrechterhält und das erhaltene System in einen dritten Niederschlag und eine dritte flüssige Phase auftrennt, in einer
4. Stufe 26,5 bis 26,9 Vol.% Methanol zu dem in der
3. Stufe erhaltenen Niederschlag zusetzt und bei einer Temperatur von -5,5 bis -4,5" C den pH-Wert auf 7,0 bis 7,4 und die Ionenstärke auf 0,0047 bis 0,0057 gill einstellt und das erhaltene System in einen vierten Niederschlag und eine vierte flüssige Phase auftrennt, in einer
5. Stufe dem in der 4.
Stufe erhaltenen Niederschlag 22,5 bis 22,9 % Methanol zusetzt, die Temperatur auf einen Wert von -6,5 bis -5,5" C und den pH-Wert auf einen Wert von 5,0 bis 5,4 einstellt und die Ionenstärke auf einen Wert von 0,008 bis 0,018 giA bringt und das erhaltene System in einen fünften Niederschlag und eine fünfte flüssige Phase auftrennt, und schliesslich in einer
6. Stufe 33,0 bis 33,4% Methanol zu der in der 5. Stufe gewonnenen flüssigen Phase zusetzt und die Temperatur auf einen Wert von 6,5 bis -5,5" C und den pH-Wert auf 7,0 bis 7,4 einstellt und die Ionenstärke auf einen Wert von 0,055 bis 0,065 gi/l bringt und das so erhaltene System in einen sechsten, das Anti-Rh-y-Globulin enthaltenden Niederschlag und eine sechste flüssige Phase auftrennt.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des Anti-Rh-y-Globulins ist also ein sechsstufiges Verfahren, wobei in jeder Verfahrensstufe ganz bestimmte enge Bereiche des pH-Wertes eingestellt werden müssen. Beispielsweise muss in der zweiten Stufe des erfindungsgemässen Verfahrens ein pH-Wert im Bereich von 7,0 bis 7,4 eingestellt werden, während der in der 5. Stufe einzuhaltende pH-Bereich 5,0 bis 5,4 beträgt. Durch diese gezielte Änderung des pH Wertes erreicht man den Ablauf chemischer Reaktionen, nämlich die Überführung von NH2-Gruppen von Aminosäuren des Proteins in NH3+-Gruppen und nachfolgend wieder die Freisetzung der NH2-Gruppen aus diesen genannten Salzen. Das erfindungsgemässe Verfahren ist daher ein chemische Schritte umfassendes Verfahren zur Herstellung des erwünschten Anti-Rh-y-Globulins.
Die nach dem erfindungsgemässen Verfahren durchgeführte Fraktionierung macht sich u. a. die durch die erwähnten Salzreaktionen hervorgerufenen unterschiedlichen Löslichkeiten der verschiedenen Komponenten des Plasma zunutze.
In jeder Trennstufe des erfindungsgemässen Verfahrens hängt die Abtrennung von unerwünschten Komponenten aus der gewünschten, das Anti-Rh-Globulin enthaltenen Fraktion von der ganz genauen Einhaltung der angeführten pH Werte, der Temperaturintervalle, der Konzentration des Fäl lungsmittels und der Ionenstärke des Systems ab.
Verschiedene organische Lösungsmittel mit niedriger Dielektrizitätskonstante, z. B. Aceton und Alkohole, fällen Proteine und sind bisher bei der Fraktionierung von Plasma verwendet worden. Beim Verfahren gemäss der Erfindung wird in der 2. bis 6. Stufe Methanol als organisches Lösungsmittel verwendet. Die Fähigkeit, die entscheidend wichtigen Ionenkonzentrationen in den verschiedenen Stufen der Fraktionierung aufrechtzuerhalten, hängt von der Verwendung von Methanol ab.
Um eine Denaturierung der Proteine während der Fraktionierung zu verhindern, wird die Fällung bei den erwähnten niedrigen Temperaturen vorgenommen. Da die Proteinlöslichkeit temperaturabhängig ist, muss die Temperatur, die für jede Stufe der Fraktionierung gewählt wird, die niedrigste mögliche Temperatur sein, die die gewünschte Trennung zulässt, um eine Denaturierung zu verhindern.
Beim erfindungsgemässen Verfahren kann in der ersten Stufe die Trennung in die erste flüssige Phase und den ersten Niederschlag durchZentrifugierenvorgenommen werden. Der erste Niederschlag wird verworfen und in einer zweiten Stufe wird, unter den erwähnten Bedingungen, eine Auftrennung der ersten flüssigen Phase in eine zweite flüssige Phase und einen zweiten Niederschlag erreicht.
Anhand des in der Folge wiedergegebenen Arbeitsschemas wird nun eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens näher erläutert:
Als Ausgangsmaterial verwendet man das gesamte menschliche Blutplasma, das in einer ersten Stufe auf eine Temperatur zwischen 0 und +2 C, also eine Temperatur von 1+1 C gekühlt wird. Dabei erhält man einen in der Kälte unlöslichen Niederschlag, der verworfen wird.
In der zweiten Stufe wird dann der pH-Wert der aus der ersten Stufe gewonnenen flüssigen Phase durch Zugabe von Essigsäure auf 7,2+0,2 eingestellt. Dadurch erreicht man eine Ionenstärke von 0,136 gi/Liter. Ferner setzt man Methanol zu, bis derMethanolgehaltdieses Ansatzes auf 10,7 + 0,1Vol. % pro Volumen gebracht ist und diese Lösung wird dann bei einer Temperatur von -5+0,5 C zentrifugiert. Dabei erhält man eine flüssige Phase I, die in einen Kolben gegeben wird, der mit einer Kühlvorrichtung ausgestattet ist, sowie einem Niederschlag I, der im wesentlichen aus Fibrinogen besteht und verworfen wird.
In der dritten Stufe wird dann zu der aus der zweiten Stufe gewonnenen flüssigen Phase, also der flüssigen Phase I, unter Kühlung Methanol, Essigsäure und Natriumacetat zugesetzt. Die Mengen an diesen zugesetzten Materialien werden so gewählt, dass die Methanolkonzentration auf einen Wert von 33,25 bis 33,35 Vol. % pro Volumen, also einen Wert von 33,3+0,5 Vol. % pro Volumen eingestellt wird und die Ionenstärke einen Wert von 0,081 bis 0,091 gi/Liter, also einen Wert von 0,086+0,005 gi/pro Liter erreicht. Der pH Wert dieser Lösung beträgt 6,9. Man kühlt dann diese Lösung auf eine Temperatur von -5,5 bis 4,50 C, also auf eine Temperatur von -5+0,5 C ab, lässt sie stehen und zentrifugiert dann.
Bei diesem Zentrifugieren in der dritten Stufe bildet sich ein Niederschlag II+III, der aufbewahrt wird und eine flüssige Phase II+III, die verworfen wird und a-Globulin, ss-Globulin und Lipoide enthält. Der weiterverarbeitete, in der dritten Stufe gewonnene Niederschlag II +111 besteht hauptsächlich aus ss-Globulinen und y-Globulinen sowie Isoagglutininen, er enthält jedoch auch Prothrombin, Plasminogen, Cholesterin und andere Lipoide.
In einer vierten Stufe wird nun der in der dritten Stufe gewonnene Niederschlag, also der Niederschlag II +111 in Wasser von 0 C, das mit Eis im Gleichgewicht steht, suspendiert. Man gibt eine Dinatriumphosphatlösung der Suspension unter Rühren zu, damit der pH-Wert auf 7,0 bis 7,4, also einem Wert von 7,2kr0,2, eingestellt wird. Ferner setzt man Methanol bei -10" C zu, bis ein Methanolgehalt von 26,7+0,2 Vol. % pro Volumen erreicht ist. Durch die Zugabe des Dinatriumphosphates wurde die Ionenstärke der Lösung auf 0,0047 bis 0,0057 gi/l, also einen Wert von 0,0052 ru0,0005 gilLiter eingestellt.
Bei einer Temperatur von -5,5 bis 4,50 C, also einer Temperatur von 5*0,5 C, wird dann zentrifugiert, wobei man eine vierte flüssige Phase, die auch flüssige Phase II+III W genannt wird, erhält. Diese flüssige Phase enthält ss-Globulin, Cholesterin und andere Lipoide und wird verworfen. Ferner erhält man bei Zentrifugieren einen vierten Niederschlag, der auch Niederschlag II+III W genannt wird, und der aus dem Zentrifugiergefäss entfernt wird. Dieser Niederschlag der vierten Stufe besteht hauptsächlich aus y-Globulinen, Isoagglutininen, Plasminogen und Prothrombin und enthält etwas ss-Globulin, Cholesterin und andere Lipoide.
In der fünften Stufe wird dann der Niederschlag der vierten Stufe, also der Niederschlag II+III W, in Eiswasser suspendiert und zu dieser Suspension gibt man Natriumacetatpuffer. Dann setzt man Methanol zu, bis die Lösung einen Methanolgehalt von 22,5 bis 22,9 %, also einen Methanolgehalt von 22,7 * 0,2%, aufweist und der pH-Wert beträgt 5,0-5,4, also 5,2*0,2 und die Ionenstärke wird auf einen Wert von 0,008 bis 0,018 gi/l, also auf 0,013+0,005 gilLiter gebracht. Die so erhaltene Lösung wird bei einer Temperatur im Bereich von -6,5 bis -5,5 C, also einer Temperatur von -6 * 0,5 Czentrifugiert.
Bei diesem Zentrifugieren bildet sich ein fünfter Niederschlag, der auch Niederschlag III genannt wird und der verworfen wird. Dieser Niederschlag enthält Isoagglutinine, Plasminogen und Prothrombin. Ferner wird beim Zentrifugieren eine fünfte flüssige Phase gewonnen, die auch flüssige Phase III genannt wird. Diese flüssige Phase, die dann in die sechste Stufe eingeführt wird, besteht im wesentlichen aus y-Globulinen und kleineren Anteilen von Fibrinogen und Lipoiden.
In der sechsten Stufe wird dann die in der fünften Stufe gewonnene flüssige Phase, also die flüssige Phase III mit Diatomeenerde behandelt und gerührt und anschliessend wird die Mischung durch eine Filterpresse filtriert. Die Filterpresse wird vorher mit einem Acetat-Methanol-Puffer vorbehandelt, also vorbeschichtet. Zu dem so gewonnenen Filtrat gibt man Natriumchlorid und Natriumbicarbonat zu und der pH-Wert des Filtrates wird auf 7,0 bis 7,4, also einen Wert von 7,2*0,2 eingestellt. Ferner setzt man dem Filtrat so viel Methanol bei einer Temperatur von unter -5" C zu, dass die Methanolkonzentration auf 33,0 bis 33,4%, also einen Wert von 33,2*0,2 gebracht wird.
Die so erhaltene Lösung wird dann bei einer Temperatur im Bereich von -6,5 bis -5,5" C, also einer Temperatur von -6*0,50 C zentrifugiert.
Die so erhaltene flüssige Phase wird verworfen und der gewonnene Niederschlag, also der sechste Niederschlag, der das Anti-Rh-y-Globulin enthält, stellt das gewünschte Endprodukt dar.
Auf dem folgenden Blatt wird dieses Fraktionierschema nochmals wiedergegeben.
EMI3.1
<tb>
<SEP> Plasma
<tb> <SEP> Kühlen <SEP> auf <SEP> 1" <SEP> C
<tb> <SEP> t <SEP> Zentrifugieren <SEP> 1 <SEP> Liter/Min.
<tb>
In <SEP> der <SEP> Kälte <SEP> unlöslichen <SEP> flüssige <SEP> Phase <SEP> eingestellt <SEP> auf
<tb> Niederschlag <SEP> verwerfen <SEP> pH <SEP> 7,2+0,2
<tb> <SEP> Methanol <SEP> 10,7in,1 <SEP> Vol.%
<tb> <SEP> Ionenkonzentration <SEP> 0,136 <SEP> gilLiter
<tb> <SEP> Temperatur <SEP> -5" <SEP> Cm0,5" <SEP> C
<tb> Niederschlag <SEP> verwerfen <SEP> flüssige <SEP> Phase <SEP> I <SEP> eingestellt <SEP> auf
<tb> <SEP> pH <SEP> 6ei02
<tb> <SEP> Methanol <SEP> 33,3 <SEP> + <SEP> 0,05 <SEP> %
<tb> <SEP> Ionenkonzentration <SEP> 0,086 <SEP> i0,005 <SEP> gilLiter
<tb> <SEP> Temperatur <SEP> -5i0,5' <SEP> C
<tb> Niederschlag <SEP> II+III <SEP> flüssige <SEP> Phase <SEP> verwerfen
<tb> pH <SEP> 7,2in,2
<tb> Methanol <SEP> 26,7iO,2%
<tb> Ionenkonzentration
<tb> <SEP> 0,0052iO,0005 <SEP> gi/Liter
<tb> Temperatur <SEP> -5i0,5' <SEP> C
<tb> Niederschlag <SEP> II+III <SEP> W <SEP> flüssige
<SEP> Phase <SEP> II+III <SEP> verwerfen
<tb> pH <SEP> S,2iO,2
<tb> Methanol <SEP> 22,7iO,2%
<tb> Ionenkonzentration
<tb> <SEP> 0,013iO,OOS <SEP> gilLiter
<tb> Temperatur <SEP> -6f <SEP> 0,5 <SEP> " <SEP> C
<tb> Niederschlag <SEP> III <SEP> verwerfen <SEP> flüssige <SEP> Phase <SEP> III
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> filtrierten
<tb> Filtrat <SEP> eingestellt <SEP> auf <SEP> flüssige <SEP> Phase <SEP> verwerfen
<tb> pH <SEP> 7,2i0,2
<tb> Methanol <SEP> 33,2i0,2%
<tb> Ionenkonzentration
<tb> <SEP> 0,06in,005 <SEP> gi/Liter
<tb> Temperatur <SEP> -6,0+0,5" <SEP> C
<tb> <SEP> I
<tb> Niederschlag <SEP> II
<tb> suspendieren <SEP> in <SEP> 0 <SEP> C, <SEP> Wasser
<tb> (T4-5 <SEP> Vol.)
<tb> lagern <SEP> bei <SEP> -5"C <SEP> oder <SEP> kälter
<tb>
Beim erfindungsgemässen Verfahren kann man in der ersten Stufe auf + 1 C kühlen.
In der zweiten Stufe, der dritten und/oder der vierten Stufe wird die Temperatur vorzugsweise auf -5 C eingestellt. In der fünften Stufe stellt man vorzugsweise eine Temperatur von 60 C ein und die vorzugsweise eingehaltene Temperatur der sechsten Stufe beträgt ebenfalls 4 C. Im allgemeinen ist es vorteilhaft, den in der sechsten Stufe erhaltenen, das Anti-Rh-y-Globulin enthaltenden Niederschlag einer Gefriertrocknung zu unterwerfen.
Die Erfindung sei nun anhand eines Beispiels näher er läutert:
Beispiel
Menschliches Blutplasma wird auf 1 1 C gekühlt. Das Plasma wird in einer Sharples-Superzentrifuge mit einem dreifachen Flügel bei 11 C bei einer Zulaufmenge von 1000+50 ml/Min. zentrifugiert. Der in der Kälte unlösliche Niederschlag wird verworfen. Der pH-Wert der obenstehenden Flüssigkeit wird auf 7,2+0,2 eingestellt. Der Methanolgehalt der Charge wird durch Zusatz von 177 ml 71%igem (V/V) Methanol pro Liter Plasma auf 10,7*0,1% (V/V) gebracht. Die Lösung wird 1 Stunde langsam bei -5*0,5' C gerührt und bei Nacht bei -5 + 0,5 C gehalten.
Die Lösung wird in einer Sharples-Superzentrifuge bei -5+0,5 Cbei einer Zulaufmenge von 1000+100 ml/Min. zentrifugiert. Die obenstehende Flüssigkeit I wird in einem Gefäss aufgefangen, das mit einer Kühlvorrichtung versehen ist.
Pro Liter der obenstehenden Flüssigkeit I werden unter Rühren 601 ml 71%iges (VW) Methanol, 0,88 ml 10n Essigsäure und 0,44 ml 4n Natriumacetat gegeben. Hierdurch wird die Methanolkonzentration auf 33,3 %, die Ionenstärke auf 0,086 gi'Liter und der pH-Wert auf 6,9 gebracht. Die Lösung wird auf eine Temperatur von -5 * 0,50 C gebracht und 2 Stunden langsam gerührt. Die Lösung wird dann 16 Stunden bei -5,5 + O,5D C stehengelassen.
Die Lösung wird in der oben genannten Sharples-Superzentrifuge bei -5+0,5 C in einer Menge von 1000*100 ml/ Min. zentrifugiert. Der Niederschlag II+III wird aus dem Gefäss genommen, gewogen und bei einer Temperatur von -20 C aufbewahrt.
Während die Temperatur bei 0 C gehalten wird, wird der Niederschlag II+III in 2 Raumteilen (doppeltes ursprüngli faches Gewicht des Niederschlages II+III) Wasser von 0 C, das sich'im Gleichgewicht mit Eis befindet, durch Zerkleinern der Paste mit einem Spatel aus nichtrostendem Stahl in einem Behälter aus nichtrostendem Stahl und Rühren suspendiert, bis die Suspension gleichmässig ist. 3 Raumteile (dreifaches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II+III) einer 0,0187molaren Dinatriumphosphatlösung werden unter Rühren zur Suspension gegeben. Nach Zugabe von 20 Raumteilen (20faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II+III) Wasser von 0 C wird noch 30 bis 60 Minuten bei 0 C gerührt.
Der pH-Wert beträgt 7,2*0,2. Um einen Me thanolanteil von 26,7+0,2 % zu erhalten, werden 15 Raumteile (15faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II +III) %iges (V/V) Methanol bei -10" C zugesetzt. Die Ionenstärke der Lösung beträgt 0,0052*0,0005 gi/Liter.
Die Lösung wird auf eine Temperatur von -5 C gebracht und in der oben genannten Sharples-Superzentrifuge bei einer Temperatur von 5,5*0,5 C'in einer Menge von 500*50 ml/Min. zentrifugiert. Der Niederschlag II+III W wird aus dem Gefäss genommen und gewogen.
Der Niederschlag II+III W wird in 2 Raumteilen (doppeltes Gewicht des Niederschlages II+III W) Eiswasser suspendiert. Zur Suspension werden 2 Raumteile (2faches Gewicht des Niederschlages II+III W) 0,175molares Natriumacetat gegeben. Ein weiterer Raumteil (Gewicht des Niederschlages
II+III W) Eiswasser, das 0,216 ml Acetatpuffer enthält, wird pro Gramm des Niederschlages II+III W, der in Pastenform vorliegt, zugesetzt. Der Acetatpuffer wird hergestellt durch Verdünnung von 40 ml 10n Essigsäure und 20 ml 4n Natriumacetat auf 100 ml mit destilliertem Wasser. Der pH Wert der Lösung beträgt 5,2+0,2. Die Lösung wird 1 Stunde langsam gerührt.
Dann werden 13,5 Raumteile (13,5faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II+III W) Eiswasser und 8,66 Raumteile (8,66faches ursprüngliches Gewicht des Niederschlages II+III W) 71 %ges (V/V) Methanol zugesetzt, während die Temperatur bei -6+0,5" C gehalten wird. Die Lösung wird 1 Stunde langsam gerührt und über Nacht stehengelassen. Die Lösung enthält 22,7 % Methanol und hat einen pH-Wert von 5,2 und eine Ionenkonzentration von 0,015 gi/Liter.
Die Lösung wird in einer Sharples-Superzentrifuge des vorstehend genannten Typs bei einer Temperatur von -6 *0,50 C und einer Zuflussmenge von 500*50 ml/Min. zentrifugiert. Das Volumen der obenstehenden Flüssigkeit III wird gemessen. Der Niederschlag III wird verworfen.
Die obenstehende Flüssigkeit III wird mit 0,4% (Gew./ Vol.) Celite 512 behandelt und 20 Minuten gerührt. Das Gemisch wird mit einer Eitel-Filterpresse mit Filterkissen D-8 filtriert.
Ein Acetatpuffer von pH 5,2 wird wie folgt hergestellt:
25 ml 4n Natriumacetat und 3 ml 10n Essigsäure werden mit destilliertem Wasser auf 100 ml aufgefüllt. Der Acetatpuffer wird mit 22,7 %igem Methanol 100fach verdünnt. Diese Lö sung hat eine Ionenstärke von 0,01 gi/Liter. Eine Eitel-Filter presse wird vorher mit dem Acetatpuffer plus Celite 512 (0,08 g/cm2 Kissenoberfläche) unter Verwendung von
6,2 ml Acetat-Methanol-Puffer/cm2 Kissenfläche überzogen.
Die obenstehende Flüssigkeit III wird filtriert und das Filtrat mit 50 mMol (2,923 g) Natriumchlorid und 7,65 ml lmola- rem Natriumbicarbonat pro Liter der filtrierten obenstehen den Flüssigkeit III versetzt. Das Filtrat hat einen pH-Wert von 7,2+0,2.
Zum Filtrat werden 160 Raumteile 100 %ges Methanol bei einer Temperatur unter -5 C gegeben. Das Gemisch wird
1 Stunde langsam bei einer Temperatur von -6,5 bis -5,5" C gerührt. Das Gemisch wird über Nacht stehengelassen.
Die Lösung wird in einer Sharples-Superzentrifuge des oben genannten Typs bei einer Temperatur von -6*0,50 C und bei einer Durchflussmenge von 500*50 ml/Min. zentrifungiert Die obenstehende Flüssigkeit wird verworfen.
Der Niederschlag II wird entfernt, in 4 Raumteilen Eiswasser suspendiert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Pulver wird gewogen und bei einer Temperatur unter halb von -5" C aufbewahrt.
Der gemäss diesem Beispiel hergestellte Niederschlag II besteht zu 99 % aus y-G-globulin, das frei von Plasminogen, Lipoiden und 19 S-Globulinen ist und eine elektrophoretische Beweglichkeit von nicht mehr als 1,1+10-5 cm2/V/Sek. in Veronalpuffer, einen pH-Wert von 8,6 und eine Ionenstärke von 0,1 gi/Liter hat. Der Niederschlag II enthält ausserdem etwa 0,99 % Natriumchlorid.
The invention relates to a method for producing
Anti-Rh-y globulin.
Fetal erythroblastosis is a hemolytic disease that causes brain damage, heart damage or the in newborns
Can cause death. This disease is caused by antibodies raised against fetal red blood cells produced by the
Mother's placenta to get to the fruit. This disease picture generally occurs in children of parents whose blood has various Rhesus factors, z. B. with the children one
Rh-negative mother and a Rh-positive father.
When a woman whose Rhesus factor is different from her husband's becomes pregnant for the first time, red blood cells from the fruit can enter her circulation. If the woman is Rh negative and her husband is Rh positive, the fetal red cells are Blood cells usually Rh positive.
Antibodies to Rh-positive red blood cells rarely form in the mother's circulation during the first pregnancy, and the first child is unaffected. After pregnancy, the Rh-positive fetal erythrocytes remaining in the mother's circulation can immunize the mother in such a way that she has a 9 to 20% chance of producing Rh antibodies. During subsequent pregnancies, the Rh-positive antibodies in the mother's circulation pass through the placenta into the circulation of the fruit and destroy the fetal red blood cells and cause fetal erythroblastosis. Since around 15% of the population is Rh negative, the disease is not uncommon.
Freda, Gorman and Pollack reported that one
Rh-negative mother by intramuscular injection of
Anti-Rh-y-globulin prevents the formation of antibodies in the circulatory system that can cause fetal erythroblastosis in the fruit of the next pregnancy within 72 hours after birth (Science, February 18, 1966,
Volume 151, No. 3712, Pages 838-830).
Cohn describes a in U.S. Patent 2,390,074
Process for fractionating blood in which γ-globulins are produced. The γ-globulins produced by the Cohn process contain 19 S-globulin, plasminogen and lipids. Although this γ-globulin is excellent for the prophylaxis of diseases such as measles and tetanus, the 19 S-globulin, plasminogen and lipoids are unnecessary impurities that reduce their effectiveness in preventing immunization against the Rh factor decrease in fetal red blood cells.
The aim of the present invention was to develop a method for the production of anti-Rh-γ-globulin from human blood plasma, this blood plasma also containing further components, for example albumin, plasminogen, α- and β-globulins and various lipids. The anti-Rhy globulin to be produced by the process according to the invention is a special γ-G-globulin, the human blood plasma generally also containing other γ-globulins in addition to this particular desired γ-globulin.
It has surprisingly been found that the production of anti-Rh-γ-globulin from human blood plasma can be achieved by a special fractionation process.
The present invention relates to a process for the production of anti-Rh-γ-globulin from human blood plasma, which is characterized in that human blood plasma which contains this anti-Rh-γ-globulin is in a
1st stage cools to a temperature between 0 and +2 C, and separates the plasma into a first liquid phase and a first precipitate, in one
2nd stage methanol is added to the liquid phase obtained in the 1st stage and its temperature is set to a value of -5.5 to -4.5 C, the amount of methanol added being 10.6 to 10.8% by volume and the pH is adjusted to a value of 7.0 to 7.4 and the ionic strength to 0.136 gill and the system thus obtained is divided into a second precipitate and a second liquid phase, then in one
3.
Stage methanol up to a content of 33.25 to
33.35% by volume of the liquid phase obtained in the 2nd stage is added and the temperature is set to -5.5 to -4.5 C and the pH value is set to 6.7 to 7.1 and the ionic strength is set to a value from 0.081 to 0.091 gill and the system obtained separates into a third precipitate and a third liquid phase, in one
4th stage 26.5 to 26.9% by volume of methanol to that in the
3rd stage added precipitate and at a temperature of -5.5 to -4.5 "C, the pH is adjusted to 7.0 to 7.4 and the ionic strength to 0.0047 to 0.0057 gill and the obtained System separates into a fourth precipitate and a fourth liquid phase, in one
5th stage in the 4th
Stage obtained precipitate 22.5 to 22.9% of methanol is added, the temperature is set to a value of -6.5 to -5.5 "C and the pH value is set to a value of 5.0 to 5.4 and the Brings ionic strength to a value of 0.008 to 0.018 giA and the system obtained separates into a fifth precipitate and a fifth liquid phase, and finally into one
6th stage 33.0 to 33.4% methanol is added to the liquid phase obtained in the 5th stage and the temperature is adjusted to a value of 6.5 to -5.5 "C and the pH value to 7.0 to 7.4 adjusts and brings the ionic strength to a value of 0.055 to 0.065 gi / l and the system thus obtained is separated into a sixth precipitate containing the anti-Rh-γ-globulin and a sixth liquid phase.
The process according to the invention for producing the anti-Rh-γ globulin is therefore a six-stage process, with very specific narrow ranges of the pH value having to be set in each process stage. For example, a pH value in the range from 7.0 to 7.4 must be set in the second stage of the process according to the invention, while the pH range to be maintained in the fifth stage is 5.0 to 5.4. Through this targeted change in the pH value, the course of chemical reactions is achieved, namely the conversion of NH2 groups from amino acids of the protein into NH3 + groups and subsequently the release of the NH2 groups again from these salts. The method according to the invention is therefore a method comprising chemical steps for the production of the desired anti-Rh-γ globulin.
The fractionation carried out according to the process according to the invention makes u. a. the different solubilities of the various components of the plasma caused by the salt reactions mentioned.
In each separation stage of the process according to the invention, the separation of undesired components from the desired fraction containing the anti-Rh globulin depends on the exact adherence to the stated pH values, the temperature intervals, the concentration of the precipitant and the ionic strength of the system.
Various low dielectric constant organic solvents, e.g. B. acetone and alcohols, precipitate proteins and have previously been used in the fractionation of plasma. In the process according to the invention, methanol is used as the organic solvent in the 2nd to 6th stage. The ability to maintain the critical ion concentrations in the various stages of fractionation depends on the use of methanol.
In order to prevent denaturation of the proteins during the fractionation, the precipitation is carried out at the low temperatures mentioned. Since protein solubility is temperature dependent, the temperature chosen for each stage of fractionation must be the lowest possible temperature that will allow the desired separation in order to prevent denaturation.
In the process according to the invention, the separation into the first liquid phase and the first precipitate can be carried out by centrifugation in the first stage. The first precipitate is discarded and in a second stage, under the conditions mentioned, a separation of the first liquid phase into a second liquid phase and a second precipitate is achieved.
An embodiment of the method according to the invention will now be explained in more detail on the basis of the working diagram shown below:
The starting material used is the entire human blood plasma, which in a first stage is cooled to a temperature between 0 and +2 C, i.e. a temperature of 1 + 1 C. This gives a precipitate which is insoluble in the cold and which is discarded.
In the second stage, the pH of the liquid phase obtained from the first stage is then adjusted to 7.2 + 0.2 by adding acetic acid. This achieves an ionic strength of 0.136 gi / liter. Furthermore, methanol is added until the methanol content of this batch is 10.7 + 0.1 vol. % by volume is brought and this solution is then centrifuged at a temperature of -5 + 0.5 C. This gives a liquid phase I, which is placed in a flask equipped with a cooling device, and a precipitate I, which consists essentially of fibrinogen and is discarded.
In the third stage, methanol, acetic acid and sodium acetate are then added to the liquid phase obtained from the second stage, ie liquid phase I, with cooling. The amounts of these added materials are chosen so that the methanol concentration is set to a value of 33.25 to 33.35% by volume per volume, that is to say a value of 33.3 + 0.5% by volume per volume and the Ionic strength reaches a value of 0.081 to 0.091 gi / liter, i.e. a value of 0.086 + 0.005 gi / per liter. The pH of this solution is 6.9. This solution is then cooled to a temperature of -5.5 to 4.50 C, that is to a temperature of -5 + 0.5 C, it is left to stand and then centrifuged.
During this centrifugation in the third stage, a precipitate II + III forms, which is stored, and a liquid phase II + III, which is discarded and contains α-globulin, β-globulin and lipoids. The processed precipitate II +111 obtained in the third stage consists mainly of ss-globulins and y-globulins as well as isoagglutinins, but it also contains prothrombin, plasminogen, cholesterol and other lipoids.
In a fourth stage, the precipitate obtained in the third stage, that is to say the precipitate II +111, is suspended in water at 0 ° C. which is in equilibrium with ice. A disodium phosphate solution is added to the suspension with stirring so that the pH is adjusted to 7.0 to 7.4, i.e. a value of 7.2 to 0.2. In addition, methanol is added at -10 ° C. until a methanol content of 26.7 + 0.2% by volume per volume is reached. The addition of the disodium phosphate increased the ionic strength of the solution to 0.0047 to 0.0057 gi / l, i.e. a value of 0.0052 ru0.0005 gilLiter is set.
Centrifugation is then carried out at a temperature of -5.5 to 4.50 ° C., that is to say a temperature of 5 * 0.5 ° C., a fourth liquid phase, also called liquid phase II + III W, being obtained. This liquid phase contains ß-globulin, cholesterol and other lipids and is discarded. Furthermore, a fourth precipitate is obtained during centrifugation, which is also called precipitate II + III W, and which is removed from the centrifuge vessel. This fourth-stage precipitate consists mainly of γ-globulins, isoagglutinins, plasminogen and prothrombin and contains some γ-globulin, cholesterol and other lipoids.
In the fifth stage, the precipitate from the fourth stage, that is to say the precipitate II + III W, is suspended in ice water and sodium acetate buffer is added to this suspension. Then methanol is added until the solution has a methanol content of 22.5 to 22.9%, i.e. a methanol content of 22.7 * 0.2%, and the pH is 5.0-5.4, i.e. 5.2 * 0.2 and the ionic strength is brought to a value of 0.008 to 0.018 gi / l, i.e. 0.013 + 0.005 gilLiter. The solution obtained in this way is centrifuged at a temperature in the range from -6.5 to -5.5 C.
During this centrifugation, a fifth precipitate is formed, which is also called Precipitation III and which is discarded. This precipitate contains isoagglutinins, plasminogen and prothrombin. In addition, a fifth liquid phase is obtained during centrifugation, which is also called liquid phase III. This liquid phase, which is then introduced into the sixth stage, consists essentially of γ-globulins and small amounts of fibrinogen and lipoids.
In the sixth stage, the liquid phase obtained in the fifth stage, ie the liquid phase III, is treated with diatomaceous earth and stirred, and then the mixture is filtered through a filter press. The filter press is pretreated beforehand with an acetate-methanol buffer, i.e. precoated. Sodium chloride and sodium bicarbonate are added to the filtrate obtained in this way and the pH of the filtrate is adjusted to 7.0 to 7.4, i.e. a value of 7.2 * 0.2. In addition, enough methanol is added to the filtrate at a temperature below -5 "C that the methanol concentration is brought to 33.0 to 33.4%, ie a value of 33.2 * 0.2.
The solution obtained in this way is then centrifuged at a temperature in the range from -6.5 to -5.5 "C, ie at a temperature of -6 * 0.50 C.
The liquid phase obtained in this way is discarded and the precipitate obtained, i.e. the sixth precipitate, which contains the anti-Rh-γ-globulin, represents the desired end product.
This fractionation scheme is reproduced on the following sheet.
EMI3.1
<tb>
<SEP> plasma
<tb> <SEP> cooling <SEP> to <SEP> 1 "<SEP> C
<tb> <SEP> t <SEP> centrifugation <SEP> 1 <SEP> liters / min.
<tb>
In <SEP> the <SEP> cold <SEP> insoluble <SEP> liquid <SEP> phase <SEP> set <SEP> to
<tb> Precipitation <SEP> discard <SEP> pH <SEP> 7.2 + 0.2
<tb> <SEP> methanol <SEP> 10.7in, 1 <SEP> vol.%
<tb> <SEP> ion concentration <SEP> 0.136 <SEP> gilLiter
<tb> <SEP> Temperature <SEP> -5 "<SEP> Cm0,5" <SEP> C
<tb> Precipitation <SEP> discard <SEP> liquid <SEP> phase <SEP> I <SEP> set <SEP> to
<tb> <SEP> pH <SEP> 6ei02
<tb> <SEP> methanol <SEP> 33.3 <SEP> + <SEP> 0.05 <SEP>%
<tb> <SEP> Ion concentration <SEP> 0.086 <SEP> i0.005 <SEP> gilLiter
<tb> <SEP> temperature <SEP> -5i0,5 '<SEP> C
<tb> Precipitation <SEP> II + III <SEP> discard liquid <SEP> phase <SEP>
<tb> pH <SEP> 7.2in, 2
<tb> methanol <SEP> 26.7iO, 2%
<tb> ion concentration
<tb> <SEP> 0.0052iO, 0005 <SEP> gi / liter
<tb> temperature <SEP> -5i0,5 '<SEP> C
<tb> Precipitation <SEP> II + III <SEP> W <SEP> liquid
<SEP> Discard phase <SEP> II + III <SEP>
<tb> pH <SEP> S, 2iO, 2
<tb> methanol <SEP> 22.7iO, 2%
<tb> ion concentration
<tb> <SEP> 0.013iO, OOS <SEP> gilLiter
<tb> Temperature <SEP> -6f <SEP> 0.5 <SEP> "<SEP> C
<tb> Precipitation <SEP> III <SEP> discard <SEP> liquid <SEP> phase <SEP> III
<tb> <SEP> I
<tb> <SEP> filtered
<tb> Filtrate <SEP> set <SEP> to <SEP> liquid <SEP> phase <SEP> discard
<tb> pH <SEP> 7.2i0.2
<tb> methanol <SEP> 33.2i0.2%
<tb> ion concentration
<tb> <SEP> 0.06in, 005 <SEP> gi / liter
<tb> Temperature <SEP> -6.0 + 0.5 "<SEP> C
<tb> <SEP> I
<tb> Precipitation <SEP> II
<tb> suspend <SEP> in <SEP> 0 <SEP> C, <SEP> water
<tb> (T4-5 <SEP> Vol.)
<tb> store <SEP> at <SEP> -5 "C <SEP> or <SEP> colder
<tb>
In the process according to the invention, the first stage can be to cool to + 1 ° C.
In the second stage, the third and / or the fourth stage, the temperature is preferably set to -5.degree. In the fifth stage, a temperature of 60 ° C. is preferably set and the temperature preferably maintained in the sixth stage is also 4 C. In general, it is advantageous to use the anti-Rh-γ-globulin-containing precipitate obtained in the sixth stage Subject to freeze-drying.
The invention will now be explained in more detail using an example:
example
Human blood plasma is cooled to 1 1 C. The plasma is in a Sharples supercentrifuge with a triple blade at 11 C with a feed rate of 1000 + 50 ml / min. centrifuged. The precipitate, which is insoluble in the cold, is discarded. The pH of the above liquid is adjusted to 7.2 + 0.2. The methanol content of the batch is brought to 10.7 * 0.1% (V / V) by adding 177 ml of 71% (V / V) methanol per liter of plasma. The solution is slowly stirred at -5 * 0.5 ° C. for 1 hour and kept at -5 + 0.5 ° C. overnight.
The solution is in a Sharples supercentrifuge at -5 + 0.5 C with a feed rate of 1000 + 100 ml / min. centrifuged. The above liquid I is collected in a vessel which is provided with a cooling device.
601 ml of 71% strength (VW) methanol, 0.88 ml of 10N acetic acid and 0.44 ml of 4N sodium acetate are added per liter of the above liquid I with stirring. This brings the methanol concentration to 33.3%, the ionic strength to 0.086 g / liter and the pH value to 6.9. The solution is brought to a temperature of -5 * 0.50 C and slowly stirred for 2 hours. The solution is then left to stand at -5.5 + 0.5 ° C. for 16 hours.
The solution is centrifuged in the Sharples supercentrifuge mentioned above at -5 + 0.5 C in an amount of 1000 * 100 ml / min. The precipitate II + III is removed from the vessel, weighed and stored at a temperature of -20 C.
While the temperature is kept at 0 C, the precipitate II + III in 2 parts by volume (twice the original weight of the precipitate II + III) water at 0 C, which is in equilibrium with ice, by crushing the paste with a spatula stainless steel suspended in a stainless steel container and stirring until the suspension is uniform. 3 parts by volume (three times the original weight of the precipitate II + III) of a 0.0187 molar disodium phosphate solution are added to the suspension with stirring. After adding 20 parts by volume (20 times the original weight of the precipitate II + III) water at 0 C, the mixture is stirred at 0 C for a further 30 to 60 minutes.
The pH value is 7.2 * 0.2. In order to obtain a methanol content of 26.7 + 0.2%, 15 parts by volume (15 times the original weight of the precipitate II + III)% (V / V) methanol at -10 "C. The ionic strength of the solution is 0 , 0052 * 0.0005 gi / liter.
The solution is brought to a temperature of -5 C and in the above-mentioned Sharples supercentrifuge at a temperature of 5.5 * 0.5 C 'in an amount of 500 * 50 ml / min. centrifuged. The precipitate II + III W is taken from the vessel and weighed.
The precipitate II + III W is suspended in 2 parts by volume (twice the weight of the precipitate II + III W) ice water. 2 parts by volume (twice the weight of the precipitate II + III W) 0.175 molar sodium acetate are added to the suspension. Another part of the room (weight of the precipitation
II + III W) Ice water containing 0.216 ml of acetate buffer is added per gram of the precipitate II + III W, which is in paste form. The acetate buffer is prepared by diluting 40 ml of 10N acetic acid and 20 ml of 4N sodium acetate to 100 ml with distilled water. The pH of the solution is 5.2 + 0.2. The solution is slowly stirred for 1 hour.
Then 13.5 parts by volume (13.5 times the original weight of the precipitate II + III W) ice water and 8.66 parts by volume (8.66 times the original weight of the precipitate II + III W) 71% total (V / V) methanol are added during the temperature is kept at -6 + 0.5 "C. The solution is stirred slowly for 1 hour and left to stand overnight. The solution contains 22.7% methanol and has a pH of 5.2 and an ion concentration of 0.015 gi /Liter.
The solution is in a Sharples supercentrifuge of the type mentioned above at a temperature of -6 * 0.50 C and a flow rate of 500 * 50 ml / min. centrifuged. The volume of the above liquid III is measured. The precipitate III is discarded.
The above liquid III is treated with 0.4% (w / v) Celite 512 and stirred for 20 minutes. The mixture is filtered with an Eitel filter press with filter pad D-8.
An acetate buffer of pH 5.2 is prepared as follows:
25 ml of 4N sodium acetate and 3 ml of 10N acetic acid are made up to 100 ml with distilled water. The acetate buffer is diluted 100-fold with 22.7% methanol. This solution has an ionic strength of 0.01 gi / liter. A Eitel filter press is previously filled with the acetate buffer plus Celite 512 (0.08 g / cm2 cushion surface) using
6.2 ml acetate-methanol buffer / cm2 cushion area coated.
The liquid III above is filtered and the filtrate is treated with 50 mmol (2.923 g) sodium chloride and 7.65 ml molar sodium bicarbonate per liter of the filtered liquid III above. The filtrate has a pH of 7.2 + 0.2.
160 parts by volume of 100% total methanol are added to the filtrate at a temperature below -5.degree. The mixture will
Stirred slowly for 1 hour at a temperature of -6.5 to -5.5 ° C. The mixture is left to stand overnight.
The solution is in a Sharples supercentrifuge of the type mentioned above at a temperature of -6 * 0.50 C and at a flow rate of 500 * 50 ml / min. centrifuged The above liquid is discarded.
The precipitate II is removed, suspended in 4 parts by volume of ice water and freeze-dried. The freeze-dried powder is weighed and stored at a temperature below -5 "C.
The precipitate II produced according to this example consists of 99% y-G-globulin, which is free of plasminogen, lipoids and 19 S-globulins and has an electrophoretic mobility of no more than 1.1 + 10-5 cm2 / V / sec. in veronal buffer, has a pH of 8.6 and an ionic strength of 0.1 gi / liter. The precipitate II also contains about 0.99% sodium chloride.