La présente invention se rapporte à la préparation par biosynthèse de substances colorées, et elle concerne plus particulièrement la fabrication du pigment jaune appelé zéaxanthine ou 3,3'-dihydroxy-B carotène par culture d'un microorganisme producteur de cette substance.
Ce pigment peut être utilisé, par exemple, à titre d'additif dans l'alimentation des poules afin de renforcer la teinte jaune de la peau de ces animaux ou d'accentuer la coloration des jaunes d'oeufs. On peut envisager également l'utilisation de cette substance comme colorant, par exemple dans l'industrie des cosmétiques.
La synthèse des pigments par certains micro-organismes, en particulier celle des pigments caroténoïdes par des bactéries du genre Flavobacter, est un phénomène connu. Cependant, la préparation industrielle de ces pigments par biosynthèse s'avère généralement délicate, et les rendements obtenus étant souvent très faibles impliquent la mise en oeuvre de quantités de milieux de culture très importants dans la mesure où l'on désire obtenir des quantités appréciables de pigment.
La présente invention se rapporte essentiellement à la préparation de zéaxanthine par biosynthèse selon un procédé simple permettant d'améliorer considérablement le rendement de production de ce pigment. Elle a trait notamment à un procédé de fabrication de zéaxanthine par culture d'un microorganisme du genre Flavobacter producteur de ce pigment, lequel est caractérisé par le fait que l'on cultive ce microorganisme dans un milieu nutritif jusqu'à l'obtention de cellules en état de croissance et de production de zéaxanthine, puis que l'on cultive ces cellules à une température de 22250 C, dans des conditions d'oxygénation suffisantes, dans un milieu de fermentation aqueux nutritif contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg/ml, à titre de source de carbone assimilable,
et au moins une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, que l'on maintient les quantités respectives de ces substances dans un rapport sensiblement constant en ajoutant progressivement ces substances au milieu de fermentation au cours de la culture, que l'on recueille les cellules et/ou que l'on extrait la zéaxanthine de ces cellules.
Par l'expression micro-organisme du genre Flavobacter on entend désigner, dans l'exposé qui suit, un micro-organisme choisi parmi les bactéries de ce genre ou un mutant d'un tel micro-organisme. De même, I'expression < r dans des conditions d'oxygénation suffisantes, signifie que la teneur en oxygène du milieu de culture n'est jamais inférieure à une valeur de seuil au-dessous de laquelle elle devient un facteur limitant vis-à-vis du taux de croissance du micro-organisme dans les conditions de culture. Ces conditions d'oxygénation peuvent être obtenues par exemple par aération et agitation énergiques du milieu de culture.
Enfin, I'expression milieu nutritif désigne un milieu de culture contenant les substances nécessaires à la vie du micro-organisme et assimilables par celui-ci; parmi ces substances, on peut citer notamment les sources de carbone et d'azote et les sels minéraux. Cependant, ce milieu nutritif peut également comporter d'autres substances telles que des vitamines, des facteurs de croissance et des oligoéléments.
Selon une forme d'exécution particulière du procédé suivant l'invention, on prépare une culture d'un micro-organisme du genre Flavobacter, que l'on inocule ensuite à un milieu nutritif placé dans un fermenteur et contenant, à titre de sources principales de carbone et d'azote assimilables par le micro-organisme, au moins un hydrate de carbone et au moins une substance contenant des acides aminés libres. On entretient la croissance du micro-organisme dans le fermenteur en assurant une oxygénation suffisante du milieu de culture ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 30V) C, et d'un pH approprié.
Lorsque les cellules bactériennes sont parvenues à un stade de croissance suffisant, de préférence lorsque la culture est dans la phase de croissance exponentielle. et quand les cellules ont atteint un stade de production de zéaxanthine, stade aisément décelable grâce à la coloration jaune de ce pigment, on poursuit la culture de ces cellules à une température comprise entre 22 et 250 C, dans des conditions d'oxygénation suffisantes, et dans un milieu nutritif aqueux contenant au moins un hydrate de carbone à raison de 15 à 35 mg/ml, ainsi qu'une source d'azote aminé assimilable contenant des acides aminés libres, en maintenant par addition progressive de ces deux substances dans le milieu de fermentation un rapport sensiblement constant entre leurs quantités respectives.
L'hydrate de carbone, constituant la source de carbone principale assimilable par le micro-organisme, peut être choisi parmi des substances telles que le glucose, le lactose ou le sucrose. Cette source principale de carbone assimilable peut également être constituée par un mélange de ces substances.
Parmi les substances susceptibles d'entrer dans la composition de la source principale d'azote aminé, on peut citer, par exemple, la liqueur de trempage de mais, les extraits de levure, les hydrolysats de protéine, en particulier les produits obtenus par hydrolyse acide ou enzymatique de protéines d'origine végétale telles que les protéines de soja ou d'arachide, et/ou l'hydrolysat de caséine appelé tryptone . Cette source d'azote aminé peut également contenir une substance préparée par hydrolyse acide ou enzymatique d'une biomasse récupérée à titre de sous-produit de la biosynthèse d'un pigment caroténoide par culture d'une bactérie du genre Flavobacter, en particulier par hydrolyse d'une biomasse de
Flavobacter cultivée pour préparer de la zéaxanthine et dont on a extrait le pigment.
On poursuit ensuite la culture dans ces conditions pendant un temps suffisant, pour obtenir dans le milieu de culture une quantité substantielle de zéaxanthine, ce pigment étant présent dans les cellules. On peut également, à la fin de cette période, interrompre l'addition progressive des sources de carbone et d'azote et laisser la composition du milieu de culture évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le micro-organisme.
Les résultats expérimentaux ont montré que, lorsque la culture du micro-organisme est effectuée selon ce procédé, la production de zéaxanthine est notablement supérieure à celle d'une culture du même micro-organisme effectuée dans les conditions pratiquées habituellement.
On peut ensuite, éventuellement après concentration du bouillon de culture, extraire la zéaxanthine des cellules à l'aide d'un solvant organique polaire tel que l'acétone, I'al- cool éthylique ou un solvant chloré comme le chloroforme.
Selon une variante, on peut séparer la biomasse du milieu de culture, par exemple par centrifugation, décantation ou filtration. La biomasse peut être utilisée telle quelle, par exemple à titre d'additif dans l'alimentation des poules, ou faire l'objet d'un traitement d'extraction à l'aide d'un solvant organique polaire.
Selon un mode d'exécution du procédé particulièrement avantageux, on prépare une culture d'un micro-organisme du genre Flavobacter que l'on inocule à un milieu nutritif aqueux placé dans un fermenteur et contenant une source principale de carbone constituée par un hydrate de carbone ou un mélange d'hydrates de carbone, de préférence à raison de 6 à 8 O/o en poids, ainsi qu'une source principale d'azote aminé assimilable. On entretient la croissance du micro-organisme en assurant une oxygénation suffisante du milieu, ainsi que le maintien d'une température adéquate, de l'ordre de 28 à 300 C et d'un pH approprié, compris entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5.
Lorsque la concentration du milieu en hydrate de carbone atteint, par valeurs décroissantes, une valeur comprise entre 15 et 35 mg/ml, on ajoute la température du milieu entre 22 et 250 C et on introduit dans le fermenteur, de façon progressive, c'est-à-dire soit par une alimentation continue, soit par quantités successives, au moins un hydrate de carbone et au moins une source de carbone assimilables. On peut introduire ces substances dans le fermenteur soit séparément, soit mélangées pour constituer un substrat nutritif. Cette addition est effectuée à un débit tel que la teneur du milieu de culture en hydrate de carbone reste comprise entre 15 et 35 mg/ml et que les quantités respectives d'hydrate de carbone et de source d'azote aminé soient dans un rapport constant.
A cet effet, on introduit de préférence dans le fermenteur un substrat contenant ces substances, selon le débit voulu pour maintenir la teneur du milieu en hydrate de carbone entre 15 et 35 mg/ml, la composition chimique du substrat étant telle que les quantités pondérales respectives d'hydrate de carbone et de substance aminée assimilables qu'il contient soient dans un rapport constant, de préférence compris entre 1,6 et 3,4.
Pendant cette fermentation, le pH du milieu de culture est ajusté entre 6,5 et 8,0, de préférence entre 7,0 et 7,5. L'ajustement du pH peut être effectué à l'aide de solutions alcalines telles que des solutions aqueuses d'hydroxyde de sodium, d'hydroxyde de potassium ou d'ammoniaque ou à l'aide d'un courant d'ammoniac. On utilise de préférence ces deux dernières substances car elles constituent également des sources d'azote aminé assimilables par le micro-organisme.
On poursuit ensuite cette culture pendant un temps suffisant pour obtenir dans le milieu une quantité substantielle de zéaxanthine. On peut également continuer la culture après arrêt des additions progressives de substances nutritives et laisser la composition du milieu évoluer en fonction de la consommation des substances nutritives par le micro-organisme.
Des résultats particulièrement intéressants ont été obtenus en cultivant, comme décrit précédemment, des mutants préparés par action de la 1-méthyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, ci-après dénommée NTG, sur certaines bactéries du genre
Flavobacter, selon un procédé de mutation original remarquable par le fait que l'on fait agir la NTG sur la bactérie au sein d'un milieu solidifié.
Selon une forme d'exécution particulière de ce procédé de mutation, on prépare une culture d'une bactérie du genre
Flavobacter, par exemple une bactérie issue de la souche enregistrée auprès de l'ATCC sous le NO 21.081.
Cette culture est diluée dans une solution physiologique stérile et la solution obtenue est ensuite mélangée dans une boîte de Pétri avec une solution aqueuse de NTG dans les proportions convenables, par exemple avec un volume équipa lent d'une solution aqueuse de NTG contenant 1 à 10 mg de cette substance par ml. On verse ensuite sur la solution obtenue de l'agar fondu que l'on mélange soigneusement à la solution. Lorsque l'agar est solidifié on maintient le milieu solide obtenu à une température d'incubation convenable, par exemple entre 25 et 280 C jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié. Les colonies sont ensuite prélevées et repiquées plusieurs fois de suite sur des supports solides nutritifs.
Le micro-organisme mutant obtenu peut ensuite faire l'objet d'un ou de plusieurs autres traitements de mutation ultérieurs en milieu solidifié.
Les résultats expérimentaux ont montré qu'un tel traitement de mutation, effectué au sein d'un milieu solidifié avec un agent mutagène tel que la NTG, permet d'obtenir, à partir de bactéries du genre Flavobacter, des mutants qui produisent, dans des conditions de culture identiques, des quantités de zéaxanthine nettement supérieures à celles qui sont produites par des mutants préparés selon des procédés de mutation traditionnels à partir des mêmes bactéries et à l'aide du même agent mutagène.
Les exemples suivants illustrent la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, celle-ci n'étant toutefois pas limitée aux conditions qui y sont décrites.
Dans ces exemples, les compositions des milieux nutritifs sont exprimées en pourcentages pondéraux.
Exemple I
On prépare une culture d'une souche du genre Flavobacter (ATCC NO 21.588) que l'on inocule à raison de 5 oxo en volume à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur. Ce mélange nutritif, préalablement stérilisé à 1200 C pendant 40 minutes et refroidi à 280 C, et dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, présente la composition suivante: Glucose ........... ...... ..... 7,0 O/o
(stérilisé séparément en solution concen
trée)
Liqueur de trempage de maïs . . ..... 1,6 O/o
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 0,8 O/o
Extrait de levure . 1,8 Olo
Sulfate de magnésium .. 0,5 O/o
Huile de mais . .. ......... .
. 0,08 O/o
Eau du robinet ..... balance à 100 O/o
Le micro-organisme est cultivé dans le fermenteur à 280 C, sous aération et agitation énergiques, avec ajustement continu du pH du milieu entre 7,2 et 7,3 par addition automatique d'une solution aqueuse diluée d'ammoniaque.
La culture exécutée dans ces conditions présente une phase de latence de 6 à 7 heures, et la production de zéaxanthine commence après 14 heures de culture.
Lorsque la teneur en glucose du milieu de fermentation atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 24 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 240 C et on introduit de façon progressive dans le fermenteur, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé dans un réservoir séparé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
Glucose . - . 32 O/o
Liqueur de trempage de mais . . 4,7 O/o
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 4,3 O/o
Extrait de levure .. . 5,5 O/o
Eau du robinet .. .. balance à 100 O/o
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à 240 C.
Après une durée totale de culture de 50 heures, on mesure la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine. A cet effet, on isole la biomasse du substrat nutritif par centrifugation et l'on extrait la zéaxanthine des cellules à l'aide d'acétone. La solution de zéaxanthine dans l'acétone est dosée par mesures colorimétriques par comparaison avec des solutions titrées de zéaxanthine synthétique dans le même solvant.
La teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine ainsi mesurée est de 20 Fg/ml.
A titre de comparaison, la même souche est cultivée selon un procédé traditionnel. A cet effet, elle est inoculée, à raison de 5 O/o en volume, à une même quantité d'un milieu nutritif préalablement stérilisé et refroidi à 280 C, dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1, et dont la composition est la suivante:
Glucose . . . . . 10,0 O/o
Liqueur de trempage de maïs . . 1,85 %
Hydrolysat de caséine (tryptone) . 1,25 %
Extrait de levure .. 2,1 %
Sulfate de magnésium 0,5 O/o
Huile de maïs .. . .. . 0,08 %
Eau du robinet ... .. balance à 100 O/o
La culture est exécutée sous agitation et aération énergiques, avec ajustement continu du pH entre 7,2 et 7,3.
La phase de latence observée est de 8 heures et la production de zéaxanthine commence après 15 heures de culture. On ajuste la température du milieu à 240 C après 24 heures de culture.
55 heures après le début de la culture, la teneur du milieu de fermentation en zéaxanthine, déterminée comme décrit précédemment, est de 12 ug/ml.
Exemple 2
On prépare une culture d'une souche du genre Flavobacter (ATCC NO 21.081) dans un milieu nutritif aqueux dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
Glucose . . . 3,0 %
Extrait de levure . . . 1,0 %
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 1,0 %
Sulfate de magnésium ... . 0,5 O/o
Eau du robinet ... ... balance à 100 %
Cette culture, qui contient 5g de cellules du micro-organisme par litre de milieu nutritif, est ensuite diluée dans le rapport 1:108 (en volume) par une série d'opérations successives dans une solution physiologique stérile contenant 0,9 % en poids de chlorure de sodium.
On mélange ensuite soigneusement 1 ml de cette solution avec 1 ml d'une solution aqueuse de NTG contenant 5 mg/ml de cette substance, dans une boîte de Pétri. On ajoute ensuite 10 mi d'agar fondu sur la solution ainsi préparée et l'on mélange complètement l'agar et la solution. Lorsque l'agar est solidifié, la boîte de Pétri est incubée à une température de l'ordre de 25 à 280 C, jusqu'à l'apparition de colonies dans le milieu solidifié, c'est-à-dire pendant 2 à 4 jours. On sépare ensuite les colonies de la boîte de Pétri puis on les étale sur des supports en agar nutritif en l'absence de NTG, en plusieurs opérations successives.
La souche mutante obtenue est ensuite inoculée à raison de 5 O/o en volume à 100 mi d'un milieu nutritif stérile dont le pH est ajusté à 6,5 et dont la composition est la suivante:
Glucose .. . .. 3,0 %
Extrait de levure . . .. 1,0 %
Hydrolysat de caséine (tryptone) .. 1,00/o Sulfate de magnésium ... . . 0,5 O/o
Eau du robinet ... .. balance à 100 %
Le micro-organisme est cultivé dans ce milieu à 280 C et en conditions aérobies pendant 24 heures, puis cette culture est à nouveau inoculée à 2 litres d'un milieu nutritif de même composition. Après 24 heures de fermentation dans les mêmes conditions, cette dernière culture est inoculée, à raison de 5 /o en volume, à un milieu nutritif aqueux contenu dans un fermenteur.
Ce milieu nutritif, préalablement stérile à 1200 C pendant 40 minutes et refroidi à 281, C, présente un pH ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, et possède la composition suivante:
Glucose. - -- 7,0 O/o
(stérilisé séparément en solution con
centrée)
Liqueur de trempage de mais . 1,6 /o
Hydrolysat de caséine (tryptone) 0,8 /o
Extrait de levure . 1,8 %
Sulfate de magnésium . 0,5 /o
Huile de maïs . . - - 0,08 %
Eau du robinet .. . balance à 100 e/o
La culture est effectuée dans le fermenteur à 280 C sous aération et agitation énergiques, avec ajustement automatique du pH du milieu entre 7,2 et 7,3.
On observe une phase de latence de 5 à 6 heures, et la production de zéaxanthine commence après 12 heures de culture.
Lorsque la teneur en glucose du milieu de culture atteint, par valeurs décroissantes, 25 mg/ml, c'est-à-dire 22 heures après le début de la culture, on ajuste la température du milieu à 240 C et l'on introduit, selon un débit tel que la teneur en glucose du milieu reste sensiblement constante, un substrat nutritif préalablement stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et dont la composition est la suivante:
Glucose . . . . 32,0 /o
Liqueur de trempage de mais -. 4,7 /o
Hydrolysat de caséine (tryptone) . 4,3 %
Extrait de levure -. 5,5 %
Eau du robinet .. .balance à 100 Olo
Cette addition progressive est poursuivie pendant 20 heures, la température du milieu étant maintenue à 240 C.
Après une durée totale de culture de 48 heures, la concentration du milieu en glucose a atteint Smg/ml, et sa teneur en zéaxanthine, mesurée comme décrit dans l'exemple 1, est de 335 ssg/ml.
Exemple 3
On prépare un mutant d'une souche Flavobacter (ATCC N 21.081) comme décrit dans l'exemple 1.
La souche mutante est ensuite inoculée à raison de 4 oxo en volume, à un milieu nutritif aqueux préalablement stérilisé à 1200 C pendant 40 minutes, refroidi à 280 C et placé dans un fermenteur. Ce milieu nutritif, dont le pH est ajusté entre 6,9 et 7,1 à l'aide d'ammoniaque, possède la composition suivante:
Glucose. . . 7,0 %
Liqueur de trempage de mals . . 1,6 %
Hydrolysat de tourteau d'arachide . 0,7 %
Extrait de levure . 2,0 %
Sulfate de magnésium - - 0,5 Olo Huile de maïs - .. -- . 0,08 /o
Eau du robinet . .. balance à 100 %
Le micro-organisme est cultivé dans le fermenteur à 280 C, comme décrit dans l'exemple 2.
Lorsque la teneur en glucose du milieu atteint 25 mg/ml, on ajuste la température du milieu à 240 C et l'on ajoute progressivement, afin de maintenir la teneur en glucose à un niveau sensiblement constant, un substrat nutritif préalable ment stérilisé, dont le pH est ajusté à 7,2 et possédant la composition suivante: Glucose . . . ........ 32,0 O/o
Liqueur de trempage de maïs .. . . 4,7 Olo
Hydrolysat de tourteau d'arachide ... 3,5 O/o Extrait de levure ... . 6,0 O/o
Eau du robinet ... ..... balance à 100 Olo
Cette addition est poursuivie pendant 20 heures à une température de 240 C.
Après une durée totale de culture de 51 heures, la teneur du milieu en glucose atteint 7,5 mg/ml. La teneur en zéaxanthine, déterminée comme décrit dans l'exemple 1, est de 312 g/ml.
The present invention relates to the preparation by biosynthesis of colored substances, and it relates more particularly to the manufacture of the yellow pigment called zeaxanthin or 3,3'-dihydroxy-B carotene by culturing a microorganism producing this substance.
This pigment can be used, for example, as an additive in the feed of hens in order to reinforce the yellow tint of the skin of these animals or to accentuate the coloring of the egg yolks. It is also possible to envisage the use of this substance as a dye, for example in the cosmetics industry.
The synthesis of pigments by certain microorganisms, in particular that of carotenoid pigments by bacteria of the genus Flavobacter, is a known phenomenon. However, the industrial preparation of these pigments by biosynthesis generally proves to be delicate, and the yields obtained are often very low imply the use of very large quantities of culture media insofar as it is desired to obtain appreciable quantities of pigment.
The present invention relates essentially to the preparation of zeaxanthin by biosynthesis according to a simple process making it possible to considerably improve the production yield of this pigment. It relates in particular to a process for the manufacture of zeaxanthin by culturing a microorganism of the genus Flavobacter producing this pigment, which is characterized in that this microorganism is cultivated in a nutrient medium until cells are obtained. in a state of growth and production of zeaxanthin, then that these cells are cultured at a temperature of 22,250 C, under sufficient oxygenation conditions, in a nutritious aqueous fermentation medium containing at least one carbohydrate in an amount of 15 to 35 mg / ml, as a source of assimilable carbon,
and at least one source of assimilable amino nitrogen containing free amino acids, which the respective amounts of these substances are maintained in a substantially constant ratio by gradually adding these substances to the fermentation medium during the culture, which the the cells are harvested and / or the zeaxanthin is extracted from these cells.
The expression microorganism of the genus Flavobacter is intended to denote, in the description which follows, a microorganism chosen from bacteria of this genus or a mutant of such a microorganism. Likewise, the expression <r under sufficient oxygenation conditions signifies that the oxygen content of the culture medium is never less than a threshold value below which it becomes a limiting factor. vis the growth rate of the microorganism under the culture conditions. These oxygenation conditions can be obtained, for example, by vigorous aeration and agitation of the culture medium.
Finally, the expression nutrient medium denotes a culture medium containing the substances necessary for the life of the microorganism and which can be assimilated by the latter; among these substances, mention may in particular be made of carbon and nitrogen sources and inorganic salts. However, this nutrient medium can also contain other substances such as vitamins, growth factors and trace elements.
According to a particular embodiment of the process according to the invention, a culture of a microorganism of the Flavobacter genus is prepared, which is then inoculated into a nutrient medium placed in a fermenter and containing, as main sources of carbon and nitrogen assimilable by the microorganism, at least one carbohydrate and at least one substance containing free amino acids. The growth of the microorganism is maintained in the fermenter by ensuring sufficient oxygenation of the culture medium as well as maintaining an adequate temperature, of the order of 28 to 30 V) C, and an appropriate pH.
When the bacterial cells have reached a sufficient stage of growth, preferably when the culture is in the phase of exponential growth. and when the cells have reached a stage of production of zeaxanthin, a stage easily detectable thanks to the yellow coloration of this pigment, the culture of these cells is continued at a temperature between 22 and 250 ° C., under sufficient oxygenation conditions, and in an aqueous nutrient medium containing at least one carbohydrate in an amount of 15 to 35 mg / ml, as well as a source of assimilable amino nitrogen containing free amino acids, maintaining by gradual addition of these two substances in the fermentation medium a substantially constant ratio between their respective amounts.
The carbohydrate, constituting the main carbon source assimilable by the micro-organism, can be chosen from substances such as glucose, lactose or sucrose. This main source of assimilable carbon can also consist of a mixture of these substances.
Among the substances liable to enter into the composition of the main source of amino nitrogen, there may be mentioned, for example, corn steep liquor, yeast extracts, protein hydrolysates, in particular products obtained by hydrolysis acid or enzymatic protein of plant origin such as soy or peanut protein, and / or the hydrolyzate of casein called tryptone. This source of amino nitrogen can also contain a substance prepared by acid or enzymatic hydrolysis of a biomass recovered as a by-product of the biosynthesis of a carotenoid pigment by culture of a bacterium of the genus Flavobacter, in particular by hydrolysis. a biomass of
Flavobacter cultivated to prepare zeaxanthin and from which the pigment has been extracted.
Culture is then continued under these conditions for a sufficient time to obtain a substantial amount of zeaxanthin in the culture medium, this pigment being present in the cells. It is also possible, at the end of this period, to interrupt the gradual addition of the carbon and nitrogen sources and to allow the composition of the culture medium to evolve according to the consumption of nutrients by the microorganism.
The experimental results have shown that, when the culture of the microorganism is carried out according to this method, the production of zeaxanthin is notably higher than that of a culture of the same microorganism carried out under the conditions usually practiced.
It is then possible, optionally after concentration of the culture broth, to extract the zeaxanthin from the cells using a polar organic solvent such as acetone, ethyl alcohol or a chlorinated solvent such as chloroform.
According to one variant, the biomass can be separated from the culture medium, for example by centrifugation, decantation or filtration. The biomass can be used as is, for example as an additive in the feed for hens, or be the subject of an extraction treatment using a polar organic solvent.
According to a particularly advantageous embodiment of the process, a culture of a microorganism of the Flavobacter genus is prepared which is inoculated into an aqueous nutrient medium placed in a fermenter and containing a main source of carbon consisting of a hydrate of carbon or a mixture of carbohydrates, preferably in an amount of 6 to 8 O / o by weight, as well as a main source of assimilable amino nitrogen. The growth of the microorganism is maintained by ensuring sufficient oxygenation of the medium, as well as the maintenance of an adequate temperature, of the order of 28 to 300 C and an appropriate pH, between 6.5 and 8, 0, preferably between 7.0 and 7.5.
When the concentration of the medium in carbohydrate reaches, by decreasing values, a value between 15 and 35 mg / ml, the temperature of the medium is added between 22 and 250 C and is introduced into the fermenter, gradually, c ' that is to say either by continuous feeding, or by successive quantities, at least one carbohydrate and at least one source of assimilable carbon. These substances can be introduced into the fermenter either separately or mixed together to form a nutrient substrate. This addition is carried out at a rate such that the carbohydrate content of the culture medium remains between 15 and 35 mg / ml and that the respective amounts of carbohydrate and of amino nitrogen source are in a constant ratio. .
For this purpose, a substrate containing these substances is preferably introduced into the fermenter, at the rate desired to maintain the carbohydrate content of the medium between 15 and 35 mg / ml, the chemical composition of the substrate being such that the quantities by weight respective carbohydrate and assimilable amino substance that it contains are in a constant ratio, preferably between 1.6 and 3.4.
During this fermentation, the pH of the culture medium is adjusted between 6.5 and 8.0, preferably between 7.0 and 7.5. Adjustment of the pH can be carried out using alkaline solutions such as aqueous sodium hydroxide, potassium hydroxide or ammonia solutions or using a stream of ammonia. The latter two substances are preferably used because they also constitute sources of amino nitrogen which can be assimilated by the microorganism.
This culture is then continued for a time sufficient to obtain a substantial amount of zeaxanthin in the medium. It is also possible to continue the culture after stopping the gradual additions of nutrients and allow the composition of the medium to evolve according to the consumption of nutrients by the microorganism.
Particularly interesting results were obtained by cultivating, as described above, mutants prepared by the action of 1-methyl-3-nitro-1-nitroso-guanidine, hereinafter called NTG, on certain bacteria of the genus
Flavobacter, according to an original mutation process remarkable for the fact that the NTG is made to act on the bacteria in a solidified medium.
According to a particular embodiment of this mutation process, a culture of a bacterium of the genus
Flavobacter, for example a bacterium resulting from the strain registered with the ATCC under the NO 21.081.
This culture is diluted in a sterile physiological solution and the solution obtained is then mixed in a Petri dish with an aqueous solution of NTG in the suitable proportions, for example with an equivalent volume of an aqueous solution of NTG containing 1 to 10 mg of this substance per ml. Molten agar is then poured onto the resulting solution, which is carefully mixed with the solution. When the agar is solidified, the solid medium obtained is maintained at a suitable incubation temperature, for example between 25 and 280 ° C. until the appearance of colonies in the solidified medium. The colonies are then picked and subcultured several times in a row on solid nutritive supports.
The mutant microorganism obtained can then be the subject of one or more other subsequent mutation treatments in a solidified medium.
The experimental results have shown that such a mutation treatment, carried out in a medium solidified with a mutagen such as NTG, makes it possible to obtain, from bacteria of the Flavobacter genus, mutants which produce, in identical culture conditions, quantities of zeaxanthin markedly greater than those produced by mutants prepared according to traditional mutation methods from the same bacteria and using the same mutagen.
The following examples illustrate the implementation of the method according to the invention, the latter not however being limited to the conditions which are described therein.
In these examples, the compositions of the nutrient media are expressed in percentages by weight.
Example I
A culture of a strain of the genus Flavobacter (ATCC NO 21.588) is prepared which is inoculated at 5 oxo by volume into an aqueous nutrient medium contained in a fermenter. This nutrient mixture, previously sterilized at 1200 C for 40 minutes and cooled to 280 C, and whose pH is adjusted between 6.9 and 7.1 using ammonia, has the following composition: Glucose .... ....... ...... ..... 7.0 O / o
(sterilized separately in concen
trée)
Corn steep liquor. . ..... 1.6 O / o
Casein hydrolyzate (tryptone) .. 0.8 O / o
Yeast extract . 1.8 Olo
Magnesium sulphate .. 0.5 O / o
Corn oil. .. ..........
. 0.08 O / o
Tap water ..... balance at 100 O / o
The microorganism is cultured in the fermenter at 280 ° C., under vigorous aeration and stirring, with continuous adjustment of the pH of the medium between 7.2 and 7.3 by automatic addition of a dilute aqueous solution of ammonia.
The culture carried out under these conditions has a lag phase of 6 to 7 hours, and the production of zeaxanthin begins after 14 hours of culture.
When the glucose content of the fermentation medium reaches, by decreasing values, 25 mg / ml, that is to say 24 hours after the start of the culture, the temperature of the medium is adjusted to 240 ° C. and the mixture is introduced so progressive in the fermenter, according to a flow rate such that the glucose content of the medium remains substantially constant, a nutrient substrate previously sterilized in a separate tank, the pH of which is adjusted to 7.2 and the composition of which is as follows:
Glucose. -. 32 Y / o
Corn steep liquor. . 4.7 O / o
Casein hydrolyzate (tryptone) .. 4.3 O / o
Yeast extract .. . 5.5 O / o
Tap water .. .. balance at 100 O / o
This gradual addition is continued for 20 hours, the temperature of the medium being maintained at 240 C.
After a total culture period of 50 hours, the zeaxanthin content of the fermentation medium is measured. For this purpose, the biomass is isolated from the nutrient substrate by centrifugation and the zeaxanthin is extracted from the cells with the aid of acetone. The solution of zeaxanthin in acetone is determined by colorimetric measurements by comparison with standard solutions of synthetic zeaxanthin in the same solvent.
The zeaxanthin content of the fermentation medium thus measured is 20 Fg / ml.
For comparison, the same strain is cultivated according to a traditional method. For this purpose, it is inoculated, at a rate of 5 O / o by volume, with the same quantity of a nutrient medium previously sterilized and cooled to 280 ° C., the pH of which is adjusted between 6.9 and 7.1, and whose composition is as follows:
Glucose. . . . . 10.0 O / o
Corn steep liquor. . 1.85%
Casein hydrolyzate (tryptone). 1.25%
Yeast extract .. 2.1%
Magnesium sulphate 0.5 O / o
Corn oil ... ... 0.08%
Tap water ..... balance at 100 O / o
The culture is carried out with vigorous stirring and aeration, with continuous adjustment of the pH between 7.2 and 7.3.
The latency phase observed is 8 hours and the production of zeaxanthin begins after 15 hours of culture. The temperature of the medium is adjusted to 240 ° C. after 24 hours of culture.
55 hours after the start of the culture, the zeaxanthin content of the fermentation medium, determined as described above, is 12 μg / ml.
Example 2
A culture of a strain of the genus Flavobacter (ATCC NO 21.081) is prepared in an aqueous nutrient medium whose pH is adjusted to 6.5 and whose composition is as follows:
Glucose. . . 3.0%
Yeast extract . . . 1.0%
Casein hydrolyzate (tryptone) .. 1.0%
Magnesium sulfate ... . 0.5 O / o
Tap water ... ... 100% balance
This culture, which contains 5 g of cells of the microorganism per liter of nutrient medium, is then diluted in the ratio 1: 108 (by volume) by a series of successive operations in a sterile physiological solution containing 0.9% by weight. of sodium chloride.
1 ml of this solution is then mixed thoroughly with 1 ml of an aqueous solution of NTG containing 5 mg / ml of this substance, in a Petri dish. Then 10 ml of molten agar is added to the solution thus prepared and the agar and the solution are completely mixed. When the agar is solidified, the Petri dish is incubated at a temperature of the order of 25 to 280 C, until the appearance of colonies in the solidified medium, that is to say for 2 to 4 days. The colonies are then separated from the Petri dish and then spread on nutrient agar supports in the absence of NTG, in several successive operations.
The mutant strain obtained is then inoculated at a rate of 5 O / o by volume at 100 ml of a sterile nutrient medium whose pH is adjusted to 6.5 and whose composition is as follows:
Glucose ... .. 3.0%
Yeast extract . . .. 1.0%
Casein hydrolyzate (tryptone) .. 1.00 / o Magnesium sulphate .... . 0.5 O / o
Tap water ..... 100% balance
The microorganism is cultivated in this medium at 280 ° C. and under aerobic conditions for 24 hours, then this culture is again inoculated with 2 liters of a nutrient medium of the same composition. After 24 hours of fermentation under the same conditions, this latter culture is inoculated, at a rate of 5% by volume, into an aqueous nutrient medium contained in a fermenter.
This nutrient medium, previously sterile at 1200 ° C. for 40 minutes and cooled to 281 ° C., has a pH adjusted between 6.9 and 7.1 using ammonia, and has the following composition:
Glucose. - - 7.0 O / o
(sterilized separately in solution con
centered)
Corn steep liquor. 1.6 / o
Casein hydrolyzate (tryptone) 0.8 / o
Yeast extract . 1.8%
Magnesium sulfate . 0.5 / o
Corn oil. . - - 0.08%
Tap water .. . balance at 100 e / o
The culture is carried out in the fermenter at 280 ° C. under vigorous aeration and stirring, with automatic adjustment of the pH of the medium between 7.2 and 7.3.
A lag phase of 5 to 6 hours is observed, and the production of zeaxanthin begins after 12 hours of culture.
When the glucose content of the culture medium reaches, by decreasing values, 25 mg / ml, that is to say 22 hours after the start of the culture, the temperature of the medium is adjusted to 240 ° C. and one introduces , at a rate such that the glucose content of the medium remains substantially constant, a previously sterilized nutrient substrate, the pH of which is adjusted to 7.2 and the composition of which is as follows:
Glucose. . . . 32.0 / o
Corn steep liquor -. 4.7 / o
Casein hydrolyzate (tryptone). 4.3%
Yeast extract -. 5.5%
Tap water ... balance at 100 Olo
This gradual addition is continued for 20 hours, the temperature of the medium being maintained at 240 C.
After a total culture period of 48 hours, the glucose concentration of the medium has reached Smg / ml, and its zeaxanthin content, measured as described in Example 1, is 335 ssg / ml.
Example 3
A mutant of a Flavobacter strain (ATCC N 21.081) is prepared as described in Example 1.
The mutant strain is then inoculated at a rate of 4 oxo by volume, into an aqueous nutrient medium previously sterilized at 1200 ° C. for 40 minutes, cooled to 280 ° C. and placed in a fermenter. This nutrient medium, the pH of which is adjusted between 6.9 and 7.1 using ammonia, has the following composition:
Glucose. . . 7.0%
Mals steeping liquor. . 1.6%
Peanut cake hydrolyzate. 0.7%
Yeast extract . 2.0%
Magnesium sulfate - - 0.5 Olo Corn oil - .. -. 0.08 / o
Tap water . .. 100% balance
The microorganism is cultivated in the fermenter at 280 C, as described in Example 2.
When the glucose content of the medium reaches 25 mg / ml, the temperature of the medium is adjusted to 240 ° C. and one adds gradually, in order to maintain the glucose content at a substantially constant level, a previously sterilized nutrient substrate, of which the pH is adjusted to 7.2 and having the following composition: Glucose. . . ........ 32.0 O / o
Corn steep liquor ... . 4.7 Olo
Peanut cake hydrolyzate ... 3.5 O / o Yeast extract .... 6.0 O / o
Tap water ... ..... scales at 100 Olo
This addition is continued for 20 hours at a temperature of 240 C.
After a total culture time of 51 hours, the glucose content of the medium reaches 7.5 mg / ml. The zeaxanthin content, determined as described in Example 1, is 312 g / ml.