Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids der Formel I
EMI1.1
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-CH <SEP> -CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, worin R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe bedeutet, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, und/oder die Thiogruppe des Methioninrestes zur Sulfinylgruppe oxydiert ist, oder ihrer Säureadditionssalze.
Das Peptidamid der Formel I, worin die erste Aminosäure L-Cystein ist, und seine Analogen sind im Schweizer Patent Nr. 517 074 beschrieben.
Als Säureadditionssalze sind besonders Salze von therapeutisch anwendbaren Säuren, wie Salzsäure, Essigsäure, vor allem aber schwerlösliche Salze, wie Sulfate, Phosphate oder Sulfonate, zu nennen.
Acylgruppen für die Acylierung der N"-Aminogruppe sind die Reste von Carbonsäuren, wie aliphatischen, aromatischen, araliphatischen, heterocyclischen und heterocyclylaliphatischen Carbonsäuren, insbesondere von niederen Alkansäuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Buttersäuren, von monocyclischen aromatischen Carbonsäuren, wie unsubstituierter und substituierter Benzoesäure, von unsubstituierten und aryl-substituierten Aryl-niederalkylcarbonsäuren, wie Phenylessigsäure, von 5- bis 6gliedrigen heterocyclischen Säuren mit Stickstoff, Schwefel und/oder Sauerstoff als Heteroatomen, wie Pyridincarbonsäuren, Thiophencarbonsäuren, oder von Heterocyclyl-niederalkansäuren, wie Pyridylessigsäure, Imidazolylessigsäure, worin die Substituenten der Ringe z. B. Halogenatome, Nitrogruppen, Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Niedercarbalkoxygruppen sind.
Weiter sind als Acylreste von Aminosäuren, besonders a-Aminosäuren, wie z. B. der Pyroglutamylrest zu nennen, ferner Acylreste, die sich von Kohlensäure oder Thiokohlensäure bzw. ihren Estern oder Amiden ableiten, z. B. Niederalkyloxycarbonylgruppen, wie Äthoxycarbonyl oder tert.-B utyloxycarbonyl, B enzyloxycarbonylgruppen, Carbamoyl- und Thiocarbamoylgruppen, wie N-substituierte Carbamoyl- und Thiocarbamoylgruppen, z. B. N-Niederalkylcarbamoyl-, N-Phenylcarbamoyl- oder N-Phenyl-thiocarbamoylgruppen, worin die Arylreste wie oben angegeben substituiert sein können.
Unter Komplexen sind die in ihrer Struktur noch nicht abgeklärten Verbindungen zu verstehen, die beim Zusatz gewisser anorganischer oder organischer Stoffe zu langkettigen Peptiden entstehen und diesen eine verlängerte Wirkung verleihen. Solche Stoffe sind beispielsweise beschrieben für ACTH und andere adrenocorticotrop wirksame Peptide. Zu nennen sind z. B. anorganische Verbindungen, die sich von Metallen wie Calcium, Magnesium, Aluminium, Cobalt und insbesondere von Zink ableiten, vor allem schwerlösliche Salze wie Phosphate, Pyrophosphate und Polyphosphate sowie Hydroxyde dieser Metalle, ferner Alkalimetallpolyphosphate wie z. B. Calgon N , Calgon 322 , Calgon 188 oder Polyron B 12 . Organische Stoffe, die eine Ver ängerung der Wirkung hervorrufen, sind beispielsweise nicht antigene Gelatine, z. B.
Polyoxygelatine, Polyvinylpyrrolidon und Carboxymethylcellulose, ferner Sulfonsäure- oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyphenolen und Polyalkoholen, vor allem Polyphloretinphosphat und Phytinsäure, sowie Polymerisate und Copolymerisate von Aminosäuren, z. B. Polyglutaminsäure.
Die neuen Verbindungen weisen eine hypocalcämische Wirkung auf. Sie senken den Plasma-, Calcium- und Phosphatgehalt des Blutes von Säugetieren.
Die neuen Verbindungen können daher zur Behandlung von Hypercalcämie und von Knochenkrankheiten wie Osteoporose verwendet werden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung des oben definierten Peptidamids der Formel I und seiner Analogen und der Säureadditionssalze dieser Verbindungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel III oder IV
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<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-Ch-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH <SEP>
<tb> <SEP> III
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A <SEP>
<tb> <SEP> IV <SEP>
<tb> worin der Asparaginrest durch den Asparaginsäurerest ersetzt sein kann und A einen Teil der auf Cystein7 folgenden Aminosäuresequenz darstellt, mit der restlichen C-terminalen Sequenz des Peptidamids unter Bildung einer Peptidbindung kondensiert.
Wenn der Acylaminorest R eine abspaltbare Acylgruppe, z. B. die tert.-Butyloxyearbonylgruppe, enthält, kann man diese Gruppe abspalten. Man erhält so die im Schweizer
Patent Nr. 517 074 beschriebenen Dotriacontapeptidamide mit freier a-Aminogruppe.
Bei der Herstellung der Ausgangsstoffe wie auch aller Zwischenprodukte kommen als Schutzgruppen besonders die von der Synthese langkettiger Peptide her bekannten sowie einige neue Schutzgruppen in Betracht, die leicht abgespalten werden können, z. B. durch Hydrolyse, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazinolyse.
So verwendet man z. B. als Schutzgruppen für Aminogruppen Acyl- oder Aralkylgruppen wie Formyl-, Trifluor acetyl-, Phthaloyl-, Benzolsulfonyl-, p-Toluolsulfonyl-, o-Nitrophenylsulfenyl-, 2,4-Dinitrophenylsulfenylgruppen (diese Sulfenylgruppen können auch durch Einwirkung nucleophiler Reagenzien, z. B. Sulfiten, Thiosulfaten, vgl.
englisches Patent Nr. 1104 271 abgespalten werden) gegebenenfalls substituierte, wie z. B. durch Niederalkoxygruppen, besonders o- oder p-Methoxygruppen substituierte Benzyl-, oder Diphenyl- oder Triphenylmethylgruppen oder von der Kohlensäure sich ableitende Gruppen wie gegebenenfalls, z. B. durch Halogenatome wie Chlor oder Brom, Nitrogruppen oder Niederalkoxygruppen substituierte Benzyl- oder Benzhydryloxycarbonylgruppen, z. B.
Carbobenzoxy, p-Brom- oder p-Chlorcarbobenzoxy, p Nitrocarbobenzoxy oder p-Methoxycarbobenzoxy, farbige B enzyloxycarbonylgruppen wie p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl und p-(p'-Methoxy-phenylazo)-benzyloxycarbonyl, aliphatische Oxycarbonylgruppen wie Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl oder vor allem tert. Butyloxycarbonyl, aromatisch-aliphatische Oxycarbonylgruppen wie 2-Phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-Tolyl-isopropyloxycarbonyl und insbesondere 2-p-Diphenylisopropyl oxycarbonyl (vgl. Schweizer Patent Nr. 509 266). Die Aminogruppen können auch durch Bildung von Enaminen, erhalten durch Reaktion der Aminogruppe mit 1,3-Diketonen, z. B. Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, geschützt werden.
Carboxylgruppen werden beispielsweise durch Amidoder Hydrazidbildung oder durch Veresterung geschützt.
Die Amid- und Hydrazidgruppen können gegebenenfalls substituiert sein, die Amidgruppe z. B. durch die 3,4-Dimethoxybenzyl- oder bis-(p-Methoxyphenyl)-methylgruppe, die Hydrazidgruppe z. B. durch die Carbobenzoxygruppe, die Trichloräthyloxycarbonylgruppe, die Trifluoracetylgruppe, die Tritylgruppe, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder die
2-p-Diphenylisopropyloxycarbonylgruppe. Zur Veresterung geeignet sind z. B. niedere gegebenenfalls substituierte Alkanole wie Methanol, Äthanol, Cyanmethylalkohol, Benzoylmethylalkohol oder insbesondere tert.-Butanol, ferner Aralkanole wie Arylniederalkanole, z.
B. gegebenenfalls durch Niederalkyl- oder Niederalkoxygruppen oder Halogenatome substituierte Benzyl oder Benzhydrylalkohole wie p-Nitrobenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol oder 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, gegebenenfalls durch elektronenanziehende Substituenten substituierte Phenole und Thiophenole wie Thiophenol, Thiokresol, p-Nitrothiophenol, 2,4,5- und 2,4,6-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol, oder p
Methansulfonylphenol, weiter z. B. N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxypiperidin, 8-Hydroxy chinolin.
Die Hydroxygruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosin reste können z. B. durch Veresterung oder Verätherung ge schützt werden. Als Acylreste bei der Veresterung sind z. B.
Niederalkanoylreste wie Acetyl, Aroylreste wie Benzoyl und vor allem von der Kohlensäure sich ableitende Reste wie
Benzyloxycarbonyl oder Äthyloxycarbonyl geeignet. Zur
Verätherung geeignete Gruppen sind z. B. Benzyl-, Tetra hydropyranyl- oder tert.-Butylreste. Ferner eignen sich zum
Schutz der Hydroxylgruppen die in Ber. 100 (1967), 3838 bis 3849 beschriebenen 2,2,2-Trifluor-1 -tert.-butyloxy- carbonylamino- oder - 1-benzyloxycarbonylaminoäthylgrup- pen (Weygand). Die Hydroxylgruppen brauchen aber nicht notwendig geschützt zu werden.
Die Mercaptogruppen der Cysteinreste werden z. B. durch
Acylierung oder Alkylierung geschützt. Zur Acylierung ge eignet ist z. B. der Acetyl- oder Benzoylrest, der Äthyl carbamoylrest oder der gegebenenfalls substituierte Carbo benzoxyrest. Zur Alkylierung geeignet sind z. B. der tert.
Butyl- oder Benzylthiomethylrest oder gegebenenfalls sub stiruierte Arylmethylgruppen wie Benzyl, p-Nitrobenzyl,
Diphenylmethyl, Dimethoxybenzhydryl oder Trityl, ferner
Phenylcyclohexyl, Thienyl-(2)-cyclohexyl u. a., vgl. Ber. 101 (1968), 681.
Zum Schutz der Aminogruppe in der Guanidinogruppierung des Arginins kommen vor allem die Nitrogruppe und die Tosylgruppe oder der Carbobenzoxyrest zur Anwendung, doch braucht die Guanidinogruppe nicht geschützt zu werden.
Ebenso braucht die Iminogruppe des Histidins nicht unbedingt geschützt zu werden, jedoch kann es vorteilhaft sein, sie zu schützen, z. B. durch Benzyl, Trityl, Carbobenzoxy.
Adamantyloxycarbonyl, oder die oben genannten Weygandschen Gruppen.
Falls die neuen Peptide nach der Merrifieldschen Feststoffträgersynthese aufgebaut werden, können die Seitenketten von Serin, Threonin und Tyrosin z. B. durch Benzyl, die von Cystein durch Benzyl oder p-Methoxybenzyl, die von Histidin durch 1 -Benzyloxycarbonylamino-2,2,2-tri fluoräthyl, die von Arginin durch die Nitrogruppe und die der Glutaminsäure durch Benzyloxy geschützt werden. Als a-Aminoschutzgruppe wird beispielsweise tert.-Butyloxycarbonyl verwendet. Die Abspaltung des geschützten Peptids vom Harz und der Schutzgruppen geschieht z. B. mit wasserfreiem Fluorwasserstoff.
Vorzugsweise verwendet man zum Schutz der Aminogruppen die tert.-Butyloxycarbonylgruppe, zum Schutz der Carboxylgruppe der Seitenkette und gegebenenfalls der terminalen Carboxylgruppe die tert.-Butylestergruppe, zum Schutz der Hydroxylgruppen der Serin-, Threonin- und Tyrosinreste, sofern diese überhaupt geschützt werden, die tert.-Butyläthergruppe und, wenn erwünscht, zum Schutz der Iminogruppe des Histidins die 2,2,2-Trifluor-1-tert.-butyloxycarbonylaminoäthylgruppe. Alle diese Schutzgruppen können, wenn erwünscht, in einer Stufe durch saure Hydrolyse, z. B. mittels Trifluoressigsäure, abgespalten werden.
Beim Aufbau des geschützten Dotriacontapeptids unter Verwendung von mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Schutzgruppen werden die Mercaptogruppen vorzugsweise durch Benzyl oder Trityl geschützt. Die S-Tritylgruppen können aus dem geschützten Peptid in organischer Lösung selektiv (unter Beibehandlung der mit Trifluoressigsäure abspaltbaren Gruppen) mit Mercuriacetat und Schwefelwasserstoff abgespalten werden. Die S-Benzylgruppen können aus dem geschützten Peptid selektiv mit Natrium in flüssigem Ammoniak abgespalten werden. In beiden Fällen erhält man das geschützte Peptid mit freien Mercaptogruppen. Dieses kann zum geschützen Disulfid, z. B. mit Jod in Eisessig, mit Dijod äthan in organischen Lösungsmitteln, mit Luftsauerstoff in flüssigem Ammoniak oxydiert werden.
Besonders vorteilhaft ist es, die Mercaptogruppen durch Tritylgruppen zu schützen und diese aus dem geschützten Peptid unter gleichzeitiger Bildung der Disulfidbrücke mit Jod in Methanol zu entfernen, vgl. Schweizer Patent Nr. 498 805. Diese Bildung des Disulfidringes kann auf der Stufe einer die beiden Cysteinreste enthaltenden Teilsequenz, z. B. des Nonapeptids 1-9, oder auf der Stufe des Dotriacontapeptids ausgeführt werden.
Die erhaltenen freien Peptide können in an sich bekannter Weise nachträglich in ihre Säureadditionssalze oder Komplexe übergeführt werden.
Das Sulfoxid wird vorteilhaft durch Oxydation mit verdünnter Wasserstoffsuperoxidlösung in schwach saurem Medium hergestellt.
Komplexe mit anorganischen Stoffen wie schwerlöslichen Metall-, z. B. Aluminium- oder Zinkverbindungen, werden in analoger Weise wie für ACTH bekannt, z. B. durch Umsetzung mit einem löslichen Salz des betreffenden Metalls, z. B. Zinkchlorid oder Zinksulfat, und Ausfällung mit einem Alkalimetallphosphat und/oder -hydroxyd hergestellt.
Komplexe mit organischen Verbindungen wie Polyoxygelatine. Carboxymethylcellulose. Polyvinylpyrrolidon.
Polychloretinphosphat, Polyglutaminsäure usw. werden durch Mischen dieser Substanzen mit dem Peptid in wässriger Lösung erhalten. In gleicher Weise können auch unlösliche Verbindungen mit Alkalimetallpolyphosphaten hergestellt werden.
Die als Ausgangsstoffe verwendeten Peptide werden erhalten, indem man die Aminosäuren, wenn erforderlich oder erwünscht, unter Verwendung leicht abspaltbarer Schutzgruppen, in der erwähnten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten verknüpft, wobei gegebenenfalls auf einer geeigneten Stufe der Synthese die Disulfidbrücke gebildet wird. Man arbeitet zweckmässig nach den für die Herstellung langkettiger Peptide, unter Berücksichtigung der Disulfid-Brücke, geeigneten Verknüpfungsmethoden, wie sie aus der Literatur bekannt sind.
Die Verknüpfung der Aminosäure- und/oder Peptideinheiten erfolgt daher z. B. in der Weise, dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit geschützter a-Aminogruppe und aktivierter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier a-Aminogruppe und freier oder geschützter, z. B. veresterter oder amidierter terminaler Carboxylgruppe umsetzt oder dass man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter terminaler Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit freier terminaler Carboxylgruppe und geschützter a-Aminogruppe umsetzt.
Die Carboxylgruppe kann beispielsweise durch Überführung in ein Säureazid, -anhydrid, -imidazolid oder einen aktivierten Ester, wie Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, Thiokresylester, p-Methansulfonylphenylester, p-Nitrophenylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5- oder 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8 -Hydroxychinolinester, N-Hydroxypiperidinester, oder durch Reaktion mittels eines Carbodiimids (gegebenenfalls unter Zusatz von N-Hydroxysuccinimid) oder N,N'-Carbonyldiimidazols, oder Isoxazoliumsalzes, z. B. Woodward Reagens, die Aminogruppe beispielsweise durch Reaktion mit einem Phosphit aktiviert werden.
Als gebräuchlichste Methoden sind zu nennen die Carbodiimidmethode, die Azidmethode, die Methode der aktivierten Ester und die Anhydridmethode, ferner die Merrifield-Methode und die Methode der N-Carboxyanhydride oder N-Thiocarboxyanhydride. Im Schweizer Patent Nr. 517 074 ist der Aufbau des Dotriacontapeptidamids ausführlich beschrieben und durch Figuren veranschaulicht. In gleicher Weise können die Derivate der vorliegenden Anmeldung aufgebaut werden.
Die Erfindung wird im folgenden Beispiel beschrieben.
Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
In der Dünnschichtchromatographie werden die folgenden Systeme verwendet: System 45: sec.-Butanol-3t iges wässriges Ammoniak (70:30) System 52: n-Butanol-Eisessig-Wasser (75 : 7,5 : 21) System 54: sec.-Butanol-Isopropanol-9%ige Monochloressigsäure (58 : 8 : 34) System 104: Chloroform-Methanol- 17 %iges wässriges Ammoniak (41:41:18)
Beispiel Na-Acetyl-Cys-S er-Asn-Leu-S er-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala- Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly- Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 (Na-Acetyl-Thyrocalcitonin) i 1,2 g (1,2 mMol) Na-Acetyl-Cys-S er-Asn-Leu-S er-Thr- Val-Leu-OH werden in 30 ml frisch destilliertem Di methylformamid und 123 mg N-Methylmorpholin gelöst.
Hierauf kühlt man die Lösung auf , gibt unter Rühren
150 mg Pivaloylchlorid hinzu und hält das Reaktionsgemisch
5 Minuten auf-15 . Dann tropft man eine auf -15" gekühlte Lösung von 2,4 g (0,9 mMol) H-Ser-Ala-Tyr-Try Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-diacetat in 50 ml Di methylformamid, 100 mg N-Methylmorpholin und Wasser hinzu. (Die Triacosapeptidlösung erhält man am besten, indem man das Peptid in dem Gemisch von Dimethylformamid und N-Methylmorpholin unter Stickstoff auf 50 erwärmt und unter Rühren sowie Wasser zutropft, bis das Peptid in Lösung geht).
Nach beendeter Zugabe wird über Nacht unter
Stickstoff bei 0 belassen und hierauf im Hochvakuum bei 40 Badtemperatur auf ein Volumen von etwa 30 ml einge engt. Man giesst das Konzentrat in 500 ml peroxydfreien Äther und saugt den entstehenden Niederschlag ab. Das so erhaltene rohe Na-Acetyldotricontapeptid wird zur Reinigung einer Gegenstromverteilung über 100 Stufen im System n-Butanol-Eisessig-Wasser (5 : 4) unterworfen. Aus den
Verteilungselementen isoliert man beim Einengen reines
Na-Acetyl-thyrocalcitonin. Rf52 = 0,55 und Rflw = 0,69.
Das als Ausgangsmaterial verwendete Nonapeptidderivat kann wie folgt hergestellt werden: 50 ml konzentrierte Salzsäure werden auf 100 ge
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<tb> kühlt, <SEP> hierauf <SEP> 3,0 <SEP> g <SEP> fein <SEP> gepulvertes <SEP> BOC-Cys-Ser(tBu)
<tb> Asn-Leu-Ser(tBu)-Thr(tBu)-Cys-Val-Leu-OH <SEP> (vgl.
<tb>
Schweizer Patent Nr. 517 074) unter Rühren eingetragen, die Luft durch Stickstoff verdrängt, auf 0 0 erwärmt und 10 Minuten bei 0 belassen. Dann gibt man 250 ml Eiswasser und 20 ml Eisessig zu und filtriert über eine Säule von Merck-Jonenaustauscher Nr. II, schwach basisch, Acetatform. Das Eluat wird zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Wasser gelöst und lyophilisiert. Das Lyophilisat löst man in 30 ml Wasser, stellt das pH der Lösung durch Zugabe von Pyridin auf 6,8 und versetzt mit dem dreifachen Volumen Dimethylformamid. Hierauf fügt man eine Lösung von 600 mg.p-Nitrophenylacetat in 5 ml Dimethylformamid zu und lässt 5 Stunden bei Raumtemperatur stehen.
Dann dampft man bei 35 Badtemperatur und 0,01 mmHg zur Trockne ein und gibt 100 ml %ige Lösung von Pyridin in Äther zu.
Man zerreibt das ausgefallene Nonpaptidderivat gut, nutscht es ab, wäscht es mit Äther nach und trocknet es im Vakuumexsikkator über konz. Schwefelsäure. Zur Reinigung wird das Produkt in Butanol-Wasser (3 1) gelöst und über eine im gleichen Lösungsmittel bereitete Säure (3,8 cm; 95 cm) Sephadex LH-20 chromatographiert. Man fängt Fraktionen zu 10 ml auf, kontrolliert ihre Reinheit dünnschichtchromatographisch auf Silicagelplatten (System 121A), vereinigt die reinen Fraktionen, dampft zur Trockne ein und trocknet bei 35 Badtemperatur und 0,01 mmHg.
Das als Ausgangsmaterial verwendete H-Ser-Ala-Tyr Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-diacetat wird wie folgt bereitet: 3,4 g DPC-Ser(tBu)-Ala-Tyr(tBu)-Try-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser(tBu)-Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu(OtBu)-Thr(tBu)-Pro-NH2 (vgl. Schweizer Patent Nr. 517 074) werden in 60 ml 80%iger Essigsäure gelöst, und die Lösung wird 6 Stunden bei 35 stehengelassen.
Hierauf dampft man sie zur Trockne ein, zerreibt den Rückstand mit peroxydfreiem Äther, nutscht das erhaltene Pulver ab, trocknet es und löst es in 50 ml 95 %iger Trifluoressigsäure. Man lässt 1,5 Stunden unter Stickstoff bei 25 stehen, dampft dann auf ein Volumen von etwa 5 ml ein und giesst in 300 ml peroxydfreien Äther ein. Man nutscht den Niederschlag ab, wäscht ihn mit Äther und trocknet über Natriumhydroxyd im Exsikkator. Hierauf löst man in 10 %aber Essigsäure und filtriert über eine Säule von Merck-Ionenaus- tauscher Nr. II (schwach basisch, Acetatform).
Man wäscht die Säule so lange mit 10%aber Essigsäure nach, bis das Eluat im UV bei 280 mu keine Absorbtion mehr zeigt, dampft das Eluat zur Trockne ein, löst den Rückstand in Wasser und lyophilisiert. In analoger Weise kann man N- Acetyl-thyrocalcitoninsulfoxid herstellen.
Die Substanz weist im Dünnschichtchromatogramm auf Aluminiumoxid ( Camag ) folgende Rf-Werte auf: Rf52 = 0,51 und Rfj04 = 0,64.
Auf Cellulose-Dünnschichtplatten ( Avicel ): Ruf54 = 0,61.
Sie ist, im Gegensatz zu Thyrocalcitoninsulfoxid, Ninhydrinnegativ.
Bei der Elektrophorese auf Celluloseacetat-Streifen ( Cellogel ) wandert sie (bei pH 1,9 und 9 Volt/cm) in 90 Minuten 0,5 cm zur Kathode.
PATENTANSPRUCH 1
Verfahren zur Herstellung eines Peptidamids der Formel I
EMI4.2
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> R-Ch-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr- <SEP>
<tb> Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, worin R Wasserstoff oder eine acylierte Aminogruppe bedeutet, oder entsprechender Verbindungen, in welchen einer oder mehrere der Asparaginreste durch den Asparaginsäurerest und/oder der Glutaminsäurerest durch den Glutaminrest und/oder der Methioninrest durch den Valin-, Norvalin-, Leucin-, Isoleucin- oder Norleucinrest ersetzt sind, und/oder die Thiogruppe des Methioninrestes zur Sulfinylgruppe oxydiert ist, oder ihrer Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet,
dass man Verbindungen der Formel III oder IV
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<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH <SEP>
<tb> R-Ch-CO-S <SEP> er-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH <SEP>
<tb> <SEP> III
<tb> <SEP> 5. <SEP>
<tb>
<SEP> CH2
<tb> R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A <SEP>
<tb> <SEP> IV
<tb> worin der Asparaginrest durch den Asparaginsäurerest ersetzt sein kann und A einen Teil der auf Cystein7 folgenden Aminosäuresequenz darstellt, mit der restlichen C-terminalen Sequenz des Peptidamids unter Bildung einer Peptidbindung kondensiert.
UNTERANSPRÜCHE
1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man von einer Verbindung der Formel IV ausgeht, worin R eine acylierte Aminogruppe ist und A für L-Valyl-L-leucin steht.
2. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, worin R für die Acetylaminogruppe steht.
3. Verfahren nach Patentanspruch I oder Unteranspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man von Verbindungen ausgeht, worin R für die tert. -Butyloxycarbonylaminogruppe steht.
4. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man aus erhaltenen Verbindungen mit abspaltbarer N=-Acylgruppe diese Gruppe durch saure Hydrolyse abspaltet.
PATENTANSPRUCH II
Verwendung von nach Patentanspruch I erhaltenen Peptidamiden zur Herstellung von Komplexen, dadurch gekennzeichnet, dass man sie durch Umsetzung mit anorganischen oder organischen Stoffen mit saurem Charakter, welche durch Komplexbildung die Wirkung basischer Peptide verlängern, in solche Komplexe überführt.
**WARNUNG** Ende DESC Feld konnte Anfang CLMS uberlappen**.
Process for producing a peptide amide
The invention relates to a process for producing a peptide amide of the formula I.
EMI1.1
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-CH <SEP> -CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg -Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, in which R is hydrogen or an acylated amino group, or corresponding compounds in which one or more of the asparagine residues is replaced by the aspartic acid residue and / or the glutamic acid residue is replaced by the glutamine residue and / or the methionine residue is replaced by the valine, norvaline, leucine, isoleucine or norleucine residue, and / or the thio group of the methionine residue is oxidized to the sulfinyl group, or its acid addition salts.
The peptide amide of formula I in which the first amino acid is L-cysteine and its analogues are described in Swiss Patent No. 517 074.
As acid addition salts, particular mention should be made of salts of therapeutically applicable acids, such as hydrochloric acid, acetic acid, but especially sparingly soluble salts, such as sulfates, phosphates or sulfonates.
Acyl groups for the acylation of the N "-amino group are the residues of carboxylic acids such as aliphatic, aromatic, araliphatic, heterocyclic and heterocyclylaliphatic carboxylic acids, in particular of lower alkanoic acids such as formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acids, of monocyclic and unsubstituted aromatic carboxylic acids, such as Benzoic acid, of unsubstituted and aryl-substituted aryl-lower alkylcarboxylic acids, such as phenylacetic acid, of 5- to 6-membered heterocyclic acids with nitrogen, sulfur and / or oxygen as heteroatoms, such as pyridinecarboxylic acids, thiophenecarboxylic acids, or of heterocyclyl-lower alkanoic acids, such as pyridylacetic acid, in which the substituents of the rings are, for example, halogen atoms, nitro groups, lower alkyl or lower alkoxy groups or lower carbalkoxy groups.
Next are acyl residues of amino acids, especially a-amino acids, such as. B. the pyroglutamyl radical, also acyl radicals derived from carbonic acid or thiocarbonic acid or their esters or amides, z. B. lower alkyloxycarbonyl groups such as ethoxycarbonyl or tert-butyloxycarbonyl, B enzyloxycarbonyl groups, carbamoyl and thiocarbamoyl groups such as N-substituted carbamoyl and thiocarbamoyl groups, e.g. B. N-lower alkylcarbamoyl, N-phenylcarbamoyl or N-phenyl-thiocarbamoyl groups, in which the aryl radicals can be substituted as indicated above.
Complexes are to be understood as meaning the compounds, which have not yet been clarified in their structure, which arise when certain inorganic or organic substances are added to long-chain peptides and which give them a prolonged effect. Such substances are described, for example, for ACTH and other adrenocorticotropic peptides. To be mentioned are z. B. inorganic compounds derived from metals such as calcium, magnesium, aluminum, cobalt and especially zinc, especially sparingly soluble salts such as phosphates, pyrophosphates and polyphosphates and hydroxides of these metals, and also alkali metal polyphosphates such. B. Calgon N, Calgon 322, Calgon 188 or Polyron B 12. Organic substances that cause a prolongation of the effect are, for example, non-antigenic gelatin, e.g. B.
Polyoxygelatine, polyvinylpyrrolidone and carboxymethyl cellulose, also sulfonic acid or phosphoric acid esters of alginic acid, dextran, polyphenols and polyalcohols, especially polyphloretin phosphate and phytic acid, as well as polymers and copolymers of amino acids, e.g. B. polyglutamic acid.
The new compounds have a hypocalcemic effect. They lower the plasma, calcium and phosphate levels in the blood of mammals.
The new compounds can therefore be used for the treatment of hypercalcaemia and bone diseases such as osteoporosis.
The process according to the invention for the preparation of the above-defined peptide amide of the formula I and its analogs and the acid addition salts of these compounds is characterized in that compounds of the formula III or IV
EMI2.1
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-Ch-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH <SEP>
<tb> <SEP> III
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH2
<tb> R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A <SEP>
<tb> <SEP> IV <SEP>
<tb> wherein the asparagine residue can be replaced by the aspartic acid residue and A represents part of the amino acid sequence following cysteine7, condenses with the remaining C-terminal sequence of the peptide amide to form a peptide bond.
If the acylamino radical R is a removable acyl group, e.g. B. contains the tert-butyloxyearbonyl group, this group can be split off. So you get those in the Swiss
Dotriacontapeptide amides with a free α-amino group described in U.S. Patent No. 517,074.
In the preparation of the starting materials as well as all intermediate products, protective groups that are particularly suitable are those known from the synthesis of long-chain peptides and some new protective groups that can be easily split off, e.g. B. by hydrolysis, reduction, aminolysis or hydrazinolysis.
So one uses z. B. as protective groups for amino groups acyl or aralkyl groups such as formyl, trifluoroacetyl, phthaloyl, benzenesulfonyl, p-toluenesulfonyl, o-nitrophenylsulfenyl, 2,4-dinitrophenylsulfenyl groups (these sulfenyl groups can also be activated by the action of nucleophilic reagents, e.g. B. sulfites, thiosulfates, cf.
English patent no. 1104 271) optionally substituted, such as. B. by lower alkoxy groups, especially o- or p-methoxy groups substituted benzyl, or diphenyl or triphenylmethyl groups or groups derived from carbonic acid such as, if appropriate, z. B. benzyl or benzhydryloxycarbonyl groups substituted by halogen atoms such as chlorine or bromine, nitro groups or lower alkoxy groups, e.g. B.
Carbobenzoxy, p-bromo- or p-chlorocarbobenzoxy, p-nitrocarbobenzoxy or p-methoxycarbobenzoxy, colored benzyloxycarbonyl groups such as p-phenylazo-benzyloxycarbonyl and p- (p'-methoxy-phenylazo) -benzyloxoxy, aliphatic oxyloxycarbonyl, aliphatic oxyloxy carbonyl, aliphatic oxyloxy carbonyl, adamicloxycarbonyl, aliphatic cycloxycarbonyl, adamophyloxycarbonyl, adamloxy carbonyl, adamoxycarbonyl carbonyl, p-methoxycarbobenzoxy or p-methoxycarbobenzoxy, tert-amyloxycarbonyl or especially tert. Butyloxycarbonyl, aromatic-aliphatic oxycarbonyl groups such as 2-phenyl-isopropyloxycarbonyl, 2-tolyl-isopropyloxycarbonyl and in particular 2-p-diphenylisopropyl oxycarbonyl (cf. Swiss Patent No. 509 266). The amino groups can also be obtained by the formation of enamines obtained by reaction of the amino group with 1,3-diketones, e.g. B. benzoylacetone, acetylacetone or dimedone are protected.
Carboxyl groups are protected, for example, by amide or hydrazide formation or by esterification.
The amide and hydrazide groups can optionally be substituted, the amide group z. B. by the 3,4-dimethoxybenzyl or bis (p-methoxyphenyl) methyl group, the hydrazide group z. B. by the carbobenzoxy group, the trichloroethyloxycarbonyl group, the trifluoroacetyl group, the trityl group, the tert-butyloxycarbonyl group or the
2-p-diphenylisopropyloxycarbonyl group. Suitable for esterification are, for. B. lower optionally substituted alkanols such as methanol, ethanol, cyanomethyl alcohol, benzoylmethyl alcohol or especially tert-butanol, also aralkanols such as aryl-lower alkanols, e.g.
B. benzyl or benzhydryl alcohols optionally substituted by lower alkyl or lower alkoxy groups or halogen atoms such as p-nitrobenzyl alcohol, p-methoxybenzyl alcohol or 2,4,6-trimethylbenzyl alcohol, optionally substituted phenols and thiophenols such as thiophenol, thiocresol, p-nitrothiophenol, 4,5- and 2,4,6-trichlorophenol, pentachlorophenol, p-nitrophenol, 2,4-dinitrophenol, p-cyanophenol, or p
Methanesulfonylphenol, further e.g. B. N-hydroxysuccinimide, N-hydroxyphthalimide, N-hydroxypiperidine, 8-hydroxy quinoline.
The hydroxy groups of the serine, threonine and tyrosine residues can, for. B. ge protected by esterification or etherification. As acyl radicals in the esterification, for. B.
Lower alkanoyl radicals such as acetyl, aroyl radicals such as benzoyl and, above all, radicals derived from carbonic acid such as
Benzyloxycarbonyl or ethyloxycarbonyl suitable. To
Groups suitable for etherification are e.g. B. benzyl, tetra hydropyranyl or tert-butyl radicals. Also suitable for
Protection of the hydroxyl groups in Ber. 100 (1967), 3838 to 3849 described 2,2,2-trifluoro-1-tert-butyloxycarbonylamino or 1-benzyloxycarbonylaminoethyl groups (Weygand). However, the hydroxyl groups do not necessarily need to be protected.
The mercapto groups of the cysteine residues are z. B. by
Acylation or alkylation protected. For acylation ge is suitable, for. B. the acetyl or benzoyl radical, the ethyl carbamoyl radical or the optionally substituted carbo benzoxy radical. Suitable for alkylation are, for. B. the tert.
Butyl or benzylthiomethyl radical or optionally substituted arylmethyl groups such as benzyl, p-nitrobenzyl,
Diphenylmethyl, dimethoxybenzhydryl or trityl, furthermore
Phenylcyclohexyl, thienyl- (2) -cyclohexyl and the like. a., cf. Ber. 1968, 101: 681.
To protect the amino group in the guanidino group of arginine, the nitro group and the tosyl group or the carbobenzoxy radical are primarily used, but the guanidino group does not need to be protected.
Likewise, the imino group of histidine does not necessarily need to be protected, but it can be advantageous to protect it, e.g. B. by benzyl, trityl, carbobenzoxy.
Adamantyloxycarbonyl, or the Weygand groups mentioned above.
If the new peptides are built up according to Merrifield's solid support synthesis, the side chains of serine, threonine and tyrosine can e.g. B. by benzyl, that of cysteine by benzyl or p-methoxybenzyl, that of histidine by 1 -benzyloxycarbonylamino-2,2,2-tri fluoroethyl, that of arginine by the nitro group and that of glutamic acid by benzyloxy. Tert-butyloxycarbonyl, for example, is used as the α-amino protecting group. The cleavage of the protected peptide from the resin and the protective groups occurs, for B. with anhydrous hydrogen fluoride.
It is preferred to use the tert-butyloxycarbonyl group to protect the amino groups, the tert-butyl ester group to protect the carboxyl group of the side chain and optionally the terminal carboxyl group, and the hydroxyl groups of the serine, threonine and tyrosine radicals, if these are protected at all tert-butyl ether group and, if desired, the 2,2,2-trifluoro-1-tert-butyloxycarbonylaminoethyl group to protect the imino group of the histidine. All of these protecting groups can, if desired, in one step by acid hydrolysis, e.g. B. by means of trifluoroacetic acid, are split off.
When the protected dotriacontapeptide is built up using protective groups which can be split off with trifluoroacetic acid, the mercapto groups are preferably protected by benzyl or trityl. The S-trityl groups can be split off selectively from the protected peptide in organic solution (while maintaining the groups which can be split off with trifluoroacetic acid) using mercuric acetate and hydrogen sulfide. The S-benzyl groups can be split off selectively from the protected peptide with sodium in liquid ammonia. In both cases, the protected peptide with free mercapto groups is obtained. This can be used to protect disulfide, e.g. B. with iodine in glacial acetic acid, with diiodine ethane in organic solvents, oxidized with atmospheric oxygen in liquid ammonia.
It is particularly advantageous to protect the mercapto groups by trityl groups and to remove them from the protected peptide with simultaneous formation of the disulfide bridge with iodine in methanol, cf. Swiss Patent No. 498 805. This formation of the disulfide ring can be carried out at the stage of a partial sequence containing the two cysteine residues, e.g. B. of the nonapeptide 1-9, or at the stage of the Dotriacontapeptide.
The free peptides obtained can subsequently be converted into their acid addition salts or complexes in a manner known per se.
The sulfoxide is advantageously produced by oxidation with a dilute hydrogen peroxide solution in a weakly acidic medium.
Complexes with inorganic substances such as sparingly soluble metal, e.g. B. aluminum or zinc compounds are known in an analogous manner as for ACTH, z. B. by reaction with a soluble salt of the metal in question, e.g. B. zinc chloride or zinc sulfate, and precipitation with an alkali metal phosphate and / or hydroxide produced.
Complexes with organic compounds such as polyoxygelatin. Carboxymethyl cellulose. Polyvinyl pyrrolidone.
Polychloretine phosphate, polyglutamic acid, etc. are obtained by mixing these substances with the peptide in an aqueous solution. Insoluble compounds with alkali metal polyphosphates can also be prepared in the same way.
The peptides used as starting materials are obtained by linking the amino acids, if necessary or desired, using easily cleavable protective groups, individually in the order mentioned or after prior formation of smaller peptide units, the disulfide bridge being formed at a suitable stage of the synthesis if necessary. It is expedient to work according to the linking methods suitable for the production of long-chain peptides, taking into account the disulfide bridge, as are known from the literature.
The amino acid and / or peptide units are therefore linked e.g. B. in such a way that one amino acid or a peptide with a protected a-amino group and activated terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with a free a-amino group and free or protected, z. B. esterified or amidated terminal carboxyl group or that one reacts an amino acid or a peptide with activated α-amino group and protected terminal carboxyl group with an amino acid or a peptide with free terminal carboxyl group and protected α-amino group.
The carboxyl group can, for example, be converted into an acid azide, anhydride, imidazolide or an activated ester such as cyanomethyl ester, thiophenyl ester, p-nitrothiophenyl ester, thiocresyl ester, p-methanesulfonylphenyl ester, p-nitrophenyl ester, 2,4-dinitrophenyl ester, 2,4,5 - or 2,4,6-trichlorophenyl ester, pentachlorophenyl ester, N-hydroxysuccinimide ester, N-hydroxyphthalimide ester, 8 -hydroxyquinoline ester, N-hydroxypiperidine ester, or by reaction using a carbodiimide (optionally with the addition of N-hydroxysuccinimide) or N, N'-carbonyldiimidazole , or isoxazolium salt, e.g. B. Woodward reagent, the amino group can be activated for example by reaction with a phosphite.
The most common methods are the carbodiimide method, the azide method, the activated ester method and the anhydride method, also the Merrifield method and the N-carboxyanhydride or N-thiocarboxyanhydride method. The structure of the dotriacontapeptide amide is described in detail and illustrated by figures in Swiss Patent No. 517 074. The derivatives of the present application can be constructed in the same way.
The invention is described in the following example.
The temperatures are given in degrees Celsius.
The following systems are used in thin-layer chromatography: System 45: sec-butanol-3-strength aqueous ammonia (70:30) System 52: n-butanol-glacial acetic acid-water (75: 7.5: 21) System 54: sec. -Butanol-isopropanol-9% monochloroacetic acid (58: 8: 34) System 104: chloroform-methanol- 17% aqueous ammonia (41:41:18)
Example Na-Acetyl-Cys-S er-Asn-Leu-S er-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr-Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe -Ser-Gly- Met-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2 (Na-acetyl-thyrocalcitonin) i 1.2 g (1.2 mmol) Na-acetyl-Cys-S er-Asn -Leu-S er-Thr- Val-Leu-OH are dissolved in 30 ml of freshly distilled dimethylformamide and 123 mg of N-methylmorpholine.
The solution is then cooled and added with stirring
150 mg of pivaloyl chloride are added and the reaction mixture is kept
5 minutes to -15. Then a solution of 2.4 g (0.9 mmol) H-Ser-Ala-Tyr-Try Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser- Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2-diacetate in 50 ml dimethylformamide, 100 mg N-methylmorpholine and water. (The best way to get the triacosapeptide solution is to add the peptide in the mixture of dimethylformamide and N-methylmorpholine heated to 50 under nitrogen and added dropwise with stirring and water until the peptide dissolves).
After the addition is complete overnight
Leave nitrogen at 0 and then concentrate in a high vacuum at a bath temperature of about 30 ml. The concentrate is poured into 500 ml of peroxide-free ether and the resulting precipitate is filtered off with suction. The crude Na acetyldotricontapeptide obtained in this way is subjected to a countercurrent distribution over 100 stages in the n-butanol-glacial acetic acid-water system (5: 4) for purification. From the
Distribution elements are isolated when they are concentrated
Na-acetyl-thyrocalcitonin. Rf52 = 0.55 and Rflw = 0.69.
The nonapeptide derivative used as starting material can be prepared as follows: 50 ml of concentrated hydrochloric acid are added to 100 ge
EMI4.1
<tb> cools, <SEP> then <SEP> 3.0 <SEP> g <SEP> fine <SEP> powdered <SEP> BOC-Cys-Ser (tBu)
<tb> Asn-Leu-Ser (tBu) -Thr (tBu) -Cys-Val-Leu-OH <SEP> (cf.
<tb>
Swiss Patent No. 517 074) entered with stirring, displaced the air with nitrogen, warmed to 0 and left at 0 for 10 minutes. 250 ml of ice water and 20 ml of glacial acetic acid are then added and the mixture is filtered through a column of Merck ion exchanger No. II, weakly basic, acetate form. The eluate is evaporated to dryness, the residue is dissolved in water and lyophilized. The lyophilizate is dissolved in 30 ml of water, the pH of the solution is adjusted to 6.8 by adding pyridine and three times the volume of dimethylformamide is added. A solution of 600 mg of p-nitrophenyl acetate in 5 ml of dimethylformamide is then added and the mixture is left to stand for 5 hours at room temperature.
Then it is evaporated to dryness at a bath temperature and 0.01 mmHg and 100 ml% solution of pyridine in ether is added.
The precipitated nonpaptid derivative is grinded well, sucked off, washed with ether and dried in a vacuum desiccator over conc. Sulfuric acid. For purification, the product is dissolved in butanol-water (3 l) and chromatographed over an acid (3.8 cm; 95 cm) Sephadex LH-20 prepared in the same solvent. 10 ml fractions are collected, their purity is checked by thin-layer chromatography on silica gel plates (system 121A), the pure fractions are combined, evaporated to dryness and dried at a bath temperature of 0.01 mmHg.
The H-Ser-Ala-Tyr Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro- NH2-diacetate is prepared as follows: 3.4 g DPC-Ser (tBu) -Ala-Tyr (tBu) -Try-Arg-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser (tBu) - Gly-Met-Gly Phe-Gly-Pro-Glu (OtBu) -Thr (tBu) -Pro-NH2 (cf. Swiss Patent No. 517 074) are dissolved in 60 ml of 80% acetic acid, and the solution is 6 hours left at 35.
They are then evaporated to dryness, the residue is triturated with peroxide-free ether, the powder obtained is filtered off with suction, dried and dissolved in 50 ml of 95% strength trifluoroacetic acid. It is left to stand under nitrogen at 25 for 1.5 hours, then evaporated to a volume of about 5 ml and poured into 300 ml of peroxide-free ether. The precipitate is filtered off with suction, washed with ether and dried over sodium hydroxide in a desiccator. Acetic acid is then dissolved in 10% and filtered through a column of Merck ion exchanger No. II (weakly basic, acetate form).
The column is washed with 10% but acetic acid until the eluate no longer shows any absorption in the UV at 280 μm, the eluate is evaporated to dryness, the residue is dissolved in water and lyophilized. N-acetyl-thyrocalcitoninsulfoxide can be prepared in an analogous manner.
The substance shows the following Rf values in a thin layer chromatogram on aluminum oxide (Camag): Rf52 = 0.51 and Rfj04 = 0.64.
On cellulose thin-layer plates (Avicel): Ruf54 = 0.61.
In contrast to thyrocalcitonin sulfoxide, it is ninhydrin negative.
During electrophoresis on cellulose acetate strips (Cellogel), it migrates (at pH 1.9 and 9 volts / cm) 0.5 cm to the cathode in 90 minutes.
PATENT CLAIM 1
Process for the preparation of a peptide amide of the formula I.
EMI4.2
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> R-Ch-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser-Ala-Tyr- <SEP>
<tb> Try-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Arg-Phe-Ser-Gly-Met Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2, wherein R is hydrogen or an acylated one Amino group means, or corresponding compounds in which one or more of the asparagine residues are replaced by the aspartic acid residue and / or the glutamic acid residue by the glutamine residue and / or the methionine residue by the valine, norvaline, leucine, isoleucine or norleucine residue, and / or the thio group of the methionine residue is oxidized to the sulfinyl group, or its acid addition salts, characterized in that
that one compounds of the formula III or IV
EMI4.3
<tb> <SEP> 5 <SEP>
<tb> <SEP> CH <SEP>
<tb> R-Ch-CO-S <SEP> er-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-OH <SEP>
<tb> <SEP> III
<tb> <SEP> 5. <SEP>
<tb>
<SEP> CH2
<tb> R-CH-CO-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-A <SEP>
<tb> <SEP> IV
<tb> wherein the asparagine residue can be replaced by the aspartic acid residue and A represents part of the amino acid sequence following cysteine7, condenses with the remaining C-terminal sequence of the peptide amide to form a peptide bond.
SUBCLAIMS
1. The method according to claim I, characterized in that one starts from a compound of the formula IV in which R is an acylated amino group and A is L-valyl-L-leucine.
2. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that one starts from compounds in which R stands for the acetylamino group.
3. The method according to claim I or dependent claim 1, characterized in that one starts from compounds in which R is the tert. -Butyloxycarbonylamino group.
4. The method according to claim I, characterized in that this group is cleaved from compounds obtained with cleavable N = acyl group by acid hydrolysis.
PATENT CLAIM II
Use of peptide amides obtained according to patent claim I for the production of complexes, characterized in that they are converted into such complexes by reaction with inorganic or organic substances with an acidic character, which by complex formation prolong the action of basic peptides.
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