Procédé de préparation de dérivés de peptides insolubles dans l'eau La présente invention a pour objet un procédé de préparation de dérivés insolubles dans l'eau de pep tides contenant un ou plusieurs groupes de formule -YH, dans laquelle -YH représente un groupe amino primaire ou secondaire, suivant lequel on fixe le pep tide, par des ponts à liaisons covalentes, à des poly mères insolubles dans l'eau contenant au moins un groupe amino primaire ou secondaire, en opérant en milieu alcalin.
Dans la suite de cet exposé, l'expression peptide comprend les protéines contenant un ou plusieurs groupes amino primaires au secondaires. (On sait que les protéines sont des peptides à haut poids molécu laires.) Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on utilise un halogénure de cyanogène comme agent formateur des ponts. On peut conduire la réaction dans un milieu faible ment alcalin. On peut la conduire en présence d'eau, ce qui est particulièrement important, et la température est variable, par exemple comprise entre 0 et 50 C. La réaction est basée sur la formation de ponts, avec des liaisons de covalence entre le polymère et le pep tide.
Des recherches faites indiquent que les ponts auraient la formule
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dans laquelle A est le résidu du polymère et B est résidu du peptide et Z représente un groupe imino (=NH) ou oxygène (=O). On attribue le fait que Z peut aussi représenter un oxygène à ce que le groupe imino puisse se convertir, dans certains cas, en oxygène par hydrolyse concomitante.
On peut conduire la réaction en un ou plusieurs stades, cependant en règle générale, en deux stades. Habituellement, on conduit le premier de ces stades de manière que le polymère contenant un au plusieurs groupes amino primaires au secondaires sait mis. en contact avec l'halogénure de cyanogène, ce dernier étant présent sous forme de la substance pure ou d'une solution de celui-ci. Comme halogénure de cyanogène, on peut utiliser habituellement le composé iodo-chloro- ou bromo- ou éventuellement un mélange de ceux-ci. On peut conduire la réaction dans des conditions alca lines, fournies par l'addition d'une substance appro priée à réactivité alcaline, par exemple l'hydroxyde de sodium.
Les pH appropriés sont en premier lieu ceux compris entre 8 et 13. On peut, par de simples essais préalables., déterminer aisément le pH ou la gamme de pH appropriés. On peut conduire la réaction à diffé rentes températures, par exemple comprises entre 0 et 50 C. On peut conduire la réaction dans une solution aqueuse, mais il y aura certaines pertes en halogénure de cyanogène dues à ce qu'une partie de ce dernier est consommée par hydrolyse. De la réaction résulte la formation de dérivés réactifs du polymère que l'on peut immédiatement, éventuellement après isolement, faire réagir avec un peptide. Le dérivé réactif ainsi formé peut aussi être conservé dans des conditions appropriées et mis en réaction avec le peptide plus tard.
Avant sa liaison au peptide, le dérivé réactif peut être purifié, par exemple par lavage, dans le case d'un polymère insoluble dans l'eau. La structure du produit intermédiaire réactif n'a pas été déterminée avec préci sion.
De préférence on conduit le deuxième stade du procédé dans une solution faiblement alcaline à une température qui peut être comprise par exemple entre 0 et 50 C. par exemple la température ordinaire. C'est aussi un avantage que de pouvoir conduire ce stade dans une solution aqueuse. Un avantage essentiel atteint par le procédé selon la présente invention est que les peptides sensibles. contenant un ou plusieurs groupes -YH peuvent aussi être liés à des polymères aminés insolubles dans l'eau, sans que le peptide soit détruit ou ne subisse une autre modification désavantageuse. Il est possible de lier des peptides sensibles sans que les liaisons peptidiques soient détruites.
Ainsi, il est possible par exemple de lier des enzymes à de tels polymères sans perte essen tielle de l'activité enzymatique et de lier un anticorps au polymère sans perte de la possibilité de l'anticorps de fixer son antigène. On peut donc dire que le procédé selon l'invention représente une méthode éton namment douce et simple de lier les peptides à des polymères du type indiqué plus haut.
Le polymère aminé insoluble dans l'eau peut être un polysaccharide insoluble dans l'eau, substitué par des groupes amino primaires ou secondaires. Comme exemple d'un dérivé insoluble dans l'eau de polysac charide, on peut citer le dextran réticulé et substitué par un ou plusieurs groupes p-aminophénoxy-hydroxy- propyles.
Le poids moléculaire moyen du polymère choisi, contenant un ou plusieurs groupes amino primaires ou secondaires peut varier dans de très larges limites. Cependant, de préférence, il dépasse 1000, et est par exemple de plus de 10 000.
Le polymère peut aussi être insoluble, mais gon flable dans l'eau. Ainsi, il peut consister en un réseau réticulé tridimensionnel contenant des groupes amino, primaires ou secondaires. Ces copolymères présentent une activité variable d'absorption d'eau. Comme copo- lymères on peut aussi citer ceux qui sont substitués par des groupes p-aminophénoxyhydroxypropyliques.
Comme peptides contenant un ou plusieurs groupes amino primaires ou secondaires, que l'on va soumettre à la réaction de liaison avec le dérivé réactif, on peut citer les, protéines. Des exemples de ces biopolymères sont les enzymes, les anticorps, les hormones protéini- ques et/ou peptidiques ou les protéines antigéniques. Les produits du procédé sont très intéressants. Une enzyme qui a été liée à un produit polymère insoluble selon l'invention peut ainsi être introduite dans un lit et ce lit utilisé comme réactif pour des réactions chimi ques. Sous ce rapport, une solution de substrat peut être passée à travers le lit d'enzyme pour convertir ce substrat en un produit utile.
La réaction est automati quement interrompue lorsque la solution quitte le lit. On peut utiliser l'enzyme solide pendant longtemps dans une opération continue. Un autre exemple utile est les anticorps liés à des polymères insolubles dans l'eau par le procédé selon la présente invention. On peut lier de tels produits spéci fiquement à l'antigène correspondant, par exemple pour la détermination analytique de ce dernier. <I>Exemple 1</I> Liaison d'une -globuline (gonadotropine antichorionique) à un copolymère amino-substitué (p-aminophénoxyhydroxypropyléther) de dextran avec l'épichlorhydrine. A. Activation du p-aminophénoxyhydroxy propyléther du copolymérisat.
On gonfle 100 mg de p-aminophénoxyhydroxypropyléther du dextran réticulé contenant environ 250 mole de groupes amino par gramme aminopolymère dans 3 ml d'eau. On dissout 50 mg de bromure de cyanogène dans 3 ml d'eau et les additionne au gel en agitant; on ajuste le pH à 8 et le maintient à cette valeur pendant 5 min par l'addition d'hydroxyde de sodium 0,5M. Lorsque la réaction est terminée, on lave rapidement le gel avec de l'eau froide et une solution de bicarbonate de sodium 0,114, puis l'utilise immédiatement pour le procédé de liaison. B. Liaison avec la y -globuline (gonadotropine antichorionique). On obtient l'antisérum contre la gonadotropine chorionique humaine à partir de lapins après injection des hormones dans l'adjuvant de Freund .
On préci pite les immunoglobulines par l'addition d'un demi volume de solution saturée de sulfate d'ammonium à la température ordinaire, puis on répète deux fois cette opération. Le dernier précipité obtenu est dissous puis dialysé contre une solution de bicarbonate de sodium 0,1m.
On fait réagir 0,5 ml de solution de gonadotropine antichorionique correspondant à 0,5 ml d'antisérum avec le polymère activé pendant 5 h à 23 C. On lave le produit avec une solution de bicarbonate de sodium 0,1M, une solution de chlorure de sodium 0,5M, de l'eau, de l'acide chlorhydrique 10-4M et de l'eau. Une portion du produit est rétrécie et séchée pour l'analyse et on trouve qu'elle contient environ 3,5 mg de pro téine par gramme de polymère.
On utilise la majeure partie du produit pour la détermination radioimmunologique de la gonadotro- pine chorionique. Le produit présente d'excellentes propriétés de liaison de la gonadotropine chorionique. <I>Exemple 2</I> Fixation de la chymotrypsine à un polyacrylamide substitué par des groupes amino aromatiques. A. Activation du polymère par réaction avec du bromure de cyanogène.
Un polyacrylamide réticulé, substitué par des groupes p-aminophényles, dont les caractères structu raux principaux sont évidents d'après la formule sui vante, a été utilisé. (Enzacryl 9; un produit vendu par The United Kingdom company Koch-Light Laborato- ries Ltd., Colmbrook, Buckingham Shire)
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Pour activer le polymère, on a ajouté à 100 mg de ce dernier 4 ml d'une solution de bromure de cyano gène contenant 25 mg de bromure de cyanogène par ml d'eau, après quoi on a effectué le processus d'acti vation à un pH de 9,
0 pendant 6 min à la température ordinaire. On a lavé le gel activé sur un filtre de verre avec aspiration pendant 5 min avec une solution de bicarbonate de sodium 0,1M.
B. Fixation sur la chymotrypsine.
On a suspendu le gel activé dans 2 ml d'une solu tion de bicarbonate de sodium 0,1M et on a ajouté 25 mg de chymotrypsine. On a laissé la copulation s'effectuer à 4 et sous lente agitation pendant 16 h.
On a lavé le produit obtenu à la température ordi naire dans une petite colonne. Les solutions de lavage ont été fournies à un débit de 8 ml/h grâce à une pompe péristaltique. Les solutions de lavage suivantes ont été utilisées dans l'ordre: solution de bicarbonate de sodium 0,1M (24 h); acide chlorhydrique 10-3M (1h); solution de chlorure de sodium 0,5M (24 h); eau distillée (3 h); tampon à l'acétate de sodium 0,01M die pH 5,4 (1 h). Le produit peut être conservé sous forme de suspension dans le tampon mentionné en dernier lieu.
L'activité enzymatique de ce conjuguat a été déter minée vis-à-vis d'une solution de 15 millimoles d'ester éthylique de la N-acétyl-N-tyrosine dans un milieu aqueux contenant 50/o d'éthanol. Ce substrat a été hydrolysé à la vitesse de 3,5 moles par min par mg de conjuguat séché. La teneur en protéines a été de 105 mg par g de conjugat séché. L'activité de l'enzyme fixé a donc été d'environ 35 mmoles par min par mg.
L'activité de la chymotrypsine libre était de 180 moles par min par mg.