Procédé de production de 7-chloro-6-déméthyltétracycline
La présente invention est relative à un procédé per fectionné pour la production de 7-chlor*6déméthyl-té- tracycline. Elle concerne, plus particulièrement, la production sélective de 7-chloro6-déméthyltétracycline par biosynthèse fermentative, en sélectionnant une souche de Streptomyces aureofaciens produisant sélectivement la 7-chloro-6-déméthyltétracycline et apte à conférer à une solution aqueuse diluée (dilution 1:
:200) du moût de récolte entier une coloration caractérisée par une courbe de réflectance telle que, lorsqu'on relève linéairement le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre 460 mu et 530 mu présente un point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et qu'elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de ce point d'inflexion.
L'antibiotique qu'est la 7-chloro-6-déméthyltracycline a été pour la première fois décrit et revendiqué dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 878 289, qui décrit aussi des procédés pour la production de cet antibiotique. Dans ce brevet on décrit un procédé au moyen duquel on cultive une souche de S.
aureofaciens productrice de 7-chloro-6-déméthyltétracycline dans un milieu de fermentation. Ce brevet précise aussi que d'autres tétracyclines, telles que la 6-déméthyltétracycline, la 7-chlorotétracycline et la tétracycline sont obtenues en même temps, dans un milieu de fermentation, lorsque les conditions de fermentation, y compris le microorganisme indiqué dans ce brevet, sont utilisées. Ce brevet indique, en outre, qu'il se peut qu'on obtienne de la 7-bromo-6-déméthyltétracycline comme produit concomitant lorsque le milieu de fermentation contient du brome.
Par ailleurs, la production de plus d'une tétracycline dans un milieu de fermentation dans lequel peut être produite de la déméthylchlortétracycline est également révélée dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 028 311, ainsi que dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 061 522, dans lequel on décrit la preésence d'inhibiteurs dits de 6-méthylation dans un milieu de fermentation dans lequel on utilise une souche de S. aureofaciens productrice de 7-chlortétracycline.
D'autres procédés pour la production de 7-chloro6-déméthy-tétracycline par culture de souches de S.
aureofaciens productrices de 7-chlortetracycline en présence d'inhibiteurs de 6-méthylation sont donnés dans les brevets des Etats-Unis d'Amérique Nos 3 019 172 et 3 127 328. Ces procédés se heurtent également au problème de la formation concomitante d'autre tétracyclines. Ainsi, dans chacun de ces procédés, un mélange de 7-chlortétracycline, tétracycline, 7-chloro6-déméthyltétracycline et 6-déméthyltétracycline, est produit.
La production concomitante de 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) est répréhensible lorsque la 7-chloro-6-déméthyltétracycline est le produit principal recherché. Bien que la 7-chloro-6-déméthyltétracycline de qualité pharmaceutique puisse contenir de petites quantités de 6-déméthyltétracycline, la présence d'une quantité substantielle de 6-déméthyltétracycline est répréhensible. La présence de 6-déméthyltétracycline (ou d'autre tétracyclines) dans le même moût de fermentation en quantités notables pose également des problèmes difficiles de séparation, au cours des traitements de raffinage ou d'extraction, lorsqu'on désire obtenir de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline. Il est évidemment possible d'extraire les antibiotiques du moût de fermentation et de les séparer par des procédés de raffinage sélectifs.
Cependant, les procédés de raffinage pour séparer les antibiotiques sont difficiles et impliquent habituellement une certaine perte de l'activité antibiotique totale. Au surplus, dans les cas où la 7-chloro-6-déméthyltétracycline est le principal produit de la fermentation, la 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines3 est indésirable et est ordinairement extraite et jetée. C'est pourquoi un procédé permettant la production accrue de 7-chloro-6-déméthyltétracycline et une production concomitante moindre de 6-déméthyltétracycline (ou d'autres tétracyclines) constitue un progrès notable dans la technique de l'obtention d'antibiotiques par fermentation.
On a découvert à présent, non sans surprise, que certaines souches mutantes nouvelles et originales de
Streptomyces aureofaciens produisent, dans un milieu de fermentation classique, de la 7-chloro-6aéméthylté- tracycline comme produit concomitant. Par ailleurs, il n'y a pas de production discernable de tétracycline ou de 7-chlorotétracycline avec les souches sélectionnées selon le critère de la courbe de réflectance déjà mentionné. Le sélection de telles souches obvie à la nécessité de procédés coûteux et difficiles d'extraction et de purification, étant donné que les cristaux de 7-chloro6-déméthyltracycline obtenus sont de qualité pharmaceutique.
Les souches produisant sélectivement la 7-chlorodéméthyltétracycline sont des souches de l'espèce Streptomyces aureofaciens. Les souches S. aureofaciens repésentatives décrites ci-dessous sont des descendantes directes de la souche de S. aureofaciens productrice de 7-chlorotétracycline isolée du sol A-377 décrite dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2482055 et déposée aux Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, Etats-Unis d'Amerique, et répertorié sous le No NRRL 2209. Elles ont été obtenues par des procédés mutagéniques connus dans la technique, par exemple par irradiation au moyen de rayons ultraviolets, par traitement avec de la nicotine ou par traitement avec des moutardes azotées.
Des souches mutantes typiques de S. aureofaciens qui possèdent les propriétés spéciales décrites dans le présent mémoire ont été désignées par les symboles IE-2322 et IE-2750 et déposées aux Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, Etats=Unis d'Amérique, sous les
No NRRL 3204 et 3234.
On comprendra, bien entendu, que des mutantes additionnelles possédant cette propriété spéciale de conférer une teinte déterminée à leurs moûts de récolte entiers peuvent être dérivées de ces souches par les procédés classiques. Ces mutantes peuvent varier quelque peu quant à leurs caractéristiques morphologiques et physiologiques générales, comme les diverses souches de l'espèce S. aureofaciens. Ainsi, la souche No
IE-2750 a été dérivée de la souche No IE-2322 en utilisant des méthodes bien connues dans la technique, par exemple celle consistant à sélectionner des mutantes qui se trouvent dans la nature et celle ayant consisté à sélectionner des mutantes qui se sont présentées à la suite d'un traitement délibéré par le mutagène chimique, la moutarde azotée ou les rayons ultra-violets.
Ces méthodes sont décrites, notamment, dans le texte intitulé Induced Mutagenesis in Selection of Microorganisms (La mutagénèse provoquée dans la sélection des microorganismes) par S.I. Alikhanian, pages 1-50 incl.
de Progress in Applied Microbiology (Progrès de la microbiologie appliquée), Vol. 4 (1962), Academic
Press, New York et Londres. On peut également s'attendre à ce que des souches de S. aureofaciens produisant sélectivement la 7-chloro-6-déméthyltétracycline puissent être trouvées dans la nature, ou être dérivées de souches présentement isolées de S. aureofaciens par des procédés mutagéniques bien connus dans la tech- nique.
Les souches à production sélective présentent les caractéristiques taxonomiques de l'espèce S. aureofa- ci ens et peuvent être aisément identifiées comme appartenant à cette espèce, bien qu'elles diffèrent des souches de S. aureofaciens décrites jusqu'ici, non seulement par la pigmentation sur des milieux solides, mais également par les teintes des moûts de récolte entiers obtenus à partir de ces souches.
Les souches qui sont aptes à produire de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline dans les milieux classiques peuvent être divisées en 3 catégories: 1) souches de S. aureofaciens ATCC 12551, 12552, 12 553, et 12 554 décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 878 289 et produisant diverses quantités de 7-chloro-6-déméthyltétracycline, 6-déméthyltétracycline, tétracycline et 7-chlorotétracycline; 2) souches de S. aureofaciens V-138, E-475, E-1311, ED1723, ED-2047 et ED-2314 décrites dans les brevets énumérés ci-après:
souche V-138 dans les brevets des
Etats-Unis d'Amérique No 3 037 916, souches E-475,
E-1311, ED-1723 et ED-2047 dans le brevet des
Etats-Unis d'Amérique No 3 050 446, souche ED-2314 dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique No 3 145 154 et qui produisent diverses quantités de 7-chloro-6-déméthyltétracycline et de 6-déméthyltétracycline virtuellement à l'exclusion de tétracyclines méthylées; et 3) souches -selectionnées suivant le critère déjà décrit, par exemple IE-2322 et IE-2750, qui produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline virtuellement à l'exclusion de toutes autres tétracyclines.
Les souches produisant sélectivement la 7-chloro6-déméthyltétracycline, représentées par exemple par les souches Nos IE-2322 et lE-2750, peuvent se distinguer des deux groupes de souches de la technique antérieure par une interprétation mathématique des courbes de réflectance spectrophotométrique de leurs moûts de récolte entiers respectifs.
Plus précisément, lorsque le pourcentage de réflectance d'échantillons dilués (échantillons aqueux à 1:200) des moûts de récolte entiers d'un bon rendement (tels que ceux des exemples donnés plus loin) desdites souches est mesuré à des longueurs d'ondes déterminées (460 m,u, 540 m,u, 560 mu et 660 m et lorsqu'on relève linéairement le pourcentage de réflectance en fonction de la longueur d'onde, la courbe résultante entre 460 mu et 530 mu présente un point d'inflexion et a au moins un point de pente nulle et elle est convexe vers le haut à gauche du point d'inflexion et concave vers le haut à droite de ce point d'inflexion.
Par exemple, la courbe résultante pour la souche type IE-2322, représentée par la fig. 1 1 des des sins, présente un maximum entre 460 mu et 520 m, (approximativement au point 500 m,u), ce maximum étant un point de pente nulle, a un point d'inflexion à environ 510 m, et a un minimum à approximativement 520 m,u, ce minimum étant un point de pente nulle. Par ailleurs, les souches de cette classe produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline sensiblement à l'exclusion de 6-déméthyltétracycline.
Les fig. 1 à 12 des dessins ci-annexés montrent des courbes de réflectance spectrophotométrique de cellules en verre de 1 cm remplies d'un échantillon dilué (1:200) de moût de récolte entier prélevé dans le bouillon de fermentation des souches produisant sélectivement la 7-chloro-6-déméthyltétracycline, de même que des dix souches connues déjà décrites, indiquées dans le tableau I. La courbe de réflectance spectrophotométrique d'une matière constitue un enregistrement permanent qui n'exige pas la conservation d'un échantillon. Au surplus, les unités qui expriment la courbe sont internationalement admises et acceptées, comme moyen pour mesurer la lumière. Dans les fig. 1 à 12, la longueur d'onde de la lumière en millicrons est donnée en abscisse, tandis que la réflectance en pourcent est donnée en ordonnée.
La longueur d'onde de la lumière a été adoptée internationalement comme étalon fondamental de longueur, auquel tous les autres étalons de longueur se réfèrent. Ces courbes de réflectance spectrophotométrique ont été déterminées à l'aide d'un spectrophotomètre à enregistrement connu sous la dénomination de General Electric Hardy Recording
Spectrophotometer (General Electric Company, Schenectady, N. Y., USA), l'échantillon étant appliqué sur de l'oxyde de magnésium, l'étalon de référence étant constitué par de l'oxyde de magnésium et la composante spéculaire étant exclue. Les courbes sont enregistrées sur du papier General Electric Co. Chart paper NP 62581 .
En ce qui concerne la détermination spectrophotométrique précitée, on notera que la dilution du moût de récolte entier est nécessaire pour obtenir les résultats indiqués.
Un moût de récolte entier est un moût non traité obtenu lorsqu'une fermentation utilisant le milieu suivant:
Amidon 45 grammes
CaCO8 10,5 grammes
NH4Cl 1,5 gramme
Farine de graines de coton 45 grammes
Levure 1,5 gramme
Eau q. s. ad 1000 ml
Huile de lard 3 O/o (vol./vol.
de milieu) a progressé jusqu'au moment où la biosynthèse de l'antibiotique primaire s'est arrêtée en pratique. En général, dans les conditions indiquées plus loin, l'activité antibiotique du moût de fermentation, telle qu'on peut la déterminer de manière classique, cesse d'augmenter dans une mesure appréciable lorsque la fermentation a duré pendant environ 140 à environ 160 heures. Il est concevable, toutefois, que dans des conditions légèrement différentes l'activité antibiotique maximum peut être atteinte après des durées un peu plus longues ou plus courtes.
Les souches de S. aureofaciens qui ne produisent virtuellement aucune autre tétracycline que la 7-chloro6-déméthyltétracycline possèdent les mêmes caractéristiques morphologiques que les souches qui produisent, de manière concomitante, de la 7-chlortétracycline, de la tétracycline, de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline et de la 6-déméthyltétracycline et les souches qui produisent de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline et une proportion substantielle de 6-déméthyltétracycline, et elles diffèrent entre elles de la même manière générale que les souches connues diffèrent l'une de l'autre, comme cela a été décrit dans un certain nombre d'articles scientifiques publiés.
Les données qui figurent dans les tableaux suivants peuvent servir à une distinction accessoire des souches mutantes nouvelles et originales de
S. aureofaciens, décrites ci-après, de la souche A-377 originelle que l'on peut se procurer sous le
No NRRL 2209, et de la souche de McCormick et al.
ATCC No 12 551 (S-604). Dans les observations suivantes de la coloration d'une série de milieux, les données de coloration de la souche S-604 (ATCC 12 551) ont été reproduites d'après le Brevet des Etats-Unis d'Amérique No 2 878 289.
Pour illustrer les variations visuelles de couleur que l'on rencontre avec les souches mutantes nouvelles et originales de S. aureofaciens, on a fait pousser ces souches sur de l'agar AP4 et on a fait les observations suivantes:
Observations de couleur: t S. aureofaciens: ** Agar AP4:
six jours Incubation à 26,5 C
Souche Colonies simples
Colonie principale Colonie secondaire Croissance en masse
Type I Type II 1E-2322 7pl (rouge bleuâtre) t à 8pn (brun rougeâtre 7pl (rouge bleuâtre) i à
7nl (brun-rose foncé) t et grisâtre foncé) t 7nl (brun-rose foncé) lE-2750 5pn (brun chocolat) t 8pn (brun rougeâtre 61/2 ni (brun-rose) t
et grisâtre foncé) t I Les teintes précitées, ainsi que celles dont il est question dans la suite du présent mémoire (lorsqu'elles sont désignées 1), sont celles
du ColorHarmonyManual , 3e édition,
Container Corporation of America (Editeur).
* Le symbole-code est la seule désignation, aucun nom de couleur attribué ne figurant dans le zColor Harmony Manuel,.
** Composition de l'Agar AP4
Saccharose 1,0 gramme
MgSO4. 7H20 0,025 gramme
KH2PO4 0,2 gramme (NH4)2HPO4 0,2 gramme
Liqueur de macération de maïs 0,4 gramme
Agar Bacto 2,0 gramme
Eau, q. s. 100,0 millilitres
pH après stérilisation = 6,3
Les nouvelles souches de S. aureofaciens citées comme exemples se différencient en outre de la souche comparative S. aureofaciens A-377 (NRRL 2209) par observation des caractéristiques de croissance sur divers milieux incubés à 26,50 C jusqu'à maturité.
(1) Agar avec Glycérol,
Asparagine et Extrait de boeuf
Glycérol 1,0 gramme
L-asparagine 0,05 gramme Agar Bacto 1,5 gramme
Extrait de boeuf 0,2 gramme Eau distillée, q. s. 100 millilitres
KH2KO4 0,05 gramme Réglage du pH à 7,0 avec KOH en solution à 50 oxo.
pH apres stérilisation = 7,1.
Streptomyces aureofaciens
Souche lE-2750 Souche 1E-2322
Croissance modérée, 3pn (brun-jaune- modérée, 5nl * (chocolat) t
rouge jaunâtre foncé) t à à 6 t/2 ni (brun-rose)
6pl (brun rougeâtre sombre)Ú
Hyphes aériens minces à moyens, blanc abondants, blanc devenant
5dc (gris rosâtre) t
Sporulation nulle incomplète
Pigment diffusible roux devenant ambre ambre foncé
Envers 3pn (brun-jaune-rouge 5pl (brun sombre)' à
jaunâtre foncé) l à 6 t/2 ni (brun-rose)'
6pl (brun rougeâtre sombre) i
Souche S-604 ** Souche A-377 **
Croissance abondante,
6pi (brun- moyenne
jaune-rouge rougeâtre) l
Hyphes aériens abondants, blanc à rose-gris blanc, uniforme
Sporulation faible devenant abondante nulle
Pigment diffusible brun rougeâtre jaune
Envers 6pi (brun rougeâtre) l jaune à jaune orange clair
* Couleurs selon le zColor Harmony Manuel , 3e édition, Container Corp. of America; pas de nom de couleur attribué.
** à titre comparatif
(2) Agar avec Dextrine (Czapex-Dox) KCl 0,05 gramme
Dextrine 1,0 gramme FeSO4 . 7H2O 0,001 gramme
NaNO3 0,2 gramme Agar Bacto 1,5 gramme
K2HPO4 0,1 gramme Eau distillée, q. s. 100 millilitres
MgSO4.
7H2O 0,05 gramme pH après stérilisation = 7,2
Streptomyces aureofaciens
Souche lE-2750 Souche 1E-2322
Croissance confluente, mince, confluente, mince,
transparente, incolore transparente, incolore
Hyphes aériens nuls nuls
Sporulation nulle nulle
Pigment diffusible nul nul
Envers translucide translucide
Souche S-604 * Souche A-377 *
Croissance clairsemée, hyaline profuse
Hyphes aériens nuls abondants, gris plomb,
globules superficiels
d'un blanc aqueux
Sporulation nulle abondante
Pigment diffusible nul léger, jaune pâle
Envers non pigmentaire non pigmentaire * à titre comparatif
(3) Agar AP4 (tel que décrit plus haut)
Streptomyces aureofaciens
Souche 1E-275Q Souche 1E-2322
Croissance abondante à profuse, 8pl profuse,
7pl (rouge bleuâtre) t à
(brun-gris rougeâtre foncé)' 7nl (brun-rose foncé)'
à 8pn (brun rougeâtre et grisâtre foncé) t
Hyphes aériens minces à modérés, modérés, 5dc (gris rosâtre) t à
5dc (gris rosâtre)' Sfe (gris brunâtre clair)'
Sporulation mince à modérée moyenne
Pigment diffusible brun rougeâtre à brun-rouge sombre
brun rougeâtre sombre
Envers 8pl (brun-gris rougeâtre 7pl (rouge bleuâtre) t à
foncé) l à 8pn (brun rougeâtre 7nl (brun-rose foncé)'
et grisâtre foncé)'
Souche S.604* Souche A-377 *
Croissance profuse profuse
Hyphes aériens abondants, 71i (brun-rouge abondants,
41i (brun-jaune
grisâtre) t grisâtre foncé) t
Sporulation très abondante, uniforme très abondante, uniforme
Pigment diffusible très conçentré, Spl (brun jaune verdâtre clair
sombre) 1à 6pl (brun
rougeâtre sombre)'
Envers 6pn (brun rougeâtre foncé)' 2n1 (brun olive) t * à titre comparatif
(4) Agar Q4 avec liqueur de macération de maïs (NH4)2HPO4 2 grammes
(Liqueur de macération de maïs) 9 grammes KH2PO4 4 grammes
Saccharose 10 grammes Agar brut 30 grammes
MgSO4. 7HaO 0,25 gramme Eau, q. s.
1000 millilitres
pH après stérilisation = 6,5
Streptomyces aureofaciens
Souche lE-27S0 Souche 1E-2322
Croissance abondante, 8pl (brun-gris abondante, 7pl (rouge bleuâtre) t à
rougeâtre foncé) t à 7nl (brun-rose foncé)Ú
8pn (brun rougeâtre et
grisâtre foncé) t
Souche lE-2750 Souche IE-2322
Hyphes aériens moyens à modérés, minces,
5fe
Sdc (gris rosâtre) t à (gris brunâtre clair)'
Sfe (gris brunâtre clair)'
Sporulation mince à moyenne rare
Pigment diffusible spl (brun-gris 7pl (rouge bleuâtre) t à
rougeâtre foncé)Ú 7nl (brun-rose foncé)'
Envers 8pn (brun rougeâtre et 7pl (rouge bleuâtre) t à
grisâtre foncé)Ú 7nl (brun-rose foncé)'
Souche S-604 * Souche A-377 *
Croissance profuse, 7pl excellente, jaune pâle
(rouge bleuâtre)'
Hyphes aériens profus, Snl (chocolat)' profus,
2pn
(brun foncé)'
Sporulation profuse profuse
Pigment diffusible 7pl (rouge bleuâtre)' brun-orange
Envers 7pl (rouge bleuâtre) l orange à jaune-orange * à titre comparatif
(5) Autres milieux d'Agar
Milieu Streptomyces aureofaciens
Souche lE-2750 Souche 1E-2322
Agar nutritif croissance confluente faible à croissance mince;
moyenne; 6pn (brun rougeâtre foncé) t. Spn (brun chocolat) l.
Absence d'hyphes aériens. Pigment Absence d'hyphes aériens.
diffusible roux teinté de brun Pigment soluble violacé clair.
rougeâtre. Envers: 6pn Envers: 5pn (brun chocolat) t.
(brun rougeâtre foncé)'.
Agar avec glucose, croissance bonne à abondante, croissance abondante; asparagine, 5pi (brun rougeâtre et jaunâtre) l à 5pl (brun sombre)Ú.
extrait de viande 6pi (brun rougeâtre)Ú. Hyphes aériens abondants; blancs
Hyphes aériens abondants devenant 5fe (gris brunâtre clair)Ú.
uniformément 5dc (gns rosâtre)'. Sporulation abondante.
Sporulation abondante. Pigment soluble jaune sombre.
Pigment diffusible jaune-roux clair Envers: 5pl (brun sombre)'.
devenant ambre. Envers: Spi
(brun rougeâtre et jaunâtre)' à
6pi (brun rougeâtre) l devenant
6pn (brun rougeâtre foncé) t.
Lait pourpre collet de croissance prononcée, collet de croissance prononcée;
51i (brun rougeâtre et grisâtre)' à 51i (brun rougeâtre ea grisâtre)' à
7nl (brun rose foncé)'. 6 1/2 ni (brun rose) t.
Changement de pH peu sensible. Changement de pH peu sensible.
Fausse réaction colorée alcaline Fausse réaction colorée alcaline
due à la diffusion du pigment. due à la diffusion du pigment.
pH 6,75 à 2 semaines pH 6,75 à 2 semaines
Cultures inclinées croissance crénelée abondante et croissance crénelée sur pommes de terre humide, 4gl (brun-jaune rougeâtre)' abondante et humide;
clair à 5pi (brun rougeâtre et 4pg (orange-brun foncé)' devenant *
jaunâtre devenant lOpo 7po à lOpo (noir violacé)'.
(noir violacé)'. Pigment soluble
Tendance à former des zones denses 6ig (brun rouge grisâtre clair)Ú.
et blanches d'hyphes aériens à Absence d'hyphes aériens.
foyers distincts. Pigment diffusible:
5ig (brun-rouge grisâtre clair)' à
51i (brun rougeâtre et grisâtre)'.
* Le symbole-code est la seule désignation, aucun nom de couleur attribué ne figurant dans le zColor Harmony Manual > .
Milieu Streptomyces aureofaciens
Souche S-604 * Souche A-377 *
Agar nutritif 51i (brun rougeâtre et grisâtre) 1 à croissance assez bonne.
Croissance médiocre. Absence d'hyphes aériens.
2pn (brun foncé) t. Absence Envers: jaune pâle. Pigment soluble
d'hyphes aériens. Envers: jaune à jaune brunâtre clair.
2pn (brun rougeâtre et grisâtre) l.
Pigment soluble brun rougeâtre.
Agar avec glucose, croissance abondante. croissance assez bonne.
asparagine, Hyphes aériens prononcés, marbres. Hyphes aériens blancs devenant de
extrait de viande 5ig (brun-rouge grisâtre clair) i à plus en plus gris à mesure qu'aug
4ig (brun-jaune rougeâtre) t à mente la formation de spores.
3ge (brun-jaune grisâtre clair)Ú. Envers: jaune clair.
Sporulation: abondante. Envers: 2pn Pigment soluble jaune clair.
(brun rougeâtre et grisâtre)'.
Pigment soluble brun rougeâtre.
Lait pourpre léger collet de croissance léger collet de croissance blanc
6 '/2 pl (brun-rouge rougeâtre sombre)'. à jaune pâle. Pas de changement
Pas de changement notable du PH, notable du pH, ni de peptonisation
ni de peptonisation apparente. apparente en 15 jours.
Légère fausse réaction colorée alcaline
due à la diffusion du pigment soluble.
Cultures inclinées croissance noduleuse lisse, croissance noduleuse lisse,
sur pommes de terre humide et abondante; humide et abondante;
6pn (brun rougeâtre foncé) l 3ea (jaune orange pâle) t à
avec traces de 5gc 71e (rouge grisâtre) t.
(brun orange rougeâtre et grisâtre)'. Traces d'hyphes aériens.
Hyphes aériens: nuls à abondants Pas de pigment soluble.
devenant blancs à 3ge
(brun-jaune grisâtre clair)'.
Sporulation abondante dans les
zones d'hyphes aériens denses.
Pigment soluble 5nl (chocolat) t à
5pn (brun chocolat) t.
* à titre comparatif
(6) Observations microscopiques
S. aureofaciens Agar avec Glucose, Agar Q4
Asparagine et Extrait de boeuf
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
îE-2322 Spores Diamètre 0,8 à 1,2 . Diamètre 0,8 à 1,2 z.
Sphériques à ovoïdaux. Sphériques à ovoïdaux.
Diamètre 0,8 à 1,5 u. Diamètre 0,8 à 1,5 u
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
îE-2750 Spores Diamètre 0,8 à 1,2,u. Diamètre 0,8 à 1,2 tL-
Sphériques à ovoïdaux. Sphériques à ovoïdaux.
Diamètre 0,8 à 1,5,u. Diamètre 0,8 à 1,5 .
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
S-604 * Spores Diamètre 0,8 à 1,0 u. Diamètre 0,8 à 1,2 u
Sphéroïdaux à ovoidaux. Sphéroïdaux à ovoïdaux.
Diamètre 1,5 à 2,0 u Diamètre 1,5 à 2,0 .
S. aureofaciens Agar avec Glucose, Agar Q4
Asparagine et Extrait de boeuf
Souche Mycélium Flexueux, continu, ramifié. Flexueux, continu, ramifié.
Diamètre 0,7 à 1,0 . Diamètre 0,8 à 1,2 u
A-377 * Spores Sphéroïdaux à ovoïdaux. Sphéroïdaux à ovoïdaux
Diamètre 1,5 à 2,0 jet. Diamètre 1,5 à 2,0 y.
* àtitrecomparatif
La morphologie des mycélia et des spores, comme on la voit au microscope ordinaire, est apparemment semblable pour les souches 1E 2322 et 1E-2750 comme pour les souches comparatives A-377 et S-604.
Cependant, les diamètres du Mycélium typique et des spores des premières souches paraissent, de manière caractéristique, plus petits que ceux des souches mentionnées en dernier lieu. Toutes les souches présentent un mycélium continu, flexueux et ramifié avec une tendance occasionnelle des hyphes aériens à présenter des crochets ou des boucles ou à former des spirales libres primitives telles que celles qui sont typiques de l'espèce
S. aureofaciens.
Les conditions de la fermentation sont généralement les mêmes que pour les procédés de production de chlortétracycline par fermentation connus actuellement.
Ainsi, le milieu de fermentation contient les sources assimilables usuelles de carbone, d'azote et de sels minéraux. Des substances nutritives appropriées sont l'amidon, le dextrose, le suçre de canne, le glucose, les mélasses, la farine de soja, le lait en poudre, la levure, les extraits de viande, la peptone, l'urée, la liqueur de macération de maïs (cornsteep)i, la farine de graines de coton, les produits solubles de distillation, les huiles glycéridiques, la farine de poisson et d'autres substances classiques. Les sels minéraux comprennent, par exemple, le carbonate de calcium, le sulfate d'ammonium, le chlorure d'ammonium et les sels de divers oligo-éléments, tels que le manganèse, le cobalt, le zinc, le cuivre, le fer, etc.
Les autres conditions générales de la fermentation, telles la concentration des ions d'hydrogènes, la température, la durée, le degré d'aération, la préparation de l'inoculum, la stérilisation, l'inoculation, etc., sont classiques et peuvent être semblables à celles prévues pour la production de 7-chloro-6-déméthyltétracycline décrites dans le brevet des Etats-Unis d'Amérique
No 2.878.289.
La récupération de la 7-chloro-6-déméthyltétracycline de la liqueur de fermentation se fait de la manière habituelle et n'a pas besoin d'être décrite, car de nombreux procédés permettant de récupérer ce produit des liqueurs de fermentation ont déjà été publiés.
L'invention sera décrite d'une manière plus détaillée dans l'exemple particulier suivant:
Exemple
On a préparé un milieu de fermentation contenant les ingrédients suivants:
Amidon 45 grammes
CaCOs 10,5 grammes
NH4Cl 1,5 gramme
Farine de graines de Cotorl 45 grammes
Levure 1,5 gramme q. s. ad 1000 milllXitress
Ce milieu a été réparti, en quantités appropriées, dans des flacons contenant 3 o/o (vol./vol. du milieu) çlthuile de saindoux, après quoi on stérilisé le contenu de ees flacons, Ces flacons ont ensuite été divisés en 12 groupes contenant environ le même nombre de flacons.
Chaque groupe a été ensuite inoculé à l'aide d'un inoculum végétai d'un des souches suivantes de S. aureo faciens.
5-609* (ATCC 12.551)
S-1071 * (ATCC 12.552)
V-62 * (ATCC 12.553)
B-740 * (ATCC 12.554)
V-138 *
E-475 * S1311 *
ED-1723 g ED-2047*
ED-2314 *
IE-2322
IE-2750
* à titre comparatif
Tous les flacons ont ensuite été incubés sur un agitateur rotatif animé d'un mouvement circulaire de 6,25 cm à 185-200 tours par minute à 25 C pendant 180 heures. Des échantillons ont été prélevés, dilués avec 199 parties d'eau et les courbes de réflectance ont été déterminées de la manière décrite plus haut. Les résultats sont indiqués dans les fig. 1 à 12. Les résultats des essais effectués sur les échantillons de moûts de récolte sont indiqués dans le tableau I donné plus loin.
Ces essais ont été effectués en utilisant les procédés suivants:
Essai No 1:
Cet essai est basé sur la différence qui existe entre les vitesse de transformation de la 7-chloro-6-déméthyl- tétracycline et de la 6-déméthyltétracycline en leurs formes anhydro respectives, par une réaction de pre mier ordre catalysée par un acide. Le degré de transfor mation en forme anhydro dépend de la durée, de la température et de la concentration de l'acide produisant une réaction qui donne lieu à une diminution d'absorbance à 368 mu et une augmentation d'absorbance à 440 nec.
Essai No 2:
Cet essai est basé sur le même principe essentiel que l'essai No 1, si ce n'est que dans ce cas l'échantillon est traité avec un acide afin de dégrader toutes les tétracy dindes présentes, pour les transformer en forme anhydro dans un cas, en comparaison d'un échantillon traité à l'eau dans le second cas.
Essai No 3:
Les valeurs énumérées dans cette colonne ont été déterminées par un procédé classique de chromatographie sur papier, en utilisant le système phosphate de sodium/acétate de n-butyle 0,3M donnant un Rf de 0,30 pour la 6-déméthyltétracycline. Trois systèmes similaires, publiés dans le Journal of the American Chemical Society, Vol. 79, pp. 4561-4563 (1957) (McCormick et al.), sont indiqués ci-après.
Gdéméthyl-
tétracycline
Système Rf
Phosphate de sodium 0,3 M/n-butanol (pH 3,0) 0,30
Tampon Mac Ilvaine/acétate d'éthyle (pH 4,7) 0,27 0,3 N H3PO4, 0,1 /o CC13COOH 9:1
CHCl3-n-butanol 0,22
Dans ce tableau I, le pourcentage de 6-déméthyltétracycline (colonne 4) des quatre premières souches comparatives (S-604, S-1071, V-62 et B-740) a été déterminé en cherchant la quantité de 6-déméthyltétracycline par chromatographie sur papier (colonne 3) et en divisant ce chiffre par la quantité totale de déméthyltétracyclines déterminée par analyse spectrophotométrique (colonne 1) et par analyse chromatographique (colonne 3).
Le pourcentage de 6-déméthyltétracycline (colonne 4) produit par le restant des souches est déterminé en divisant l'analyse chromatographique (colonne 3) par l'analyse spectrophotométrique des tétracyclines totales (colonne 2).
Tableau I
Essai
No. 1 No. 2 No. 3
S. aureofaciens DMCTC Tétra- DMTC y/ml 'lo DMTC
Souche No. y/ml cyclines Chromato
totales gramme
y/ml quantitatif
sur papier
S-604 ** 1193 2037 110 8,4 S-1071 ** 876 2428 138 13,1
V-62 ** 1177 2255 573 32,7
B-740 ** 1042 2553 380 26,7
V-138 ** 960 1817 645 35,5
E-475 ** 2348 3601 847 23,5
E-1311 ** 3186 4263 820 19,2
ED-1723 ** 1961 3304 1320 39,9
ED-2047 ** 4726 6316 1775 28,1
ED-2314 ** 4946 6650 1100 16,5 1E-2322 3281 3197 pas dé- 0
tectée * lE-2750 3451 3566 pas dé- 0
tectée *
* Pas de 6-déméthyltétracycline trouvée au taux le plus faible détectable de 1 y/ml.
** à titre comparatif.
Process for the production of 7-chloro-6-demethyltetracycline
The present invention relates to an improved process for the production of 7-chlor * 6-demethyl-tetracycline. It relates, more particularly, to the selective production of 7-chloro6-demethyltetracycline by fermentative biosynthesis, by selecting a strain of Streptomyces aureofaciens which selectively produces 7-chloro-6-demethyltetracycline and capable of imparting to a dilute aqueous solution (dilution 1:
: 200) of the whole harvest must a coloration characterized by a reflectance curve such that, when the percentage of reflectance is linearly recorded as a function of the wavelength, the resulting curve between 460 mu and 530 mu has a point d 'inflection and has at least one point of zero slope and that it is convex upward to the left of the inflection point and concave upward to the right of that inflection point.
The antibiotic 7-chloro-6-demethyltracycline was first described and claimed in US Pat. No. 2,878,289, which also describes processes for the production of this antibiotic. This patent describes a process by which a strain of S.
aureofaciens producer of 7-chloro-6-demethyltetracycline in a fermentation medium. This patent also specifies that other tetracyclines, such as 6-demethyltetracycline, 7-chlorotetracycline and tetracycline are obtained at the same time, in a fermentation medium, when the fermentation conditions, including the microorganism indicated in this patent , are used. This patent further states that it is possible to obtain 7-bromo-6-demethyltetracycline as a concomitant product when the fermentation medium contains bromine.
On the other hand, the production of more than one tetracycline in a fermentation medium in which demethylchlortetracycline can be produced is also disclosed in United States Patent No. 3,028,311, as well as in United States Patent No. 3,028,311. United States of America No. 3,061,522, in which the presence of so-called 6-methylation inhibitors is described in a fermentation medium in which a strain of S. aureofaciens producing 7-chlortetracycline is used.
Other methods for the production of 7-chloro6-demethy-tetracycline by culturing strains of S.
aureofaciens producing 7-chlortetracycline in the presence of 6-methylation inhibitors are given in United States Patents Nos. 3,019,172 and 3,127,328. These methods also face the problem of the concomitant formation of other tetracyclines. Thus, in each of these methods, a mixture of 7-chlortetracycline, tetracycline, 7-chloro6-demethyltetracycline and 6-demethyltetracycline is produced.
The concomitant production of 6-demethyltetracycline (or other tetracyclines) is reprehensible when 7-chloro-6-demethyltetracycline is the main product sought. Although pharmaceutical grade 7-chloro-6-demethyltetracycline may contain small amounts of 6-demethyltetracycline, the presence of a substantial amount of 6-demethyltetracycline is objectionable. The presence of 6-demethyltetracycline (or other tetracyclines) in the same fermentation must in significant quantities also poses difficult problems of separation, during the refining or extraction treatments, when it is desired to obtain 7- chloro-6-demethyltetracycline. It is obviously possible to extract the antibiotics from the fermentation must and separate them by selective refining processes.
However, the refining processes to separate the antibiotics are difficult and usually involve some loss of the total antibiotic activity. Moreover, in cases where 7-chloro-6-demethyltetracycline is the main product of fermentation, 6-demethyltetracycline (or other tetracyclines3 is undesirable and is usually extracted and discarded. Therefore, a process allows fermentation increased production of 7-chloro-6-demethyltetracycline and a concomitant decreased production of 6-demethyltetracycline (or other tetracyclines) constitutes a significant advance in the art of obtaining antibiotics by fermentation.
It has now been discovered, not without surprise, that some new and original mutant strains of
Streptomyces aureofaciens produces, in a conventional fermentation medium, 7-chloro-6aemethylteracycline as a concomitant product. Moreover, there is no discernible production of tetracycline or of 7-chlorotetracycline with the strains selected according to the criterion of the reflectance curve already mentioned. The selection of such strains obviates the need for expensive and difficult extraction and purification procedures, since the crystals of 7-chloro6-demethyltracycline obtained are of pharmaceutical grade.
The strains selectively producing 7-chlorodemethyltetracycline are strains of the species Streptomyces aureofaciens. The representative S. aureofaciens strains described below are direct descendants of the 7-chlorotetracycline-producing strain of S. aureofaciens isolated from soil A-377 described in United States Patent No. 2482055 and filed in the Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, USA, and listed under No. NRRL 2209. They were obtained by mutagenic methods known in the art, for example by irradiation with ultraviolet rays, by treatment with nicotine or by treatment with nitrogen mustards.
Mutant strains typical of S. aureofaciens which possess the special properties described herein have been designated by the symbols IE-2322 and IE-2750 and deposited at the Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, United States of America, under the
NRRL 3204 and 3234.
It will, of course, be understood that additional mutants possessing this special property of imparting a definite hue to their whole harvest musts can be derived from these strains by conventional methods. These mutants may vary somewhat in their general morphological and physiological characteristics, like the various strains of the species S. aureofaciens. Thus, the strain No
IE-2750 was derived from strain No. IE-2322 using methods well known in the art, for example that of selecting mutants which occur in nature and that of selecting mutants which have occurred. as a result of deliberate treatment with chemical mutagen, nitrogen mustard or ultra-violet rays.
These methods are described, in particular, in the text entitled Induced Mutagenesis in Selection of Microorganisms by S.I. Alikhanian, pages 1-50 incl.
of Progress in Applied Microbiology, Vol. 4 (1962), Academic
Press, New York and London. It can also be expected that strains of S. aureofaciens selectively producing 7-chloro-6-demethyltetracycline could be found in nature, or be derived from strains presently isolated from S. aureofaciens by mutagenic methods well known in the world. the technique.
The selectively produced strains exhibit the taxonomic characteristics of the species S. aureofaciens and can be readily identified as belonging to this species, although they differ from the strains of S. aureofaciens described so far, not only by the pigmentation on solid media, but also by the colors of the whole harvest musts obtained from these strains.
The strains which are able to produce 7-chloro-6-demethyltetracycline in conventional media can be divided into 3 categories: 1) strains of S. aureofaciens ATCC 12551, 12552, 12,553, and 12,554 described in the patent. USA No. 2,878,289 and producing various amounts of 7-chloro-6-demethyltetracycline, 6-demethyltetracycline, tetracycline and 7-chlorotetracycline; 2) strains of S. aureofaciens V-138, E-475, E-1311, ED1723, ED-2047 and ED-2314 described in the patents listed below:
strain V-138 in the patents of
United States of America No. 3,037,916, strains E-475,
E-1311, ED-1723 and ED-2047 in the patent of
U.S. Patent No. 3,050,446 strain ED-2314 in U.S. Patent No. 3,145,154 and which produce varying amounts of 7-chloro-6-demethyltetracycline and 6-demethyltetracycline virtually at virtually no cost. exclusion of methylated tetracyclines; and 3) strains -selected according to the criteria already described, for example IE-2322 and IE-2750, which produce 7-chloro-6-demethyltetracycline virtually to the exclusion of all other tetracyclines.
The strains selectively producing 7-chloro6-demethyltetracycline, represented for example by the strains Nos IE-2322 and IE-2750, can be distinguished from the two groups of strains of the prior art by a mathematical interpretation of the spectrophotometric reflectance curves of their musts. of respective whole harvest.
Specifically, when the percent reflectance of diluted samples (1: 200 aqueous samples) of good-yielding whole crop musts (such as those in the examples given later) of said strains is measured at wavelengths determined (460 m, u, 540 m, u, 560 mu and 660 m and when the percentage of reflectance is linearly recorded as a function of the wavelength, the resulting curve between 460 mu and 530 mu shows a point of inflection point and has at least one point of zero slope and is convex upward to the left of the inflection point and concave upward to the right of that inflection point.
For example, the resulting curve for the type strain IE-2322, shown in FIG. 1 1 of the sins, has a maximum between 460 mu and 520 m, (approximately at the point 500 m, u), this maximum being a point of zero slope, has an inflection point at about 510 m, and has a minimum at approximately 520 m, u, this minimum being a point of zero slope. Moreover, the strains of this class produce 7-chloro-6-demethyltetracycline substantially to the exclusion of 6-demethyltetracycline.
Figs. 1 to 12 of the accompanying drawings show spectrophotometric reflectance curves of 1 cm glass cells filled with a diluted sample (1: 200) of whole crop wort taken from the fermentation broth of strains selectively producing 7- chloro-6-demethyltetracycline, as well as the ten known strains already described, shown in Table I. The spectrophotometric reflectance curve of a material constitutes a permanent record which does not require the preservation of a sample. Moreover, the units which express the curve are internationally accepted and accepted, as a means of measuring light. In fig. 1 to 12, the wavelength of light in millicrons is given on the abscissa, while the reflectance in percent is given on the ordinate.
The wavelength of light has been adopted internationally as the fundamental standard of length, to which all other standards of length refer. These spectrophotometric reflectance curves were determined using a recording spectrophotometer known under the name of General Electric Hardy Recording
Spectrophotometer (General Electric Company, Schenectady, N. Y., USA), the sample being applied to magnesium oxide, the reference standard being constituted by magnesium oxide and the specular component being excluded. The curves are recorded on General Electric Co. Chart paper NP 62581.
With regard to the above spectrophotometric determination, it will be noted that dilution of the whole harvest must is necessary to obtain the indicated results.
A whole harvest must is an untreated must obtained when a fermentation using the following medium:
Starch 45 grams
CaCO8 10.5 grams
NH4Cl 1.5 grams
Cottonseed flour 45 grams
Yeast 1.5 gram
Water q. s. ad 1000 ml
Bacon oil 3 O / o (vol./vol.
medium) progressed until the time when the biosynthesis of the primary antibiotic stopped in practice. In general, under the conditions given below, the antibiotic activity of the fermentation wort, as can be determined in a conventional manner, ceases to increase to an appreciable extent when the fermentation has lasted for about 140 to about 160 hours. . It is conceivable, however, that under slightly different conditions maximum antibiotic activity can be achieved after somewhat longer or shorter durations.
Strains of S. aureofaciens which produce virtually no tetracycline other than 7-chloro6-demethyltetracycline have the same morphological characteristics as strains which concomitantly produce 7-chlortetracycline, tetracycline, 7-chloro -6-desmethyltetracycline and 6-desmethyltetracycline and strains which produce 7-chloro-6-desmethyltetracycline and a substantial proportion of 6-desmethyltetracycline, and they differ from each other in the same general way that known strains differ from one on the other, as has been described in a number of published scientific articles.
The data in the following tables may be used for an ancillary distinction between new and original mutant strains of
S. aureofaciens, described below, of the original strain A-377 which can be obtained under the
No. NRRL 2209, and the strain of McCormick et al.
ATCC No 12,551 (S-604). In the following observations of the staining of a series of media, the staining data of strain S-604 (ATCC 12,551) was reproduced according to US Pat. No. 2,878,289.
To illustrate the visual variations in color found with the new and original mutant strains of S. aureofaciens, these strains were grown on AP4 agar and the following observations were made:
Color observations: t S. aureofaciens: ** Agar AP4:
six days Incubation at 26.5 C
Strain Simple colonies
Main colony Secondary colony Mass growth
Type I Type II 1E-2322 7pl (bluish red) t to 8pn (reddish brown 7pl (bluish red) i to
7nl (dark pink-brown) t and dark greyish) t 7nl (dark pink-brown) lE-2750 5pn (chocolate brown) t 8pn (reddish brown 61/2 ni (pink-brown) t
and dark grayish) t I The aforementioned shades, as well as those referred to in the remainder of this specification (when they are designated 1), are those
of the ColorHarmonyManual, 3rd edition,
Container Corporation of America (Publisher).
* The symbol-code is the only designation, no assigned color name appearing in the zColor Harmony Manual.
** Composition of Agar AP4
Sucrose 1.0 gram
MgSO4. 7H20 0.025 gram
KH2PO4 0.2 gram (NH4) 2HPO4 0.2 gram
Corn maceration liqueur 0.4 gram
Bacto Agar 2.0 gram
Water, q. s. 100.0 milliliters
pH after sterilization = 6.3
The new strains of S. aureofaciens cited as examples are further differentiated from the comparative strain S. aureofaciens A-377 (NRRL 2209) by observation of the growth characteristics on various media incubated at 26.50 C until maturity.
(1) Agar with Glycerol,
Asparagine and Beef extract
Glycerol 1.0 gram
L-asparagine 0.05 gram Agar Bacto 1.5 gram
Beef extract 0.2 gram Distilled water, q. s. 100 milliliters
0.05 gram KH2KO4 Adjust pH to 7.0 with KOH solution at 50 oxo.
pH after sterilization = 7.1.
Streptomyces aureofaciens
Strain lE-2750 Strain 1E-2322
Moderate growth, 3pn (brown-yellow- moderate, 5nl * (chocolate) t
dark yellowish red) t to 6 t / 2 ni (brown-pink)
6pl (dark reddish brown) Ú
Aerial hyphae thin to medium, abundant white, becoming white
5dc (pinkish gray) t
Incomplete zero sporulation
Diffusible reddish pigment turning amber to dark amber
Reverse 3pn (brown-yellow-red 5pl (dark brown) 'to
dark yellowish) l to 6 t / 2 ni (brown-pink) '
6pl (dark reddish brown) i
Strain S-604 ** Strain A-377 **
Abundant growth,
6ft (brown- medium
reddish yellow-red) l
Abundant aerial hyphae, white to pink-gray-white, uniform
Sporulation weak becoming abundant zero
Yellow reddish-brown diffusible pigment
Reverse 6ft (reddish brown) l yellow to light orange yellow
* Colors according to zColor Harmony Manual, 3rd Edition, Container Corp. of America; no color name assigned.
** for comparison
(2) Agar with Dextrin (Czapex-Dox) KCl 0.05 gram
Dextrin 1.0 gram FeSO4. 7H2O 0.001 gram
NaNO3 0.2 gram Agar Bacto 1.5 gram
K2HPO4 0.1 gram Distilled water, q. s. 100 milliliters
MgSO4.
7H2O 0.05 gram pH after sterilization = 7.2
Streptomyces aureofaciens
Strain lE-2750 Strain 1E-2322
Growth confluent, thin, confluent, thin,
transparent, colorless transparent, colorless
Null aerial hyphae
Zero sporulation
Diffusible pigment zero zero
Translucent translucent reverse
Strain S-604 * Strain A-377 *
Sparse growth, profuse hyaline
Abundant aerial hyphae, lead-gray,
superficial blood cells
watery white
No abundant sporulation
Light zero diffusible pigment, pale yellow
Non-pigmentary non-pigmentary reverse * for comparison
(3) AP4 Agar (as described above)
Streptomyces aureofaciens
Strain 1E-275Q Strain 1E-2322
Growth abundant to profuse, 8pl profuse,
7pl (bluish red) t to
(dark reddish brown-gray) '7nl (dark pink-brown)'
at 8pn (reddish brown and dark grayish) t
Aerial hyphae thin to moderate, moderate, 5dc (pinkish gray) t to
5dc (pinkish gray) 'Sfe (light brownish gray)'
Thin to moderate moderate sporulation
Diffusible pigment reddish-brown to dark red-brown
dark reddish brown
Reverse 8pl (reddish brown-gray 7pl (bluish red) t to
dark) l to 8pn (reddish brown 7nl (dark pink-brown) '
and dark grayish) '
Strain S.604 * Strain A-377 *
Profuse profuse growth
Abundant aerial hyphae, 71i (abundant red-brown,
41i (yellow-brown
grayish) t dark grayish) t
Sporulation very abundant, uniform very abundant, uniform
Very concentrated diffusible pigment, Spl (light greenish yellow brown
dark) 1 to 6pl (brown
dark reddish) '
Reverse 6pn (dark reddish brown) '2n1 (olive brown) t * for comparison
(4) Agar Q4 with corn maceration liquor (NH4) 2HPO4 2 grams
(Corn maceration liquor) 9 grams KH2PO4 4 grams
Sucrose 10 grams Raw Agar 30 grams
MgSO4. 7HaO 0.25 gram Water, q. s.
1000 milliliters
pH after sterilization = 6.5
Streptomyces aureofaciens
Strain lE-27S0 Strain 1E-2322
Growth abundant, 8pl (abundant gray-brown, 7pl (bluish red) t to
dark reddish) t to 7nl (dark pink-brown) Ú
8pn (reddish brown and
dark grayish) t
Strain lE-2750 Strain IE-2322
Aerial hyphae medium to moderate, thin,
5fe
Sdc (pinkish gray) t to (light brownish gray) '
Sfe (light brownish gray) '
Rare thin to medium sporulation
Diffusible pigment spl (brown-gray 7pl (bluish red) t to
dark reddish) Ú 7nl (dark pink-brown) '
Reverse 8pn (reddish brown and 7pl (bluish red) t to
dark grayish) Ú 7nl (dark pink-brown) '
Strain S-604 * Strain A-377 *
Profuse growth, excellent 7pl, pale yellow
(bluish red) '
Profuse aerial hyphae, Snl (chocolate) 'profuse,
2pn
(dark brown)'
Profuse profuse sporulation
Diffusible pigment 7pl (bluish red) 'orange-brown
Reverse 7pl (bluish red) l orange to yellow-orange * for comparison
(5) Other Agar environments
Streptomyces aureofaciens medium
Strain lE-2750 Strain 1E-2322
Nutrient agar weak to thin growth confluent growth;
average; 6pn (dark reddish brown) t. Spn (chocolate brown) l.
Absence of aerial hyphae. Pigment Absence of aerial hyphae.
diffusible reddish tinted brown Soluble light purplish pigment.
reddish. Reverse: 6pn Reverse: 5pn (chocolate brown) t.
(dark reddish brown) '.
Agar with glucose, growth good to abundant, growth abundant; asparagine, 5pi (reddish brown and yellowish) l to 5pl (dark brown) Ú.
meat extract 6ft (reddish brown) Ú. Abundant aerial hyphae; white
Abundant aerial hyphae becoming 5fe (light brownish gray) Ú.
uniformly 5dc (pinkish gns) '. Abundant sporulation.
Abundant sporulation. Dark yellow soluble pigment.
Light reddish-yellow diffusible pigment Reverse: 5pl (dark brown) '.
turning amber. Reverse: Spinnaker
(reddish brown and yellowish) 'to
6ft (reddish brown) l becoming
6pn (dark reddish brown) t.
Milk purple pronounced growth collar, pronounced growth collar;
51i (reddish brown and greyish) 'to 51i (reddish brown ea greyish)' to
7nl (dark pink brown) '. 6 1/2 ni (pink brown) t.
Insensitive pH change. Insensitive pH change.
False alkaline color reaction False alkaline color reaction
due to the diffusion of the pigment. due to the diffusion of the pigment.
pH 6.75 at 2 weeks pH 6.75 at 2 weeks
Sloping crops abundant crenellated growth and crenellated growth on moist potatoes, 4gl (reddish-brown-yellow) 'abundant and moist;
clear at 5ft (reddish brown and 4pg (dark orange-brown) 'becoming *
yellowish becoming 10 "7" to 10 "(purplish black) '.
(purplish black) '. Soluble pigment
Tend to form dense areas 6ig (light greyish reddish brown) Ú.
and white aerial hyphae to Absence of aerial hyphae.
separate homes. Diffusible pigment:
5ig (light greyish red-brown) 'to
51i (reddish brown and greyish) '.
* The code symbol is the only designation, no assigned color name appearing in the zColor Harmony Manual>.
Streptomyces aureofaciens medium
Strain S-604 * Strain A-377 *
Fairly good growing nutrient agar 51i (reddish brown and grayish) 1.
Poor growth. Absence of aerial hyphae.
2pn (dark brown) t. Absence Reverse: pale yellow. Soluble pigment
of aerial hyphae. Reverse: yellow to light brownish yellow.
2pn (reddish brown and grayish) l.
Reddish-brown soluble pigment.
Agar with glucose, abundant growth. fairly good growth.
asparagine, Pronounced aerial hyphae, marbles. White aerial hyphae becoming
meat extract 5ig (light greyish red-brown) i to increasingly gray as aug
4ig (reddish-brown-yellow) prevents spore formation.
3ge (light grayish yellow-brown) Ú. Reverse: light yellow.
Sporulation: abundant. Reverse: 2pn Light yellow soluble pigment.
(reddish brown and grayish) '.
Reddish-brown soluble pigment.
Light purple milk light growth collar white growth collar
6 '/ 2 pl (dark reddish brown-red)'. to pale yellow. No change
No noticeable change in pH, noticeable in pH, or peptonization
nor any apparent peptonization. apparent in 15 days.
Slight false alkaline color reaction
due to the diffusion of the soluble pigment.
Tilted crops smooth nodular growth, smooth nodular growth,
on moist and abundant potatoes; moist and abundant;
6pn (dark reddish brown) l 3ea (pale orange yellow) t to
with traces of 5gc 71st (grayish red) t.
(reddish orange brown and greyish) '. Traces of aerial hyphae.
Aerial hyphae: none to abundant No soluble pigment.
becoming white at 3ge
(light grayish yellow-brown) '.
Abundant sporulation in
areas of dense aerial hyphae.
Soluble pigment 5nl (chocolate) t at
5pn (chocolate brown) t.
* for comparison
(6) Microscopic observations
S. aureofaciens Agar with Glucose, Agar Q4
Asparagine and Beef extract
Strain Mycelium Flexuous, continuous, branched. Flexuous, continuous, branched.
îE-2322 Spores Diameter 0.8 to 1.2. Diameter 0.8 to 1.2 z.
Spherical to ovoid. Spherical to ovoid.
Diameter 0.8 to 1.5 u. Diameter 0.8 to 1.5 u
Strain Mycelium Flexuous, continuous, branched. Flexuous, continuous, branched.
îE-2750 Spores Diameter 0.8 to 1.2, u. Diameter 0.8 to 1.2 tL-
Spherical to ovoid. Spherical to ovoid.
Diameter 0.8 to 1.5, u. Diameter 0.8 to 1.5.
Strain Mycelium Flexuous, continuous, branched. Flexuous, continuous, branched.
S-604 * Spores Diameter 0.8 to 1.0 u. Diameter 0.8 to 1.2 u
Spheroidal to ovoidal. Spheroidal to ovoidal.
Diameter 1.5 to 2.0 u Diameter 1.5 to 2.0.
S. aureofaciens Agar with Glucose, Agar Q4
Asparagine and Beef extract
Strain Mycelium Flexuous, continuous, branched. Flexuous, continuous, branched.
Diameter 0.7 to 1.0. Diameter 0.8 to 1.2 u
A-377 * Spores spheroidal to ovoidal. Spheroidal to ovoidal
Diameter 1.5 to 2.0 jet. Diameter 1.5 to 2.0 y.
* as a comparison
The morphology of mycelia and spores, as seen under an ordinary microscope, is apparently similar for strains 1E 2322 and 1E-2750 as for comparative strains A-377 and S-604.
However, the diameters of the typical mycelium and of the spores of the first strains characteristically appear to be smaller than those of the last mentioned strains. All strains exhibit continuous, flexuous, branching mycelium with an occasional tendency for aerial hyphae to exhibit hooks or loops or to form primitive free spirals such as those typical of the species
S. aureofaciens.
The fermentation conditions are generally the same as for the currently known fermentation processes for chlortetracycline.
Thus, the fermentation medium contains the usual assimilable sources of carbon, nitrogen and mineral salts. Suitable nutrients are starch, dextrose, cane sugar, glucose, molasses, soybean meal, milk powder, yeast, meat extracts, peptone, urea, liquor maceration of corn (cornsteep) i, cottonseed meal, soluble distillation products, glyceridic oils, fish meal and other conventional substances. Mineral salts include, for example, calcium carbonate, ammonium sulfate, ammonium chloride, and salts of various trace elements, such as manganese, cobalt, zinc, copper, iron, etc.
The other general conditions of fermentation, such as concentration of hydrogen ions, temperature, time, degree of aeration, preparation of inoculum, sterilization, inoculation, etc., are conventional and may be similar to those intended for the production of 7-chloro-6-demethyltetracycline described in the patent of the United States of America
No. 2,878,289.
The recovery of 7-chloro-6-demethyltetracycline from the fermentation liquor takes place in the usual way and does not need to be described, since many methods for recovering this product from fermentation liquors have already been published. .
The invention will be described in more detail in the following specific example:
Example
A fermentation medium was prepared containing the following ingredients:
Starch 45 grams
CaCOs 10.5 grams
NH4Cl 1.5 grams
Cotorl seed flour 45 grams
Yeast 1.5 grams q. s. ad 1000 milllXitress
This medium was distributed, in appropriate quantities, into vials containing 3 o / o (vol./vol. Of medium) lard oil, after which the contents of these vials were sterilized. These vials were then divided into 12 groups. containing approximately the same number of vials.
Each group was then inoculated with a vegetable inoculum of one of the following strains of S. aureo faciens.
5-609 * (ATCC 12.551)
S-1071 * (ATCC 12.552)
V-62 * (ATCC 12.553)
B-740 * (ATCC 12.554)
V-138 *
E-475 * S1311 *
ED-1723 g ED-2047 *
ED-2314 *
IE-2322
IE-2750
* for comparison
All vials were then incubated on a rotary shaker with a 6.25 cm circular motion at 185-200 rpm at 25 ° C for 180 hours. Samples were taken, diluted with 199 parts water and reflectance curves were determined as described above. The results are shown in Figs. 1 to 12. The results of the tests carried out on the samples of harvest musts are indicated in Table I given below.
These tests were carried out using the following methods:
Test No 1:
This test is based on the difference between the rates of conversion of 7-chloro-6-demethyl-tetracycline and 6-demethyltetracycline into their respective anhydro forms, by a first order reaction catalyzed by an acid. The degree of conversion to the anhydro form depends on the time, temperature and concentration of the acid producing a reaction which results in a decrease in absorbance to 368 mu and an increase in absorbance to 440 nec.
Test No 2:
This test is based on the same essential principle as test No 1, except that in this case the sample is treated with an acid in order to degrade all the tetracy turkeys present, to transform them into anhydro form in a case, in comparison with a sample treated with water in the second case.
Test No 3:
The values listed in this column were determined by a conventional paper chromatography method, using the 0.3M sodium phosphate / n-butyl acetate system giving an Rf of 0.30 for 6-demethyltetracycline. Three similar systems, published in the Journal of the American Chemical Society, Vol. 79, pp. 4561-4563 (1957) (McCormick et al.), Are shown below.
Gdemethyl-
tetracycline
Rf system
0.3 M sodium phosphate / n-butanol (pH 3.0) 0.30
Mac Ilvaine buffer / ethyl acetate (pH 4.7) 0.27 0.3 N H3PO4, 0.1 / o CC13COOH 9: 1
CHCl3-n-butanol 0.22
In this Table I, the percentage of 6-demethyltetracycline (column 4) of the first four comparative strains (S-604, S-1071, V-62 and B-740) was determined by looking for the amount of 6-demethyltetracycline by chromatography on paper (column 3) and dividing this figure by the total quantity of demethyltetracyclines determined by spectrophotometric analysis (column 1) and by chromatographic analysis (column 3).
The percentage of 6-demethyltetracycline (column 4) produced by the remainder of the strains is determined by dividing the chromatographic analysis (column 3) by the spectrophotometric analysis of the total tetracyclines (column 2).
Table I
Trial
No. 1 No. 2 No. 3
S. aureofaciens DMCTC Tetra- DMTC y / ml 'lo DMTC
Strain No. y / ml Cyclins Chromato
total gram
y / ml quantitative
on paper
S-604 ** 1193 2037 110 8.4 S-1071 ** 876 2428 138 13.1
V-62 ** 1177 2255 573 32.7
B-740 ** 1042 2553 380 26.7
V-138 ** 960 1817 645 35.5
E-475 ** 2348 3601 847 23.5
E-1311 ** 3186 4263 820 19.2
ED-1723 ** 1961 3304 1320 39.9
ED-2047 ** 4726 6316 1775 28.1
ED-2314 ** 4946 6650 1100 16.5 1E-2322 3281 3197 step de- 0
detected * lE-2750 3451 3566 not detected
tected *
* No 6-demethyltetracycline found at the lowest detectable level of 1 y / ml.
** for comparison.