Verfahren zur Herstellung eines Dekapeptides
Im Hauptpatent Nr. 408 948 ist die Herstellung neuer Dekapeptide der Formel L-Seryl-ktyrosyl-L- seryl-l-a-merkapto-niederalkyl -a- amino-acetyl-L-glut aminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-(X-amino-niederalkyl- a-amino-acetyl-L-tryptophyl-g,lycin, deren Merkaptogruppe durch einen Niederalkylrest, wie Athyl, Propyl, insbesondere aber Methyl, substituiert oder unsubstituiert ist, sowie entsprechender Verbindungen, die statt des Glutaminrestes den Rest der Glutaminsäure aufweisen, und ihrer Derivate beschrieben.
Diese Verbindungen, insbesondere das L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Lmethionyl- L-glutaminyl - L - histidyl-L-phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycin, und die entsprechende Glutaminsäureverbindung weisen eine die Abscheidung des adrenocorticotropen Hormons (ACTH) aus der Antehypophyse stimulierende Wirkung (CRF-Wirkung) auf.
Die Verbindungen und vor allem ihre Derivate mit geschützten Amino- oder Carboxylgruppen können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung von Heilmitteln, die eine längere Kette von Arninosäuren aufweisen, z. B. des ACTH oder des Peptids, das die ersten 24 Aminosäuren des ACTH umfasst und wie dieses eine adrenocorticotrope Wirkung aufweist, verwendet werden.
Es wurde nun gefunden, dass das Verfahren des Hauptpatents zur Herstellung des genannten Dekapeptids L-Seryl - L - tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glut- amyl- L-.histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl- glycins und seiner Derivate durch Kondensation von tert.-Butyloxycarbonyl - L - seryl - L - tyrosyl-Lseryl-L- methionin-azid mit y-tert.-Butyl-L-gluamyl-L-histidyl Lphenylalanyl - L - arginyl-L-tryptophyl-glycin verbessert werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Hexapeptidderivat y - tert. - Butyl - L - glutamyl - L - histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin dadurch herstellt, dass man Carbobenzoxy- L- arginin mit L-Tryptophyl-glycin-methylester kondensiert, aus dem erhaltenen Tripeptidderivat die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tripeptidester mit Carbobenzoxy-L-phenylanilin kondensiert, aus dem erhaltenen Tetrapeptidester die Carbobenzoxygruppe abspaltet, den freien Tetrapeptidester mit Carbobenzoxy (r-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidin-azid kondensiert, in dem erhaltenen Carbobenzoxy-(;
;tert.-butyl)-L-glut- amyl - L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycin-methylester die Methylestergruppe verseift und die Carbobenzoxygruppe durch Hydrierung entfernt, vgl. Fig. 1. Z bedeutet die Carbobenzoxygruppe.
Das beschriebene Hexapeptidderivat kann, wie im HauptpatentNr. 408948 gezeigt, mitdemTetrapeptidderi- vat tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Lmethionin-azid zum Dekapeptidderivat tert.-Butyloxycar bonyl - L - seryl - L - tyrosyl-Lseryl-l-methionyl-1-tert .- butyl-Dglutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L - tryptophyl-glycin kondensiert werden. Aus diesem kann das freie Dekapeptid, wie im Hauptpatent beschrieben, hergestellt werden, oder das Derivat kann als Ausgangsmaterial für die Herstellung des oben erwähnten Tetrakosapeptids verwendet werden.
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<tb> Fig. 1
Die Erfindung wird im nachfolgenden Beispiel beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Für die Papierchromatographie wurden die folgenden Systeme benützt: System 52: n-Butanol-Essigsäure-Wasser
100:10:30
System 54: sek.-Butanol-Isopropanol-Monochlor essigsäure-Wasser 70:10 3 g: 40
System 56: S-Butanol-lsopropanol-5 R; Veronal Natrium-Wasser 100:15 10: 60 -System 87: Isopropanol-Ameisensäure-Wasser 400 : 20:100
System 100: Essigester-Pyridin-Essigsäure-Wasser 60: 20: 6: 1
System 101: n-Butanol-Pyridin-Essigsäure-Wasser
30:20:6:24.
Beispiel
1) Carbobenzo:ry-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester-hydrochlorid
40 g (0,128 Mol) L-Tryptophyl-glycin-methylesterhydrochlorid und 41,5 g (0,135 Mol) Carbobenzoxy-L arginin werden in 650 ml abs, Pyridin bei 400 gerührt, bis eine schwach getrübte Lösung erhalten wird. Diese wird auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 39,6 g Dicyclohexylcarbodiimid (0,192 Mol) versetzt Nach lstündigem Rühren wird über Nacht bei Raumtemperatur aufbewahrt. Am nächsten Tag wird auf 0 gekühlt und der Dicyclohexylharnstoff abgesogen. Man engt das Filtrat im Vakuum stark ein, löst das dicke Öl in Chloroform und tropft die Lösung unter Rühren in viel Äther ein. Dabei erhält man einen amorphen Niederschlag.
Man dekantiert den Äther ab und wäscht den Rückstand gut mit Äther. Nach Trocknen im Vakuum bei 50 erhält man 77,3 g eines schwach rötlich-brau nen Pulvers (100% der Theorie = 77,1 g). Das erhaltene Produkt wird ohne weitere Reinigung für di nächste Stufe eingesetzt.
2) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester
77,2 g (0,123 Mol) Carbobenzoxy-L-arginyl-L-tryp tophyl-glycin-methylester-hydrochlorid werden in 800 ml ln. Essigsäure gelöst und mit 5 g Norit gerührt. Nach etwa 10 Min. erstarrt die Mischung gelatineartig. Durch Zugabe von 40 ml Eisessig und Erwärmen auf 400 wird die Substanz wieder in Lösung gebracht und die Aktivkohle über Celite abgesaugt. Das Filtrat wird nach Zusatz von 5 g Palladiumkohle 10 oig hydriert, bis nach etwa 6 Stunden die theoretische Menge Wasserstoff aufgenommen ist (2,9 Liter). Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat mit Amberlite IRA400, Acetatform, versetzt und gerührt, bis sich keine Chloridionen mehr nachweisen lassen.
Der Ionenaustauscher wird abgesaugt, mit Wasser gewaschen und das Filtrat im Vakuum zur Trockne verdampft. Es hinterbleiben 74,5 g L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-diacetat in Form eines gelblichen Schaumes.
Überführung ins Ditosylat:
34,5 g (0,0625 Mol) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycinmethylester-diacetat werden in 200 ml Methanol gelöst und mit 23,8 g p-Toluolsulfonsäure lHgO (0,125 Mol) versetzt. Die Lösung wird im Vakuum zur Trockne verdampft, der Rückstand mit Äthanol vollständig entwässert und im Vakuum getrocknet. Das Ditosylat wird als beiger Schaum (48 g) erhalten.
3) Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-Lárginyl-L-tryptophyl- glycin-methylester-acetat
45 g (58 mMol) L-Arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester-ditosylat, 26 g (87 mMol) Carbobenzoxy-Lphenylanilin und 8,1 g (58 mMol) Triäthylamin werden in 450 ml Acetonitril bei Raumtemperatur gelöst. Darauf gibt man 19,3 g (94 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid zu und rührt noch all/2 Std. bei Raumtemperatur.
Nach Stehen über Nacht im Eisschrank wird der Dicyclohexylharnstoff abgesaugt. Das Filtrat wird im Vakuum stark eingeengt, dann die Substanz mit Ather als zähes Produkt gefällt. Nach Abgiessen des Lösungsmittels trocknet man den Rückstand im Vakuum bei 500. Das erhaltene Rohprodukt (65 g) wird zur Reinigung in das Acetat übergeführt. Man löst das Rohprodukt bei 500 in 250 ml tert.-Butanol und versetzt mit 200 ml Wasser. Die schwach trübe Lösung wird durch eine lonenaustauschersäule Amberlite IRA-400, Acetatform, die mit 50 S tert.-Butanol vorgewaschen ist, filtriert. Anschliessend wird mit 50 % tert.-Butanol nachgewaschen, bis Tupfproben mit Sakaguchi negativ sind.
Man dampft das Filtrat im Vakuum bei 500 zur Trockne ein und erhält als Rückstand 49,2 g Carbo benzoxy - L - phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester-acetat als hellbraunen Schaum. Der Rf-Wert im System 52 ist 0,83, im Dünnschichtchromatogramm System 101: 0,7. Das Produkt wird ohne weitere Reinigung zur Hydrierung eingesetzt.
4) L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin- methylester
49 g (63,4 mMol) Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-Larginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat werden in 600 ml 90 Sigem Methanol gelöst, mit 4,9 g 10 %Liter Palladiumkohle versetzt und hydriert unter Absorption des Kohlendioxyds mit Kaliumhydroxyd. Nach 1 1: Stunden sind 1130 ml Wasserstoff aufgenommen und die Hydrierung bleibt stehen. Man filtriert den Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand, 39 g = 96 m der Theorie gibt in der Papierchromatographie folgende Werte:
System: 52 54 56 87
Rf: 0,45 0,65 0,78 0,5
Bei der Papierelektrophorese in ln. Essigsäure, 7 V/cm, 5 Stunden, ist die Laufstrecke 18 cm.
5) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl)-L-glutamyl-L-histidyl L-phenylalanyl-Uarginyl-L4ryptophyl.glycin-meffiylester
17,12 g (34,9 mMol) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl) L-glutamyl-L-histidin-hydrazid (G. Nr. 7536/61 - Case 4587/1-5) in 106 ml Dimethylformamid werden auf -5 gekühlt, dann mit 16 ml eiskalter 6n Salzsäure versetzt, und bei -5 bis -100 tropft man 7,7 ml eiskalte 5n Natriumnitritlösung innerhalb 2-3 Minuten dazu.
Man lässt 5 Min. bei -5 reagieren. Hierauf gibt man unter intensivem Rühren die eiskalte frisch zubereitete Lösung von 16,3 g L-Phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester-acetat (25,5 mMol) in 140 ml Dimethylformamid, enthaltend 12,03 ml N-Triäthylamin dazu. Man rührt noch 2 Stunden im Kältebad und anschliessend 15 Stunden bei 00 Man filtriert vom auskristallisierten Salz ab und gibt zur Dimethylformamidlösung 1 Liter Essigester. Dabei scheidet sich 1,9 g mit Triäthylamin-hydrochlorid verunreinigte Substanz aus.
Die filtrierte klare Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen eingedampft und dann der rohe noch mit Ausgangsmaterial und Nebenprodukten verunreinigte Hexapeptidester mit viel Essigester ausgefällt.
Die Fällung ergibt nach dem Trocknen 28 g Rohprodukt. Zur Mischung werden 27 g dieses Produktes im Gemisch Methanol-Chloroform 1: 9 (810 g) auf eine Aluminiumoxydsäule gegeben und mit 20 Liter des gleichen Lösungsmittelgemisches eluiert. Man isoliert 11 g (41,5/0) amorphen, im Dünnschichtchromatogramm reinen Carbobenzoxyhexapeptidester. Rf 0,3 im System 100; positive Reaktion auf Pauly, Ehrlich und Reindel-Hoppe.
In der Niederspannungselektrophorese pH 2,4 (In Essigsäure) bei 300 Volt zeigt der Carbobenzoxy-hexapeptidester nach einer Stunde eine Wanderungsstrecke von 15,5 cm.
6) Carbobe nzoxy-(y-tert.-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl-L- phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin
9,6 g (8,7 mMol) Carbobenzoxy-hexapeptid-methylester werden in 150 ml 75 ,obigem Dioxan mit 18 ml ln Natronlauge während 20 Min. bei Zimmertemperatur verseift. Während der Verseifung scheidet sich Substanz aus. Das Verseifungsgemisch wird mit 150 ml eis kaltem Wasser versetzt und mit 30 ml 10 Liter Essigsäure angesäuert. Man lässt noch 30 Min. bei 0 stehen, filtriert das Carbobenzoxy-hexapeptid ab und wäscht gut mit Wasser nach. Nach dem Trocknen im Hochvakuum Ausbeute: 8 g (90 sO der Theorie), F. 2040 (Zers.).
Aus der Mutterlauge lassen sich noch weitere 780 mg weniger reines Carbobenzoxy-hexapeptid erhalten, F. 1800.
Das Carbobenzoxyhexapeptid kann aus 90 % Methanol umkristallisiert werden, F. 2060.
Im Dünnschichtchromatogramm auf Silikagel sind die Rf-Werte: 52/0,2 und im System 101/0,75.
7) y-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L arginyl-L-tryptophyl-glycin.
7,96 g (7,36 mMol) Carbobenzoxy-(y-tert.-butyl) L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-trypto- phyl-glycin werden in 300 ml Essigsäure (90 Fig) in Gegenwart von 1,5 g 10 S Palladiumkohlekatalysator während 5 Stunden bei Normaldruck und Zimmertemperatur hydriert. Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 400 zur Trockne ein. Der Rückstand wird aus MethanoVÄther umgefällt. Ausbeute: 6,9 g Hexapeptid-y-tert.-butylester. Das Produkt ist mit dem im Hauptpatent beschriebenen identisch.
Der Hexapeptid-r-tert.-butylester kann nach dem im Hauptpatent beschriebenen Verfahren mit tert.-Butyl oxycarbonyl - L - seryl - L - tyrosyl-L-seryl-L-methioninhydrazid (-azid) zum tert . -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L- tyrosyl - L - seryl-L-methionyl-(y-tert.-butyl)-glutamyl-L histidyl - L - phenylalanyl-L-arginyüL-tryptophyl - glycin kondensiert werden.
Process for the production of a decapeptide
The main patent No. 408 948 describes the production of new decapeptides of the formula L-Seryl-ktyrosyl-L-seryl-la-merkapto-lower-alkyl-a amino-acetyl-L-glut aminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L- (X-amino-lower-alkyl-a-amino-acetyl-L-tryptophyl-g, lycin, the mercapto group of which is substituted or unsubstituted by a lower alkyl radical such as ethyl, propyl, but especially methyl, as well as corresponding compounds which instead of the glutamine radical The remainder of the glutamic acid and its derivatives are described.
These compounds, in particular L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-Lmethionyl-L-glutaminyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-larginyl-L-tryptophyl-glycine, and the corresponding glutamic acid compound exhibit the deposition of the adrenocorticotropic hormone (ACTH) from the anterior pituitary stimulating effect (CRF effect).
The compounds and especially their derivatives with protected amino or carboxyl groups can also be used as intermediates for the preparation of medicinal products that have a longer chain of amino acids, e.g. B. the ACTH or the peptide which comprises the first 24 amino acids of ACTH and how this has an adrenocorticotropic effect can be used.
It has now been found that the process of the main patent for the production of the said decapeptide L-Seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glut-amyl-L-.histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl- L-tryptophyl-glycins and its derivatives by condensation of tert-butyloxycarbonyl - L - seryl - L - tyrosyl-Lseryl-L-methionine azide with y-tert-butyl-L-gluamyl-L-histidyl Lphenylalanyl - L - arginyl-L-tryptophyl-glycine can be improved.
The process according to the invention is characterized in that the hexapeptide derivative y-tert. - Butyl - L - glutamyl - L - histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine produced by condensing carbobenzoxy-L-arginine with L-tryptophyl-glycine methyl ester, the resulting tripeptide derivative the carbobenzoxy group splits off, the free tripeptide ester is condensed with carbobenzoxy-L-phenylaniline, the carbobenzoxy group is split off from the tetrapeptide ester obtained, the free tetrapeptide ester is condensed with carbobenzoxy (r-tert.-butyl) -L-glutamyl-L-histidine azide, in the carbobenzoxy obtained - (;
; tert-butyl) -L-glutamyl - L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycine methyl ester saponifies the methyl ester group and removes the carbobenzoxy group by hydrogenation, cf. Fig. 1. Z means the carbobenzoxy group.
The hexapeptide derivative described can, as described in main patent no. 408948, with the tetrapeptide derivative tert-butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine azide to the decapeptide derivative tert-butyloxycarbonyl - L - seryl - L - tyrosyl-Lseryl-l-methionyl-1- tert-butyl-Dglutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine are condensed. From this, the free decapeptide, as described in the main patent, can be prepared, or the derivative can be used as a starting material for the preparation of the above-mentioned tetrakosapeptide.
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<tb> Fig. 1
The invention is described in the following example. The temperatures are given in degrees Celsius.
The following systems were used for the paper chromatography: System 52: n-butanol-acetic acid-water
100:10:30
System 54: sec-butanol-isopropanol-monochloroacetic acid-water 70:10 3 g: 40
System 56: S-butanol-isopropanol-5 R; Veronal sodium-water 100: 15 10:60 system 87: isopropanol-formic acid-water 400: 20: 100
System 100: ethyl acetate-pyridine-acetic acid-water 60: 20: 6: 1
System 101: n-butanol-pyridine-acetic acid-water
30: 20: 6: 24.
example
1) Carbobenzo: ry-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester hydrochloride
40 g (0.128 mol) of L-tryptophyl-glycine methyl ester hydrochloride and 41.5 g (0.135 mol) of carbobenzoxy-L arginine are stirred in 650 ml of abs, pyridine at 400, until a slightly cloudy solution is obtained. This is cooled to room temperature and 39.6 g of dicyclohexylcarbodiimide (0.192 mol) are added. After stirring for 1 hour, the mixture is stored at room temperature overnight. The next day it is cooled to 0 and the dicyclohexylurea is sucked off. The filtrate is concentrated strongly in vacuo, the thick oil is dissolved in chloroform and the solution is added dropwise to a lot of ether with stirring. An amorphous precipitate is obtained.
The ether is decanted off and the residue is washed well with ether. After drying in vacuo at 50, 77.3 g of a slightly reddish-brown powder are obtained (100% of theory = 77.1 g). The product obtained is used for the next stage without further purification.
2) L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester
77.2 g (0.123 mol) of carbobenzoxy-L-arginyl-L-tryp tophyl-glycine methyl ester hydrochloride are dissolved in 800 ml of ln. Acetic acid dissolved and stirred with 5 g of Norit. After about 10 minutes the mixture solidifies in a gelatinous manner. By adding 40 ml of glacial acetic acid and heating to 400, the substance is brought back into solution and the activated charcoal is suctioned off through Celite. The filtrate is hydrogenated after the addition of 5 g of palladium carbon 10% until the theoretical amount of hydrogen has been absorbed after about 6 hours (2.9 liters). After filtering off the catalyst, Amberlite IRA400, acetate form, is added to the filtrate and the mixture is stirred until chloride ions can no longer be detected.
The ion exchanger is filtered off with suction, washed with water and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo. 74.5 g of L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester diacetate remain in the form of a yellowish foam.
Conversion into ditosylate:
34.5 g (0.0625 mol) of L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester diacetate are dissolved in 200 ml of methanol, and 23.8 g of p-toluenesulfonic acid 1HgO (0.125 mol) are added. The solution is evaporated to dryness in vacuo, the residue is completely dehydrated with ethanol and dried in vacuo. The ditosylate is obtained as a beige foam (48 g).
3) Carbobenzoxy-L-phenylalanyl-larginyl-L-tryptophylglycine methyl ester acetate
45 g (58 mmol) of L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester ditosylate, 26 g (87 mmol) of carbobenzoxy-L-phenylaniline and 8.1 g (58 mmol) of triethylamine are dissolved in 450 ml of acetonitrile at room temperature. 19.3 g (94 mmol) of dicyclohexylcarbodiimide are then added, and the mixture is stirred at room temperature for every 1/2 hour.
After standing in the refrigerator overnight, the dicyclohexylurea is suctioned off. The filtrate is strongly concentrated in vacuo, then the substance is precipitated as a viscous product with ether. After the solvent has been poured off, the residue is dried in vacuo at 500 °. The crude product obtained (65 g) is converted into the acetate for purification. The crude product is dissolved in 250 ml of tert-butanol at 500 ml, and 200 ml of water are added. The slightly cloudy solution is filtered through an Amberlite IRA-400 ion exchange column, acetate form, which has been prewashed with 50 S tert-butanol. It is then washed with 50% tert-butanol until the swab samples with Sakaguchi are negative.
The filtrate is evaporated to dryness in vacuo at 500 and 49.2 g of carbobenzoxy-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester acetate are obtained as a pale brown foam. The Rf value in system 52 is 0.83, in the thin-layer chromatogram system 101: 0.7. The product is used for the hydrogenation without further purification.
4) L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester
49 g (63.4 mmol) of carbobenzoxy-L-phenylalanyl-larginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester acetate are dissolved in 600 ml of 90% methanol, mixed with 4.9 g of 10% liters of palladium carbon and hydrogenated with absorption of the carbon dioxide with potassium hydroxide. After 11: hours 1130 ml of hydrogen have been taken up and the hydrogenation stops. The catalyst is filtered off and the filtrate is evaporated to dryness in vacuo. The residue, 39 g = 96 m of theory gives the following values in paper chromatography:
System: 52 54 56 87
Rf: 0.45 0.65 0.78 0.5
In paper electrophoresis in ln. Acetic acid, 7 V / cm, 5 hours, the running distance is 18 cm.
5) Carbobenzoxy- (y-tert-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl L-phenylalanyl-urarginyl-L4ryptophyl.glycine-meffiyl ester
17.12 g (34.9 mmol) of carbobenzoxy (γ-tert-butyl) L-glutamyl-L-histidine hydrazide (G. No. 7536/61 - Case 4587 / 1-5) in 106 ml of dimethylformamide cooled to -5, then treated with 16 ml of ice-cold 6N hydrochloric acid, and at -5 to -100, 7.7 ml of ice-cold 5N sodium nitrite solution is added dropwise within 2-3 minutes.
The reaction is allowed to take place at -5 for 5 minutes. The ice-cold, freshly prepared solution of 16.3 g of L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine methyl ester acetate (25.5 mmol) in 140 ml of dimethylformamide, containing 12.03 ml of N, is then added with vigorous stirring -Triäthylamine in addition. The mixture is stirred for a further 2 hours in the cold bath and then for 15 hours at 0 ° C. The crystallized salt is filtered off and 1 liter of ethyl acetate is added to the dimethylformamide solution. 1.9 g of substance contaminated with triethylamine hydrochloride are precipitated.
The filtered clear solution is evaporated to a small volume in vacuo and then the crude hexapeptide ester, which is still contaminated with starting material and by-products, is precipitated with a large amount of ethyl acetate.
After drying, the precipitation gives 28 g of crude product. To the mixture, 27 g of this product in a methanol-chloroform 1: 9 mixture (810 g) are placed on an aluminum oxide column and eluted with 20 liters of the same solvent mixture. 11 g (41.5 / 0) of amorphous carbobenzoxyhexapeptide ester that is pure in a thin-layer chromatogram are isolated. Rf 0.3 in system 100; positive reaction to Pauly, Ehrlich and Reindel-Hoppe.
In low-voltage electrophoresis pH 2.4 (in acetic acid) at 300 volts, the carbobenzoxy-hexapeptide ester shows a migration distance of 15.5 cm after one hour.
6) Carbobe nzoxy- (y-tert-butyl) -L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine
9.6 g (8.7 mmol) of carbobenzoxy-hexapeptide methyl ester are saponified in 150 ml of the above-mentioned 75 dioxane with 18 ml of ln sodium hydroxide solution for 20 minutes at room temperature. Substance separates out during the saponification. The saponification mixture is mixed with 150 ml of ice-cold water and acidified with 30 ml of 10 liters of acetic acid. The mixture is left to stand at 0 for a further 30 minutes, the carbobenzoxy-hexapeptide is filtered off and washed thoroughly with water. After drying in a high vacuum, yield: 8 g (90 ° C. of theory), melting point 2040 (decomp.).
Another 780 mg of less pure carbobenzoxy-hexapeptide can be obtained from the mother liquor, F. 1800.
The carbobenzoxyhexapeptide can be recrystallized from 90% methanol, F. 2060.
In the thin-layer chromatogram on silica gel, the Rf values are: 52 / 0.2 and in the system 101 / 0.75.
7) y-tert-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L arginyl-L-tryptophyl-glycine.
7.96 g (7.36 mmol) of carbobenzoxy (y-tert-butyl) L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycine are dissolved in 300 ml of acetic acid (90 Fig) hydrogenated in the presence of 1.5 g of 10 S palladium-carbon catalyst for 5 hours at normal pressure and room temperature. The solution freed from the catalyst is evaporated to dryness in vacuo at 400. The residue is reprecipitated from MethanoVÄther. Yield: 6.9 g of hexapeptide-γ-tert-butyl ester. The product is identical to that described in the main patent.
The hexapeptide r-tert-butyl ester can be oxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionine hydrazide (azide) to tert -butyl according to the process described in the main patent. -Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-tyrosyl - L - seryl-L-methionyl- (y-tert.-butyl) -glutamyl-L histidyl - L - phenylalanyl-L-arginyüL-tryptophyl - glycine can be condensed.