Verfahren zur Herstellung von 14a-Hydroxy-steroiden l4z-Hydroxy-steroide der allgemeinen Formel
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worin R1, R2, R3 Wasserstoff oder einen vorzugsweise niederen Acylrest bedeuten und welche alle 4 durch Variation der sterischen Anordnung an den mit * bezeichneten Kohlenstoffatomen möglichen Isomeren umfassen soll und zwar sowohl in isoliertem Zustand als auch in beliebigem Mengenverhältnis der einzelnen Isomeren, zeichnen sich durch eine hohe Wirksamkeit als Insektenmetamorphose-Hormone aus. Daneben zeigen sie tiefgreifende Beeinflussungen des Zell stoffwechsels bei anderen Lebewesen, insbesondere auch bei Warmblütern.
Ferner werden Wirkungen auf das Zentralnervensystem beobachtet Hieraus ergibt sich eine vielfache technische Verwertbarkeit, beispielsweise als Pharmazeutika in der Human- und Veterinärmedizin oder als Schädlingsbekämpfungsmittel im Pflanzenschutz. Der bekannten entsprechenden 20-Desoxyverbindung (Ecdyson) zeigen sich die neuen Verfahrensprodukte, wie der Calliphora-Test am Beispiel des A7-5p-Cholesten-2,3 14 ,2O,22,25-hexa- ol-6-on (20-Hydroxy-ecdyson) ausweist, überlegen.
Wie das Ecdyson, so ist auch das natürlich vorkommende 20-Hydroxy-ecdyson aus z.B. Insekten (z.B. aus Seidenspinnerpuppen Bombyx mori in einer Menge von 47 mg/2,8 t) isolierbar. Um diese hochwirksamen Produkte praktisch nutzen zu können, ist ihre synthetische Herstellung von technischer Bedeutung.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von neuen 14a-Hydroxy-Derivaten von Steroiden der Formel list dadurch gekennzeichnet, dass man Verbindungen der Formel
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in 14c-Stellung hydroxyliert. Die 14a-Hydroxylierung kann nach an sich bekannten Methoden der Steroidchemie, sei es auf rein chemischem Wege, insbesondere durch Einwirkung von seleniger Säure, sei es auf biochemischem Wege, insbesondere durch Einwirkung von solchen Mikroorganismen bzw. der von ihnen gebildeten Enzyme, die bekanntermassen zur 14a-Hydroxylierung befähigt sind, wie z.B. Enzyme aus Stämmen der Gattung Curvularia oder Heliocostylum sowie Absidia regnieri, erfolgen.
Hierbei ist es möglich, entweder von bereits sterisch einheitlichen Ausgangsstoffen auszugehen oder ein nach dem erfindungsgemässen Verfahren primär erhaltenes Diastereomeren-Gemisch in an sich bekannter Weise z.B.
durch fraktionierte Destillation, Chromatographie oder Gegenstromverteilung nachträglich in seine Bestandteile aufzutrennen. Nach Einführung der 14x-Hydroxylgrup- pe - und zwar vor oder nach der Diastereomerentrennung - können gewünschtenfalls die 2- und/oder 3- und/ oder 22ständigen Hydroxylgruppen in üblicher Weise acyliert werden.
Zur Veresterung dieser Hydroxylgruppen kommen insbesondere Essigsäure, Propionsäure, Buttersäure oder deren reaktionsfähige Derivate in Frage.
Das in der Literatur bisher nicht beschriebene Ausgangsmaterial der Formel I kann nach an sich bekannten Methoden der Steroidchemie, z.B. aus 2,B,3,-Diacetoxy- -A7-5p-pregnen-6,20-dion [herstellbar aus 20-Äthylendi- oxy-5cc-pregnan-3a-ol-6-on analog der in Tetrahedron Letters (1966) 1387 beschriebenen Arbeftsmethoden nach folgendem Reaktionsschema erhalten werden: einem Schüttelkolben sterilisiert. Dann wird beimpft mit Absidia regnieri und bei 280C 2 Tage lang geschüttelt. Zu dieser Kultur werden 90 mg 20-(1',4'-Dihydroxy-4'-me thyl-pentyl)-A7-5,8-pregnen-2p,3p-20-triol-6-on in 5 ml 2,5% Methanol gegeben.
Nach beendeter Fermentation, feststellbar durch Dünnschicht-Chromatographie, wird von der Zellmasse abfiltriert und diese mit Aceton und Essigester extrahiert, wonach alle Extrakte vereinigt werden. Die Extrakte werden mit Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene im Vakuum eingeengt. Nach Reinigung durch präparative Dünnschicht-Chromatographie wird das 20-(1',4'-Dihydroxy-4'-methyl-pentyl)-A7 -5ss-pregnen-2ss,3ss,14α,20-tetraol-6-on isoliert; F. 236 bis 2400C. UV: $242 = 12400 (Methanol).
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Beispiel I
300 mg 20-(1',4'-Dihydroxy-4'-methyl-pentyl)-A7-5,,B- -pregnen-2p,3,ss,20-triol-6-on (hergestellt aus 2p,3,ss-Diacet- oxy-A7-5p-pregnen- 6, 20-dion durch Vinylgrignardierung an C20, Ozonspaltung zum 20-Aldehyd, Grignardierung mit 2-Methyl-butin-2-ol-tetrahydropyranyläther,
Hydrierung der Dreifachbindung und Hydrolyse) werden in 15 ml Dioxan gelöst und mit 300 mg Selendioxyd 70 Minuten auf 800 erhitzt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand durch präparative Schichtchromatographie (Kieselgel PF54 MERCK AG; Entwicklung mit Chloroform/Methanol) gereinigt. Man erhält 20 mg #7-5ss-Cholesten-2ss,3ss,14α,20,22,25-hexaol- -6-on, die nach Umkristallisation aus Tetrahydrofuran/ Essigester bei 237,5 bis 239,50 schmelzen. UV: & 42 = 12400 (Methanol).
Beispiel 2
200 ml eines Mediums, bestehend aus 4,5% Glucose, 2% Pepton und 0,5% Corn-Steep-Liquor werden in
IR: (KBr) ou 3440 cm-'
Vco 1650 cm-1 Ve=c 1610 cm-l
KMR: (Protonen-resonanzspektrograph Farian HP 100 , perdeuteriertes Pyridin,
Bezugssubstanz Tetramethylsilan)
C-18-Methylprotonen 8 1,19
C-19-Methylprotonen 8 1,05
C-21-Methylprotonen 8 1,55
C25- und C26-Methylprotonen 8 1,35
C7-Vinylproton 8 6,20
Beispiel 3
Eine Nährlösung bestehend aus
5 % Saccharose
1 % Rübenzuckermelasse
0,2 % NaNO3
0,1 % KH2PO4
0,05 % KCl
0,05 % MgSO4 0,001% FeSO4
0,5 % Maisquellwasser vom pH 7 wird durch 90minütiges Erhitzen auf 1200C sterilisiert und nach Abkühlung mit einer Sporen-Suspension von Curvularia lunata beimpft, die durch Abschwemmen einer 7tägigen Maiskultur mit physiologischer Kochsalzlösung erhalten wurde.
Nach 2tägiger Vermehrung bei 250C unter Rühren und Belüftung werden 280 ml der erzeugten Kultur unter sterilen Bedingungen entnommen und in einen Fermenter mit 4,7 Liter einer Nährlösung aus 5% Saccharose, 1% Rübenzuckermelasse, 0,2% NaNO3, 0,1% KH2PO4 übergeführt. Nach 24stündiger Anzucht unter Rühren und Belüftung werden 1,13 g 20-(1',4'-Dihydroxy-4'-methyl pentyl)-A7-58-pregnen-2p3B2o-triol-6-on in 50 ml Äthanol zugesetzt. Nach beendeter Fermentation wird wie in Beispiel 2 beschrieben weiter verfahren. Man isoliert das 20-(1',4' - Dihydroxy-4'- methyl-pentyl)-A7-5-pregnen-2p, 3,14x,20-tetraol-6-on. F. 237,5 bis 2390C.
Process for the preparation of 14a-hydroxy steroids 14z-hydroxy steroids of the general formula
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where R1, R2, R3 denote hydrogen or a preferably lower acyl radical and which should include all 4 isomers possible by varying the steric arrangement of the carbon atoms marked with *, both in the isolated state and in any proportion of the individual isomers, are characterized by high effectiveness as insect metamorphosis hormones. In addition, they show profound effects on cell metabolism in other living beings, especially in warm-blooded animals.
Effects on the central nervous system are also observed. This results in a multiple technical usability, for example as pharmaceuticals in human and veterinary medicine or as pesticides in plant protection. The known corresponding 20-deoxy compound (ecdysone) shows the new process products, such as the Calliphora test using the example of the A7-5p-Cholesten-2,3 14, 2O, 22,25-hexaol-6-one (20- Hydroxy-ecdyson), consider.
Like the ecdysone, the naturally occurring 20-hydroxy-ecdysone is also derived from e.g. Insects (e.g. from Bombyx mori silkworm pupae in an amount of 47 mg / 2.8 t) can be isolated. In order to be able to use these highly effective products in practice, their synthetic production is of technical importance.
The process according to the invention for the preparation of new 14a-hydroxy derivatives of steroids of the formula 1 is characterized in that compounds of the formula
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hydroxylated in the 14c position. The 14a-hydroxylation can be carried out according to known methods of steroid chemistry, be it purely chemically, in particular through the action of selenous acid, be it biochemically, in particular through the action of such microorganisms or the enzymes formed by them, which are known to be used 14a-hydroxylation are capable, such as Enzymes from strains of the genus Curvularia or Heliocostylum and Absidia regnieri take place.
Here it is possible either to start from sterically uniform starting materials or to use a diastereomer mixture primarily obtained by the process according to the invention in a manner known per se, e.g.
to be subsequently separated into its constituents by fractional distillation, chromatography or countercurrent distribution. After the 14x-hydroxyl group has been introduced - before or after the separation of the diastereomers - the 2- and / or 3- and / or 22-position hydroxyl groups can, if desired, be acylated in the customary manner.
Acetic acid, propionic acid, butyric acid or their reactive derivatives are particularly suitable for esterifying these hydroxyl groups.
The starting material of the formula I, not previously described in the literature, can be prepared by methods of steroid chemistry known per se, e.g. from 2, B, 3, -diacetoxy- -A7-5p-pregnen-6,20-dione [can be prepared from 20-ethylenedioxy-5cc-pregnan-3a-ol-6-one analogously to that in Tetrahedron Letters (1966) Working methods described in 1387 can be obtained according to the following reaction scheme: sterilized in a shake flask. Then it is inoculated with Absidia regnieri and shaken at 280C for 2 days. 90 mg of 20- (1 ', 4'-dihydroxy-4'-methylpentyl) -A7-5,8-pregnen-2p, 3p-20-triol-6-one in 5 ml of 2, Given 5% methanol.
After the fermentation has ended, which can be determined by thin-layer chromatography, the cell mass is filtered off and extracted with acetone and ethyl acetate, after which all the extracts are combined. The extracts are washed with sodium hydrogen carbonate solution and water, dried over sodium sulfate and concentrated to dryness in vacuo. After purification by preparative thin-layer chromatography, the 20- (1 ', 4'-dihydroxy-4'-methyl-pentyl) -A7 -5ss-pregnen-2ss, 3ss, 14α, 20-tetraol-6-one is isolated; F. 236 to 2400C. UV: $ 242 = 12400 (methanol).
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Example I.
300 mg of 20- (1 ', 4'-dihydroxy-4'-methyl-pentyl) -A7-5,, B- -pregnen-2p, 3, ss, 20-triol-6-one (made from 2p, 3 , ss-Diacet- oxy-A7-5p-pregnen- 6, 20-dione by vinyl grignardation at C20, ozone cleavage to form 20-aldehyde, grignardation with 2-methyl-butyn-2-ol-tetrahydropyranyl ether,
Hydrogenation of the triple bond and hydrolysis) are dissolved in 15 ml of dioxane and heated to 800 for 70 minutes with 300 mg of selenium dioxide. The solvent is removed in vacuo and the residue is purified by preparative layer chromatography (silica gel PF54 MERCK AG; development with chloroform / methanol). 20 mg of # 7-5ss-Cholesten-2ss, 3ss, 14α, 20,22,25-hexaol-6-one are obtained which, after recrystallization from tetrahydrofuran / ethyl acetate, melt at 237.5 to 239.50. UV: & 42 = 12400 (methanol).
Example 2
200 ml of a medium consisting of 4.5% glucose, 2% peptone and 0.5% corn steep liquor are in
IR: (KBr) or 3440 cm- '
Vco 1650 cm-1 Ve = c 1610 cm-l
KMR: (proton resonance spectrograph Farian HP 100, perdeuterated pyridine,
Reference substance tetramethylsilane)
C-18 methyl protons 8 1.19
C-19 methyl protons 8 1.05
C-21 methyl protons 8 1.55
C25 and C26 methyl protons 8 1.35
C7 vinyl proton 8 6.20
Example 3
A nutrient solution consisting of
5% sucrose
1% beet sugar molasses
0.2% NaNO3
0.1% KH2PO4
0.05% KCl
0.05% MgSO4 0.001% FeSO4
0.5% corn steep water of pH 7 is sterilized by heating to 1200C for 90 minutes and, after cooling, inoculated with a spore suspension of Curvularia lunata, which was obtained by washing away a 7-day corn culture with physiological saline solution.
After 2 days of propagation at 250C with stirring and aeration, 280 ml of the culture produced are removed under sterile conditions and placed in a fermenter with 4.7 liters of a nutrient solution consisting of 5% sucrose, 1% beet sugar molasses, 0.2% NaNO3, 0.1% KH2PO4 convicted. After cultivation for 24 hours with stirring and aeration, 1.13 g of 20- (1 ', 4'-dihydroxy-4'-methyl pentyl) -A7-58-pregnen-2p3B2o-triol-6-one in 50 ml of ethanol are added. After the fermentation has ended, the procedure described in Example 2 is continued. The 20- (1 ', 4' -dihydroxy-4'-methyl-pentyl) -A7-5-pregnen-2p, 3,14x, 20-tetraol-6-one is isolated. F. 237.5 to 2390C.