Verfahren zur Herstellung von Aminosäuren bzw. von Peptiden
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von N-tert.-Butyloxycarbonyl-, N-tert.-Amyl oxycarbonyl-Aminosäuren bzw. Peptiden, dadurch gekennzeichnet, dass man Aminosäuren und/oder Peptide in einer wässrigen Lösung bei einem pH von 6 bis 12 mit tert.-Butyloxycarbonyl-bzw. tert.-Amyloxycarbonyldi äthylphosphorsäure-anhyd rid umsetzt.
Die tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe (BOC) besitzt bei Peptidsynthesen als Schutzgruppe für Aminosäuren grosse Bedeutung, weil sie sich unter milden, sauren Bedingungen wieder entfernen lässt, ohne dass hierbei die Peptidbindung angegriffen wird. Es besteht daher Interesse an geeigneten Verfahren zur Einführung der tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe u. analoger Schutzgruppen in Aminosäuren und Peptiden.
Bisher wurde as Reagens zur Einführung der tert.-Butyloxycarbonyl- -Schutzgruppe (BOC) in Aminosäuren das sehr unbeständige tert.-Butyloxycarbonylchlorid bzw. der (p-Nitro phenyl)-tert.-butylkohlensäureester empfohlen. Letzterer reagiert zwar leicht mit Estern der Aminosäuren und Peptide, die Reaktion mit freien Aminosäuren bzw. mit Peptiden, deren terminale Carboxylgruppe frei ist, ergibt jedoch nur unbefriedigende Ausbeuten.
Man hat weiterhin das schwer zugängliche und kostspielige tert.-Butyloxycarbonylazid mit Aminosäuren in relativ guten Ausbeuten zu den entsprechenden N-tert.- -Butyloxycarbonylaminosäuren umgesetzt.
Es wurde nun gefunden, dass es unter Umgehung der Nachteile der bisher bekannten Methoden (Unbeständig- keit, schlechte Ausbeuten, schwere Zugänglichkeit des Ausgangsmaterials) gelingt, sowohl Aminosäuren als auch Peptide mit einer tert.-Butyloxycarbonylgruppe oder tert. -Amyloxycarbonylgruppe zu schützen, indem man tert. -Butyloxycarbonyl-bzw. tert.-Amyloxycarbonyl-diäthyl- phosphorsäure-anhydrid in wässriger Lösung bei einem pH von 6 bis 12 mit Aminosäuren und/oder Peptiden umsetzt.
Es wurde bereits die Beobachtung gemacht, dass sich Glycinäthylester mit tert.-Butyloxycarbonyl-diäthylphos- phorsäure-anhydrid in wasserfreien Medien zum N-tert. -Butyloxycarbonylglycinäthylester umsetzen lässt, wobei die zuletzt gebildete Verbindung in einer weiteren Reaktionsstufe verseift werden kann.
Es war jedoch wegen der Empfindlichkeit des tert. -Butyloxycarbonyl-diäthylphosphorsäure-anhydrids ge genüber sauren und basischen Reagentien nicht zu erwarten, dass sich diese Verbindung zur direkten Umsetzung in wässriger Lösung mit Aminosäuren bzw. Peptiden eignen würde.
Das Verfahren gemäss der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise durchgeführt, indem man die zu schüt- zende Aminosäure bzw. das Peptid in einem wässrig-or- ganischen Lösungsmittelgemisch bei einem pH von 6 bis 12 löst und hierauf bei einer Temperatur von 0 bis 40 das tert.-Butyloxycarbonyl-bzw. tert.-Amyloxycarbonyl- -diäthylphosphorsäure-anhydrid zugibt. Vorzugsweise werden die genannten Anhydriden im Überschuss zuge- fügt. Anschliessend wird das pH der Lösung auf 2,5 gebracht und der ausgeschiedene Niederschlag nach an sich bekannten Methoden aufgearbeitet. Die Ausbeuten an N-tert.-Butyloxycarbonyl-bzw.
N-tert.-Amyloxycarbonyl- -Aminosäuren bzw. an entsprechend N-geschützten Peptiden liegen im allgemeinen über 90%.
Die Darstellung des bisher unbekannten Ausgangs- materials tert.-Amyloxycarbonyl-diäthylphosphorsäure- -anhydrid wird im Beispiel 2 beschrieben.
Beispiel I t ert.-Brtyloxycarbonyl-L-phenylalanin
20,6 g L-Phenylalanin werden in einem Gemisch von
125 mi I N Natronlauge und 50 ml Dioxan gelöst ; anschliessend lässt man innerhalb 45 Minuten bei 15 und einem pH von 11, 3 eine Lösung von 35 g tert.-Butyloxy carbonyl-diäthylphosphorsäure-anhydrid in 35 ml Dioxan zutropfen. Man rührt noch während 15 Minuten, wobei der pH bei 11, 3 gehalten wird. Danach wird der pH auf 8 eingestellt und die Lösung bei 30 zur Hälfte eingeengt.
Die wässrige Lösung wird mit Chloroform gewaschen und der pH bei 0 mittels konz. Phosphorsäure auf 2, 5 eingestellt. Das ausgeschiedene öl wird mit Essigester extrahiert, die Essigesterlösung mit Wasser bis zur Neu tralität gewaschen, auf Natriumsulfat getrocknet und bei 30 zur Trockne eingedampft ; Ausbeute 32, 2 g. Nach Umkristallisieren aus einem Gemisch von Essigester-Pe troläther crhält man das tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin vom Smp. 85 . [α]20D=-3 in Eisessig.
Beispiel 2 tert.-Amyloxycarbonyl-L-phenylalanin
Analog Beispiel I wird, ausgehend von 20,9 g L-Phenylalanin und 40 g tert.-Amyloxycarbonyl-diäthylphos- phorsäure-anhydrid, das tert.-Amyloxycarbonyl-L-phenylalanin vom Smp. 198 erhalten. [α]20D = +28 in Äthanol.
Das zur Einführung der tert.-Amyloxycarbonylgrup- pe benützte Anhydrid wird folgendermassen hergestellt :
In eine Suspension von 64,5 g Kalium-tert.-amylat in 2000 ml Diäthyläther wird während 2 Stunden ein kräf- tiger Kohlendioxyd-Strom eingeleitet. Anschliessend gibt man eine Lösung von 90,5 g Phosphorsäure-diäthylester- -chlorid in 250 ml Diäthyläther hinzu, rührt noch wäh- rend 45 Minuten bei 0 , filtriert das ausgeschiedene Salz ab und dampft bei 20 zur Trockne ein. Man erhält einen öligen Rückstand, der sofort zu weiteren Synthese eingesetzt wird.
Process for the production of amino acids or peptides
The present invention relates to a process for the preparation of N-tert-butyloxycarbonyl-, N-tert-amyl oxycarbonyl-amino acids or peptides, characterized in that amino acids and / or peptides are in an aqueous solution at a pH of 6 to 12 with tert-butyloxycarbonyl or. tert-Amyloxycarbonyldi äthylphosphorsäure-anhydride converts.
The tert-butyloxycarbonyl protective group (BOC) is of great importance as a protective group for amino acids in peptide syntheses because it can be removed again under mild, acidic conditions without the peptide bond being attacked. There is therefore interest in suitable processes for introducing the tert-butyloxycarbonyl protective group and the like. analogous protecting groups in amino acids and peptides.
So far, the recommended reagent for introducing the tert-butyloxycarbonyl protective group (BOC) into amino acids is the very unstable tert-butyloxycarbonyl chloride or the (p-nitrophenyl) -tert-butyl carbonate. The latter reacts easily with esters of amino acids and peptides, but the reaction with free amino acids or with peptides whose terminal carboxyl group is free only gives unsatisfactory yields.
Furthermore, the difficult to access and expensive tert-butyloxycarbonylazide has been reacted with amino acids in relatively good yields to give the corresponding N-tert-butyloxycarbonylamino acids.
It has now been found that, while avoiding the disadvantages of the previously known methods (instability, poor yields, difficult accessibility of the starting material), both amino acids and peptides with a tert-butyloxycarbonyl group or tert. Protect amyloxycarbonyl group by tert. -Butyloxycarbonyl- or. tert-amyloxycarbonyl diethyl phosphoric acid anhydride is reacted with amino acids and / or peptides in aqueous solution at a pH of 6 to 12.
It has already been observed that glycine ethyl ester with tert-butyloxycarbonyl-diethylphosphoric anhydride in anhydrous media to the N-tert. -Butyloxycarbonylglycine ethyl ester can be reacted, wherein the compound formed last can be saponified in a further reaction stage.
However, it was because of the sensitivity of the tert. -Butyloxycarbonyl-diethylphosphoric acid anhydrides compared to acidic and basic reagents, it is not to be expected that this compound would be suitable for direct reaction in aqueous solution with amino acids or peptides.
The method according to the present invention is preferably carried out by dissolving the amino acid or peptide to be protected in an aqueous-organic solvent mixture at a pH of 6 to 12 and then the tert at a temperature of 0 to 40. -Butyloxycarbonyl- or. tert-amyloxycarbonyl diethylphosphoric anhydride adds. The anhydrides mentioned are preferably added in excess. The pH of the solution is then brought to 2.5 and the precipitate which has separated out is worked up by methods known per se. The yields of N-tert-butyloxycarbonyl or.
N-tert-amyloxycarbonyl- amino acids or correspondingly N-protected peptides are generally above 90%.
The preparation of the previously unknown starting material tert-amyloxycarbonyl diethylphosphoric anhydride is described in Example 2.
Example I tert-brtyloxycarbonyl-L-phenylalanine
20.6 g of L-phenylalanine are in a mixture of
125 ml of I N sodium hydroxide solution and 50 ml of dioxane dissolved; a solution of 35 g of tert-butyloxy carbonyl diethylphosphoric acid anhydride in 35 ml of dioxane is then added dropwise at 15 and a pH of 11.3 over the course of 45 minutes. The mixture is stirred for a further 15 minutes, the pH being kept at 11.3. The pH is then adjusted to 8 and the solution is concentrated to half at 30.
The aqueous solution is washed with chloroform and the pH at 0 using conc. Phosphoric acid adjusted to 2.5. The precipitated oil is extracted with ethyl acetate, the ethyl acetate solution washed with water until neutral, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness at 30; Yield 32.2g. After recrystallization from a mixture of ethyl acetate-petroleum ether, the tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanine of melting point 85 is obtained. [α] 20D = -3 in glacial acetic acid.
Example 2 tert-amyloxycarbonyl-L-phenylalanine
As in Example I, starting from 20.9 g of L-phenylalanine and 40 g of tert-amyloxycarbonyl diethylphosphoric acid anhydride, tert-amyloxycarbonyl-L-phenylalanine with a melting point of 198 is obtained. [α] 20D = +28 in ethanol.
The anhydride used to introduce the tert-amyloxycarbonyl group is produced as follows:
A vigorous stream of carbon dioxide is passed into a suspension of 64.5 g of potassium tert-amylate in 2000 ml of diethyl ether for 2 hours. A solution of 90.5 g of phosphoric acid diethyl ester chloride in 250 ml of diethyl ether is then added, the mixture is stirred for 45 minutes at 0, the precipitated salt is filtered off and evaporated to dryness at 20. An oily residue is obtained which is used immediately for further synthesis.