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säure, Ornithin, Hydroxylysin und vor allem Lysin.
Als Derivate der genannten oc- (Aminoalkyl) -oc-aminoessigsäuren kommen solche der Säuregruppe, der -Aminogruppe oder beider Gruppen in Betracht. So kann die Säuregruppe verestert, oder in Form eines Anhydrids, Hydrazids oder Azids vorliegen oder, wie im Fall von Peptiden, als Säureamidgruppierung vorhanden sein. Die oc-Aminogruppe kann z. B. durch eine der in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen, vor allem solcher, die durch Hydrogenolyse entfernbar sind, wie die Carbobenzoxygruppe (im folgenden mit Z abgekürzt), die p- (Phenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (PZ) oder die p- (p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxy-carbonylgruppe (MZ) blockiert sein. Die oc-Aminogruppe kann aber auch Teil einer Säureamidgruppe wie in einem Peptid, sein.
Viele biologisch wichtige Polypeptide enthalten Reste von K-Aminoalkyl- < x-aminoessigsäuren, vor allem von Lysin, so z. B. Lysin-Vasopressin, die Melanophoren stimulierenden Hormone, Corticotropin und Insulin.
Daher sind Methoden, welche die Synthese von Peptiden ermöglichen, die Reste von oc-Aminoalkyl-ocaminoessigsäuren, besonders Lysin, enthalten, von grosser Bedeutung.
Der Erfolg einer derartigen Synthese hängt weitgehend von der Wahl geeigneter Schutzgruppen zur Blockierung der nicht oc-ständigen Aminogruppen dieser Aminosäuren, z. B. der s-Aminogruppe des Lysins, ab.
Die bisher verwendeten, in der Peptidchemie üblichen Schutzgruppen lassen sich in manchen Fällen nicht ohne Veränderung des Moleküls abspalten, wodurch ihre Anwendbarkeit nachteilig eingeschränkt ist, teils stehen sie einer selektiven Abspaltung gleichzeitig vorhandener anderer Schutzgruppen, sei es einer Amino- oder Carboxylgruppe, im Wege.
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den Nachteil, dass sie sowohl reduktiv als auch hydrolytisch abspaltbar sind und daher einer selektiven Freisetzung der oc-Aminogruppe, welche mit auf die gleiche Art abspaltbaren Schutzgruppen blockiert ist, im Wege stehen. Weiter versagt von den gebräuchlichen Methoden zur Abspaltung dieser Gruppen die katalytische Hydrierung bei schwefelhaltigen Peptiden. Abspaltung mit Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitteln kann vielfach nicht angewendet werden, weil das dabei gebildete Benzylhalogenid benzylierend wirkt (z.
B. wird das S-Atom im Methionin benzyliert). Die Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak schliesslich wird von vielen störenden Nebenreaktionen begleitet. Ferner ist auch die selektive hydrogenolytische Freisetzung vorhandener Benzylestergruppen bei Vorhandensein solcher Carbobenzoxyreste unmöglich.
Die Tritylgruppe kann zwar durch milde, saure Hydrolyse entfernt werden, sie wird aber auch durch katalytische Hydrierung angegriffen. Deshalb ist auch hier die Verwendung von hydrogenolytisch abspaltbaren Gruppen, wie Z, PZ oder MZ, an der -Aminogruppe nicht mehr möglich, wenn die andere Aminogruppe durch Tritylierung blockiert ist.
Der Trifluoracetylrest endlich wird zwar durch Alkali unter relativ milden Bedingungen abgespalten.
Dabei werden aber auch durch Veresterung geschützte Carboxylgruppen angegriffen ; auch der Trifluoracetylrest lässt sich somit nicht allgemein verwenden.
Es wurde nun gefunden, dass der tert.-Butyloxycarbonylrest in vortrefflicher Weise allgemein und ohne die genannten Nachteile zum Schutz der Aminogruppe des Aminoalkylrestes in K-Aminoalkyl-K-amino- essigsäuren und ihren Derivaten geeignet ist. Die t-Butyloxycarbonylgruppe wird durch katalytische Hydrierung nicht argegriffen ; sie erlaubt daher die Verwendung von hydrogenolytisch abspaltbaren Resten, wie Z, PZ, MZ, Trityl u. ähnl., zum selektiven Schutz und Freisetzen der -Aminogruppen und lässt sich darüber hinaus durch äusserst milde, saure Hydrolyse entfernen, ohne dass dabei vorhandene Estergruppen
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entfernt oder sonstige störende Nebenreaktionen eintreten würden.
Anderseits lässt sich eine Estergruppe durch alkalische Verseifung leicht abspalten, ohne dass die tert.-Butyloxycarbonylgruppe entfernt wird.
Die Verfahrensprodukte, oc- (tert.-Butyloxycarbonylamino)-x-aminoessigsäuren und ihre Derivate, sind neu. Sie stellen wertvolle Zwischenprodukte in der Peptidsynthese dar. Dabei kann man z. B. so vorgehen, dass man in #-(tert.-Butyloxycarbonyl-aminoalkyl)-α-aminoessigsäuren, z. B. in N-tert.- Butyloxycarbonyl-lysin, die -Aminogruppe in bekannter Weise mittels eines durch Hydrierung abspaltbaren Restes, z. B. Z. PZ, oder MZ, schützt und die freie Carboxylgruppe, gegebenenfalls nach Überführung in ein reaktionsfähiges Derivat zur Bildung einer neuen Peptidbindung heranzieht. Hydrogenolytische Abspaltung der Schutzgruppe in oc-Stellung liefert dann ein Derivat mit freier Aminogruppe, welches zur weiteren Peptidsynthese geeignet ist.
Zum Schluss der Synthese kann die t-Butyloxycarbonylgruppe durch milde, saure Hydrolyse, z. B. durch Salzsäuregas in organischen Lösungsmitteln oder durch verdünnte, wässerige Mineralsäure, abgespalten werden.
Man kann aber auch, wenn Peptide hergestellt werden sollen, in denen die Verknüpfung nicht über die oc-Aminogruppe, sondern über die andere Aminogruppe erfolgt, zunächst die oc-Aminogruppe, wie angegeben, blockieren, dann dentert.-Butyloxycarbonylrest durch milde, saure Hydrolyse selektiv entfernen und die freie Aminogruppe zur Bildung einer neuen Peptidbindung benützen. Zum Schluss wird die Schutzgruppe an der -Aminogruppe nach bekannten Methoden entfernt.
In Peptidzstern mit einer tert.-Butyloxycarbonylaminogruppe und einer hydrogenolytisch abspaltbaren Schutzgruppe an der -Aminogruppe kann man die Carboxylgruppe durch alkalische Verseifung freisetzen und sie, g gebenenfalls nach Überführung in ein reaktionsfähiges Derivat, zur Bildung einer weiteren Peptidbindung heranziehen.
Beispielsweise kann nach dem erfindungsgemässen Verfahren das Dipeptid-L-lysyl-L-lysin nach folgendem Schema hergestellt werden, wobei gleichzeitig für die weitere Peptidsynthese brauchbare Derivate als Zwischenprodukte erhalten werden :
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BOC bedeutet den tert.-Butyloxycarbonylrest, T den Trityl- (Triphenylmethyl) -rest.
Der Pentapeptidrest L-Lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl, eine Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone, kann nach folgendem Schema erhalten werden :
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Eine weitere Teilsequenz des ACTH, das L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin, kann beispielsweise nach folgendem Schema hergestellt werden :
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Die Einführung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe geschieht vorteilhaft durch Acylierung eines Metallkomplexes, vorzugsweise eines Kupferkomplexes, der freien Aminosäure, oder durch Acylierung solcher Derivate, in denen die oc-Aminogruppe geschützt oder in einer Peptidbindung vorliegt. Zur Acylierung nimmt man zweckmässig reaktionsfähige Säurederivate des Kohlensäure-tert.-butylhalbesters, wie das Chlorid, Cyanid, Anhydrid oder einen aktivierten Phenylester.
Es wurde gefunden, dass die Acylierung besonders vorteilhaft mit dem Azid durchgeführt wird. Unerwarteterweise wurde festgestellt, dass die Acylierung besonders gut verläuft, wenn man den Kupferkomplex der Säure in wässeriger Lösung mit dem Azid zur Reaktion bringt. Der Kupferkomplex lässt sich daraufhin in üblicher Weise zersetzen.
In den erhaltenen tert.-Butyloxycarbonyl-Verbindungen können freie -Aminogruppen oder Carboxylgruppen in üblicher Weise abgewandelt oder funktionell abgewandelte oc-Aminogruppen oder Carboxylgruppen auf beliebiger Stufe freigesetzt werden.
So kann man die Cl-Aminogruppen acylieren, z. B. durch die oben genannten hydrogenolytisch abspaltbaren Schutzgruppen oder die Reste weiterer Aminosäuren oder Peptide substituieren. Freie Carbonsäuregruppen können ebenfalls geschützt, z. B. verestert werden, insbesondere mittels niederer Alkanole, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Butanol, oder in reaktionsfähige Derivate, wie reaktive Ester, Anhydride, oder Azide übergeführt oder in Amidgruppen, z. B. solche von Aminosäuren oder Peptiden, umgewandelt werden.
Weiter lassen sich z. B. auf beliebiger Stufe die genannten Schutzgruppen der oc-Aminogruppe durch Hydrogenolyse abspalten und/oder Estergruppen unter Beibehaltung der tert.-Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe hydrolysieren.
Die genannten Reaktionen werden in üblicher Weise bei tiefer, gewöhnlicher oder erhöhter Temperatur, in An-oder Abwesenheit von Verdünnungs- und/oder Kondensationsmitteln oder Katalysatoren, im offenen oder geschlossenen Gefäss unter Druck durchgeführt.
Die Erfindung betrifft auch diejenigen Ausführungsformen des Verfahrens, bei denen man auf irgendeiner Stufe als Zwischenprodukte erhältliche Verbindungen als Ausgangsstoffe verwendet und die fehlenden Verfahrensschritte durchführt oder das Verfahren auf irgendeiner Stufe abbricht.
Je nach der Arbeitsweise erhält man Verbindungen mit freien Amino-und/oder Carboxylgruppen in Form ihrer Salze mit Säuren und/oder Basen. Diese lassen sich in üblicher Weise ineinander überführen.
Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen näher beschrieben. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.
Beispiel 1 : NE-t-Butyloxycarbonyl-L-lysin. a) Kupferkomplex : 15 g L-Lysin-monohydrochlorid werden in 150 cm3 Wasser gelöst, 15 g basisches Kupfercarbonat zugegeben und das Reaktionsgemisch 1 Stunde lang zum Sieden erhitzt. Hierauf wird
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vom ungelösten Kupferkarbonat abgenutscht und mit etwas Wasser nachgewaschen. Nach Abkühlen wird die tiefblaue Kupfer-Lysin-Lösung (Volumen 180 cm3) mit 5, 4 g Magnesiumoxyd und einer Lösung von20, 8gt-Butyloxy-azidoformat in 260 cm3 Methanol versetzt und unter intensivem Rühren 18 Stunden bei 450 gehalten. Dabei scheidet sich der Kupferkomplex des N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins als hellblauer Niederschlag ab.
Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung des überschüssigen Magnesiumoxyds unter Eiskühlung mit 200 cm3 eiskalter 2-n. Essigsäurelösung versetzt und 1 Stunde bei 50 gerührt.
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b) freies N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin aus dem Kupferkomplex : Der unter a) erhaltene Kupferkomplex von N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin (14 g) wird suspendiert in 300 cm3 Wasser und 50 cm3 2-n. Ammoniaklösung zugegeben, wobei teilweise Lösung eintritt. Dann wird unter intensivem Rühren ein kräftiger Schwefelwasserstrom eingeleitet (während zirka 3 Stunden). Hierauf wird das ausgefallene Kupfersulfid durch ein Kohlefilter abgenutscht, das klare Filtrat unter Eiskühlung mit 75 cm3 2-n.
Essig-
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insgesamt 11, 5 g rohes N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin vom F. 235-2550 erhalten (92% der Theorie).
Zur weiteren Reinigung kann das Rohprodukt aus Wasser umkristallisiert werden, F. 245-251 .
Das Produkt ist in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln schwer löslich ; etwas löslich in Wasser, leicht löslich in verdünnten Alkalien. In verdünnter Salzsäure löslich unter Gasentwicklung (Zersetzung, vgl. unten).
Bei Papierchromatographie im System t-Butanol-n-Butanol-Wasser (40 : 30 : 30) Rf Wert = 0, 73 ; im System sec.-Butanol-Isopropanol-Monochloressigsäure-Wasser (70 : 10 : 3 : 40) Rf-Wert = 0, 80.
Die tert.-Butyloxycarbonylgruppe kann nach bekannten Methoden durch Halogenwasserstoff in organischen Lösungsmitteln oder vorteilhaft in verdünnter, wässeriger Säure abgespalten werden. Eine
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gangsmaterial nachweisbar.
Beispiel 2 : Na-Carbobenzyloxy-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin.
2, 46 g des in Beispiel 1 erhaltenen rohen N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysins werden unter Eiskühlung gelöst in 5, 5 cm3 2-n. Natronlauge und dann unter Rühren innerhalb von 30 Minuten gleichzeitig 6, 0 cm3 2-n. Natronlauge sowie eine Lösung von 1, 90 g Carbobenzoxychlorid in 3 cm3 Toluol eingetropft. Das Reaktionsgemisch wird weitere 2 Stunden bei 5-10'gerührt und sodann die Toluolphase abgetrennt.
Die wässerige Lösung wird mit etwas Äther nachgewaschen und unter Eiskühlung durch Zugabe von 10% Citronensäurelösung auf PH = 2 gebracht. Das ausgeschiedene Öl wird in Äther aufgenommen, die Ätherlösung mit etwas Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Eindampfen der Lösung gibt Na-Carbobenzyloxy-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin als Öl, das ohne Reinigung weiter umgesetzt werden kann.
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mit Natriumsulfatlösung getrocknet und eingedampft. Der ölige Rückstand wird zur weiteren Reinigung an der 50fachen Menge Silikagel ("Davison", Mesh 200) chromatographiert.
Die mit Benzol : Chloroform-Gemischen (1 : 4) eluierten Anteile geben den analysenreinen Na-Carbobenzyloxy-N-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester als Öl. b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester : 265 mg des unter a) erhaltenen, chromatographisch gereinigten Produktes werden in 20 cm3 Methanol gelöst und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende CO2 wird durch Ätznatron gebunden). Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Abnutschen des Katalysators und Eindampfen des Filtrates gibt N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester als Öl. Das Rohprodukt ist für weitere Umsetzungen genügend rein.
Es kann auch zur Charakterisierung in das kristalline Hydrochlorid übergeführt werden : Eine Probe des öligen Esters wird in wenig Methanol gelöst, die
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Wasser, 1, 00 g Magnesiumoxyd zugegeben und das Gemisch 1 Stunde bei 50 gerührt. Hierauf werden 30 cm3 Dioxan zugefügt und eine Lösung von 3, 30 g p-Phenylazo-benzyl-kohlensäurechlorid in 30 cm3 Dioxan unter intensivem Rühren im Verlauf von 30 Minuten zugetropft. Das Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Zimmertemperatur intensiv gerührt, sodann 200 cm3 Wasser zugegeben und das Dioxan
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durch Einengen am Vakuum entfernt, wobei viel amorphes, orange-rotes Material ausfällt (Gemisch von p-Phenylazo-benzylalkohol und dem Magnesiumsalz des Na- (p-Phenylazo-benzyloxy-carbonyl)-N - tert.-butyloxy-carbonyl-L-lysins).
Nach Zugabe von viel Essigester und Kühlen auf 50 wird die wässerige Phase mit eiskalter, 10% Citronensäurelösung auf PH = 2 gebracht, wobei sich nach Umschütteln das gesamte gefärbte Material im Essigester löst. Die Essigesterlösung wird hierauf mit etwas Wasser und dann so viel mal mit verdünnter Ammoniumhydroxydlösung gewaschen, bis diese nur noch schwach gelb gefärbt ist. (Die organische Phase ist immer noch stark orange-rot gefärbt und gibt beim Eindampfen 1, 5 g rohen p-Phenylazobenzylalkohol.)
Die stark orange-gelb gefärbten Ammoniumhydroxydauszüge werden vereinigt, mit viel Äther überschichtet und unter Kühlen auf 5 mit 10% Citronensäurelösung auf PH = 2 gebracht.
Das dabei ausgefallene, gelbe Öl wird in Äther aufgenommen, die Ätherlösung unter Eiskühlung mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (3, 0 g oranges Harz) wird zur weiteren Reinigung an der 50fachen Menge Silikagel chromatographiert. Die mit Chloroform eluierten Anteile
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lysenreines Material vom F. 105-106 .
Die Substanz ist löslich in den meisten organischen Lösungsmitteln, schwer löslich in Wasser und Petrol- äther, löslich in verdünnten Alkalien.
Beispiel 5 : Na- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin-methylester.
Eine Lösung von 5, 19 g N"-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester und 9, 70 g Na- (p-Phenylazo- benzyloxycarbonyl)-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in 120 cm3 Acetonitril wird auf-15 gekühlt und 4, 35 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Nach kurzer Zeit ist die Reaktionsmasse gallertig erstarrt.
Nach 30 Minuten bei -15 0 und 2 Tagen bei 20 wird mit viel Essigester versetzt, wobei das orange, gallertige Material in Lösung geht und der Dicyclohexylharnstoff ungelöst zurückbleibt. Er wird abgenutscht (4, 14 g, Smp. 224-226 ) und das Filtrat unter Kühlung mit Eis, mit 5% Zitronensäurelösung, Wasser, Natriumbikarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand (16, 3 g) wird mit 100 cm3 Äther durchgerieben, wobei er kristallisiert. Es werden 10, 9 g Dipeptid-derivat vom Smp. (111 0) 119-1270 erhalten. Die Kristalle enthalten noch etwas Dicyclohexylharnstoff. Zu dessen Abtrennung wird mit wenig Aceton versetzt, wobei 175 mg Harnstoff ungelöst bleiben. Nach Abnutschen wird das Filtrat mit viel Äther versetzt, wobei 9, 14 g reines Dipeptidderivat in Nadeln
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Aus den Mutterlaugen werden durch Adsorption an Silikagel ("Davison", Mesh 200, mit Zusatz von 10% Wasser) und Elution mit Benzol-Chloroform-Gemischen (1 : 4) noch 300 mg reines Dipeptidderivat erhalten.
Beispie16 : NE-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester.
1, 29 g des in Beispiel 5 erhaltenen Produkts werden in 80 cm3 Methanol gelöst, 3 cm3 1-n. wässerige Essigsäurelösung zugegeben und in Gegenwart von Palladiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd wird in einem zweiten, mit Natronlauge gefüllten Hydriergefäss aufgefangen). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Der Katalysator wird abgenutscht und das. Filtrat zur Trockne verdampft. Der ölige Rückstand wird verteilt zwischen 10 cm3 1-n. Essigsäure und 50 cm3 Äther, die Essigsäurelösung passiert einen weiteren Scheidetrichter mit weiteren 30 cm3 Äther.
Beide Ätherphasen werden mit wenig Essigsäurelösung nachgewaschen, die wässerigen Phasen vereinigt, zur Trockne verdampft und der ölige Rückstand zur Entfernung der Essigsäure unter Eiskühlung verteilt zwischen 20 cm3 Wasser-gesättigtem n-Butanol und 5 cm3 gesättigter Pottaschelösung.
Die Butanollösung gibt nach Trocknen und Eindampfen 805 mg farblosen Firn (93% der Theorie). Das Produkt ist nach Papierchromatographie einheitlich ; im System n-Propanol-Äthanol-Wasser (7 : 1 : 2) Rf-Wert = 0, 88, im System n-Butanol-Äthanol-Wasser (2 : 2 : 1) Rf-Wert = 0, 91.
Beispiel 7: Nα-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-tert.-butyl- oxycarbonyl-L-lysin.
145 nig des in Beispiel 5 erhaltenen Produktes werden in 3 cm Dioxan gelöst, 1 cm3 Wasser zugegeben, die Lösung auf 50 gekühlt und mit 0, 22 cm3 1, 0-n. Natronlauge (1, 1 Äquivalente) versetzt. Die klare Lösung wird 90 Minuten bei 50 belassen, hierauf mit etwas festem Kohlendioxyd neutralisiert, viel Wasser zugegeben und das Dioxan im Vakuum vollständig entfernt. Die schwach trübe, wässerige Lösung wird durch Waschen mit etwas Äther geklärt und dann unter Eiskühlung mit verdünnter Salzsäure angesäuert.
Der orange, flockige Niederschlag wird abgenutscht, mit viel Wasser neutral gewaschen und getrocknet.
Ausbeute 108 mg orangefarbenes Harz, Smp. zirka 60-80 . Das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein.
Beispiel 8 : NII-Trityl-NE-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysvl-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-methyl- ester.
800 mg des in Beispiel 6 erhaltenen, öligen Dipeptidesters werden in 12 cm3 trockenem Methylenchlorid gelöst und 500 mg reines Triphenylchlormethan sowie 0, 28 cm3 absolutes Triäthylamin zugegeben.
Nach 22 Stunden bei 20 wird die Lösung mit Essigester verdünnt und unter Eiskühlung mit verdünnter Zitronensäurelösung und Wasser gewaschen. Trocknen der Lösung mit Natriumsulfat und Eindampfen
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gibt 1, 21 g Harz. Nach mehrmaligem Umfällen aus Äther-Petroläther tritt Kristallisation ein. Es werden 1, 10 g Trityl-dipeptid-derivat vom Smp. 132-135 0 erhalten. Zur Analyse wird aus Äther-Petroläther
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Das Produkt kann wie in Beispiel 10, (4) beschrieben, auf milde Weise selektiv enttrityliert werden, ohne dass die tert.-Butyloxycarbonylgruppen angegriffen werden.
Der erhaltene N-tert.-Butyloxycar-
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Systemen einheitlich und identisch mit dem in Beispiel 6 beschriebenen Produkt. beispiel 9: Nα-Trityl-N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nα-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin.
1, 47 g des in Beispiel 8 erhaltenen Produktes werden, wie in Beispiel 7 beschrieben, verseift. Analoge Aufarbeitung gibt 1, 18 g Nα-Trityl-Nαtert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nα-tert.-butyloxycarbonyl-L-
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für weitere Umsetzungen genügend rein.
Beispiel 10 : N, 1-Trityl-Nz-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-nitro- L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester.
102 mg Nα-Trityl-Nα-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nα-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin, 82 mg NitroL-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester und 3 cm3 Dimethylformamid werden bei-15 mit 33 mg Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und die klare Lösung 30 Minuten bei -150 und 4 Tage bei 20 belassen. Hierauf wird vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff abgenutscht (16 mg, Smp. 224 bis 226 ) und das Filtrat im Hochvakuum von Dimethylformamid befreit. Der Eindampfrückstand wird mit viel Petroläther zerrieben und das ungelöste Pulver in Essigester aufgenommen, wobei weitere 2 mg Dicyclohexylharnstoff ungelöst bleiben. Die Essigesterlösung wird unter Eiskühlung wie üblich neutral gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.
Der Rückstand (105 mg Harz) wird zur weiteren Reinigung mit Äther zerrieben und aus Acetonlösung mit Äther ausgefällt. Das erhaltene Pentapeptidderivat zeigt Smp. 125-160 . Es stellt eine geschützte Teilsequenz der adrenocorticotropen Hormone dar.
Zur weiteren Charakterisierung wird eine Probe mit konzentrierter Salzsäure hydrolysiert (90 Minuten bei 40 ) ; das dabei erhaltene L-Lysyl-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin zeigt im Papierchromatogramm im System n-Butanol-3% Ammoniaklösung (100 : 44) eine Laufstrecke von 6 cm (26 Stunden Laufzeit). Bei Hochspannungselektrophorese (45 Volt/cm ; PH = 1, 9) bei 45 Minuten Laufzeit eine Laufstrecke von 15 cm (i. Vgl. Lysin : 17 cm ; Lysyl-lysin 24 cm).
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von 0, 87 ; im System n-Butanol-3% Ammoniaklösung (100 : 44) 0, 95.
Der als Ausgangsmaterial verwendete Nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-prolin-tert.-butylester wird durch Kondensation von Trityl-nitro-L-arginin mit L-Prolin-tert.-butylester in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid, Abspaltung des Tritylrestes mit 75% iger Essigsäure, Umsetzung des so erhaltenen Dipeptidesters mit Trityl-nitro-L-Arginin und Abspaltung des Tritylrestes aus dem Tripeptidester erhalten.
Beispiel 11: Nα-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-Nα-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L- valyl-glycin-äthylester.
Zu einer Lösung von 5, 47 g L-Propyl-L-valyl-glycin-äthylester und 8, 85 g Na- (p-Phenylazo-benzyl- oxycarbonyl)-N-tert.-butyloxy-carbonyl-L-lysin in 150 cm3 Acetonitril werden bei-15 4, 00 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Die Mischung wird zuerst 30 Minuten bei-15 , dann bei 20 belassen,
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Er wird abgenutscht (3, 2 g, entsprechen 78% der Theorie), das Filtrat zur Trockne verdampft, der Rückstand in Essigester aufgenommen und unter Eiskühlung wie üblich neutral gewaschen. Die neutralen Anteile (14, 72g oranges Harz) werden mehrmals mit Äther zerrieben und das ätherunlösliche Material (12, 6 g rohes Tetrapeptidderivat) zur weiteren Reinigung chromatographiert. Das Material wird in BenzolChloroform-Gemisch = 1 : 4 gelöst und auf eine Säule von 600 g Silikagel ("Davison", Mesh 200, mit Zusatz von 10% Wasser) gebracht. Elution mit weiteren 3 Liter des gleichen Gemisches gibt 0, 80 g Material, aus dem noch 290 mg Dicyclohexylharnstoff erhalten wird. Hierauf wird der Hauptteil des orangefarbenen Materials durch Elution mit 4 Liter Chloroform aus der Säule gewaschen.
Die stark orange-roten Chloroform-Eluate geben beim Eindampfen insgesamt 11, 87 g Rückstand. Es wird in wenig warmem Acetonitril gelöst ; beim langsamen Abkühlen scheiden sich insgesamt 9, 72 g kristallines Tetrapeptidderivat in Nadeldrusen vom Smp. (147 ) 149-151 ab.
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[ < x] 1, 1' (c = 1, 02 in Methanol). Das Produkt stellt eine geschützte Teilsequenz der andrenocorticotropen Hormone dar.
Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Prolyl-L-valyl-glycinäthylester vom F. 127-129 C wird durch Kondensation von L-Valyl-glycin-äthylester mit Carbobenzoxy-L-prolin und hydrogenolytische Abspaltung der Carbobenzoxygruppe erhalten.
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Beispiel 12 : N"- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-1ysyl-L-propyl-L- valyl-glycin.
Der in Beispiel 11 erhaltene Tetrapeptid-äthylester wird in genau gleicher Weise, wie in Beispiel 7 beschrieben, verseift. Analoge aufarbeitung ergibt in 97% Ausbeute Nα-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)- N-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycin als Pulver vom Smp. 86-115 ; das Produkt ist für weitere Umsetzungen genügend rein. Zur Analyse wird aus Aceton-Äther kristallisiert, Smp.
(122 ) 127-132 ; [ < x] 7 =-64, 9 1, 1 (c = 0, 80 in Methanol).
Beispiel 13 : N -tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester.
900 mg des in Beispiel 11 erhaltenen, kristallinen Tetrapeptidderivates werden in 25 cm3 Feinsprit gelöst, 1 cm3 2-n. wässerige Essigsäure zugegeben und in Gegenwart von Pallasdiumkohle (10% Pd) hydriert (das entstehende Kohlendioxyd wird in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand. Die Aufarbeitung und Überführung in den freien Ester geschieht in genau gleicher Weise wie in Beispiel 6 beschrieben. Erhalten werden 601 mg (97% der Theorie) Tetrapeptidester als farbloses Harz. Das Produkt ist nach Papierchromatographie rein, Rf-Wert = 0, 84 (System n-Butanol-Äthanol-Wasser = 2 : 2 : 1).
Beispiel 14: Nα-(p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl)-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin-äthylester.
Aus dem in Beispiel 11 erhaltenen Produkt kann die tert.-Butyloxycarbonylgruppe wie folgt selektiv entfernt werden :
4 mg Tetrapeptidderivat werden mit 0, 4 cm3 2-n. Salzsäure in Essigester versetzt und die Lösung bei Zimmertemperatur eine Stunde belassen. Hierauf wird die klare Lösung zur Trockne verdampft. Das Produkt ist ein oranges Harz. Bei Papierchromatographie in verschiedenen Systemen wird nur ein oranger Fleck erhalten, der zugleich eine positive Ninhydrinreaktion zeigt (Ne-Aminogruppe des Lysylrestes).
Rf-Wert = 0, 77 (System n-Butanol-Äthanol-Wasser = 2 : 2 : 1) ; 0, 80 = (System t-Amylalkohol-Isopropanol-Wasser = 100 : 40 : 55) ; 0, 95 = (System s-Butanol-3% Ammoniak = 100 : 44).
Beispiel 15 : N' -tert.-Butyloxycarbonyl-L-ornithin.
3, 0 g L-Ornithin-monohydrochlorid in 30 cm3 Wasser werden mit 3 g basischem Kupfercarbonat während 1# Stunden am Rückfluss gekocht. Das überschüssige Kupfercarbonat wird warm abgenutscht und mit Wasser gewaschen. Die erhaltene dunkelblaue Kupferkomplexlösung des Omithins wird mit 20 cm3 Dioxan, 3, 75 g Natriumhydrogencarbonat und 4, 9 cm3 tert. Butyloxycarbonylazid versetzt und 4 Tage bei 100 gerührt. Die entstandene Fällung wird abgenutscht, gut mit Wasser, Alkohol und Äther gewaschen.
Kupferkomplex von N-BOC-Omithin = 2, 5 g = 53% der Theorie.
Zur Zersetzung werden diese 2, 5 g des Kupferkomplexes in 75 cm3 Wasser und 10 cm3 2-n. Essigsäure suspendiert und während 30 Minuten mit Schwefelwasserstoff behandelt. Das Kupfersulfid wird abgenutscht, das Filtrat im Vakuum bei 400 eingeengt und die restliche Lösung im Hochvakuum lyophilisiert. Der pulverige Rückstand wird im Hochvakuum bei Zimmertemperatur über Kaliumhydroxyd bis zur Gewichtskonstanz getrocknet. Ausbeute an N'1-BOC-Ornithin = 1, 83 g = 44% der Theorie.
F ; 2160 (unter Zersetzung, Braunfärbung ab zirka 1900) :
Das Produkt ist gut löslich in Wasser, Methanol, etwas schwerer in Äthanol. Aus Methanol-Äther fällt es gallertig aus.
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Kupfercarbonat abgenutscht und mit wenig warmem Wasser nachgewaschen. Das tiefblaue Filtrat wird auf ein Volumen von zirka 15 cm3 eingeengt, mit 1 g Magnesiumoxyd sowie einer Lösung von 2, 15 g tert.-Butyloxy-azidoformat in 40 cm3 Methanol versetzt und 18 Stunden bei 400 gerührt. Hierauf wird das Methanol im Vakuum abdestilliert, der hellblaue Niederschlag abgenutscht und mit wenig Wasser und Äther gewaschen. Das Produkt enthält noch etwas Magncsiumoxyd. Es wird daher mit kalter, verdünnter Essigsäurelösung gut zerrieben, abgenutscht und mit Wasser neutral gewaschen.
Die Ausbeute beträgt 1, 05 g, Smp. 229-233 (Zersetzung). b) freie Nγ-tert.-Butyloxycarbonyl-L-α,γ-diaminobuttersäure aus dem Kupferkomplex : Die Freisetzung des Derivates aus dem Kupferkomplex geschieht in gleicher Weise, wie in Beispiel 1 (Sub b) beschrieben. Das Produkt wird in Form eines feinen, gallertigen Niederschlages (aus Wasser) erhalten. Smp. 217-229 (Zersetzung). Die Substanz ist löslich in verdünnten Alkalien und verdünnter Essig-
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acid, ornithine, hydroxylysine and especially lysine.
Suitable derivatives of the oc- (aminoalkyl) -oc-aminoacetic acids mentioned are those of the acid group, the -amino group, or both groups. Thus, the acid group can be esterified or in the form of an anhydride, hydrazide or azide or, as in the case of peptides, be present as an acid amide group. The oc-amino group can, for. B. by one of the protective groups customary in peptide chemistry, especially those that can be removed by hydrogenolysis, such as the carbobenzoxy group (hereinafter abbreviated as Z), the p- (phenylazo) -benzyloxycarbonyl group (PZ) or the p- ( p'-methoxyphenylazo) -benzyloxy-carbonyl group (MZ) be blocked. The α-amino group can, however, also be part of an acid amide group such as in a peptide.
Many biologically important polypeptides contain residues of K-aminoalkyl- <x-aminoacetic acids, especially of lysine, e.g. B. lysine vasopressin, melanophore stimulating hormones, corticotropin and insulin.
Therefore, methods which enable the synthesis of peptides which contain residues of oc-aminoalkyl-ocaminoacetic acids, especially lysine, are of great importance.
The success of such a synthesis depends largely on the choice of suitable protective groups for blocking the non-oc amino groups of these amino acids, e.g. B. the s-amino group of lysine, from.
The previously used protective groups in peptide chemistry cannot in some cases be split off without changing the molecule, which disadvantageously restricts their applicability; in some cases they stand in the way of the selective splitting off of other protective groups present at the same time, be it an amino or carboxyl group.
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the disadvantage that they can be split off both reductively and hydrolytically and therefore stand in the way of a selective release of the α-amino group, which is blocked with protective groups which can be split off in the same way. Furthermore, of the usual methods for splitting off these groups, the catalytic hydrogenation fails in the case of sulfur-containing peptides. Splitting off with hydrogen halide in organic solvents can often not be used because the benzyl halide formed has a benzylating effect (e.g.
B. the S-atom in methionine is benzylated). Finally, the reduction with sodium in liquid ammonia is accompanied by many disruptive side reactions. Furthermore, the selective hydrogenolytic release of any benzyl ester groups present is also impossible in the presence of such carbobenzoxy radicals.
The trityl group can be removed by mild, acidic hydrolysis, but it is also attacked by catalytic hydrogenation. Therefore, the use of hydrogenolytically cleavable groups, such as Z, PZ or MZ, on the amino group is no longer possible if the other amino group is blocked by tritylation.
Finally, the trifluoroacetyl radical is split off by alkali under relatively mild conditions.
However, carboxyl groups protected by esterification are also attacked; The trifluoroacetyl radical cannot therefore be used generally either.
It has now been found that the tert-butyloxycarbonyl radical is suitable in an excellent manner in general and without the disadvantages mentioned for protecting the amino group of the aminoalkyl radical in K-aminoalkyl-K-aminoacetic acids and their derivatives. The t-butyloxycarbonyl group is not attacked by catalytic hydrogenation; it therefore allows the use of residues which can be split off hydrogenolytically, such as Z, PZ, MZ, trityl and the like. Similar., for the selective protection and release of the -amino groups and can also be removed by extremely mild, acidic hydrolysis without the ester groups present
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removed or other disruptive side reactions would occur.
On the other hand, an ester group can easily be split off by alkaline saponification without the tert-butyloxycarbonyl group being removed.
The products of the process, oc- (tert-butyloxycarbonylamino) -x-aminoacetic acids and their derivatives, are new. They represent valuable intermediates in peptide synthesis. B. proceed so that # - (tert-butyloxycarbonyl-aminoalkyl) -α-aminoacetic acids, e.g. B. in N-tert-butyloxycarbonyl-lysine, the amino group in a known manner by means of a residue that can be split off by hydrogenation, e.g. B. Z. PZ, or MZ, protects and uses the free carboxyl group, possibly after conversion into a reactive derivative, to form a new peptide bond. Hydrogenolytic cleavage of the protective group in the oc position then yields a derivative with a free amino group which is suitable for further peptide synthesis.
At the end of the synthesis the t-butyloxycarbonyl group can be removed by mild, acidic hydrolysis, e.g. B. by hydrochloric acid gas in organic solvents or by dilute, aqueous mineral acid, split off.
However, if peptides are to be produced in which the linkage is not via the α-amino group but via the other amino group, first the α-amino group, as indicated, is blocked, then the tert-butyloxycarbonyl radical by mild, acidic hydrolysis selectively remove and use the free amino group to form a new peptide bond. Finally, the protective group on the amino group is removed by known methods.
In a peptide star with a tert-butyloxycarbonylamino group and a hydrogenolytically cleavable protective group on the -amino group, the carboxyl group can be released by alkaline saponification and, if necessary after conversion into a reactive derivative, used to form a further peptide bond.
For example, the dipeptide-L-lysyl-L-lysine can be prepared according to the following scheme according to the process according to the invention, whereby derivatives which can be used for further peptide synthesis are obtained as intermediates:
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BOC means the tert-butyloxycarbonyl radical, T the trityl (triphenylmethyl) radical.
The pentapeptide residue L-Lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl, a partial sequence of the adrenocorticotropic hormones, can be obtained according to the following scheme:
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Another partial sequence of ACTH, L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycine, can be produced, for example, according to the following scheme:
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The tert-butyloxycarbonyl group is advantageously introduced by acylating a metal complex, preferably a copper complex, the free amino acid, or by acylating those derivatives in which the α-amino group is protected or in a peptide bond. Reactive acid derivatives of the carbonic acid tert-butyl half ester, such as chloride, cyanide, anhydride or an activated phenyl ester, are expediently used for the acylation.
It has been found that the acylation is carried out particularly advantageously with the azide. Unexpectedly, it was found that the acylation proceeds particularly well when the copper complex of the acid is reacted with the azide in aqueous solution. The copper complex can then be decomposed in the usual way.
In the tert-butyloxycarbonyl compounds obtained, free -amino groups or carboxyl groups can be modified in the customary manner or functionally modified α-amino groups or carboxyl groups can be released at any stage.
So you can acylate the Cl amino groups, for. B. by the above-mentioned hydrogenolytically cleavable protective groups or the residues of other amino acids or peptides. Free carboxylic acid groups can also be protected, e.g. B. be esterified, in particular by means of lower alkanols such as methanol, ethanol, propanol, butanol, or converted into reactive derivatives such as reactive esters, anhydrides, or azides or converted into amide groups, e.g. B. those of amino acids or peptides are converted.
Further z. B. cleave off said protective groups of the α-amino group by hydrogenolysis at any stage and / or hydrolyze ester groups while maintaining the tert-butyloxycarbonyl protective group.
The reactions mentioned are carried out in the customary manner at low, normal or elevated temperature, in the presence or absence of diluents and / or condensing agents or catalysts, in an open or closed vessel under pressure.
The invention also relates to those embodiments of the process in which compounds obtainable as intermediates at any stage are used as starting materials and the missing process steps are carried out or the process is terminated at any stage.
Depending on the mode of operation, compounds with free amino and / or carboxyl groups are obtained in the form of their salts with acids and / or bases. These can be converted into one another in the usual way.
The invention is described in more detail in the following examples. The temperatures are given in degrees Celsius.
Example 1: NE-t-Butyloxycarbonyl-L-lysine. a) Copper complex: 15 g of L-lysine monohydrochloride are dissolved in 150 cm3 of water, 15 g of basic copper carbonate are added and the reaction mixture is heated to the boil for 1 hour. Then will
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sucked off the undissolved copper carbonate and washed with a little water. After cooling, the deep blue copper-lysine solution (volume 180 cm3) is mixed with 5.4 g of magnesium oxide and a solution of 20.8 g-butyloxy-azidoformate in 260 cm3 of methanol and kept at 450 for 18 hours while stirring vigorously. The copper complex of N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine separates out as a light blue precipitate.
To remove the excess magnesium oxide, the reaction mixture is cooled with ice with 200 cm3 of ice-cold 2-n. Acetic acid solution was added and the mixture was stirred at 50 for 1 hour.
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b) Free N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine from the copper complex: The copper complex of N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine (14 g) obtained under a) is suspended in 300 cm3 of water and 50 cm3 of 2-n . Ammonia solution added, whereby partial solution occurs. A vigorous stream of sulfuric water is then introduced with vigorous stirring (for about 3 hours). The precipitated copper sulfide is then filtered off with suction through a carbon filter, the clear filtrate with 75 cm3 2-n while cooling with ice.
Vinegar-
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a total of 11.5 g of crude N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine with a melting point of 235-2550 were obtained (92% of theory).
For further purification, the crude product can be recrystallized from water, F. 245-251.
The product is sparingly soluble in common organic solvents; somewhat soluble in water, slightly soluble in dilute alkalis. Soluble in dilute hydrochloric acid with evolution of gas (decomposition, see below).
For paper chromatography in the system t-butanol-n-butanol-water (40: 30: 30) Rf value = 0.33; in the system sec-butanol-isopropanol-monochloroacetic acid-water (70: 10: 3: 40) Rf value = 0.80.
The tert-butyloxycarbonyl group can be split off by known methods using hydrogen halide in organic solvents or, advantageously, in dilute, aqueous acid. A
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walking material detectable.
Example 2: Na-carbobenzyloxy-Nz-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine.
2.46 g of the crude N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine obtained in Example 1 are dissolved in 5.5 cm3 of 2-n while cooling with ice. Sodium hydroxide solution and then simultaneously 6.0 cm3 2-n with stirring within 30 minutes. Sodium hydroxide solution and a solution of 1.90 g of carbobenzoxychloride in 3 cm3 of toluene were added dropwise. The reaction mixture is stirred for a further 2 hours at 5-10 'and then the toluene phase is separated off.
The aqueous solution is washed with a little ether and brought to pH = 2 by adding 10% citric acid solution while cooling with ice. The separated oil is taken up in ether, the ether solution is washed with a little water and dried with sodium sulfate. Evaporation of the solution gives Na-carbobenzyloxy-N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine as an oil, which can be reacted further without purification.
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dried with sodium sulfate solution and evaporated. For further purification, the oily residue is chromatographed on 50 times the amount of silica gel ("Davison", 200 mesh).
The fractions eluted with benzene: chloroform mixtures (1: 4) give the analytically pure Na-carbobenzyloxy-N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine methyl ester as an oil. b) N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine methyl ester: 265 mg of the chromatographically purified product obtained under a) are dissolved in 20 cm3 of methanol and hydrogenated in the presence of palladium carbon (10% Pd) (the CO2 formed is replaced by caustic soda bound). When a little more than the calculated amount of hydrogen has been absorbed, the hydrogenation comes to a standstill. The catalyst is filtered off with suction and the filtrate is evaporated to give N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine methyl ester as an oil. The crude product is sufficiently pure for further reactions.
It can also be converted into the crystalline hydrochloride for characterization: A sample of the oily ester is dissolved in a little methanol, which
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Water, 1.00 g of magnesium oxide were added and the mixture was stirred at 50 for 1 hour. 30 cm3 of dioxane are then added and a solution of 3.30 g of p-phenylazo-benzyl carbonic acid chloride in 30 cm3 of dioxane is added dropwise over the course of 30 minutes with vigorous stirring. The reaction mixture is stirred vigorously overnight at room temperature, then 200 cm3 of water are added and the dioxane
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removed by concentration in a vacuum, whereby a lot of amorphous, orange-red material precipitates (mixture of p-phenylazo-benzyl alcohol and the magnesium salt of Na- (p-phenylazo-benzyloxy-carbonyl) -N - tert-butyloxy-carbonyl-L- lysins).
After adding a lot of ethyl acetate and cooling to 50, the aqueous phase is brought to pH = 2 with ice-cold, 10% citric acid solution, whereby all the colored material dissolves in the ethyl acetate after shaking. The ethyl acetate solution is then washed with a little water and then repeatedly with dilute ammonium hydroxide solution until it is only slightly yellow in color. (The organic phase is still strongly orange-red in color and gives 1.5 g of crude p-phenylazobenzyl alcohol on evaporation.)
The strongly orange-yellow colored ammonium hydroxide extracts are combined, covered with a large amount of ether and brought to pH = 2 with 10% citric acid solution while cooling to 5.
The yellow oil which has precipitated is taken up in ether, the ether solution is washed with water while cooling with ice, dried over sodium sulfate and evaporated. The residue (3.0 g of orange resin) is chromatographed on 50 times the amount of silica gel for further purification. The portions eluted with chloroform
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Lysically pure material from F. 105-106.
The substance is soluble in most organic solvents, sparingly soluble in water and petroleum ether, soluble in dilute alkalis.
Example 5: Na- (p-phenylazo-benzyloxycarbonyl) -N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-tert-butyl-oxycarbonyl-L-lysine methyl ester.
A solution of 5.19 g of N "-tert. -Butyloxycarbonyl-L-lysine methyl ester and 9.70 g of Na- (p-phenylazo-benzyloxycarbonyl) -N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine in 120 cm3 of acetonitrile is Cooled to -15 and 4.35 g of dicyclohexylcarbodiimide were added.After a short time, the reaction mass has solidified like a gel.
After 30 minutes at -15 0 and 2 days at 20, a lot of ethyl acetate is added, the orange, gelatinous material going into solution and the dicyclohexylurea remaining undissolved. It is filtered off with suction (4.14 g, melting point 224-226) and the filtrate is washed with cooling with ice, with 5% citric acid solution, water, sodium bicarbonate solution and water, dried with sodium sulfate and evaporated.
The residue (16.3 g) is rubbed through with 100 cm3 of ether, during which it crystallizes. 10.9 g of dipeptide derivative of melting point (111 0) 119-1270 are obtained. The crystals still contain some dicyclohexylurea. To separate it off, a little acetone is added, 175 mg of urea remaining undissolved. After suction filtering, the filtrate is mixed with a lot of ether, with 9.14 g of pure dipeptide derivative in needles
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300 mg of pure dipeptide derivative are obtained from the mother liquors by adsorption on silica gel ("Davison", mesh 200, with addition of 10% water) and elution with benzene-chloroform mixtures (1: 4).
Example 16: NE-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nz-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine methyl ester.
1.29 g of the product obtained in Example 5 are dissolved in 80 cm3 of methanol, 3 cm3 of 1-n. aqueous acetic acid solution is added and the mixture is hydrogenated in the presence of palladium carbon (10% Pd) (the carbon dioxide formed is collected in a second hydrogenation vessel filled with sodium hydroxide solution). After the calculated amount of hydrogen has been absorbed, the hydrogenation comes to a standstill. The catalyst is suction filtered and the filtrate is evaporated to dryness. The oily residue is distributed between 10 cm3 of 1-n. Acetic acid and 50 cm3 ether, the acetic acid solution passes through another separating funnel with another 30 cm3 ether.
Both ether phases are washed with a little acetic acid solution, the aqueous phases are combined, evaporated to dryness and the oily residue to remove the acetic acid is distributed between 20 cm3 of water-saturated n-butanol and 5 cm3 of saturated potash solution while cooling with ice.
After drying and evaporation, the butanol solution gives 805 mg of colorless firn (93% of theory). According to paper chromatography, the product is uniform; in the n-propanol-ethanol-water system (7: 1: 2) Rf value = 0.88, in the n-butanol-ethanol-water system (2: 2: 1) Rf value = 0.91.
Example 7: Nα- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl) -N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine.
145 nig of the product obtained in Example 5 is dissolved in 3 cm of dioxane, 1 cm3 of water is added, the solution is cooled to 50 and with 0.22 cm3 of 1.0-n. Sodium hydroxide solution (1.1 equivalents) added. The clear solution is left at 50 for 90 minutes, then neutralized with a little solid carbon dioxide, a lot of water is added and the dioxane is completely removed in vacuo. The slightly cloudy, aqueous solution is clarified by washing with a little ether and then acidified with dilute hydrochloric acid while cooling with ice.
The orange, flaky precipitate is filtered off with suction, washed neutral with plenty of water and dried.
Yield 108 mg of orange resin, m.p. about 60-80. The product is sufficiently pure for further reactions.
Example 8: NII-trityl-NE-tert-butyloxycarbonyl-L-lysvl-Nz-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine methyl ester.
800 mg of the oily dipeptide ester obtained in Example 6 are dissolved in 12 cm3 of dry methylene chloride and 500 mg of pure triphenylchloromethane and 0.28 cm3 of absolute triethylamine are added.
After 22 hours at 20, the solution is diluted with ethyl acetate and washed with dilute citric acid solution and water while cooling with ice. Dry the solution with sodium sulfate and evaporate
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gives 1.21 g of resin. After repeated reprecipitation from ether-petroleum ether, crystallization occurs. 1.10 g of trityl dipeptide derivative with a melting point of 132-135 ° are obtained. For analysis, ether becomes petroleum ether
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As described in Example 10, (4), the product can be selectively enttritylated in a mild manner without the tert-butyloxycarbonyl groups being attacked.
The obtained N-tert.-butyloxycar-
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Systems uniform and identical to the product described in Example 6. Example 9: Nα -trityl-N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Nα -tert-butyloxycarbonyl-L-lysine.
1.47 g of the product obtained in Example 8 are, as described in Example 7, saponified. Analogous work-up gives 1.18 g of N? -Trityl-N? Tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N? -Tert.-butyloxycarbonyl-L-
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pure enough for further conversions.
Example 10: N, 1-Trityl-Nz-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-proline-tert.- butyl ester.
102 mg of N? -Trityl-N? -Tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N? -Tert.-butyloxycarbonyl-L-lysine, 82 mg of nitroL-arginyl-nitro-L-arginyl-L-proline-tert.- 33 mg of dicyclohexylcarbodiimide are added to butyl ester and 3 cm3 of dimethylformamide at -15 and the clear solution is left at -150 for 30 minutes and at 20 for 4 days. The dicyclohexylurea which has separated out is then suction filtered (16 mg, melting point 224 to 226) and the filtrate is freed from dimethylformamide in a high vacuum. The evaporation residue is triturated with a lot of petroleum ether and the undissolved powder is taken up in ethyl acetate, a further 2 mg of dicyclohexylurea remaining undissolved. The ethyl acetate solution is washed neutral as usual while cooling with ice, dried with sodium sulfate and evaporated.
The residue (105 mg resin) is triturated with ether for further purification and precipitated from acetone solution with ether. The pentapeptide derivative obtained shows m.p. 125-160. It is a protected partial sequence of adrenocorticotropic hormones.
For further characterization, a sample is hydrolyzed with concentrated hydrochloric acid (90 minutes at 40); the L-lysyl-L-lysyl-nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-proline obtained in this way shows in the paper chromatogram in the system n-butanol-3% ammonia solution (100: 44) a distance of 6 cm (26 Hours running time). With high-voltage electrophoresis (45 volts / cm; PH = 1.9) with a running time of 45 minutes, a running distance of 15 cm (compared to lysine: 17 cm; lysyl-lysine 24 cm).
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from 0.87; in the system n-butanol-3% ammonia solution (100: 44) 0.95.
The nitro-L-arginyl-nitro-L-arginyl-L-proline-tert-butyl ester used as starting material is cleaved by condensation of trityl-nitro-L-arginine with L-proline tert-butyl ester in the presence of dicyclohexylcarbodiimide of the trityl residue with 75% acetic acid, reaction of the dipeptide ester thus obtained with trityl-nitro-L-arginine and cleavage of the trityl residue from the tripeptide ester.
Example 11: Nα- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl) -Nα -tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycine-ethyl ester.
To a solution of 5.47 g of L-propyl-L-valyl-glycine ethyl ester and 8.85 g of Na- (p-phenylazo-benzyl-oxycarbonyl) -N-tert-butyloxy-carbonyl-L-lysine in 150 cm3 of acetonitrile are added at -154.00 g of dicyclohexylcarbodiimide. The mixture is left at -15 for 30 minutes, then at 20,
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It is suction filtered (3.2 g, corresponds to 78% of theory), the filtrate is evaporated to dryness, the residue is taken up in ethyl acetate and washed neutral as usual while cooling with ice. The neutral components (14.72 g of orange resin) are rubbed several times with ether and the ether-insoluble material (12.6 g of crude tetrapeptide derivative) is chromatographed for further purification. The material is dissolved in a 1: 4 benzene-chloroform mixture and applied to a column of 600 g of silica gel ("Davison", 200 mesh, with the addition of 10% water). Elution with a further 3 liters of the same mixture gives 0.80 g of material from which 290 mg of dicyclohexylurea are obtained. The majority of the orange material is then washed from the column by elution with 4 liters of chloroform.
The strong orange-red chloroform eluates give a total of 11.87 g of residue on evaporation. It is dissolved in a little warm acetonitrile; on slow cooling, a total of 9.72 g of crystalline tetrapeptide derivative separate in needle glands with a melting point (147) 149-151.
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[<x] 1.1 '(c = 1.02 in methanol). The product is a protected partial sequence of andrenocorticotropic hormones.
The L-prolyl-L-valyl-glycine ethyl ester used as starting material with a melting point of 127-129 C is obtained by condensation of L-valyl-glycine ethyl ester with carbobenzoxy-L-proline and hydrogenolytic cleavage of the carbobenzoxy group.
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Example 12: N "- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl) -Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-1ysyl-L-propyl-L-valyl-glycine.
The tetrapeptide ethyl ester obtained in Example 11 is saponified in exactly the same way as described in Example 7. Analogous work-up gives Nα- (p-phenylazo-benzyloxycarbonyl) -N-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-propyl-L-valyl-glycine as a powder with a melting point of 86-115; the product is sufficiently pure for further reactions. For analysis, it is crystallized from acetone-ether, mp.
(122) 127-132; [<x] 7 = -64.9 1, 1 (c = 0.80 in methanol).
Example 13: N -tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycine-ethyl ester.
900 mg of the crystalline tetrapeptide derivative obtained in Example 11 are dissolved in 25 cm3 of fine spirits, 1 cm3 of 2-n. aqueous acetic acid is added and the mixture is hydrogenated in the presence of palladium carbon (10% Pd) (the carbon dioxide formed is absorbed in sodium hydroxide solution). After the calculated amount of hydrogen has been absorbed, the hydrogenation comes to a standstill. The work-up and conversion into the free ester are carried out in exactly the same way as described in Example 6. 601 mg (97% of theory) of tetrapeptide ester are obtained as a colorless resin. According to paper chromatography, the product is pure, Rf value = 0.84 (system n-butanol-ethanol-water = 2: 2: 1).
Example 14: Nα- (p-Phenylazo-benzyloxycarbonyl) -L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycine-ethyl ester.
The tert-butyloxycarbonyl group can be selectively removed from the product obtained in Example 11 as follows:
4 mg of tetrapeptide derivative are mixed with 0.4 cm3 of 2-n. Hydrochloric acid is added to ethyl acetate and the solution is left at room temperature for one hour. The clear solution is then evaporated to dryness. The product is an orange resin. With paper chromatography in different systems, only one orange spot is obtained, which at the same time shows a positive ninhydrin reaction (Ne-amino group of the lysyl residue).
Rf value = 0.77 (n-butanol-ethanol-water system = 2: 2: 1); 0.80 = (system t-amyl alcohol-isopropanol-water = 100: 40: 55); 0.95 = (system s-butanol-3% ammonia = 100: 44).
Example 15: N'-tert-butyloxycarbonyl-L-ornithine.
3.0 g of L-ornithine monohydrochloride in 30 cm3 of water are refluxed with 3 g of basic copper carbonate for 1 hour. The excess copper carbonate is sucked off warm and washed with water. The resulting dark blue copper complex solution of the omithin is tert with 20 cm3 of dioxane, 3.75 g of sodium hydrogen carbonate and 4.9 cm3. Butyloxycarbonylazid was added and the mixture was stirred at 100 for 4 days. The resulting precipitate is filtered off with suction, washed well with water, alcohol and ether.
Copper complex of N-BOC-omithine = 2.5 g = 53% of theory.
To decompose, these 2.5 g of the copper complex are dissolved in 75 cm3 of water and 10 cm3 of 2-n. Suspended acetic acid and treated with hydrogen sulfide for 30 minutes. The copper sulfide is filtered off with suction, the filtrate is concentrated in vacuo at 400 and the remaining solution is lyophilized in a high vacuum. The powdery residue is dried in a high vacuum at room temperature over potassium hydroxide to constant weight. Yield of N'1-BOC-ornithine = 1.83 g = 44% of theory.
F; 2160 (with decomposition, brown discoloration from around 1900):
The product is readily soluble in water, methanol, somewhat more difficultly in ethanol. From methanol-ether it precipitates as gelatinous.
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Sucked off copper carbonate and washed with a little warm water. The deep blue filtrate is concentrated to a volume of about 15 cm3, treated with 1 g of magnesium oxide and a solution of 2.15 g of tert-butyloxy-azidoformate in 40 cm3 of methanol and stirred at 400 for 18 hours. The methanol is then distilled off in vacuo, the light blue precipitate is suction filtered and washed with a little water and ether. The product still contains some magncsium oxide. It is therefore rubbed well with cold, dilute acetic acid solution, suction filtered and washed neutral with water.
The yield is 1.05 g, melting point 229-233 (decomposition). b) Free Nγ-tert-butyloxycarbonyl-L-α, γ-diaminobutyric acid from the copper complex: The release of the derivative from the copper complex takes place in the same way as described in Example 1 (sub b). The product is obtained in the form of a fine, gelatinous precipitate (from water). M.p. 217-229 (decomposition). The substance is soluble in dilute alkalis and dilute vinegar
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