Verfahren zur Herstellung von Anthelvenein Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuartigen Antibiotikums, das mit der Bezeichnung Anthelvenein belegt wird sowie dessen Säureadditions- salze. Diese neuen Verbindungen können insbesondere zur Rezeptur von Tierfuttermitteln bzw. Zusatzfutter mitteln verwendet werden.
Anthelvencin ist eine basische stickstoffhaltige Ver bindung, die erhalten wird, wenn bestimmte, bisher nicht beschriebene Stämme der Acrynomycete Strepto- myces venezuelae unter geregelten Bedingungen ge züchtet werden. Als freie Base ist das Anthelvencin verhältnismässig unbeständig. Seine Verwendung und Charakterisierung erfolgt daher vorzugsweise in Form der Additionssalze mit organischen oder anorganischen, therapeutisch geeigneten Säuren. Vorzugsweise werden die Salze mit 2 Naphthalinsulfonsäure und Salicylsäure verwendet.
Die verschiedenen Eigenschaften von Anthelvencin in Form seines Additionssalzes mit 2-Naphthalinsulfon- säure werden weiter unter beschrieben.
Das Anthelvencin kann weiterhin in Tierfutter mitteln, Zusatzfuttermitteln bzw. Tierfuttermittelkonzen- traten enthalten sein.
Das Verfahren zur Herstellung von Anthelvencin ist dadurch gekennzeichnet, dass man Streptomyces venezuelae ATCC <B>14583,</B> Streptomyces venezuelae ATCC 14854 oder Streptomyces venezuelae ATCC 14585 in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stickstoff sowie anorga nische Salze enthält, unter aeroben Bedingungen in Form eine Tauchkultur züchtet.
Anthelvencin kann auch zur Behandlung von Wurm krankheiten verwendet werden, indem man einem mit Parasiten befallenen Wirtsorganismus eine therapeutisch wirksame Menge einer Verbindung der aus Anthelvencin und seinen Säureadditionssalzen mit physiologisch ge eigneten Säuren bestehenden Gruppe verabreicht. Unter den verschiedenen Säureadditionssalzen ist z. B. 2-Naphthalinsulfonsäuresalz des Anthelvencins bekannt.
Es ist eine weisse, kristalline Festsubstanz, die bei etwa 18l-183 C schmilzt und in heissem Wasser, Methanol, Benzylalkohol, Dimethylformamid, Dimethyl- sulfoxyd, Phenol, Methylcellosolve und wässrigen Lö- sungsmittelgemischen wie wässrigem Aceton, wässrigem Alkohol und .dergleichen löslich ist.
In Äthanol ist es nur schwach und in Lösungsmitteln wie kaltem Wasser, Isopropanol, Aceton, Äthylacetat, Äther, Chloroform, Benzol und dergleichen verhältnismässig unlöslich.
Die elektrometrische Titration von Anthelvencin-2- naphthalinsulfonat in 66 % igem wässrigem Dimethyl- formamid zeigt das Vorliegen von zwei titrierbaren Gruppen mit pKä Werten von 9,58 und 11,95. Das aus der Titrationskurve bestimmte scheinbare Molekular gewicht beträgt etwa 847.
Ein Durchschnitt mehrerer Mikroanalysen von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat ergibt die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung: C 54,78 %; H 5,23 %; N 14,66 %; O 17,38 %; ,S 7,41 %. Die empi rische Formel des Salzes, die am besten mit diesen Daten in Einklang zu bringen ist, ist C:;9H44N909S2, woraus sich die empirische Formel der freien Base Anthelvencin zu C@gH"sN:30,3 ergibt.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Anthelvencin- 2 Naphthalinsulfonat in einer Verreibung in Mineralöl wird in Fig.l gezeigt.
Die unterscheidungskräftigen Banden in der Infrarotabsorptionskurve innerhalb des Bereichs von 2,0 bis 15,0,u sind wie folgt: 2,79; 3,04; 3,20; 3,41 (Mineralöl); 3,48 (Mineralöl); 5,8:6; 5,91 (Schulter); 6,08; 6,26; 6,47; 6,60 (Schulter); 6,83 (Mineralöl); 6,95; 7,07; 7,22 (zum grossen Teil auf das :Mineralöl zurückzuführen); 7,40; 7,55; 7,88; etwa 8,35 (breit); 8,55; 8,65; 8,79;<B>9,11;</B> 9,36; 9,64; 10,10 (schwach);<B>10,30;</B> 10,49 (schwach); 10,58; 10,95; 11,1l;
<B>11,25;</B> 11,52;<B>12,16;</B> 12,39; 12,98;<B>13,17;</B> 13,38; 13,89 und 14,78 ,u. Die spezifische optische Drehung von Anthelvencin- 2-naphthalinsulfonat - getrocknet bei Raumtemperatur in einem Vakuumexsiccator über Phosphorpentoxyd beträgt +11,7 , wenn die Bestimmung bei einer Tem peratur von<B>25'</B> C in einer Lösung in 95 % igem wässrigem Äthanol durchgeführt wird,
in der die Konzentration des Salzes des Antibioticums 1 % (auf Gewicht/Volumen- Grundlage) beträgt.
Das Ultraviolettabsorptionsspektrum einer wässrigen Lösung von Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat zeigt ein Maximum bei 225 my mit einer Absorption von Ei /-@1 = 2180 sowie ein weiteres Maximum bei 285 m,y mit einer Absorption von E i /m = 330.
Ein Pulverröntgenstrahlenbeugungsdiagramm dieses Salzes unter Verwendung von mit Hilfe von Nickel filtrierter Kupferstrahlung und eines Wellenlängenwertes von 1,5405 A zur Charakterisierung der Zwischenebenen abstände liefert folgende Werte:
EMI0002.0021
(d) <SEP> (I/Ii)
<tb> 11,70 <SEP> 0,10
<tb> 10,71 <SEP> 0,02
<tb> 9,50 <SEP> 0,10
<tb> 8,33 <SEP> 0,33
<tb> 8,00 <SEP> 0,02
<tb> 7,40 <SEP> 0,02
<tb> 7,07 <SEP> 0,10
<tb> 6,70 <SEP> 0,04
<tb> 6,25 <SEP> 0,20
<tb> 6,06 <SEP> 0,50
<tb> 5,86 <SEP> 0,27
<tb> 5,56 <SEP> 0,07
<tb> 5,23 <SEP> 0,20
<tb> 4,95 <SEP> 0;
02
<tb> 4,63 <SEP> <B>1,00</B>
<tb> 4,36 <SEP> 0,13
<tb> 4,15 <SEP> 0,07
<tb> 3,99 <SEP> 0,13
<tb> 3,79 <SEP> 0,04
<tb> 3,65 <SEP> 0,50
<tb> 3,45 <SEP> 0,27
<tb> 3,33 <SEP> 0,01
<tb> 3,28 <SEP> 0,10
<tb> 3,11 <SEP> 0,33
<tb> 3,00 <SEP> 0,10
<tb> 2,90 <SEP> 0,03
<tb> 2,82 <SEP> 0,02
<tb> 2,68 <SEP> 0,07
<tb> 2,59 <SEP> 0,07
<tb> 2,47 <SEP> 0,07
<tb> 2,46 <SEP> 0,01
<tb> 2,39 <SEP> 0;
03
<tb> 2,34 <SEP> 0,02
<tb> 2,27 <SEP> 0,02
<tb> 2,24 <SEP> 0,02
<tb> 2,18 <SEP> 0,02
<tb> 2,09 <SEP> 0,04
<tb> 2,01 <SEP> 0,04
<tb> 1,977 <SEP> 0,04
<tb> 1,870 <SEP> 0,02
<tb> 1,809 <SEP> 0,03
<tb> 1,747 <SEP> 0,03
<tb> 1,717 <SEP> 0,01
<tb> 1,657 <SEP> 0,02
<tb> 1,552 <SEP> 0,02 Anthelvencin-2-naphthalinsulfonat liefert ein posi tives Ergebnis beim Ehrlich-Test und negative Ergeb nisse beim Ninhydrintest auf a-Aminosäuren und beim Sakaguchi-Test auf Guanidinogruppen.
Es können auch andere Additionssalze hergestellt werden. So ist das Salicylsäuresalz von Anthelvencin eine weisse kristalline Festsubstanz, die bei etwa 153-.155 C schmilzt. Die Löslichkeitseigenschaften dieses :Salzes sind ähnlich wie diejenigen des 2-Naph- thalinsulfonats, mit Ausnahme einer etwas höheren Löslichkeit in kaltem Wasser.
Die elektrometrische Titration von Anthelvencin- salicylat in 66 % igem wässrigem Dimethylformamid zeigt das Vorliegen von titrierbaren Gruppen mit pK"rWerten von 9,75 und 11,98 und ein scheinbares Molekular gewicht von etwa 726.
Das Infrarotabsorptionsspektrum von Anthelvencinsalicylat, .das in Fig.2 gezeigt wird, besitzt innerhalb des Bereichs von 2,0-15,0,u die fol genden unterscheidungskräftigen Banden: 3,05; 3,42 (Mineralöl); 3,48 (Mineralöl); 3,65 (Schulter); 3,73 (Schulter); 4,00; 4,25 (schwach); 5,88; 6,10; 6,26; etwa 6,50 (breit); 6,73; 6,85 (Mineralöl); 7,24; 7,40; 7,69; 8,00; 8,15 (Schulter); 8,31; 8,68 (Schulter); 8,76; 8,92; 9,40 (schwach); 9,72; 10,43 (schwach); 11,27 (schwach); 11;66; 12,44; 13,2'2; 13,90; 14,27 und etwa 15,10 p.
Eine wässrige Lösung von Anthelvencinsalicylat zeigt in ihrem Ultraviolettabsorptionsspektrum zwei Maxima, eines bei 230 m,u mit einer Absorption von Ei - 508 eni und das andere bei 295 my mit einer Absorption von E i @m - 435.
Die Elementaranalyse von Anthelvencinsalicylat zeigt, dass das Salz die folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung aufweist: C 56,27 7o; H 5,62 %; N 17,97 %; <B>0</B> 20,09 %.
Die auf Grund .dieser Werte berechnete empirische Formel für das Salz lautet C33H,oN909, woraus sich für die freie Base Anthelvencin wiederum die Formel CinH'aN903 ergibt.
Anthelvencinsalicylat weist eine spezifische Drehung von +7,9 auf, bestimmt bei 25 C an Hand einer 1 % igen Lösung des Salzes in 95 % igem wässrigem Äthanol.
Andere Säuren, und zwar sowohl organische als auch anorganische, können ebenfalls zur Herstellung von Additionssalzen des Anthelvencins verwendet werden. Zu verwendbaren anorganischen Säuren gehören Salz säure, Schwefelsäure, Phosphorsäure und dergleichen.
Als Beispiele organischer Säuren, die zur Salzbildung verwendet werden können, seien erwähnt; Citronensäure, Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, p-Bromsalicyl- säure, Pikrinsäure, m-Nitrobenzoesäure, Flaviansäure, p-Nitrophthalsäure, p - (2 - Hydroxy -1- naphthylazo)- benzolsulfonsäure (Orange 1I) und dergleichen Säuren.
Im allgemeinen werden die Additionsalze des Anthel- veneins mit organischen Säuren vorzugsweise aus einem Salz mit einer anorganischen Säure hergestellt, wie z. B. aus dem Hydrochlorid.
Die vollständige Strukturformel von Anthelvencin konnte bis jetzt noch nicht bestimmt werden. Hydroly- tische Abbauuntersuchungen zeigen jedoch, dass Anthel- vencin einen oder mehrere Pyrrolreste und eine Viel zahl von Peptidverbindungen aufweist.
Die Abbau untersuchungen zeigen weiterhin, dass das Anthelvencin- molekül eine oder mehrere Einheiten von f-Alanin sowie entweder Glutaminsäure oder ein Bruchstück aufweist, das unter den Abbaubedingungen in Glutaminsäure um gewandelt wird.
Wie es bei Peptidantibiotica häufig der Fall ist, besteht das Anthelvencin, wie es normaler weise bei der fermentativen Herstellung erhalten wird, aus mindestens zwei eng verwandten Verbindungen, die im Anschluss hieran als Anthelvencin A und Anthel- vencin B bezeichnet werden. Die Bezeichnung Anthel- venein , wie sie hier verwendet wird, bezieht sich auf das Antibioticum in der Form, wie es bei der Fermen tation erhalten wird.
Die physikalischen Eigenschaften von Anthelvencin A und Anthelvencin B sind sehr ähnlich. Die Anti- biotica unterscheiden sich hauptsächlich durch ihr Ver halten in bestimmten chromatographischen Systemen. Ein besonders brauchbares Verfahren zur Unterschei dung der beiden Antibiotica besteht z. B. in einer Dünnschichtchromatographie an Kieselsäuregel mit einem Lösungsmittelsystem, das aus 15 Teilen n Butanol, 10 Teilen Pyridin, 1 Teil Eisessig und 12 Teilen Wasser besteht.
In einem solchen System kann der Rf-Wert für Anthelvencin A 0,5 betragen, während er für Anthel- v encin B<B>0,3</B> beträgt.
Anthelvencin kann eine Hemmwirkung gegen das Wachstum bestimmter Mikroorganismenstämme, ein schliesslich bakterieller Krankheitserreger und pilz- bzw. schwammartiger Pflanzenkrankheitserreger, ausüben. Qualitativ sind die mikrobiologischen Wirksamkeiten von Anthelvencin A und Anthelvencin B praktisch iden tisch.
Auf der Grundlage gleicher Gewichtsmengen ist jedoch die mikrobiologische Wirksamkeit von Anthel- vencin-A-naphthalinsulfonat etwa 2mal so gross wie diejenige des entsprechenden ,Salzes von Anthelvencin B. Die Konzentrationen in Anthelvencin, bei denen im allgemeinen eine Hemmung des Wachstums verschie dener Organismen festzustellen ist, werden zahlenmässig in Tabelle I angegeben.
Die Mindesthemmkonzentration konnte mit Hilfe des Agarverdünnungstestes oder mit Hilfe des Nährbrühen-Verdünnungstestes bestimmt werden, und .die Hemmkonzentrationen für die bakte riellen Krankheitserreger und die pilz- bzw. schwamm artigen Pflanzenkrankheitserreger wurden über einen Zeitraum von 72 Stunden bestimmt.
Beim Agarverdünnungstest wird der Testorganismus vorzugsweise auf eine Reihe von Agarplatten gestrichen bzw. implantiert, die verschiedene Konzentrationen an Anthelvencin im Agar enthalten, um die Mindestkon zentration des Antibiotikums in ,ug/cm3 zu bestimmen, bei der eine Hemmung des Wachstums des Organismus über einen Zeitraum von 48 Stunden eintritt.
Beim Nährbrühen- Verdünnungstest wird eine Reihe von Prüfröhrchen, die eine Nährbrühe mit verschiede nen Konzentrationen an Anthelvencin enthalten, mit dem Testorganismus beimpft, um die Mindestkonzen tration Anthelvencin in ,ug/cm3 in der Nährbrühe zu bestimmen, bei der eine Hemmung des Wachstums des Organismus über einen Zeitraum von etwa 24 Stun den eintritt.
EMI0003.0054
<I>Tabelle <SEP> 1</I>
<tb> Mindest Testorganismus <SEP> hemmkonzentration
<tb> ,ug/cm3 <SEP> 24 <SEP> Std.
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 25,0
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 50,0
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 12,5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 1,56
<tb> myco. <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 50,0
<tb> myco.
<SEP> avium <SEP> 25,0
EMI0003.0055
<I>Tabelle <SEP> 1</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Mindest Testorganismus <SEP> hemmkonzentration
<tb> ,ug/cm3 <SEP> 24 <SEP> Std.
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 12,5
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 25,0
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> <B>100,0</B>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 25,0
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 50,0
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 50,0
<tb> Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP> 50,0
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> 6,25
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> <B>100,0</B>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 3,13
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> 3,13 <SEP> a
<tb> Argobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> 12,5
<tb> Corynebacterium <SEP> michiganense <SEP> 1,56
<tb> Erwinia <SEP> amylovora <SEP> 6,25
<tb> Pseudomonas <SEP> solanacearum <SEP> 6,
25
<tb> Xanthomonas <SEP> phaseoli <SEP> <B>12,5</B>
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 6,25
<tb> Botrytis <SEP> cinerea <SEP> 6,25
<tb> Caratostomella <SEP> ulmi <SEP> 25,0
<tb> Collletotrichum <SEP> pisi <SEP> 12,5
<tb> Endoconidiophora <SEP> fagacearum <SEP> 50,0
<tb> Fusarium <SEP> moniliforme <SEP> 50,0
<tb> Carotostomellaulmi <SEP> 25,0
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum <SEP> 12,5
<tb> Penicillium <SEP> expansum <SEP> 50,0
<tb> Phoma <SEP> pigmentovora <SEP> 100,0
<tb> Polyporus <SEP> ostreatus <SEP> 3,13
<tb> Pullularia <SEP> sp. <SEP> 100,0
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> 50,0
<tb> a) <SEP> bestimmt <SEP> während <SEP> 48 <SEP> Stunden Mit dem .Salicylsäuresalz des Anthelvencins werden identische Werte erhalten.
Aus diesen Daten ist ersicht lich, dass Anthelvencin in Form seiner äureadditions- salze zur Unterdrückung des Wachstums der verschie densten pathogenen Organismen brauchbar ist.
Die Säureadditionssalze des Anthelveneins können weiterhin zur Bekämpfung von Eingeweidewürmern und verschiedenen anderen Typen von parasitären Orga nismen gebraucht werden. So hat sich z.
B. eine Wirk samkeit gegenüber beiden Arten des Mäuse-Maden- wurmes, Syphacia obvelata und As,pivuluris tetraptera, und gegenüber den Schweinewürmern Ascaria summ,
Oeseophagostumum spp. und Trichuris suis gezeigt. Bei Einverleibung in die tägliche Futterration von Schweinen für einen Zeitraum von mindestens 35 Tagen erweisen sich die Anthelvencinsalze bei einer Konzen tration von nur 12 g je Tonne Futter als wirksam, den Wurmbefall der Tiere zu verringern. Kombinationen von Anthelvencin mit anderen Substanzen mit Anthel- minticumeigenschaften, wie z.
B. mit Piperazin, Hygro- mycin B und dergleichen, können ebenfalls verwendet werden. Weitere Organismen, die mit Hilfe von Anthel- vencin bekämpft werden können, sind u. a. Escherichia coli, Proteus vulgaris, Entamoeba histolytica und der gleichen.
Die akute Toxizität von Anthelvencinsalicylat konnte an der Maus bestimmt werden. Oral beträgt der LDäo- Wert dieses Salzes mehr als 500 mg/kg. Der LD5o-Wert von Anthelvencinsalicylat beträgt etwa 175 mg/kg, wenn das Arzneimittel intraperitoneal injiziert wird.
Anthelvencin wird durch Züchten von bisher unbe kannten Stämmen von Streptomyces venezuelae unter aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium ,erhalten, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff und Stick stoff sowie anorganische Salze enthält. Die Organismen konnten zuerst aus Bodenproben isoliert werden. Anteile der Bodenproben wurden vorzugsweise in sterilem, destilliertem Wasser suspendiert und die Suspensionen auf Nähragarplatten gestrichen.
Die beimpften Nähr- agarplatten wurden in der Regel mehrere Tage bei etwa 25-35 C bebrütet. Am Ende der Bebrütungszeit wur den die Kolonien der Anthelvencin bildenden Orga nismen mit Hilfe einer sterilen Platinöse auf Schrägagar- medien übertragen. Die beimpften Schrägagarmedien wurden bebrütet, um grössere Mengen an Impfkultur zur Herstellung von Anthelvencin erhalten zu können.
Die neuartigen Organismen, die zur Bildung von Anthelvencin befähigt sind, sind bei der American Type Culture Collection, Washington, D. C., USA, hinterlegt worden und stehen der Öffentlichkeit unter den ATCC- Hinterlegungsnummern 14583, 14584 und 14585 zur Verfügung.
Wegen der Unsicherheit, die bei klassifizierenden Untersuchungen bei der Streptomyces-Gruppe der Mikroorganismen besteht, ist die Klassifizierung eines neu entdeckten Organismus stets mit gewissen Zweifeln behaftet. Die Anthelvencin bildenden Organismen schei nen jedoch in ihren wichtigsten Eigenschaften den Be schreibungen am nächsten zu kommen, die für die Organismen S. cinnamonensis, S. roseoflavus und S. venezuelae (NRRL 902) gegeben worden sind, die sämtlich bestimmten Stämmen von S.lavendulae mit geraden Sporenketten ähneln.
Trotz gewisser Ähnlich- keiten bestehen jedoch ausreichende Unterschiede, um die neuartigen Organismen, die im erfindungsgemässen Verfahren zur Herstellung von Anthelvencin verwendet werden, von sämtlichen bisher beschriebenen Orga nismen zu unterscheiden. Die neuen Organismen kom men den obengenannten S. venezuelae (NRRL 902) in ihren Eigenschaften näher als irgendeinem anderen bisher beschriebenen Organismus. Zwischen den neuen Kulturen und S. venezuelae (NRRL 902) bestehen jedoch zahlreiche Unterschiede.
Die neuartigen Orga nismen des vorliegenden erfindungsgemässen Verfahrens sind daher als neue Stämme von S. venezuelae anzu sehen.
Die folgende ausführliche Beschreibung bezieht sich auf die neu aufgefundenen Organismen ATCC 14583, 14584 und 14585 und deren Verwendung zur erfin dungsgemässen Herstellung von Anthelvencin durch Züchten von Mutanten dieser Antfhelvencin bildenden Organismen. Derartige andere Mutanten können nach bekannten Verfahren erhalten werden, wie z. B. da durch, dass man einen der obigen Stämme mit Röntgen strahlen oder Ultraviolettstrahlen oder mit chemischen Mitteln, wie z. B. mit Stickstofflostverbindungen, be handelt.
Bei den Klassifizierungsuntersuchungen der Anthel- vencin bildenden Stämmen von C. venezuelae ATCC 14583, 14584 und 14585 konnten Verfahren ange wendet werden, wie sie bei der Klassifizierung von Antinomyceten üblich sind. Die Kohlenstoffverwertungs- Prüfversuche wurden nach dem Verfahren von Prid- ham und Gottlieb, J. Bact. 56, 107 (1948), durchge führt.
Die bei den klassifizierenden Untersuchungen erhaltenen Daten werden im folgenden in Tabellenform angegeben. Die in Klammern gegebenen Zahlen bezie hen sich auf die Farbtafeln von Maers und Paul, Dictio- nary of Color (1950). Die Kulturen wurden in der Regel bei 30 C gezüchtet und die morphologischen, physiologischen und Züchtungseigenschaften nach 14tägiger Bebrütung und die Kohlenstoffverwertung nach 10 Tagen Bebrütung bestimmt.
EMI0004.0079
<I>Tabelle <SEP> 11</I>
<tb> Beschreibung <SEP> der <SEP> Kulturen <SEP> ATCC <SEP> 14583, <SEP> 14584 <SEP> und <SEP> 14585
<tb> Verglichene <SEP> Eigenschaften <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Morphologie <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder <SEP> Sporenketten <SEP> gerade <SEP> oder
<tb> gekrümmt; <SEP> Sporen <SEP> gekrümmt; <SEP> Sporen <SEP> gekrümmt; <SEP> Sporen
<tb> 0,7-1,0<I>,u <SEP> X</I> <SEP> 1,0-1,8<I>,u,</I> <SEP> 0,7-1,0 <SEP> <I>,u <SEP> X</I> <SEP> 1,0-1,8 <SEP> <I>,u,</I> <SEP> 0,7-1,0 <SEP> <I>,u <SEP> X</I> <SEP> 1,2-1,8 <SEP> <I>,It,</I>
<tb> oval <SEP> bis <SEP> zylindrisch. <SEP> oval <SEP> bis <SEP> zylindrisch. <SEP> zylindrisch.
<tb> Kolonieeigenschaften <SEP> auf: <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<tb> Tomatenpaste- <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich,
<tb> Hafermehl <SEP> rosagrau <SEP> (43-1B); <SEP> Rück- <SEP> hellgrau <SEP> (35-A1); <SEP> Rück- <SEP> rosagrau <SEP> (51-2A); <SEP> Rück seite <SEP> rotbraun <SEP> <B>(</B>16-11A); <SEP> Seite <SEP> braun <SEP> (15-E7); <SEP> Seite <SEP> dunkel <SEP> rotbraun
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> (8-9H); <SEP> lösliches <SEP> Pigment
<tb> dunkel <SEP> rotbraun.
<tb> Nähragar <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend; <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend; <SEP> Wachstum <SEP> befriedigend;
<tb> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> kein <SEP> Luftmycel; <SEP> Rück Rückseite <SEP> gelb <SEP> (10-1E); <SEP> Rückseite <SEP> gelb <SEP> (11L7);
<SEP> Seite <SEP> gelb <SEP> (10-3H);
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> Hefe <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<tb> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> spärlich,
<tb> hellgrau <SEP> (20=1A); <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (4-A8); <SEP> weiss <SEP> (1-1B);
<tb> Rückseite <SEP> hell <SEP> rotbraun; <SEP> Rückseite <SEP> braun <SEP> (14-J8); <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun;
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
EMI0005.0001
<I>Tabelle <SEP> 11</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Verglichene <SEP> Eigenschaften <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Salze-Stärke-Agar <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich; <SEP> Wachstum <SEP> reichlich;
<tb> Luftmycel, <SEP> grauweiss <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich, <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> reichlich,
<tb> (12-1A); <SEP> Rückseite <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (10-A2); <SEP> hell <SEP> orangegelb <SEP> (9-2A);
<tb> braun <SEP> (14-11G); <SEP> Rückseite <SEP> braun <SEP> (14A5); <SEP> Rückseite <SEP> braun <SEP> (8-10J);
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> sehr <SEP> hellbraunes <SEP> lösliches
<tb> Pigment.
<tb> Czapekscher <SEP> Agar <SEP> Wachstum <SEP> mässig; <SEP> Wachstum <SEP> mässig;
<SEP> Wachstum <SEP> mässig;
<tb> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> nahezu <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> weiss <SEP> Luftmycel <SEP> mässig, <SEP> weiss;
<tb> weiss <SEP> (2-7A); <SEP> bis <SEP> hellbraun <SEP> (3-B7, <SEP> 3A8); <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun <SEP> (5-9G);
<tb> Rückseite <SEP> gelb <SEP> (11-4J); <SEP> Rückseite <SEP> rotbraun <SEP> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> kein <SEP> lösliches <SEP> Pigment. <SEP> (7-H9);
<SEP> schwach <SEP> rotes
<tb> lösliches <SEP> Pigment.
<tb> Einwirkung <SEP> auf <SEP> Milch <SEP> Koagulierung, <SEP> Reichlich <SEP> bräunlichgelbes <SEP> Koagulation,
<tb> Peptonisierung. <SEP> Oberflächenwachstum, <SEP> Peptonisierung.
<tb> Koagulierung, <SEP> teilweise
<tb> Peptonisierung.
<tb> Nährgelatine <SEP> vollständige <SEP> Verflüssigung <SEP> 50 <SEP> % <SEP> ige <SEP> Verflüssigung <SEP> vollständige <SEP> Verflüssigung
<tb> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen. <SEP> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen. <SEP> nach <SEP> 19 <SEP> Tagen.
<tb> Nitratredukthon <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> H,-S-Bildung <SEP> - <SEP> - <SEP> In <SEP> der <SEP> folgenden <SEP> Tabelle <SEP> III <SEP> sind <SEP> die <SEP> Ergebnisse <SEP> suche <SEP> wiedergegeben.
<SEP> In <SEP> der <SEP> Tabelle <SEP> wurden <SEP> die <SEP> folgen der <SEP> an <SEP> den <SEP> Organismen <SEP> ATCC <SEP> 14583, <SEP> 14584 <SEP> und <SEP> den <SEP> Symbole <SEP> verwendet:
<tb> 14585 <SEP> durchgeführten <SEP> Kohlenstoffverwertungs-Prüfver + <SEP> = <SEP> Wachstum <SEP> und <SEP> Verwertung
<tb> - <SEP> = <SEP> Wachstum <SEP> oder <SEP> Verwertung <SEP> nicht <SEP> erkennbar.
EMI0005.0002
<I>Tabelle <SEP> 111</I>
<tb> Kohlenstoffverwertung <SEP> von <SEP> Anthelvencin <SEP> bildenden <SEP> Organismen
<tb> Subtrat <SEP> Wachstum
<tb> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 15484 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> L <SEP> (+)-Arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> L <SEP> (+)-Rhamnose <SEP> - <SEP> - <SEP> D-Ribose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D <SEP> (+) <SEP> Xylose <SEP> + <SEP> + <SEP> Dexeose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D <SEP> (-)Fructose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> - <SEP> Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Saccharose <SEP> - <SEP> - <SEP> D <SEP> (+)-Trehalose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> - <SEP> - <SEP> D <SEP> (+)
-Raffinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> i-Inosit <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Mannit <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Sorbit <SEP> - <SEP> - <SEP> Cellulose <SEP> - <SEP> - <SEP> Salicin <SEP> + <SEP> + <SEP> + Bei der Herstellung von Anthelvencin durch Züchten der oben beschriebenen Organismen können die ver- schiedensten Kulturmedien verwendet werden, da aus den Ergebnissen der oben beschriebenen Verwertungs- Prüfversuche ersichtlich ist, dass die Organismen ver schiedene Energiequellen zu verwerten vermögen.
Aus Gründen einer wirtschaftlichen Herstellung, einer maxi malen Ausbeute an Antibioticum und der Leichtigkeit der Isolierung des Antibioticums sind jedoch bestimmte Kulturmedien vorzuziehen, die verhältnismässig einfache Nährstoffquellen enthalten. Zum Beispiel enthalten die Medien, die zur Herstellung von Anthelvencin brauch bar sind, eine assimilierbare Quelle für Kohlenstoff, wie z. B.
Glukose, Fructose, Maltose, Mannose, lösliche Stärke, Melassen, Dextrin, braunen Zucker, Maisquell- feststoffe und dergleichen. .Eine bevorzugte Quelle für Kohlenstoff ist Glukose. Zusätzlich enthalten die ver wendbaren Medien eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, wie z. B. Hafermehl, Rindfleischextrakt, Pep tone (aus Fleisch oder Sojabohnen), hydrolysiertes Casein, Hefe, Aminosäuregemische und dergleichen.
Zur Zeit bevorzugte Stickstoffquellen sind P'eptone, hydrolysiertes Casein und Rindfleischextrakte.
Mineralsalze, wie z. B. solche, .die Calcium-, Magne sium-, Natrium-, Kalium-, Chlorid-, Sulfat- und Carbo- nationen liefern, sowie eine Quelle für Wachstumsfakto ren, wie z. B. Hefe oder Hefeextrakt, sind in die Medien mit günstigen Ergebnissen einverleibt..
Wie bei vielen Mikroorganismen ist es wünschens wert anzusehen, dem für die Züchtung der-erfindungs- gemässen hergestellten Actinomyceten benutzten Kultur medium die sogenannten Spurenelemente zuzusetzen. Diese Spurenelemente werden gewöhnlich als Verunrei nigungen zwang ,läufig mit der Zugabe der anderen Bestandteile des Mediums zugeführt.
Der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums kann innerhalb breiter Grenzen variiert werden. Es hat sich jedoch als wünschenswert erwiesen, den Anfangs-pH- Wert des Mediums zwischen etwa 6,0 und etwa 7,5 und vorzugsweise zwischen etwa 6,5 und etwa 7,3 ein zustellen. Wie es bei anderen Actinomyceten beobachtet worden ist, erhöht sich der pH-Wert des Mediums allmählich während der ganzen Wachstumsperiode des Organismus, während Anthelvencin gebildet wird und kann eine Höhe von etwa 7,0 bis etwa 8,0 oder dar über erreichen.
Der End-pH-Wert ist mindestens zum Teil vom Anfangs-pH-Wert des Mediums, den im Medium vorhandenen Puffersubstanzen und der Zeit dauer abhängig, die der Organismus wachsen gelassen wird.
Die aeroben Tauchkulturbedingungen können bei der Herstellung von Anthelvencin verschieden sein. Zur Herstellung verhältnismässig kleiner Mengen kön nen Schüttelflaschen und Oberflächenkulturen in Fla schen verwendet werden; für die Herstellung grosser Mengen ist jedoch die aerobe Tauchkultur in Steril tanks vorzuziehen. Das in dem Steriltank befindliche Medium kann mit einer Sporensusp.ension beimpft wer den; wegen der Wachstumsverzögerung, die bei Ver wendung einer Sporensuspension als Impfmaterial be obachtet wird, ist jedoch die vegetative Form der Kultur zu bevorzugen.
Indem man auf diese Weise die Wachs tumsverzögerung vermeidet, erreicht man eine wirksamere Ausnutzung der Fermentationsanlagen. Dementspre chend ist es wünschenswert, zunächst eine vegetative Impfkultur des Organismus herzustellen, indem man eine verhältnismässig geringe Menge Kulturmedium mit der Sporenform des Organismus beimpft; und wenn eine junge, aktive vegetative Impfkultur erhalten wor den ist., wird die vegetative Impfkultur unter asep tischen Bedingungen auf den grossen Fermentationstank übertragen.
Das Medium, in dem die vegetative Impf kultur hergestellt wird, kann entweder das gleiche oder ein anderes als das Medium sein, das für die im grossen Massstabe erfolgende Herstellung von Anthelvencin ver wendet wird.
Die Organismen wachsen in der Regel am besten bei Temperaturen im Bereich von etwa 26-33 C. Eine optimale Anthelvencinbildung scheint bei Tempe raturen von etwa 26-30 C stattzufinden.
Wie es bei unter aeroben Bedingungen durchgeführ ten Tauchkulturverfahren üblich ist, wird insbesondere sterile Luft durch das Kulturmedium geblasen. Zur Er zielung eines wirksamen Wachstums des Organismus und einer wirksamen Anthelvencinbildung beträgt das bei der Tankherstellung von Anthelvencin verwendete Luftvolumen vorzugsweise mindestens 0,1 Volumteil Luft je Minute und je Volumteil Kulturmedium.
Die Zunahme der Anth:elvencinaktivität in dem Kulturmedium kann während der Fermentationsdauer leicht verfolgt werden, indem man aus dem Kultur medium entnommene Proben auf ihre Hemmwirksam keit gegenüber dem Wachstum eines Organismus, von dem bekannt ist, dass sein Wachstum in Gegenwart von Anthelvenein gehemmt wird, prüft. Die Verwendung des Organismus Bacillus subtilis hat sich für diesen Zweck als geeignet erwiesen. Die Prüfung kann unter Anwendung wohlbekannter Trübungsmessungsverfahren oder Becher-Platten-Verfahren erfolgen.
Im allgemeinen findet eine maximale Bildung des Antibioticums innerhalb von etwa 4-7 Tagen nach der Beimpfung des Kulturmediums statt, wenn eine aerobe Tauchkultur oder eine Schüttelflaschenkultur angewen det wird, sowie innerhalb von etwa 5-10 Tagen, wenn eine Oberflächenkultur durchgeführt wird.
Das Mycel und die ungelösten Feststoffe werden im allgemeinen aus der Fermentationsbrühe mit Hilfe bekannter Mittel, wie z. B. durch Filtrieren oder Zen trifugieren, entfernt, gewöhnlich nach Einstellung des pH-Wertes auf etwa 3,5. Die antibiotische Wirksamkeit ist in der filtrierten Brühe enthalten und kann aus ihr unter Anwendung der üblichen Adsorptionsverfahren entfernt werden.
Es können die verschiedensten Adsorp- tionsmittel verwendet werden, jedoch werden im allge meinen Ionenaustauschharze von saurem Charakter be- vorzugt. Ein besonderes bevorzugtes Harz ist IRC-50 , ein schwach kationisches Carbonsäureharz, das von der Rohm and Haas Company auf den Markt gebracht wird.
Bei der Anwendung des Säulenadsorptionsverfahrens kann das Anthelvencin isoliert werden, indem man die filtrierte Brühe durch eine Säule gibt, die mit einem geeigneten lonenaustauschharz, wie z. B. IRC-50 , be schickt ist. Wenn 1 Teil Harz je 30-35 Teile filtrierter Brühe verwendet werden, wird üblicherweise eine prak tisch vollständige Entfernung des Anthelvencins aus der Fermentationsbrühe erreicht, wenn die Fliessgeschwin digkeit durch eine Säule mit einem Durchmesser von 7,62 cm bei etwa 5-10 cm2 je Minute gehalten wird.
Die Säule wird dann gründlich mit Wasser gewaschen, bis das Eluat farblos ist, und die antibiotische Wirksamkeit aus der Säule unter Verwendung eines Lösungsmittels eluiert, das eine verdünnte wässrige Säure und ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel enthält.
So hat sich ein Lösungsmittelgemisch, das aus 80 Volum- teilen 0,5 n Salzsäure und 20 Volumteilen Aceton be steht, als zur Eluierung der Anthelvencinwirksamkeit hoch wirksam erwiesen.
Zur Entfernung gewisser begleitender Verunreini gungen kann der pH-Wert des Eluats mit einer Base auf etwa 5,5 ,eingestellt werden, und das Eluat kann auf etwa seines ursprünglichen Volumens eingeengt, das eingeengte Eluat mit etwa 3 Vollumina Aceton unter Rühren versetzt und der pH-Wert des erhaltenen Ge misches erneut auf etwa 8,5 eingestellt werden.
Das Gemisch wird dann vorzugsweise durch eine Säule ge geben, die mit Florisil mit einer Teilchengrösse ent sprechend 0,149-0,250 mm lichter Siebmaschenweite (ein von der Floridin Company auf den Markt ge brachtes Magnesiumsilikat-Adsorptionsmittel) gefüllt ist, um färbende Substanzen und teerartige Stoffe zu ent fernen.
Die Säule wird weiter mit 75 % igem wässrigem Aceton gewaschen, bis sich das Eluat gegenüber Ehrlich- schem Reagenz negativ verhält, worauf man das ur sprüngliche Eluat und die Waschflüssigkeiten gewöhn lich vereinigt und einengt. Zu dem Konzentrat wird in der Regel Natriumchlorid in einer Menge von etwa 250 g je Liter Konzentrat gegeben. Der sich abschei dende dunkle, ölige Rückstand kann dann entfernt, das Gemisch filtriert und das klare Filtrat mit Benzyl- alkohol extrahiert werden.
Das Wasser wird üblicher weise aus den Benzylalkoholextrakten im Vakuum ent fernt und die erhaltene trockene Lösung in Benzyl- alkohol langsam zu etwa 9 Volumina Aceton gegeben. Beim Kühlen des erhaltenen Gemisches scheidet sich vor allem das Hydrochlorid des Anthelvencins ab. Das auf diese Weise erhaltene Produkt besteht in der Hauptsache aus dem Hydrochlorid von Anthelvencin A und enthält eine kleinere Menge Anthelvencin-B-hydro- chlorid.
Von Anthelvencin B freies Anthelvencin A kann in Form eines seiner Säureadditionssalze erhalten wer den, indem man das wie oben beschriebene Präparat einer weiteren Behandlung unterwirft: So kann z. B. das Gemisch der Anthelvencinhydrochloride in einem Lö- sungsmittelsystem, das n Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser enthält, gelöst und die erhaltene Lösung durch eine Säule gegeben werden, die mit vorbehandel tem Cellulosepulver beschickt ist.
Das Cellulosepulver ist vor allem in Wasser zu einer Ausschlämmung suspen diert, sodann abfiltriert und erneut nacheinander in 0,2 n wässriger Salzsäure, Wasser und einem aus n Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15:10:1 :12 bestehenden Lösungsmittelsystem suspendiert worden.
Das aus der Säule fliessende Eluat wird vorzugsweise in regelmässigen Zeitabständen frak tioniert aufgefangen und der Verlauf der chromatogra- phischen Fraktionierung durch Prüfung der Fraktionen mit Hilfe der Dünnschichtschromatographie überwacht. Die zuerst aufgefangenen Fraktionen enthalten lediglich Anthelvencin-A-hydrochlorid. Sie werden von Zwischen fraktionen gefolgt, die die Salze beider Anthelvencine enthalten. In den zuletzt aufgefangenen Fraktionen ist in der Regel reines Anthelvencin-B-hydrochlorid ent halten.
Diejenigen Fraktionen, die reines Anthelvencin- A-hydrochlorid bzw. Anthelvencin-B-hydrochlorid ent halten, werden zusammengefasst und zur Trockne ein gedampft, wobei reine Abscheidungen des Hydro- chlorids von Anthelvencin A bzw. Anthelvencin B er halten werden können.
Zur Trennung des Gemisches von Anthelvencin A und B in seine Einzelbestandteile können auch andere Salze als die Hydrochloride benutzt werden. So kann man z. B. das Gemisch der Hydrochloride in ein Ge misch umwandeln, das die Naphthalinsulfonat- oder Salicylatsalze enthält, und sodann dieses Gemisch in ähnlicher Weise chromatographisch fraktionieren, um das entsprechende Salz von Anthelvencin A frei von dem Salz des Anthelvencins B zu erhalten.
<I>Beispiel 1</I> Herstellung von Anthelvencin Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATCC 14584 wird hergestellt, indem man den Organismus auf einem Schrägnähragar wachsen lässt. Der Nähragar wird aus 65 g Hafermehl hergestellt, das zu einer Auf- schlämmung verkocht und durchgeseiht und mit 20 g Agar und genügend Wasser vermischt wird, um ein Gesamtvolumen von 1 Liter zu erhalten.
Das Schräg nährmedium wird mit Sporen von S. venezuelae ATCC 14584 beimpft und 5 Tage bei 30 C bebrütet. Das auf dem Schrägnährmedium befindliche Kulturwachstum wird mit etwa 6 cm,', destilliertem Wasser bedeckt, und das Schrägnährmedium wird vorsichtig abgekratzt, um eine wässrige Suspension der Organismen zu erhalten.
1 cm3 der auf diese Weise erhaltenen Suspension wird verwendet, um unter aseptischen Bedingungen <B>100</B> cm3 eines sterilen vegetativen Kulturmediums der folgenden Zusammensetzung anzuimpfen: Cerelose 15 g Sojabohnenmehl 15 g Maisquellflüssigkeit 5 g Natriumchlorid 5 g Calciumcarbonat 2 g Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter Das angeimpfte vegetative Medium wird 48 .Stunden bei etwa 30 C bebrütet.
Innerhalb dieser Zeit werden die Kolben auf einer Schüttelmaschine, die sich jeweils um 5 cm hin und her bewegt, mit einer Geschwindig keit von 108 Schüttelbewegungen pro Minute geschüttelt.
5 cm,' der vegetativen Impfkultur werden zum asep tischen Beimpfen von 100-cm-3-Anteilen eines in 500- cm3-Erlenmeyerkolben enthaltenen Mediums verwendet, das 30 Minuten bei 120 C sterilisiert worden ist und die folgende Zusammensetzung aufweist: Sojabohnenmehl 15 g Casein 1 g Natriumnitrat 3 g Roher Glukosesirup 20 cm3 Calciumcarbonat 2,5 g Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter Die beimpfte Kultur wird 5 Tage bei etwa 30 C bebrütet, wobei wie oben beschrieben auf einer Schüttel maschine geschüttelt wird.
Der pH-Wert des Ausgangs mediums beträgt etwa 6,9. Am Ende der Bebrütungs- zeit hat sich der pH-Wert des Mediums auf etwa 7,3 erhöht.
Die auf diese Weise erhaltene Kulturbrühe wird zur Entfernung des Mycels und der ungelösten Feststoffe filtriert. Die filtrierte Brühe enthält das von den Orga nismen gebildete Anthelvencin.
<I>Beispiel 2</I> Herstellung von Anthelveneinhydrochlorid Eine Kultur von Streptomyces venezuelae ATCC 1.4584 wird wie in Beispiel 1 unter Verwendung eines Nährmediums hergestellt, das 20 g Stärke, 3 g Rind fleischextrakt, 1 g Asparagin, 20 g Agar und Wasser in einer solchen Menge, wie zum Auffüllen bis auf ,ein Gesamtvolumen von 1 Liter erforderlich ist, enthält. Die Schrägkulturen werden 5-7 Tage bei einer Tempe ratur von etwa 30 C wachsen gelassen.
Die auf der Schrägkultur gewachsenen Organismen werden dann wie in Beispiel 1 beschrieben isoliert, und 1 cm3 der auf diese Weise erhaltenen Suspension wer den zum aseptischen Beimpfen von 100 cm3 eines steri lisierten vegetativen Kulturmediums verwendet, die sich in einem 500-cm3 Erlenmeyerkolben befinden und die folgende Zusammensetzung aufweisen Dextrose,
technisch rein 15 g Sojabohnenölmehl mit Lösungsmitteln extrahiert 15 g Maisquellflüssigkeit 10 g Natriumchlorid 5 g Calciumcarbonat 2 g Wasser bis auf ein Gesamtvolumen von 1 Liter Das beimpfte Medium wird 24 Stunden bei<B>301C</B> bebrütet, wobei auf einer Drehschüttelmaschine, die Schüttelbewegungen von 5 cm bewirkt, mit 250 Schüttel bewegungen pro Minute geschüttelt wird.
Etwa 25 cm3 der erhaltenen vegetativen Kultur werden dann mit Hilfe einer sterilen Pipette in einen abgeänderten 4-Liter- Erlenmeyerkolben eingeführt, der 1 Liter eines Mediums der gleichen Zusammensetzung aufweist. Die Bebrütung wird 48 Stunden unter den beschriebenen Bedingungen durchgeführt.
Der gesamte Inhalt des Kolbens, der die vegetative Kultur enthält, wird in einen mit Prallplatten versehenen 45 Liter Fermentationsbehälter aus rost freiem Stahl überführt, der mit je 2 Rührblättern aus gestatteten Turbinenrührern von 12,7 cm Durchmesser versehen ist und 28 Liter eines Produktionsmediums der folgenden Zusammensetzung enthält:
Dextrose, technisch rein 30 g Sojabohnenölmehl mit Lösungsmitteln extrahiert 20 g Natriumnitrat 3 g Calciumcarbonat 5 g Baumwollsamenöl 2 cm3 Casein 2 g Wasser bis auf 1 Liter Die Fermentation wird bei 30 C 4 Tage unter Rühren mit einer Geschwindigkeit von 400'-450 Um drehungen pro Minute durchgeführt. Das Schäumen wird, falls erforderlich, durch Zugabe von Sojabohnenöl geregelt.
Während der ganzen Dauer der Fermentation wird das Medium durch Einführung von steriler Luft mit einer Geschwindigkeit von etwa 30 Litern pro Minute belüftet. Am Ende der Fermentationadauer wird die gesamte Brühe mit 5 n Schwefelsäure auf etwa pH = 3,5 eingestellt, worauf etwa 3 % (Gewicht/Volu- men) eines handelsüblichen Filtrierhilfsmittels zugegeben werden. Nach dem Filtrieren liegen etwa 22 Liter fil trierte Fermentationsbrühe vor.
Die aus 4 Tank-Fermentationen vereinigten Fer- mentationsbrühen werden durch eine Säule mit 7,62 cm Durchmesser gegeben, die .etwa 2650 cm3 feuchtes IRC- 50-Harz in der Säureform enthält. Wenn die Fliessge schwindigkeit auf etwa 6 cm3 je Minute eingestellt wird, weist die aus der Säule herausfliessende Flüssigkeit; keine biologische Aktivität auf, was anzeigt, dass die Adsorp- tion des Antibioticums am Harz praktisch vollständig ist.
Wenn die gesamte Menge der filtrierten Fermen tationsbrühe, insgesamt etwa 88 Liter, durch die Säule gegeben worden sind, wird die Säule wiederholt mit Wasser gewaschen, bis das Waschwasser farblos ist.
Das Anthelvencin wird aus der Säule wie folgt isoliert: Die Säule wird ununterbrochen mit einem Ge misch aus 30 VolA Aceton und 70 Vol. % 0,5n wässriger Salzsäure so lange eluiert, wie das Eluat auf Ehrlichsches Reagenz positiv reagiert. Eine Gesamtmenge von etwa 10;4 Liter Eluat wird aufgefangen. Das Eluat wird mit <B>10</B> % iger wässriger Natriumhydroxydlösung auf etwa pH = 5,5 eingestellt und auf ein Volumen von etwa 8,5 Litern eingeengt.
Zu dem eingeengten Eluat werden unter Rühren 3 Volumina Aceton gegeben, und der pH-Wert des erhaltenen Gemisches wird weiter bis auf etwa 8,5 eingestellt. Das Gemisch wird durch eine Säule gegeben, die mit etwa 1750 cm3 feuchtem Florisil , mit einer Teilchengrösse entsprechend 0,149-0,250 mm lichter Siebmaschenweite gefüllt ist, um färbende und teerartige Substanzen zu entfernen. Die Säule wird dann mit 75 % igem wässrigem Aceton gewaschen, bis die Waschflüssigkeit gegenüber dem Ehrlich Reagenz negativ reagiert.
Das ursprüngliche Eluat und die Waschflüssig- keiten werden vereinigt und auf ein Volumen von etwa 9 Litern eingeengt, worauf 2250g Natriumchlorid zuge geben werden. Der sich bildende dunkle, teerartige Rückstand wird abfiltriert und das erhaltene Filtrat 3mal mit je 90 cm3 Benzylalkohol extrahiert. Das restliche Wasser wird aus den vereinigten Extrakten unter Vakuum entfernt und die erhaltene benzylalkoholische Lösung langsam unter raschem Rühren zu 9 Volumina Aceton gegeben.
Nachdem über Nacht bei etwa 3 C stehengelassen worden ist, wird die abgeschiedene Fest substanz abfiltriert, gründlich mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Das auf diese Weise erhal tene Anthelvencinhydrochlorid kann der weiteren Reini gung unterworfen oder in ein anderes Salz umgewandelt werden, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben wird.
<I>Beispiel 3</I> Herstellung von Anthelvencinr2-naphthalinsulfonat Zu einer Lösung von 1 g Anthelvencinhydrochlorid, nach Beispiel 2 hergestellt, werden 40 cm3 einer 5 % igen wässrigen Lösung von Natrium-2-naphthalinsulfonat ge geben. Das Gemisch wird zur Erzielung einer vollstän digen Auflösung erwärmt und sodann langsam abkühlen gelassen. Ein dunkles Öl, das sich abzuscheiden beginnt, wenn die Temperatur der Lösung etwa 20 C erreicht, wird durch Zentrifugieren entfernt und die überstehende Lösung gekühlt, um das Anthelvencin-2-naphthalinsulfo- nat zur Kristallisation zu bringen.
<I>Beispiel 4</I> Herstellung von Anthelvencinsalicylat Zu 30 cm3 einer 5%igen wässrigen Lösung von Natriumsalicylat werden 1 g Anthelvencinhydrochlorid, hergestellt nach Beispiel 2, gegeben. Das Gemisch wird etwa 10 Minuten auf einem Wasserdampfbad erhitzt und in heissem Zustand filtriert, um ungelöste Festsubstanzen zu entfernen.
Das klare Filtrat wird auf Raumtempe ratur abkühlen gelassen und die Kristallisation durch Kratzen der Seitenwände des Kolbens mit einem Glas stab eingeleitet. Beim ersten Anzeichen einer Kristalli- sation wird das Gemisch auf etwa 3 C abgekühlt, um eine vollständige Kristallisation zu ermöglichen. Das kristalline Anthelvencinsalicylat wird abfiltriert, 2mal auf dem Filter mit je 10 cm3 Eiswasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd bei Raumtempe ratur getrocknet.
Die Umkristallisation erfolgt aus einer 2 ö igen wässrigen Natriumsalicylatlösung.
<I>Beispiel 5</I> Herstellung von Anthelvencin A, das von Anthelvencin B frei isst Eine Chromatographiesäule, die einen Durchmesser von 3,17 cm und eine Länge von 43,2 cm aufweist, wird mit einem in der folgenden Weise vorbehandelten Cellulosepulver beschickt;
eine Suspension von 100 g Whatman-Cellulosepulver (CM 70) wird hergestellt und etwa 30 Minuten gut gerührt. Die Cellulose wird ab filtriert und sodann erneut nacheinander in 0,2 n Salz säure, Wasser und einem Lösungsmittelgemisch suspen diert, das aus n Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser in einem Verhältnis von 15 :<B>10:</B> 1 :12 besteht.
Eine Lösung von 5 g Anthelvencinhydrochlorid, her gestellt nach Beispiel 2, in 40 cm3 des oben beschriebe nen Lösungsmittelsystems wird durch die Säule gegeben. Die Säule ist mit einem automatischen Fraktionssammler ausgestattet, der auf Zeitabstände von 30 Minuten ein gestellt ist.
Die Fliessgeschwindigkeit aus der Säule wird so eingestellt, dass innerhalb dieses Zeitintervalls etwa 5-7 om3 Eluat ausfliessen. Der Verlauf der chromatogra- phischen Fraktionierung wird durch Prüfung des Eluats in jedem 5. Rohr mit Hilfe einer Dünnschichtchromato- graphie auf Kieselsäuregel verfolgt.
Die beiden Anthel- vencine unterscheiden sich auf den Chromatographie- platten leicht infolge der Tatsache, dass sich die Salze des Anthelvencins A in diesem System rascher bewegen als die entsprechenden Salze des Anthelvencins B. Die Rf-Werte betragen in diesem System 0,5 bzw. 0,3. Die Fraktionen, die nach Bestimmung durch dieses Verfah ren lediglich Anthelvencin A enthalten, werden zusam mengefasst und zur Trockne eingedampft.
Das auf diese Weise erhaltene feste Anthelvencin-A-hydrochlorid kann weiter gereinigt oder nach dem Verfahren der Beispiele 4 und 5 in andere Salze des Anthelvencins A umge wandelt werden.
Die Fraktionen, die lediglich Anthelvencin B ent halten, werden ebenfalls zusammengefasst und in der gleichen Weise behandelt. Die Zwischenfraktionen, die sowohl Anthelvencin A als auch Anthelvencin B ent halten, können zur Erzielung einer weiteren Trennung einer weiteren Chromatographie unterworfen werden, um zusätzliche Mengen der reinen Einzelverbindungen zu erhalten.
Process for the production of anthelvenein The invention relates to a process for the production of a new type of antibiotic, which is referred to as anthelvenein, and its acid addition salts. These new compounds can be used in particular for the formulation of animal feed or additional feed.
Anthelvencin is a basic nitrogen-containing compound that is obtained when certain, previously not described strains of Acrynomycete Streptomyces venezuelae are grown under regulated conditions. As a free base, anthelvencin is relatively unstable. It is therefore preferably used and characterized in the form of addition salts with organic or inorganic, therapeutically suitable acids. The salts with 2 naphthalenesulfonic acid and salicylic acid are preferably used.
The various properties of anthelvencin in the form of its addition salt with 2-naphthalenesulfonic acid are described below.
Anthelvencin can also be contained in animal feed, additional feed or animal feed concentrates.
The process for the preparation of anthelvencin is characterized in that Streptomyces venezuelae ATCC 14583, Streptomyces venezuelae ATCC 14854 or Streptomyces venezuelae ATCC 14585 in a culture medium which contains assimilable sources of carbon and nitrogen and inorganic salts, cultivates an immersion culture under aerobic conditions.
Anthelvencin can also be used to treat worm diseases by administering to a parasitic host organism a therapeutically effective amount of a compound from the group consisting of anthelvencin and its acid addition salts with physiologically acceptable acids. Among the various acid addition salts is e.g. B. 2-naphthalenesulfonic acid salt of anthelvencin is known.
It is a white, crystalline solid substance which melts at around 18-183 C and is soluble in hot water, methanol, benzyl alcohol, dimethylformamide, dimethyl sulfoxide, phenol, methyl cellosolve and aqueous solvent mixtures such as aqueous acetone, aqueous alcohol and the like .
It is only weakly in ethanol and relatively insoluble in solvents such as cold water, isopropanol, acetone, ethyl acetate, ether, chloroform, benzene and the like.
The electrometric titration of anthelvencin-2-naphthalenesulfonate in 66% aqueous dimethylformamide shows the presence of two titratable groups with pKä values of 9.58 and 11.95. The apparent molecular weight determined from the titration curve is about 847.
An average of several microanalyses of anthelvencin-2-naphthalenesulfonate gives the following approximate percentage composition: C 54.78%; H 5.23%; N 14.66%; O 17.38%; , S 7.41%. The empirical formula of the salt that can best be reconciled with these data is C: 9H44N909S2, which gives the empirical formula of the free base anthelvencin as C @ gH "sN: 30.3.
The infrared absorption spectrum of anthelvencin 2-naphthalene sulfonate in a trituration in mineral oil is shown in FIG.
The distinctive bands in the infrared absorption curve within the range 2.0 to 15.0, µ are as follows: 2.79; 3.04; 3.20; 3.41 (mineral oil); 3.48 (mineral oil); 5.8: 6; 5.91 (shoulder); 6.08; 6.26; 6.47; 6.60 (shoulder); 6.83 (mineral oil); 6.95; 7.07; 7.22 (largely due to: mineral oil); 7.40; 7.55; 7.88; about 8.35 (wide); 8.55; 8.65; 8.79; 9.11; 9.36; 9.64; 10.10 (weak); 10.30; 10.49 (weak); 10.58; 10.95; 11.1l;
<B> 11.25; </B> 11.52; <B> 12.16; </B> 12.39; 12.98; 13.17; 13.38; 13.89 and 14.78, etc. The specific optical rotation of anthelvencin 2-naphthalenesulfonate - dried at room temperature in a vacuum desiccator over phosphorus pentoxide is +11.7 when the determination is made at a temperature of <B> 25 '</B> C in a 95% solution aqueous ethanol is carried out,
in which the concentration of the salt of the antibiotic is 1% (on a weight / volume basis).
The ultraviolet absorption spectrum of an aqueous solution of anthelvencin-2-naphthalene sulfonate shows a maximum at 225 my with an absorption of Ei / - @ 1 = 2180 and a further maximum at 285 m, y with an absorption of E i / m = 330.
A powder X-ray diffraction diagram of this salt using copper radiation filtered with the help of nickel and a wavelength value of 1.5405 A to characterize the interplanar spacing gives the following values:
EMI0002.0021
(d) <SEP> (I / Ii)
<tb> 11.70 <SEP> 0.10
<tb> 10.71 <SEP> 0.02
<tb> 9.50 <SEP> 0.10
<tb> 8.33 <SEP> 0.33
<tb> 8.00 <SEP> 0.02
<tb> 7.40 <SEP> 0.02
<tb> 7.07 <SEP> 0.10
<tb> 6.70 <SEP> 0.04
<tb> 6.25 <SEP> 0.20
<tb> 6.06 <SEP> 0.50
<tb> 5.86 <SEP> 0.27
<tb> 5.56 <SEP> 0.07
<tb> 5.23 <SEP> 0.20
<tb> 4.95 <SEP> 0;
02
<tb> 4.63 <SEP> <B> 1.00 </B>
<tb> 4.36 <SEP> 0.13
<tb> 4.15 <SEP> 0.07
<tb> 3.99 <SEP> 0.13
<tb> 3.79 <SEP> 0.04
<tb> 3.65 <SEP> 0.50
<tb> 3.45 <SEP> 0.27
<tb> 3.33 <SEP> 0.01
<tb> 3.28 <SEP> 0.10
<tb> 3.11 <SEP> 0.33
<tb> 3.00 <SEP> 0.10
<tb> 2.90 <SEP> 0.03
<tb> 2.82 <SEP> 0.02
<tb> 2.68 <SEP> 0.07
<tb> 2.59 <SEP> 0.07
<tb> 2.47 <SEP> 0.07
<tb> 2.46 <SEP> 0.01
<tb> 2.39 <SEP> 0;
03
<tb> 2.34 <SEP> 0.02
<tb> 2.27 <SEP> 0.02
<tb> 2.24 <SEP> 0.02
<tb> 2.18 <SEP> 0.02
<tb> 2.09 <SEP> 0.04
<tb> 2.01 <SEP> 0.04
<tb> 1.977 <SEP> 0.04
<tb> 1.870 <SEP> 0.02
<tb> 1.809 <SEP> 0.03
<tb> 1.747 <SEP> 0.03
<tb> 1.717 <SEP> 0.01
<tb> 1.657 <SEP> 0.02
<tb> 1.552 <SEP> 0.02 Anthelvencin-2-naphthalenesulfonate delivers a positive result in the Ehrlich test and negative results in the ninhydrin test for a-amino acids and in the Sakaguchi test for guanidino groups.
Other addition salts can also be made. The salicylic acid salt of anthelvencin is a white crystalline solid substance that melts at around 153-155 ° C. The solubility properties of this: salt are similar to those of 2-naphthalene sulfonate, with the exception of a slightly higher solubility in cold water.
The electrometric titration of anthelmintic salicylate in 66% aqueous dimethylformamide shows the presence of titratable groups with pK values of 9.75 and 11.98 and an apparent molecular weight of about 726.
The infrared absorption spectrum of anthelvencine salicylate shown in Figure 2 has the following distinctive bands within the range 2.0-15.0: 3.05; 3.42 (mineral oil); 3.48 (mineral oil); 3.65 (shoulder); 3.73 (shoulder); 4.00; 4.25 (weak); 5.88; 6.10; 6.26; about 6.50 (wide); 6.73; 6.85 (mineral oil); 7.24; 7.40; 7.69; 8.00; 8.15 (shoulder); 8.31; 8.68 (shoulder); 8.76; 8.92; 9.40 (weak); 9.72; 10.43 (weak); 11.27 (weak); 11; 66; 12.44; 13.2'2; 13.90; 14.27 and about 15.10 p.
An aqueous solution of anthelvencin salicylate shows two maxima in its ultraviolet absorption spectrum, one at 230 m, u with an absorption of Ei - 508 eni and the other at 295 my with an absorption of E i @m - 435.
Elemental analysis of anthelvencine salicylate shows that the salt has the following approximate percentage composition: C 56.27 7o; H 5.62%; N 17.97%; <B> 0 </B> 20.09%.
The empirical formula for the salt calculated on the basis of these values is C33H, oN909, which in turn gives the formula CinH'aN903 for the free base anthelvencin.
Anthelvencine salicylate has a specific rotation of +7.9, determined at 25 C using a 1% solution of the salt in 95% aqueous ethanol.
Other acids, both organic and inorganic, can also be used to prepare addition salts of anthelvencin. Inorganic acids which can be used include hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid and the like.
As examples of organic acids which can be used for salt formation, there may be mentioned; Citric acid, formic acid, acetic acid, tartaric acid, p-bromosalicylic acid, picric acid, m-nitrobenzoic acid, flavic acid, p-nitrophthalic acid, p - (2 - hydroxy -1-naphthylazo) - benzenesulfonic acid (Orange 1I) and similar acids.
In general, the addition salts of anthelvenein with organic acids are preferably prepared from a salt with an inorganic acid, such as. B. from the hydrochloride.
The full structural formula of anthelvencin has not yet been determined. However, hydrolytic degradation studies show that anthelvencin has one or more pyrrole residues and a large number of peptide compounds.
The degradation studies also show that the anthelvencin molecule has one or more units of f-alanine and either glutamic acid or a fragment that is converted into glutamic acid under the degradation conditions.
As is often the case with peptide antibiotics, anthelvencin, as it is normally obtained in fermentative production, consists of at least two closely related compounds, which are hereinafter referred to as anthelvencin A and anthelvencin B. The term anthelvenein, as it is used here, refers to the antibiotic in the form in which it is obtained during fermentation.
The physical properties of anthelvencin A and anthelvencin B are very similar. The antibiotics differ mainly in their behavior in certain chromatographic systems. A particularly useful method for differentiating the two antibiotics is such. B. in a thin layer chromatography on silica gel with a solvent system consisting of 15 parts of n butanol, 10 parts of pyridine, 1 part of glacial acetic acid and 12 parts of water.
In such a system, the Rf value for anthelvencin A can be 0.5, while it is 0.3 for anthelvencin B.
Anthelvencin can inhibit the growth of certain strains of microorganisms, which are ultimately bacterial pathogens and fungal or spongy plant pathogens. In terms of quality, the microbiological efficacies of anthelvencin A and anthelvencin B are practically identical.
On the basis of equal amounts by weight, however, the microbiological effectiveness of anthelvencin-A-naphthalene sulfonate is about twice as great as that of the corresponding salt of anthelvencin B. The concentrations in anthelvencin at which an inhibition of the growth of various organisms can generally be observed , are given numerically in Table I.
The minimum inhibitory concentration could be determined with the aid of the agar dilution test or with the aid of the nutrient broth dilution test, and the inhibitory concentrations for the bacterial pathogens and the fungal or sponge-like plant pathogens were determined over a period of 72 hours.
In the agar dilution test, the test organism is preferably spread or implanted on a series of agar plates which contain various concentrations of anthelvencin in the agar, in order to determine the minimum concentration of the antibiotic in .ug / cm3 at which the growth of the organism is inhibited over a period of time of 48 hours.
In the nutrient broth dilution test, a series of test tubes containing a nutrient broth with different concentrations of anthelvencin are inoculated with the test organism in order to determine the minimum concentration of anthelvencin in .ug / cm3 in the nutrient broth at which an inhibition of the growth of the organism is determined occurs over a period of around 24 hours.
EMI0003.0054
<I> Table <SEP> 1 </I>
<tb> Minimum test organism <SEP> inhibitory concentration
<tb>, ug / cm3 <SEP> 24 <SEP> hrs.
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 25.0
<tb> Staphylococcus <SEP> albus <SEP> 50.0
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 12.5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> 1.56
<tb> myco. <SEP> tuberculosis <SEP> (607) <SEP> 50.0
<tb> myco.
<SEP> avium <SEP> 25.0
EMI0003.0055
<I> Table <SEP> 1 </I> <SEP> (continued)
<tb> Minimum test organism <SEP> inhibitory concentration
<tb>, ug / cm3 <SEP> 24 <SEP> hrs.
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 12.5
<tb> Proteus <SEP> vulgaris <SEP> 25.0
<tb> Aerobacter <SEP> aerogenes <SEP> <B> 100.0 </B>
<tb> Klebsiella <SEP> pneumoniae <SEP> 25.0
<tb> Salmonella <SEP> enteritidis <SEP> 50.0
<tb> Shigella <SEP> paradysenteriae <SEP> 50.0
<tb> Vibrio <SEP> metschnikovii <SEP> 50.0
<tb> Saccharomyces <SEP> pastorianus <SEP> 6.25
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> <B> 100.0 </B>
<tb> Trichophyton <SEP> rubrum <SEP> 3.13
<tb> Trichophyton <SEP> interdigitale <SEP> 3,13 <SEP> a
<tb> Argobacterium <SEP> tumefaciens <SEP> 12.5
<tb> Corynebacterium <SEP> michiganense <SEP> 1.56
<tb> Erwinia <SEP> amylovora <SEP> 6.25
<tb> Pseudomonas <SEP> solanacearum <SEP> 6,
25th
<tb> Xanthomonas <SEP> phaseoli <SEP> <B> 12.5 </B>
<tb> Alternaria <SEP> solani <SEP> 6.25
<tb> Botrytis <SEP> cinerea <SEP> 6.25
<tb> Caratostomella <SEP> ulmi <SEP> 25.0
<tb> Collletotrichum <SEP> pisi <SEP> 12.5
<tb> Endoconidiophora <SEP> fagacearum <SEP> 50.0
<tb> Fusarium <SEP> moniliform <SEP> 50.0
<tb> Carotostomella ulmi <SEP> 25.0
<tb> Helminthosporium <SEP> sativum <SEP> 12.5
<tb> Penicillium <SEP> expansum <SEP> 50.0
<tb> Phoma <SEP> pigmentovora <SEP> 100.0
<tb> Polyporus <SEP> ostreatus <SEP> 3.13
<tb> Pullularia <SEP> sp. <SEP> 100.0
<tb> Verticillium <SEP> albo-atrum <SEP> 50.0
<tb> a) <SEP> determines <SEP> during <SEP> 48 <SEP> hours Identical values are obtained with the salicylic acid salt of anthelvencin.
From these data it can be seen that anthelvencin in the form of its acid addition salts can be used to suppress the growth of a wide variety of pathogenic organisms.
The acid addition salts of Anthelveneins can still be used to control intestinal worms and various other types of parasitic organisms. So has z.
B. an effectiveness against both species of the mouse pinworm, Syphacia obvelata and As, pivuluris tetraptera, and against the pig worms Ascaria summ,
Oeseophagostumum spp. and Trichuris suis shown. When incorporated into the daily feed ration of pigs for a period of at least 35 days, the anthelvencin salts prove to be effective in reducing the worm infestation of the animals at a concentration of only 12 g per ton of feed. Combinations of anthelvencin with other substances with anthelminticum properties, such as.
B. with piperazine, hygromycin B and the like can also be used. Other organisms that can be controlled with the help of anthelvencin are u. a. Escherichia coli, Proteus vulgaris, Entamoeba histolytica and the like.
The acute toxicity of anthelvencine salicylate could be determined in the mouse. Orally, the LDäo value of this salt is more than 500 mg / kg. The LD50 for anthelvencine salicylate is approximately 175 mg / kg when the drug is injected intraperitoneally.
Anthelvencin is obtained by cultivating previously unknown strains of Streptomyces venezuelae under aerobic conditions in a culture medium which contains assimilable sources of carbon and stick and inorganic salts. The organisms could first be isolated from soil samples. Portions of the soil samples were preferably suspended in sterile, distilled water and the suspensions spread onto nutrient agar plates.
The inoculated nutrient agar plates were usually incubated for several days at about 25-35 ° C. At the end of the incubation period, the colonies of the anthelvencin-forming organisms were transferred to slant agar media using a sterile platinum loop. The inoculated slant agar media were incubated in order to be able to obtain larger quantities of inoculum culture for the production of anthelvencin.
The novel organisms capable of producing anthelvencin have been deposited with the American Type Culture Collection, Washington, D.C., USA and are available to the public under ATCC accession numbers 14583, 14584 and 14585.
Because of the uncertainty that exists in classifying examinations of the Streptomyces group of microorganisms, the classification of a newly discovered organism is always fraught with certain doubts. The anthelvencin-producing organisms, however, appear to come closest in their most important properties to the descriptions given for the organisms S. cinnamonensis, S. roseoflavus and S. venezuelae (NRRL 902), all of which are specific strains of S. lavendulae resemble with straight chains of spores.
Despite certain similarities, however, there are sufficient differences to distinguish the novel organisms which are used in the process according to the invention for the production of anthelvencin from all the organisms described so far. The properties of the new organisms come closer to the abovementioned S. venezuelae (NRRL 902) than any other organism described so far. However, there are numerous differences between the new cultures and S. venezuelae (NRRL 902).
The novel organisms of the present inventive method are therefore to be seen as new strains of S. venezuelae.
The following detailed description relates to the newly found organisms ATCC 14583, 14584 and 14585 and their use for the production of anthelvencin according to the invention by culturing mutants of these organisms which produce anthelvencin. Such other mutants can be obtained by known methods, e.g. B. because by that one of the above strains with X-rays or ultraviolet rays or with chemical agents, such as. B. with nitrogen mustard compounds, be.
In the classification investigations of the anthelvencin-producing strains of C. venezuelae ATCC 14583, 14584 and 14585 it was possible to use methods that are customary for the classification of antinomycetes. The carbon recovery tests were carried out according to the method of Pridham and Gottlieb, J. Bact. 56, 107 (1948), carried out.
The data obtained in the classifying tests are given below in tabular form. The numbers in brackets refer to the color tables by Maers and Paul, Dictionary of Color (1950). The cultures were usually grown at 30 ° C. and the morphological, physiological and breeding properties were determined after 14 days of incubation and the carbon utilization after 10 days of incubation.
EMI0004.0079
<I> Table <SEP> 11 </I>
<tb> Description <SEP> of the <SEP> cultures <SEP> ATCC <SEP> 14583, <SEP> 14584 <SEP> and <SEP> 14585
<tb> Compared <SEP> properties <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Morphology <SEP> spore chains <SEP> straight <SEP> or <SEP> spore chains <SEP> straight <SEP> or <SEP> spore chains <SEP> straight <SEP> or
<tb> curved; <SEP> spores <SEP> curved; <SEP> spores <SEP> curved; <SEP> spores
<tb> 0.7-1.0 <I>, u <SEP> X </I> <SEP> 1.0-1.8 <I>, u, </I> <SEP> 0.7- 1.0 <SEP> <I>, u <SEP> X </I> <SEP> 1.0-1.8 <SEP> <I>, u, </I> <SEP> 0.7-1 , 0 <SEP> <I>, u <SEP> X </I> <SEP> 1,2-1,8 <SEP> <I>, It, </I>
<tb> oval <SEP> to <SEP> cylindrical. <SEP> oval <SEP> to <SEP> cylindrical. <SEP> cylindrical.
<tb> Colony characteristics <SEP> on: <SEP> growth <SEP> abundant; <SEP> growth <SEP> abundant;
<SEP> growth <SEP> abundant;
<tb> tomato paste- <SEP> aerial mycelium <SEP> abundant, <SEP> aerial mycelium <SEP> abundant, <SEP> aerial mycelium <SEP> abundant,
<tb> oatmeal <SEP> pink gray <SEP> (43-1B); <SEP> return <SEP> light gray <SEP> (35-A1); <SEP> back <SEP> pink gray <SEP> (51-2A); <SEP> back side <SEP> red-brown <SEP> <B> (</B> 16-11A); <SEP> page <SEP> brown <SEP> (15-E7); <SEP> page <SEP> dark <SEP> red-brown
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> (8-9H); <SEP> soluble <SEP> pigment
<tb> dark <SEP> red-brown.
<tb> nutrient agar <SEP> growth <SEP> satisfactory; <SEP> growth <SEP> satisfactory; <SEP> growth <SEP> satisfactory;
<tb> no <SEP> aerial mycelium; <SEP> no <SEP> aerial mycelium; <SEP> no <SEP> aerial mycelium; <SEP> back back <SEP> yellow <SEP> (10-1E); <SEP> rear side <SEP> yellow <SEP> (11L7);
<SEP> page <SEP> yellow <SEP> (10-3H);
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment.
<tb> yeast <SEP> growth <SEP> abundant; <SEP> growth <SEP> moderate; <SEP> growth <SEP> abundant;
<tb> aerial mycelium <SEP> abundant, <SEP> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> white <SEP> aerial mycelium <SEP> sparse,
<tb> light gray <SEP> (20 = 1A); <SEP> to <SEP> light brown <SEP> (4-A8); <SEP> white <SEP> (1-1B);
<tb> back <SEP> light <SEP> red-brown; <SEP> back side <SEP> brown <SEP> (14-J8); <SEP> back <SEP> red-brown;
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment.
EMI0005.0001
<I> Table <SEP> 11 </I> <SEP> (continued)
<tb> Compared <SEP> properties <SEP> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 14584 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> Salts-Starch Agar <SEP> Growth <SEP> Abundant; <SEP> growth <SEP> abundant; <SEP> growth <SEP> abundant;
<tb> aerial mycelium, <SEP> gray-white <SEP> aerial mycelium <SEP> abundant, <SEP> white <SEP> aerial mycelium <SEP> abundant,
<tb> (12-1A); <SEP> back side <SEP> to <SEP> light brown <SEP> (10-A2); <SEP> light <SEP> orange-yellow <SEP> (9-2A);
<tb> brown <SEP> (14-11G); <SEP> back side <SEP> brown <SEP> (14A5); <SEP> back side <SEP> brown <SEP> (8-10J);
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> very <SEP> light brown <SEP> soluble
<tb> pigment.
<tb> Czapekscher <SEP> agar <SEP> growth <SEP> moderate; <SEP> growth <SEP> moderate;
<SEP> growth <SEP> moderate;
<tb> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> almost <SEP> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> white <SEP> aerial mycelium <SEP> moderate, <SEP> white;
<tb> white <SEP> (2-7A); <SEP> to <SEP> light brown <SEP> (3-B7, <SEP> 3A8); <SEP> back side <SEP> red-brown <SEP> (5-9G);
<tb> back <SEP> yellow <SEP> (11-4J); <SEP> back side <SEP> red-brown <SEP> no <SEP> soluble <SEP> pigment.
<tb> no <SEP> soluble <SEP> pigment. <SEP> (7-H9);
<SEP> weak <SEP> red
<tb> soluble <SEP> pigment.
<tb> Action <SEP> on <SEP> milk <SEP> coagulation, <SEP> copious <SEP> brownish yellow <SEP> coagulation,
<tb> peptonization. <SEP> surface growth, <SEP> peptonization.
<tb> coagulation, <SEP> partially
<tb> peptonization.
<tb> Nutrient gelatine <SEP> complete <SEP> liquefaction <SEP> 50 <SEP>% <SEP> ige <SEP> liquefaction <SEP> complete <SEP> liquefaction
<tb> after <SEP> 19 <SEP> days. <SEP> after <SEP> 19 <SEP> days. <SEP> after <SEP> 19 <SEP> days.
<tb> Nitratredukthon <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> H, -S formation <SEP> - <SEP> - <SEP> In <SEP> the <SEP> following <SEP> table <SEP> III <SEP> <SEP> are the <SEP> results < SEP> search <SEP> played.
<SEP> In <SEP> of the <SEP> table <SEP> <SEP> the <SEP> follow the <SEP> to <SEP> the <SEP> organisms <SEP> ATCC <SEP> 14583, <SEP> 14584 <SEP> and <SEP> use the <SEP> symbols <SEP>:
<tb> 14585 <SEP> carried out <SEP> carbon recovery test + <SEP> = <SEP> growth <SEP> and <SEP> recovery
<tb> - <SEP> = <SEP> growth <SEP> or <SEP> utilization <SEP> not <SEP> recognizable.
EMI0005.0002
<I> Table <SEP> 111 </I>
<tb> Carbon utilization <SEP> of <SEP> anthelvencin <SEP> forming <SEP> organisms
<tb> Subtrate <SEP> growth
<tb> ATCC <SEP> 14583 <SEP> ATCC <SEP> 15484 <SEP> ATCC <SEP> 14585
<tb> L <SEP> (+) - arabinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> L <SEP> (+) - Rhamnose <SEP> - <SEP> - <SEP> D-Ribose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D <SEP> (+) <SEP> Xylose <SEP> + <SEP> + <SEP> Dexeose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> D <SEP> (-) fructose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Mannose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Lactose <SEP> - <SEP> - <SEP> Maltose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Sucrose <SEP> - <SEP> - <SEP> D <SEP> (+) - Trehalose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Inulin <SEP> - <SEP> - <SEP> D <SEP> (+)
-Raffinose <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> i-inositol <SEP> + <SEP> - <SEP> +
<tb> Mannitol <SEP> + <SEP> + <SEP> +
<tb> Sorbitol <SEP> - <SEP> - <SEP> Cellulose <SEP> - <SEP> - <SEP> Salicin <SEP> + <SEP> + <SEP> + In the manufacture of anthelvencin by growing the ones described above A wide variety of culture media can be used for organisms, since the results of the recovery test experiments described above show that the organisms are able to make use of different energy sources.
However, for reasons of economical production, a maximum yield of antibiotic and the ease with which the antibiotic can be isolated, certain culture media are preferred which contain relatively simple nutrient sources. For example, the media which are useful for the production of anthelvencin contain an assimilable source of carbon, such as. B.
Glucose, fructose, maltose, mannose, soluble starch, molasses, dextrin, brown sugar, corn steep solids and the like. A preferred source of carbon is glucose. In addition, the ver usable media contain a source of assimilable nitrogen, such as. B. oatmeal, beef extract, pep tone (from meat or soybeans), hydrolyzed casein, yeast, amino acid mixtures and the like.
Currently preferred nitrogen sources are p'eptones, hydrolyzed casein and beef extracts.
Mineral salts such as B. those. The calcium, magnesium, sodium, potassium, chloride, sulfate and carbonate ions supply, as well as a source of growth factors such. B. yeast or yeast extract, are incorporated into the media with favorable results.
As with many microorganisms, it is desirable to add the so-called trace elements to the culture medium used for the cultivation of the actinomycetes produced in accordance with the invention. These trace elements are usually added to the medium as impurities inevitably with the addition of the other components.
The initial pH of the culture medium can be varied within wide limits. However, it has been found desirable to set the initial pH of the medium between about 6.0 and about 7.5 and preferably between about 6.5 and about 7.3. As has been observed with other actinomycetes, the pH of the medium increases gradually throughout the growth period of the organism while anthelvencin is formed and can reach a level of about 7.0 to about 8.0 or above.
The final pH value depends at least in part on the initial pH value of the medium, the buffer substances present in the medium and the length of time that the organism is allowed to grow.
The aerobic immersion culture conditions in the production of anthelvencin can be different. Shake flasks and surface cultures in bottles can be used to produce relatively small quantities; however, aerobic immersion culture in sterile tanks is preferable for the production of large quantities. The medium in the sterile tank can be inoculated with a spore suspension; however, because of the growth retardation observed when using a spore suspension as inoculum, the vegetative form of the culture is preferred.
By avoiding the growth delay in this way, a more effective utilization of the fermentation equipment is achieved. Accordingly, it is desirable to first produce a vegetative inoculation culture of the organism by inoculating a relatively small amount of culture medium with the spore shape of the organism; and when a young, active vegetative inoculum has been obtained, the vegetative inoculum is transferred to the large fermentation tank under aseptic conditions.
The medium in which the vegetative inoculum is produced can be either the same or different from the medium used for the large scale production of anthelvencin.
The organisms usually grow best at temperatures in the range of about 26-33 C. Optimal anthelvencin formation appears to take place at temperatures of about 26-30 C.
As is customary in immersion culture processes carried out under aerobic conditions, sterile air in particular is blown through the culture medium. To achieve effective growth of the organism and effective anthelvencin formation, the volume of air used in tank production of anthelvencin is preferably at least 0.1 part by volume of air per minute and per part by volume of culture medium.
The increase in anthelvencin activity in the culture medium can easily be followed during the fermentation period by examining samples taken from the culture medium for their inhibitory effect on the growth of an organism known to be inhibited in the presence of anthelvenein, checks. The use of the organism Bacillus subtilis has proven suitable for this purpose. Testing can be done using well known turbidity measurement techniques or cup and plate techniques.
In general, maximum antibiotic formation occurs within about 4-7 days after inoculation of the culture medium if an aerobic immersion culture or a shake flask culture is used, and within about 5-10 days if a surface culture is used.
The mycelium and undissolved solids are generally removed from the fermentation broth by known means, e.g. B. by filtration or centrifugation, removed, usually after adjusting the pH to about 3.5. The antibiotic activity is contained in the filtered broth and can be removed from it using standard adsorption techniques.
A wide variety of adsorbents can be used, but ion exchange resins of an acidic character are generally preferred. A particularly preferred resin is IRC-50, a weakly cationic carboxylic acid resin marketed by the Rohm and Haas Company.
When using the column adsorption method, the anthelvencin can be isolated by passing the filtered broth through a column coated with a suitable ion exchange resin, such as. B. IRC-50, be sent. If 1 part of resin per 30-35 parts of filtered broth are used, a practically complete removal of the anthelvencin from the fermentation broth is usually achieved when the flow rate is through a column with a diameter of 7.62 cm at about 5-10 cm2 each Minute.
The column is then washed thoroughly with water until the eluate is colorless and the antibiotic activity is eluted from the column using a solvent containing a dilute aqueous acid and a water-miscible organic solvent.
A solvent mixture consisting of 80 parts by volume of 0.5N hydrochloric acid and 20 parts by volume of acetone has proven to be highly effective in eluting the anthelvencin effect.
To remove certain accompanying impurities, the pH of the eluate can be adjusted to about 5.5 with a base, and the eluate can be concentrated to about its original volume, the concentrated eluate is admixed with about 3 full volumes of acetone with stirring and the pH Value of the mixture obtained can be adjusted again to approximately 8.5.
The mixture is then preferably passed through a column filled with Florisil with a particle size corresponding to 0.149-0.250 mm clear mesh size (a magnesium silicate adsorbent marketed by the Floridin Company) to add coloring substances and tarry substances remove.
The column is washed further with 75% aqueous acetone until the eluate behaves negatively towards Ehrlich's reagent, whereupon the original eluate and the washing liquids are usually combined and concentrated. Sodium chloride is generally added to the concentrate in an amount of about 250 g per liter of concentrate. The dark, oily residue which separates out can then be removed, the mixture filtered and the clear filtrate extracted with benzyl alcohol.
The water is usually removed from the benzyl alcohol extracts in vacuo and the resulting dry solution in benzyl alcohol is slowly added to about 9 volumes of acetone. When the mixture obtained is cooled, it is mainly the hydrochloride of anthelvencin that separates out. The product obtained in this way consists mainly of the hydrochloride of anthelvencin A and contains a minor amount of anthelvencin B hydrochloride.
Anthelvencin A free of anthelvencin B can be obtained in the form of one of its acid addition salts by subjecting the preparation as described above to further treatment: B. the mixture of anthelvencin hydrochloride in a solvent system containing n butanol, pyridine, acetic acid and water, and the resulting solution can be passed through a column that is charged with pretreated cellulose powder.
The cellulose powder is mainly suspended in water to form a slurry, then filtered off and again successively in 0.2 N aqueous hydrochloric acid, water and one consisting of n butanol, pyridine, acetic acid and water in a ratio of 15: 10: 1:12 Solvent system has been suspended.
The eluate flowing out of the column is preferably collected in fractions at regular time intervals and the course of the chromatographic fractionation is monitored by checking the fractions with the aid of thin-layer chromatography. The fractions collected first contain only anthelvencin A hydrochloride. They are followed by intermediate fractions containing the salts of both anthelvencins. As a rule, pure anthelvencin B hydrochloride is contained in the last fractions collected.
Those fractions which contain pure anthelvencin A hydrochloride or anthelvencin B hydrochloride are combined and evaporated to dryness, whereby pure deposits of the hydrochloride of anthelvencin A or anthelvencin B can be obtained.
Salts other than the hydrochloride can also be used to separate the mixture of anthelvencin A and B into its individual components. So you can z. B. convert the mixture of hydrochloride into a mixture containing the naphthalene sulfonate or salicylate salts, and then similarly fractionate this mixture chromatographically to obtain the corresponding salt of anthelvencin A free from the salt of anthelvencin B.
Example 1 Preparation of Anthelvencin A culture of Streptomyces venezuelae ATCC 14584 is prepared by growing the organism on a nutrient slant. The nutrient agar is made from 65 g of oatmeal, which is boiled into a slurry, strained and mixed with 20 g of agar and enough water to make a total volume of 1 liter.
The inclined nutrient medium is inoculated with spores of S. venezuelae ATCC 14584 and incubated at 30 ° C. for 5 days. The culture growth on the nutrient slant is covered with about 6 cm "distilled water" and the nutrient slant is carefully scraped off in order to obtain an aqueous suspension of the organisms.
1 cm3 of the suspension obtained in this way is used to inoculate <B> 100 </B> cm3 of a sterile vegetative culture medium of the following composition under aseptic conditions: Cerelose 15 g soybean meal 15 g corn steep liquor 5 g sodium chloride 5 g calcium carbonate 2 g water up to to a total volume of 1 liter. The inoculated vegetative medium is incubated at about 30 ° C. for 48 hours.
During this time, the flasks are shaken on a shaker, which moves back and forth by 5 cm, at a speed of 108 shaking movements per minute.
5 cm, 'of the vegetative inoculum are used for the aseptic inoculation of 100 cm 3 portions of a medium contained in 500 cm 3 Erlenmeyer flasks, which has been sterilized for 30 minutes at 120 C and has the following composition: soybean meal 15 g casein 1 g sodium nitrate 3 g raw glucose syrup 20 cm3 calcium carbonate 2.5 g water up to a total volume of 1 liter. The inoculated culture is incubated for 5 days at about 30 C, shaking on a shaker as described above.
The pH of the starting medium is about 6.9. At the end of the incubation period, the pH value of the medium has increased to around 7.3.
The culture broth obtained in this way is filtered to remove the mycelium and the undissolved solids. The filtered broth contains the anthelvencin produced by the organisms.
<I> Example 2 </I> Preparation of Anthelvenein Hydrochloride A culture of Streptomyces venezuelae ATCC 1.4584 is prepared as in Example 1 using a nutrient medium containing 20 g starch, 3 g beef extract, 1 g asparagine, 20 g agar and water in in such an amount as is necessary to fill up to a total volume of 1 liter. The slants are allowed to grow at a temperature of about 30 ° C. for 5-7 days.
The organisms grown on the slant culture are then isolated as described in Example 1, and 1 cm3 of the suspension obtained in this way is used for the aseptic inoculation of 100 cm3 of a steri lized vegetative culture medium, which is located in a 500 cm3 Erlenmeyer flask and which have the following composition dextrose,
technically pure 15 g soybean oil flour extracted with solvents 15 g corn steep liquor 10 g sodium chloride 5 g calcium carbonate 2 g water up to a total volume of 1 liter The inoculated medium is incubated for 24 hours at <B> 301C </B>, using a rotary shaker which Shaking movements of 5 cm caused, shaking with 250 shaking movements per minute.
About 25 cm3 of the vegetative culture obtained are then introduced with the aid of a sterile pipette into a modified 4-liter Erlenmeyer flask containing 1 liter of a medium of the same composition. The incubation is carried out for 48 hours under the conditions described.
The entire contents of the flask, which contains the vegetative culture, are transferred to a 45 liter fermentation vessel made of stainless steel with baffle plates, each equipped with 2 blades made of approved turbine stirrers of 12.7 cm diameter and 28 liters of a production medium of the following Composition includes:
Dextrose, technically pure 30 g soybean oil flour extracted with solvents 20 g sodium nitrate 3 g calcium carbonate 5 g cottonseed oil 2 cm3 casein 2 g water up to 1 liter The fermentation is carried out at 30 ° C for 4 days with stirring at a speed of 400-450 revolutions per Minute. The foaming is controlled by adding soybean oil if necessary.
Throughout the fermentation, the medium is aerated by introducing sterile air at a rate of about 30 liters per minute. At the end of the fermentation period, the entire broth is adjusted to about pH = 3.5 with 5N sulfuric acid, whereupon about 3% (weight / volume) of a commercially available filter aid is added. After filtering, there are about 22 liters of filtered fermentation broth.
The fermentation broths combined from 4 tank fermentations are passed through a column with a 7.62 cm diameter, which contains about 2650 cm3 of moist IRC-50 resin in the acid form. If the flow rate is set to about 6 cm3 per minute, the liquid flowing out of the column has; shows no biological activity, which indicates that the adsorption of the antibiotic on the resin is practically complete.
When the entire amount of filtered fermentation broth, a total of about 88 liters, has been passed through the column, the column is repeatedly washed with water until the wash water is colorless.
The anthelvencin is isolated from the column as follows: The column is continuously eluted with a mixture of 30 vol.% Acetone and 70 vol.% 0.5N aqueous hydrochloric acid as long as the eluate reacts positively to Ehrlich's reagent. A total of about 10; 4 liters of eluate is collected. The eluate is adjusted to about pH = 5.5 with 10% aqueous sodium hydroxide solution and concentrated to a volume of about 8.5 liters.
3 volumes of acetone are added to the concentrated eluate with stirring, and the pH of the mixture obtained is further adjusted to about 8.5. The mixture is passed through a column which is filled with about 1750 cm3 of moist Florisil, with a particle size corresponding to 0.149-0.250 mm clear mesh size, in order to remove coloring and tarry substances. The column is then washed with 75% aqueous acetone until the washing liquid reacts negatively to the Ehrlich reagent.
The original eluate and the washing liquids are combined and concentrated to a volume of about 9 liters, whereupon 2250 g of sodium chloride are added. The dark, tarry residue that forms is filtered off and the filtrate obtained is extracted 3 times with 90 cm3 of benzyl alcohol each time. The remaining water is removed from the combined extracts under vacuum and the resulting benzyl alcoholic solution is slowly added to 9 volumes of acetone with rapid stirring.
After leaving to stand overnight at about 3 C, the deposited solid is filtered off, washed thoroughly with acetone and dried in vacuo. The anthelvencin hydrochloride obtained in this way can be subjected to further purification or converted into another salt, as described in the following examples.
<I> Example 3 </I> Production of anthelvencinr2-naphthalenesulfonate To a solution of 1 g of anthelvencin hydrochloride, prepared according to Example 2, 40 cm3 of a 5% aqueous solution of sodium 2-naphthalene sulfonate are added. The mixture is heated to achieve complete dissolution and then allowed to cool slowly. A dark oil, which begins to separate out when the temperature of the solution reaches around 20 C, is removed by centrifugation and the supernatant solution is cooled in order to cause the anthelvencin-2-naphthalenesulfonate to crystallize.
<I> Example 4 </I> Production of anthelvencine salicylate 1 g of anthelvencine hydrochloride, prepared according to Example 2, is added to 30 cm3 of a 5% aqueous solution of sodium salicylate. The mixture is heated on a steam bath for about 10 minutes and filtered while it is hot in order to remove undissolved solid substances.
The clear filtrate is allowed to cool to room temperature and crystallization is initiated by scratching the side walls of the flask with a glass rod. At the first sign of crystallization, the mixture is cooled to around 3 C to allow complete crystallization. The crystalline anthelmintic salicylate is filtered off, washed twice on the filter with 10 cm3 of ice water each time and dried in vacuo over phosphorus pentoxide at room temperature.
The recrystallization takes place from a 2-strength aqueous sodium salicylate solution.
<I> Example 5 </I> Preparation of anthelvencin A which eats free of anthelvencin B A chromatography column which has a diameter of 3.17 cm and a length of 43.2 cm is filled with a cellulose powder pretreated in the following manner loaded;
a suspension of 100 g Whatman cellulose powder (CM 70) is prepared and stirred well for about 30 minutes. The cellulose is filtered off and then suspended again one after the other in 0.2 N hydrochloric acid, water and a solvent mixture composed of n butanol, pyridine, acetic acid and water in a ratio of 15: 10: 1 : 12 exists.
A solution of 5 g of anthelvencine hydrochloride, prepared according to Example 2, in 40 cm3 of the above-described solvent system is passed through the column. The column is equipped with an automatic fraction collector that is set to time intervals of 30 minutes.
The flow rate from the column is set so that about 5-7 om3 eluate flow out within this time interval. The course of the chromatographic fractionation is followed by checking the eluate in every 5th tube with the aid of thin-layer chromatography on silica gel.
The two anthelvencins differ slightly on the chromatography plates due to the fact that the salts of anthelvencin A move faster in this system than the corresponding salts of anthelvencin B. The Rf values in this system are 0.5 and 0.5, respectively. 0.3. The fractions which, as determined by this procedure, contain only anthelvencin A are pooled and evaporated to dryness.
The solid anthelvencin A hydrochloride obtained in this way can be further purified or converted into other salts of anthelvencin A according to the method of Examples 4 and 5.
The fractions containing only anthelvencin B are also pooled and treated in the same way. The intermediate fractions, which contain both anthelvencin A and anthelvencin B, can be subjected to further chromatography to achieve a further separation in order to obtain additional amounts of the pure individual compounds.