Procédé de préparation d'un médicament bactério-thérapeutique
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un médicament bactérie-thérapeutique, selon lequel on cultive, d'une part, du Lactobacillus acidophilus, d'autre part, des souches non pathogènes d'Escherichia coli, sur du lait qui contient de la mucine gastro-pylorique de porc, de la lysine, de l'arginine et de l'histidine et l'on soumet les cultures obtenues à une lyophilisation, avant ou après les avoir mélangées.
Le lait utilisé est, de préférence, du lait écrémé stérilisé du commerce et la quantité de mucine gastropylorique de porc qu'il contient, comptée en extrait sec, peut varier de 0,5 à 15"/o en poids par rapport à l'extrait sec du lait ; chacun des trois acides aminés figure à raison d'environ 0, 5 /o en poids par rapport à l'extrait sec.
La mucine gastro-pylorique dont il s'agit est ajoutée, de préférence sous la forme de la solution (titrant de 1 à 2,5 ID/o d'extrait sec) que l'on obtient en soumettant à une extraction par une solution aqueuse, alcalinisée à la soude caustique, un mélange de muqueuse rouge et d'antre pylorique de porc.
Le ferment lactique Lactobacillus acidophilus est, de préférence, une souche de selles d'enfants sains que l'on a cultivée en présence d'antibiotiques pour lui conférer une résistance à ceux-ci.
Le milieu de culture peut, en particulier, renfermer les antibiotiques énumérés ci-après :
Antibiotiques Dose par ml
(origine et nature) de culture
Pénicillium
Pénicilline. 200 U
Actinomycètes
Streptomycine 5000 y
Tétracycline.. look y
Chloramphénicol 200 Y
Erythromycine. 2000-y
Spiramycine. 2000 y
Oléandomycine.. 2000 y Novobiocine. 2000 y
Bacillus
Colymicine 2000 y
Ce milieu de culture est du lait renfermant les substances additionnelles indiquées ci-dessus et auxquelles on peut, avec avantage, adjoindre de la vitamine B12.
Le lait servant de milieu de culture peut, plus particulièrement, avoir la composition suivante :
Lait écrémé stérilisé du commerce. 950 ml
Solution aqueuse de mucine
gastro-pylorique de porc à I O/o
(à 1-2, 5 10/o d'extrait sec) 50 ml
Lysine...... 0,5 g
Arginine..... 0,5 g
Histidine......... 0,5 g
Vitamine B12 cristallisée. 5 Rg
Une fois acquise l'antibiorésistance, le ferment lactique est ensemencé sur du lait de mme composition mais sans antibiotique.
Avant ensemencement, ce milieu est tyndallisé par passage deux fois à 100 à 24 heures d'intervalle (on s'assure de la stérilité du milieu).
Après l'ensemencement par le ferment lactique, on soumet le milieu à une incubation à 41 jusqu'à l'obtention d'un caillé homogène, ce qui demande environ 24 heures ; on peut poursuivre l'incubation davantage, mais il n'y a pas d'intért pratique à le faire. La proportion d'acide lactique produit est alors de l'ordre de 0,8 à 1 /o environ et le nombre de germes revivifiables atteint environ loll à 1014 par ml.
On peut directement congeler le caillé, par exemple à environ-600 (après l'avoir agité) et le lyophiliser. Toutefois, on peut aussi, avant congélation, neutraliser l'acide lactique produit jusqu'à un pH d'environ 6,5, au moyen d'une solution aqueuse stérilisée de phosphate trisodique. Il faut en général de 3 à 4,5 g de phosphate trisodique (sous forme de solution aqueuse stérilisée) par litre de milieu pour arriver à ce résultat.
Les colibacilles utilisés sont des Escherichia coli que l'on isole à partir des souches de selles d'enfants sains et qui, notamment, acidifient les milieux lactoses en moins de 24 heures, donnent de l'indol, ne cultivent pas sur le milieu de Simmons au citrate et sont exempts d'hémolysines actives à l'égard de divers globules rouges. Il y a avantage à choisir des souches offrant les meilleures propriétés de résistance aux antibiotiques usuels.
On s'assure en outre de l'absence de caractère antigénique par la technique d'agglutination et d'hémaglutination passive et l'on vérifie l'absence de pouvoir pathogène : 1. par absorption orale
-chez la souris, à raison de 500 millions en une
seule dose,
-chez le cobaye, à raison de 3 milliards en une
fois,
-chez le porc, à raison de plusieurs litres d'une
culture à 1014 germes par ml, 3 jours de suite.
Afin de s'assurer que cette absorption n'a déterminé aucune modification du transit intestinal chez aucun des animaux et, au contraire, a très nettement amélioré l'aspect et l'odeur des selles, notamment chez le porc ;
2. par l'injection sous-cutanée à des souris, des cobayes et des lapins à la dose de 50 millions ;
3. par l'injection intra-péritonéale à des souris, à la dose de 20 millions et à des cobayes à la dose de 50 millions ;
4. par l'injection intra-veineuse à des lapins à raison d'un milliard.
On part, de préférence, de deux souches différentes d'Escherichia coli que l'on cultive chacune comme le ferment lactique, en présence d'antibiotiques sur le milieu standard de l'Institut Pasteur pour leur conférer une résistance à ceux-ci. Les antibiotiques peuvent tre les mmes, utilisés aux mmes doses, que le ferment lactique.
Lorsqu'a été atteinte la résistance recherchée, on procède à la culture de chaque souche, séparément, sur des mélanges d'eau peptone et de lait, de plus en plus riches en celui-ci, le lait contenant les ingré- dients définis plus haut, en particulier dans les proportions préférables indiquées. Ainsi, on peut conduire la culture sur des mélanges à environ 5o0lopuis 35 /o, puis 20, 0/o et enfin 10"Vo en volume d'eau peptonée.
L'eau peptone utilisée contient, de préférence,
15 g de peptone, 5 g de chlorure de sodium et 1 g de lactose par litre, son pH ayant été ajusté à 7,6 par addition d'hydroxyde de sodium.
Le milieu final de culture est le suivant :
Lait additionné de mucine et
d'acides aminés. 900 ml
Eau peptone 100 ml, le lait en question ayant la composition suivante :
Lait écrémé stérilisé du commerce 950 ml
Solution de mucine gastro-pylorique
de porc (à 1-2, zoo d'extrait sec) 50 ml
Lysine.. 0,5 g
Arginine.. 0,5 g
Histidine..... 0,5 g
Pour chaque culture on tyndallise le milieu par deux fois, à 24 heures d'intervalle, à 100 , en s'assurant de sa stérilité, on ensemence et on incube à 370 jusqu'à l'obtention d'un caillé, ce qui demande un à deux jours.
L'acidité lactique est alors de l'ordre de 0,6 à 0,8/o et le nombre de germes revivifiables de loll à 1014 environ, par ml, la numération étant faite avec utilisation, comme milieu, du milieu de culture lui-mme.
Là aussi, on peut homogénéiser le milieu, le congeler, par exemple à environ-600, et le lyophiliser.
Néanmoins, avant homogénéisation, on peut neutraliser l'acide lactique produit par addition de solution aqueuse stérilisée de phosphate trisodique pour obtenir un pH d'environ 6,5. Il faut en général ajouter environ 3 g de phosphate par litre de milieu.
Pour préparer le médicament final, on mélange, généralement à poids égaux, d'une part, la culture lyophilisée de Lactobacillus acidophilus, d'autre part, un mélange, là aussi généralement à poids égaux, des cultures lyophilisées des deux souches d'Escherichia coli. Toutefois, les proportions relatives peuvent tre modifiées pour répondre à des prescriptions particulières.
Comme variante ou mieux, en supplément, le médicament peut contenir le produit de la lyophilisation d'une culture de bacilles lactiques de l'espèce Bifidi bactérium bifidus prélevés dans des selles de nourisson sain, cultivés selon une technique usuelle sur milieu VF, le tout étant ensuite lyophilisé. La quantité ajoutée peut tre de l'ordre de celle de la culture lyophilisée de Lactobacillus acidophilus ou un peu moindre.
Les propriétés pharmacologiques du nouveau médicament sont liées, d'une part, à l'influence spéciale des constituants du milieu lacté qui les accompagne, d'autre part, à une particularité de coaction du action du Lactobacillus acidophilus et des Escherichia coli.
On avait déjà auparavant constaté que le succès de l'implantation ou de la ré-implantation intestinale de bacilles lactiques, aussi bien que d'Escherichia coli, après une thérapie par antibiotiques, dépendait d'un assez grand nombre de facteurs et qu'en gros, elle était d'abord subordonnée à la possibilité de renouvellement et de survie des germes vivants administrés ainsi qu'à leur nombre ou à leur nature.
Or, s'il a été possible, auparavant, de produire des souches de ferments lactiques antibio-résistantes, on n'a pu qu'enregistrer leur disparition en présence de micro-organismes tels que Proteus Pseudomonas (pyocyanus) et Staphylococcus aureus, ainsi que leur résistance variable, mais plutôt mauvaise, en présence d'Escherichia coli.
Or, à cet égard, une propriété fondamentale du nouveau médicament découle de l'effet particulier qui a été produit par le lait et les substances qui l'accom- pagnent sur les souches non pathogènes d'Escherichia au stade de la culture : à ces entérobactéries, qui s'adapteraient mal ou ne s'adapteraient pas en présence de bacille lactique, si l'on se contenait d'administrer tels quels ces divers micro-organismes, il s'est substitué des variants doués de la possibilité de proliférer en présence de Lactobacillus acidophilus.
Ainsi, le nouveau médicament permet-il d'assurer dans l'organisme humain, sans une période précaire d'adaptation in vivo , les développements parallèles de Lactobacillus acidophilus et d'Escherichia coli non pathogènes sur le modèle d'une symbiose entérale saine, avec l'élimination graduelle de la flore concurrente inopportune.
En outre, les substances en provenance du lait et celles qui sont adjointes au lait, favorisent l'implantation ou la ré-implantation et la prolifération des microorganismes figurant à côté d'elles dans le médicament :
(a) en stimulant les sécrétions digestives, grâce à l'intervention des trois acides aminés basiques (lysine, histidine et arginine), et en normalisant le transit intestinal par suite du pouvoir histaminopexique de la mucine gastro-pylorique de porc,
(b) en s'opposant, grâce au pouvoir tampon de la mucine, renforcé par la présence des acides basiques, à de trop fortes fluctuations de l'équilibre acidobasique du milieu intestinal, compte tenu de ce que les ions acides (H+) limitent la croissance des ferments lactiques,
(c)
en protégeant les micro-organismes apportés par le médicament contre la destruction qu'ils peuvent subir sous l'effet des sucs digestifs, cette protection étant due d'abord à la résistance conférée au Lactobacillus acidophilus du fait de sa culture sur lait puis au rôle protecteur joué par la mucine,
(d) en protégeant la muqueuse du colon, dont l'in tégrité est essentielle à sa symbiose immunobiologique avec l'Escherichia coli.
Il convient aussi de noter que la mucine protège certaines vitamines, notamment la vitamine B12 contre leur destrcution sous l'effet des sucs digestifs.
Enfin, le lait accompagné de mucine gastro-pylorique de porc et des trois acides aminés basiques contient les facteurs de croissance nécessaires au Lactobacillus acidophilus et à l'Escherichia coli, notamment le facteur bifidus, le facteur dénommé animal protein factor , la strepogénine et la lysine.
Les principales indications thérapeutiques du présent médicament sont celles des affections gastrointestinales en général, notamment des gastro-entérites et des colites de l'enfant et de l'adulte ; dans le cadre de ces affections, on citera les constipations et diar rhées, la dyspepsie primitive, les dyspepsies secondaires à des intoxications et toxi-infections d'origine alimentaires, les dysmicrobismes primitifs et les dysmicrobismes secondaires aux traitements par les antibiotiques et par les sulfamides, aux gastrectomies, aux interventions chirurgicales, à la radiothérapie, à la curiethérapie ainsi qu'aux infections parasitaires.
D'autres indications sont le traitement de dermatoses d'origine intestinale, de l'herpès et d'affections mycosiques.
Le médicament peut tre présenté sous enrobage entérique, plus spécialement en gélules contenant le mélange des poudres lyophilisées ou séchées, des exemples typiques de compositions pour une gélule étant les suivants (l'unité thérapeutique pouvant tre une boîte renfermant de 16 à 20 gélules) : (a) Culture lyophilisée de
Bacillus acidophilus... 50 à 100 mg
Mélanges des cultures lyophilisées desdeux souchesd'Escherichia
coli..... 50 à 100 mg (b) Culture de Bacillus
acidophilus lyophilisée.. 50 à 150 mg
Mélange des cultures des
deux souches d'Escherichia
coli lyophilisées... 50 à 150 mg
Culture de Bifidibactérium
bifidus lyophilisée. 20 à 50 mg cette dernière composition correspondant à la formule infantile.
Dans ce dernier cas, il est souhaitable de faire absorber, en mme temps que le mélange de culture, du facteur Bifidus II de Raynaud (la mucine apportant, pour sa part, le facteur Bifidus I) et un supplément de strepogénine, notamment sous forme d'autolysat enzymatique de foie de poisson ou de caséine. On peut ajouter un tel autolysat au contenu de la gélule.
Toutefois, en raison du caractère hygroscopique des autolysats lorsqu'ils sont sous forme pulvérulente, on peut les présenter à part, dans une ampoule scellée, dont on incorpore le contenu au lait du biberon.
La titulaire a trouvé, de plus, qu'au lieu de lyophiliser séparément la culture de Lactobacillus acidophilus et le mélange des cultures d'Escherichia coli, il y avait avantage à les mélanger d'abord et à maintenir le mélange pendant un certain temps à la température du local avant d'effectuer la lyophilisation.
L'Escherichia coli est connu pour tre un microorganisme protéolytique producteur d'histamine ; la quantité produite dépend des souches utilisées ; certaines sont si faiblement protéolytiques qu'on ne trouve finalement que 10 à 30 microgrammes d'his- tamine dans un gramme de produit lyophilisé.
En revanche, alors que le Lactobacillus acidophilus était réputé jusqu'ici sans action protéolytique, la titulaire a eu la surprise de constater la présence d'histamine dans des ferments thérapeutiques du commerce à base de Lactobacillus acidophilus et de déceler jusqu'à 3000 microgrammes d'histamine par gramme de produit lyophilisé lors de la culture de ce
Lactobacillus sur certains milieux.
Sans vouloir limiter l'invention à une explication théorique, on admettra la possibilité d'une biosynthèse d'histamine à partir de constituants du milieu de culture ; il semble, en particulier, que la production biosynthétique soit favorisée par l'acétate et le glucose et se fasse aux dépens des sels minéraux azotés figurant à l'état de traces dans le milieu.
Quelle que soit l'explication, la titulaire a constaté qu'au bout d'un certain temps de séjour à la température du local, non seulement le mélange des cultures de Lactobacillus acidophilus et d'Escherichia coli était exempt d'histamine mais l'histamine formée dans les milieux de culture respectifs avait disparu, probablement du fait de sa transformation en histidine.
Ainsi, on peut maintenir à la température du local les cultures de Lactobacillus acidophilus et d'Escherichia coli, après les avoir mélangées et avant de soumettre leur mélange à la lyophilisation, jusqu'à ce que la présence d'histamine n'y soit plus décelable, c'est-à-dire, en pratique, pendant un temps de l'ordre de 12 à 24 heures.
On a constaté que l'administration du présent médicament à des porcelets, dès leur naissance, permettait de diminuer considérablement le taux de mor talité, actuellement très élevé dans la plupart des élevages. Les mmes résultats ont été observés chez les enfants dans des cas de toxicoses diarrhéiques graves. II a été en effet possible de juguler ces affections en quelques jours avec le seul usage du présent médicament.
II a été en particulier constaté, à l'occasion d'examens bactériologiques des selles, la régression totale des germes pathogènes responsables de ces affections (staphylocoques pathogènes, Escherichia coli pathogènes, Shigella flexneri, etc.)
Mis à part le changement indiqué ci-dessus quant au mode de préparation, le médicament est réalisé et présenté comme il est décrit ci-dessus.
Toutefois, le médicament peut tre préparé, lorsqu'il est destiné aux enfants, à partir d'un mélange d'environ 2 parties en poids de culture de ss acidophilus et 1 partie en poids de culture mixte d'Escherichia coli (abstraction faite de la teneur éventuelle en Bifidibactérium bifidus).