Procédé de préparation de polypeptides de haut poids moléculaire
La présente invention concerne la préparation de polypeptides de haut poids moléculaire.
Les corps de Leuchs sont des anhydrides mixtes obtenus par l'action de certains réactifs sur des amino-acides. Par exemple:
EMI1.1
Ces anhydrides mixtes sont peu stables et donnent naissance par décarboxylation à des radicaux libres dont la vie moyenne est suffisamment longue pour qu'ils puissent se souder à eux-mêmes ou à des radicaux semblables, appartenant à des chaînes hydrocarbonées différentes.
On peut obtenir ainsi des polypeptides de poids moléculaire élevé. Les peptides simples et les polypeptides binaires sont bien connus. On a réussi aussi la synthèse d'un polypeptide ternaire, le glutamylleucyl-lysine.
En revanche, les polypeptides supérieurs ont été jusqu'ici très difficiles à préparer et les rendements deviennent très faibles.
Il a été découvert maintenant que, en respectant certaines conditions déterminées, il est possible de préparer par synthèse des polypeptides supérieurs, notamment des hexapeptides voire des octopeptides, avec un rendement de 80 /o, la réaction étant totale en une heure environ.
L'invention a pour objet un procédé de préparation de polypeptides, de haut poids moléculaire, caractérisé en ce qu'un mélange d'acides aminés est transformé en le mélange d'anhydrides mixtes par réaction soit avec un ester chloroformique et du chlorure de thionyle soit avec du phosgène, on dissout le mélange d'anhydrides mixtes ainsi obtenus dans un mélange de glycol éthylénique fraîchement redistillé et d'alcool éthylique redistillé sur du magnésium, mélange solvant dans lequel lesdits anhydrides mixtes sont décarboxylés en engendrant des radicaux libres qui s'associent en un polypeptide.
La transformation des acides aminés en anhydrides mixtes peut se faire en recourant soit à un ester chloroformique et au chlorure de thionyle, soit au phosgène. Les corps complexes susceptibles d'être obtenus par le procédé selon l'invention ouvrent un chemin d'approche vers les holoprotéines, avec toutes les perspectives d'intérêt que cela comporte pour la chimie, la biochimie et la biophysique, et surtout la pharmacologie.
Dans le domaine de la médecine, c'est l'immunochimie qui pourra utiliser le plus fructueusement ces corps. On sait en effet que l'insuline et le venin de cobra, par exemple, sont également des holoprotéines, donc uniquement composées d'amino-acides, et leurs propriétés sont pourtant tout à fait exceptionnelles.
Exemple
On mélange les six acides aminés simples (purs, racémiques), soit le glycocolle, l'alanine, la valine, la leucine, la phénylalanine et l'isoleucine, dans les proportions respectives de 0,4 g, 2,4 g, 6,0 g, 10,0 g, 3,6 g et 6,0 g. On ajoute aux 28,4 g du mélange des acides aminés 3 cm3 de soude 2 N. On opère dans un ballon muni d'un agitateur. La dissolution est incomplète, le pH de la solution se stabilisant aux environs de 10,35. On verse alors simultanément, en deux filets liquides, 17 cm3 de chloroformiate de méthyle et 3 cm3 de soude 2 N. On verse les deux liquides ensemble de façon à avoir une introduction terminée en même temps dans les deux ampoules, l'opération s'étendant sur 30 minutes environ. Le ballon de réaction étant sur bain de glace pilée, la température passe de 00 initialement à 80 en fin d'introduction.
Après 20 minutes, la température retombe à 20 C. Le bain de glace est remplacé par de l'eau à 200, l'agitation est toujours maintenue et la température de la solution remonte en une demiheure, de 20 à 200. Le pH est alors de 10.
On continue l'agitation pendant une heure environ, et le pH se fixe à 9,4. On ajoute alors 32 cm d'acide chlorhydrique concentré. Il se forme un précipité blanc collant sur les parois.
On effectue deux extractions en utilisant 162 cm3 d'éther sulfurique. Après chaque séparation, l'éther est lavé avec deux fois 50 cm3 d'eau distillée. Les eaux mères aqueuses sont encore extraites par 100 cm3 d'éther sulfurique. Les solutions éthérées sont concentrées, mises dans un cristallisoir taré où le mélange des amides, qui se présente comme huile incolore, finit de perdre l'éther. Rendement 80 O/o.
Sur 12,2 g du mélange d'amides ainsi préparé, on fait agir 10 cm3 soit 16,5 g de chlorure de thionyle.
La réaction est assez violente au début. On maintient la température inférieure à 200. On laisse réagir pendant 15 heures environ. On obtient une solution marron rougeâtre, claire. On évapore sous vide à 400 jusqu'à ce que tout le chlorure de thionyle restant soit éliminé. Il reste 8,8 g de mélange d'anhydride brut, soit un rendement de 87 O/o.
8,8 g du mélange d'anhydrides sont dissous dans un mélange de 6 cm : 3 de glycol éthylénique redistillé depuis moins d'une heure et de 15,5 cm3 d'alcool éthylique séché par distillation sur magnésium. On obtient une solution brune qui se transforme en un gel rigide en une heure environ. Desséché sous vide, le gel perd ses solvants et se transforme en une poudre qui est épuisée par l'eau. Le résidu se présente comme une poudre blanche qui est un polypeptide de haut poids moléculaire.
Process for the preparation of high molecular weight polypeptides
The present invention relates to the preparation of high molecular weight polypeptides.
Leuchs bodies are mixed anhydrides obtained by the action of certain reagents on amino acids. For example:
EMI1.1
These mixed anhydrides are not very stable and give rise by decarboxylation to free radicals whose average life is long enough for them to be able to weld to themselves or to similar radicals belonging to different hydrocarbon chains.
High molecular weight polypeptides can thus be obtained. Simple peptides and binary polypeptides are well known. The synthesis of a ternary polypeptide, glutamylleucyl-lysine, has also been successful.
In contrast, the higher polypeptides have heretofore been very difficult to prepare and the yields are becoming very low.
It has now been discovered that, while respecting certain determined conditions, it is possible to prepare by synthesis higher polypeptides, in particular hexapeptides or even octopeptides, with a yield of 80%, the reaction being complete in approximately one hour.
The subject of the invention is a process for the preparation of polypeptides, of high molecular weight, characterized in that a mixture of amino acids is transformed into the mixture of mixed anhydrides by reaction either with a chloroform ester and thionyl chloride. either with phosgene, the mixture of mixed anhydrides thus obtained is dissolved in a mixture of freshly redistilled ethylenic glycol and ethyl alcohol redistilled over magnesium, a solvent mixture in which said mixed anhydrides are decarboxylated by generating free radicals which s' combine into a polypeptide.
The transformation of amino acids into mixed anhydrides can be accomplished by using either a chloroform ester and thionyl chloride, or phosgene. The complex bodies capable of being obtained by the process according to the invention open a path of approach towards holoproteins, with all the prospects of interest that this entails for chemistry, biochemistry and biophysics, and especially pharmacology.
In the field of medicine, it is immunochemistry that will be able to use these bodies most fruitfully. We know in fact that insulin and cobra venom, for example, are also holoproteins, and therefore only composed of amino acids, and their properties are however quite exceptional.
Example
Mix the six simple amino acids (pure, racemic), namely glycocoll, alanine, valine, leucine, phenylalanine and isoleucine, in the respective proportions of 0.4 g, 2.4 g, 6 , 0 g, 10.0 g, 3.6 g and 6.0 g. 3 cm3 of 2N sodium hydroxide are added to the 28.4 g of the mixture of amino acids. The operation is carried out in a flask fitted with a stirrer. Dissolution is incomplete, the pH of the solution stabilizing at around 10.35. Then poured simultaneously, in two liquid streams, 17 cm3 of methyl chloroformate and 3 cm3 of 2N soda. The two liquids are poured together so as to have an introduction completed at the same time in the two ampoules, the operation s' extending over about 30 minutes. The reaction flask being in a bath of crushed ice, the temperature goes from 00 initially to 80 at the end of the introduction.
After 20 minutes, the temperature drops to 20 C. The ice bath is replaced by water at 200, stirring is still maintained and the temperature of the solution rises again in half an hour, from 20 to 200. The pH is then 10.
Stirring is continued for about an hour, and the pH is fixed at 9.4. Then added 32 cm of concentrated hydrochloric acid. A sticky white precipitate forms on the walls.
Two extractions are carried out using 162 cm3 of sulfuric ether. After each separation, the ether is washed with twice 50 cm3 of distilled water. The aqueous mother liquors are further extracted with 100 cm3 of sulfuric ether. The ethereal solutions are concentrated, placed in a tared crystallizer where the mixture of amides, which appears as colorless oil, ends up losing the ether. Yield 80 O / o.
On 12.2 g of the mixture of amides thus prepared, 10 cm3, ie 16.5 g of thionyl chloride, are allowed to act.
The reaction is quite violent at first. The temperature is maintained below 200. Allowed to react for about 15 hours. A clear reddish-brown solution is obtained. Evaporate in vacuo at 400 until all remaining thionyl chloride is removed. 8.8 g of crude anhydride mixture remain, ie a yield of 87 O / o.
8.8 g of the mixture of anhydrides are dissolved in a mixture of 6 cm: 3 of ethylenic glycol redistilled for less than an hour and of 15.5 cm3 of ethyl alcohol dried by distillation over magnesium. A brown solution is obtained which turns into a rigid gel in about an hour. Dry under vacuum, the gel loses its solvents and turns into a powder which is used up by the water. The residue appears as a white powder which is a high molecular weight polypeptide.