Indicateur et son utilisation pour doser les substances dans les liquides biologiques
La présente invention se rapporte à un indicateur nouveau qui convient pour des réactions chimiques comprenant la détermination de certaines substances dans les liquides biologiques et elle se rapporte égale ment à l'utilisation du papier indicateur pour analyser des sécrétions.
L'analyse des liquides de l'organisme comme le sang, l'urine, etc. est, depuis longtemps, utilisée comme moyen de diagnostic pour déterminer les taux de substances produites par des réactions chimiques et dont la présence ou l'absence, plus ou moins totales, constitue une indication d'une condition anormale. Certaines substances biochimiques primaires peuvent être décelées directement par des examens colorimétriques relativement simples. D'autres ne peuvent être déterminées que par une réaction secondaire qui comprend le traitement de la sécrétion par des systèmes réactifs divers et la mesure d'un ou plusieurs des produits réactionnels formés.
Certaines de ces dernières substances comme l'azote de l'urée, la trypsine et l'histidine peuvent être déterminées par des réactions chimiques appropriées dans lesquelles il se forme des produits réactionnels gazeux que l'on mesure. Par exemple, l'azote de l'urée contenu dans le sérum peut être déterminé par une conversion de l'azote de l'urée en ammoniac et par mesure de l'ammoniac dégagé. La mesure du taux d'auote de l'urée est une méthode de diagnostique importante, étant donné que des taux élevés d'azote de l'urée dans le sérum sont observées chez des malades qui souffrent d'urémie, de néphrite chronique, d'hémorragies importantes ou d'une obstruction du petit intestin.
En outre, le taux de trypsine constituant une enzyme dans le sérum devient élevé dans les maladies du pancréas, et le taux dans le sérum de cet enzyme peut être déterminé par la mesure de son effet dans la réaction qui comprend l'hydrolyse du chlorhydrate de l'amide d'a-benzoyl-L-arginine qui libère de l'ammoniac. Les taux d'histidine peuvent être déterminés dans l'urine par une réaction provoquant la libération d'ammoniac en présence de l'histidine servant d'enzyme diaminase ou d'anhydride carbonique en présence de l'histidine servant d'enzyme aodécarboxylase. Des taux anormaux en histidine sont l'indice de la grossesse.
Dans tous les examens mentionnés ci-dessus, il faut déterminer la quantité de gaz qui est libérée par la réaction secondaire en vue de mesurer la concentration de la substance biochimique primaire dans la sécrétion examinée. Dans les méthodes analytiques mises en oeuvre jusqu'à ce jour, il était nécessaire de faire absorber le gaz formé par la réaction secondaire dans une solution absorbante et de déterminer ensuite la concentration dans la solution par titrage ou un autre moyen. La nature compliquée de cette méthode analytique nécessitait sa mise en oeuvre par des personnes expérimentées. En outre, le mode d'examen est de lui-même très long.
La présente invention a pour objet:
- un indicateur pour examens utilisé pour la détermination quantitative rapide et simple des substances biochimiques contenues dans des liquides biologiques qui peuvent subir une réaction chimique pour former un gaz dont la quantité peut être mesurée;
- l'utilisation du papier indicateur pour analyser la quantité de substances biochimiques qui peut être mise en oeuvre par des personnes sans expérience.
Pour obtenir l'indicateur selon l'invention, on utilise un papier ou autre substance absorbante qui est imprégné de façon telle qu'on obtienne le système de réactifs chimiques nécessaire pour que la réaction chimique désirée de la substance biochimique à doser ait lieu afin de libérer un gaz et, en outre, il comporte un indicateur sensible au gaz dégagé au cours de la réaction chimique, gaz qui produit un changement de couleur à un degré proportionnel à la quantité de substances biochimiques dans la sécrétion. L'utilisation de l'indicateur, conforme à la présente invention, demande tout simplement son insertion dans un tube contenant un petit volume dosé de la sécrétion à examiner, après quoi on compare la zone de papier imprégnée de l'indicateur avec un catalogue de couleurs étalons après un intervalle de temps défini.
On voit donc que l'utilisation du papier indicateur de la présente invention supprime les méthodes analytiques compliquées de la méthode d'examen disponible jusqu'a ce jour pour mesurer la quantité d'une substance biochimique dans une sécrétion examinée grâce à la réaction chimique de cette substance pour former un gaz. La suppression de ces méthodes compliquées et longues des procédés de la technique antérieure signifie que l'examen peut être effectué par des personnes non qualifiées. En outre, il ne faut aucune installation de laboratoire à l'exception d'une simple éprouvette, ce qui fait que de nombreux examens individuels peuvent être effectués simultanément.
L'indicateur selon la présente invention, est caractérisé en ce qu'il comprend une feuille généralement rectangulaire de substance absorbante imprégnée de plusieurs systèmes réactifs suivant des bandes s'étendant dans la largeur de la feuille, ces bandes comprenant une première bande à l'une des extrémités de la feuille imprégnée d'un réactif formant avec la substance biochimique un gaz, une seconde bande voisine de la première imprégnée d'une substance libérant ledit gaz, une troisième bande voisine de la seconde bande imprégnée d'une substance inerte empêchant l'écoulement par capillarité à travers cette troisième bande, et une quatrième bande adjacente à la troisième imprégnée d'un indicateur changeant de couleur proportionnellement à la quantité dudit gaz formé.
Sur le dessin annexé, les fig. 1 et 2 représentent des papiers indicateurs selon l'invention.
Sur le dessin, le papier indicateur (l'expression papier couvrant bien entendu le papier lui-même ainsi que toute substance absorbante) comprend une bande de réaction 1 située à l'une des extrémités de l'indicateur et s'étendant transversalement à ce dernier. Dans la zone où se trouve la bande de réaction, le papier indicateur est imprégné d'un système réactif chimique qui entre en réaction de la manière désirée avec la substance biochimique dont la présence dans la sécrétion examinée doit être mesurée. On a conçu de manière qu'un gaz se trouve finalement libéré, comme on le décrira par la suite. Au voisinage de la bande de réaction est prévue une bande de libération de gaz s'étendant sur la largeur du papier indicateur.
Dans la zone occupée par la bande de libération de gaz, le papier indicateur est imprégné d'une substance chimique qui libère d'une solution le gaz formé par la réaction chimique se produisant dans la bande de réaction. On a prévu une bande d'arrêt 3 s'étendant sur la largeur du papier indicateur. Dans la zone occupée par la bande d'arrêt, le papier indicateur est uniformément imprégné d'une matière résineuse qui obture les pores du papier pour empêcher la migration de la sécrétion examinée, ce qui fait qu'un changement de couleur quelconque de l'indicateur est uniquement dû au gaz dégagé au cours de la réaction. Près de la bande d'arrêt se trouve une bande d'indicateur s'étendant sur la largeur de la bande.
Dans la zone occupée par cette bande 4, le papier est uniformément imprégné d'une substance convenant pour neutraliser le gaz dégagé et d'un indicateur dont la couleur change dans la gamme de pH atteinte au cours de la réaction de neutralisation. La zone de la bande d'indicateur qui change de couleur est proportionnelle à la quantité de gaz formé par la réaction.
Les bandes de réaction, ! de libération de gaz, d'ar- rêt et d'indicateur sont communes aux deux modes de réalisation de Invention représentés sur les fig. 1 et 2.
Dans le mode de réalisation de la fig. 2, certaines zones du papier indicateur n'ont pas été imprégnées pour laisser des bandes vierges la, 2a et 4a. En outre, dans le mode de réalisation illustré sur la fig. 2, des couches de ruban 5 sensible à la pression, représentées avec arrachement partiel sur la fig. 2, recouvrant les deux bandes de réaction et de libération des gaz.
On va maintenant décrire plus complètement la réalisation et le rôle des diverses bandes prévues sur les papiers indicateurs selon la présente invention et dont des exemples sont les modes de réalisation illustrées sur les fig. 1 et 2.
La matière dont est fait le papier indicateur est un produit absorbant, c'est-à-dire n'importe quel produit en feuille poreux et absorbant qui est insoluble dans l'eau ou des solvants organiques, qui peut absorber et retenir les liquides qui y sont appliqués, qui possède une solidité satisfaisante à l'état humide et qui ne réagit pas en présence des divers réactifs appliqués sur ce produit ou des sécrétions à examiner. Le papier constitue un produit absorbant extrêmement efficace pour la mise en oeuvre de l'invention. Il peut avoir n'importe quelle épaisseur, une épaisseur comprise entre 0,2 et 1 mm étant appropriée.
Le papier indicateur doit avoir une longueur et une largeur suffisantes pour permettre l'imprégnation des divers réactifs sous forme de bandes et être cependant assez petit pour pouvoir être introduit dans de petites éprouvettes en cours d'utilisation. Un papier indicateur d'une longueur d'environ 63 mm à 101 mm et d'une largeur d'environ 3,2 à 12,7 mm est approprié. Lorsqu'on cite les dimensions des diverses bandes du papier indicateur au cours de la description, on utilise le terme longueur pour désigner la dimension parallèle à la longueur du papier indicateur.
On imprègne le papier indicateur d'une série de substances différentes pour former des bandes paral lèles voisines les unes des autres comme représenté sur la fig. 1 ou séparées les unes des autres sur la longueur du papier indicateur par des zones non imprégnées, comme représenté sur la fig. 2. La bande de réaction est disposée près de l'une des extrémités du papier indicateur ou en est séparée par une bande vierge ou non imprégnée, comme représenté en la sur la fig. 2. La bande de réaction est uniformément imprégnée d'un système réactif qui, lors du contact avec une sécrétion, réagit avec une substance qui est contenue dans cette sécrétion pour former un gaz. Le système réactif comprend le réactif spécifique et un tampon servant à maintenir le pH à une valeur optimum pour la réaction intéressée.
Lorsqu'on détermine le taux en azote de l'urée dans le sérum, on imprègne la bande de réaction d'une uréase et d'un tampon convenant pour maintenir le pH du papier indicateur entre 7 et 8 et de préférence à environ 7,6, quand il est en contact avec ce sérum. Cette gamme de pH est optimum pour l'activité de l'enzyme constituée par l'uréase sur l'azote de l'urée pour former de l'ammoniac. Un tampon au phosphate, par exemple un mélange de K2HPO4 et de KH2PO4 est particulièrement efficace pour l'obtention de pH désiré à environ 7,6 dans la bande de réaction. La quantité de réactif et de tampon dans la bande de réaction du papier indicateur conforme à la présente invention peut varier de manière importante, à condition que la bande de réaction contienne au moins un excès du système réactif.
Bien entendu, la bande de réaction peut être imprégnée d'autres réactifs dans le cas de la détermination de substances autres que l'azote de l'urée dans des sécrétions. Pour mesurer la trypsine dans le sérum, on imprègne la bande de réaction de chlorhydrate de l'amine a-benzoyl-L-arginine. Pour la détermination de l'histidine, la bande de réaction est imprégnée d'histidine-a-décarboxylase et d'un tampon convenant pour maintenir le pH durant l'examen entre environ 4 et environ 5, ou l'histidine déaminase et d'un tampon pouvant maintenir le pH durant l'examen entre environ 7,5 et 8,5. On peut modifier la longueur de e la bande de réaction et une longueur comprise entre environ 9,5 et 15,8mu est appropriée.
Dans le mode de réalisation illustré sur la fig. 2, une bande vierge ou non imprégnée la est située à l'extrémité du papier indicateur, près de la bande de réaction. Cette bande vierge est particulièrement utile quand les zones de réaction et de libération de gaz sont recouvertes d'un ruban sensible à la pression, comme représenté sur la fig. 2. La bande vierge la constitue une zone contrôlée pour l'absorption dans le papier indicateur du liquide provenant de la sécrétion examinée. Le liquide migre de la bande vierge par capillarité, et passe dans la bande de réaction.
La bande vierge a normalement une longueur de 3,17 à 9,5 mm.
Quand on imprègne le papier indicateur pour former la bande de réaction, on utilise une solution du système réactif; Par exemple, quand on prépare des papiers indicateurs pour la détermination de l'azote de l'urée dans le sérum, la zone du papier qui doit constituer la bande de réaction est imprégnée d'une solution Id'uréase et de tampon dans un solvant approprié. On peut utiliser de l'eau ou des mélanges d'eau et de solvants organiques volatils, comme l'éthanol. De préférence, le solvant doit contenir autant de solvant organique volatil que possible pour faciliter le séchage du papier indicateur après imprégnation.
On peut utiliser des préparations commerciales d'uréase comme source d'enzyme de l'uréase ou bien on peut préparer des extraits de l'uréase par extraction de sources naturelles de l'enzyme telles que la farine de soja ou la-farine de jacquier par un alcool aqueux.
La bande ! de libération de gaz est disposée sur l'indicateur au voisinage de la bande de réaction, et elle est uniformément imprégnée d'un produit adapté convenant pour dégager de la solution le gaz formé par réaction chimique entre la substance biochimique contenue dans la sécrétion examinée et le système réactif de la bande de réaction. La réaction a lieu en phase liquide, étant donné que la bande de réaction se sature de la sécrétion examinée par migration du liquide qui monte dans le papier indicateur par capillarité. Le gaz formé par la réaction chimique est initialement dissous dans la phase liquide dont la bande de réaction est saturée.
Afin d'obtenir une mesure précise de la quantité de substance biochimique contenue dans la sécrétion examinée, il est évident que le gaz formé par la réaction qui se produit dans la bande de réaction doit être complètement dégagé de la solution. Il en est ainsi particulièrement parce que la quantité de gaz formée est extrêmement faible. Le pH dans la bande de réaction pour la mise en oeuvre de la réaction avec la substance biochimique, est fréquemment tel qu'au moins une partie du gaz formé tende à rester en solution.
Par exemple, quand on détermine le teneur en azote de l'urée dans un sérum, on tamponne la bande de réaction pour obtenir un pH compris entre environ 7 et 8. Dans ces conditions légèrement alcalines, au moins une partie de l'ammoniac formé dans la réaction reste en solution.
Le produit utilisé pour imprégner le papier indicateur afin de former la bande de libération de gaz est capable de porter le pH dans la bande de libération du gaz à une valeur convenant pour assurer une libération complète du gaz contenu dans la solution, gaz qui a été formé par la réaction. Dans le cas de papiers indicateurs conformes à l'invention dans lesquels l'ammoniac est libéré dans la bande de réaction, la bande de libération de gaz doit être imprégnée d'une substance basique pour que le pH dans la bande de libération soit d'au moins 10 quand elle est humide. On préfère un pH compris entre 10 et 11.
Quand le système réactif dans la bande de réaction réagit avec la substance biochimique contenue dans la sécrétion examinée et forme ainsi de l'anhydride carbonique, on imprègne la bande de libération de gaz avec un acide convenant pour donner un pH inférieur à 4 dans la bande de libération de gaz, quand elle est humide.
Quand on procède à l'examen en utilisant un papier indicateur conforme à l'invention, la sécrétion examinée monte par capillarité dans le papier indicateur, en venant d'abord en contact avec la bande de réaction où la réaction se produit et un gaz est forme.
Ce gaz est initialement dissous dans le liquide dont la bande est saturée pendant l'examen. Le liquide conter nant le gaz formé par la réaction continue à monter dans le papier indicateur par capillarité et passe dans la bande de libération de gaz. Dans cette dernière bande, par suite de la présence du produit avec lequel la bande est imprégnée, le pH du liquide est modifié et prend une valeur qui assure un dégage ment complet du gaz contenu dans la solution. La bande de libération du gaz dans des papiers indicateurs conformes à la présente invention permet une mesure précise de la quantité de substance biochimique contenue dans la sécrétion examinée, étant donné qu'elle assure une libération complète du gaz formé par la réaction et se trouvant en solution.
Le produit acide ou basique utilisé doit être non hygroscopique ou non déliquescent, non volatil, soluble dans l'eau et exempt d'une tendance quelconque au suintement ainsi que d'effet nuisible sur le produit absorbant constituant le papier indicateur. Des produits basiques appropriés comprennent les carbonates, les phosphates et les acétates d'un métal alcalin comme le phosphate de potassium, le carbonate de lithium, le carbonate de sodium, le carbonate de potassium, l'acétate de sodium, l'acétate de potassium, le phosphate de sodium, etc.. Le carbonate de potassium est une base particulièrement efficace pour la bande de libération de gaz dans des papiers indicateurs préparés en vue de la détermination de la teneur en azote de l'urée dans le sérum ou d'autres substances qui libèrent de l'ammoniac dans les conditions d'examen.
Des produits acides appropriés pour la bande de libération de gaz quand de l'anhydride carbonique est libéré dans les conditions d'examen comprennent l'acide benzoïque, l'acide lactique, l'acide fumarique, l'acide salicylique, l'acide sulfosalicylique, l'acide tartrique, l'acide oxalique etc.
La quantité de produit acide ou basique à utiliser doit être suffisante pourqu'une libération efficace du gaz se produise pendant la totalité de la période d'examen, et elle doit être suffisante pour combattre toute basicité ou acidité dans la sécrétion examinée qui migre par capillarité vers le haut du papier indicateur. Dans le cas de papiers indicateurs utilisée pour mesurer l'azote de l'urée dans 0,1 à 0,2 ml de sérum, la présence de 0,05 à 1,0 mg environ de carbonate de potassium est particulièrement appropriée.
La longueur de la bande de libération de gaz est normalement égale à celle de la bande de réaction, c'est-à-dire qu'elle est comprise entre environ 9,5 et 15,8 mm.
La bande de libération de gaz est imprégnée d'une manière similaire à celle qu'on a décrite au sujet de l'imprégnation de la bande de réaction. Le produit acide ou basique, en solution dans l'eau ou de préférence dans un mélange d'eau et d'un solvant organique volatil, est appliquée au papier indicateur dans la zone devant être occupée par la bande de libération de gaz, et on sèche ensuite le papier indicateur pour éliminer le solvant.
Conformément au mode de réalisation illustré sur la fig. 2, les bandes de réaction et de libération de gaz sont recouvertes sur les deux faces du papier indicateur d'un ruban adhésif, par exemple un ruban de papier adhérant par pression. L'utilisation de ce ruban est particulièrement désirable pour plusieurs raisons. Tout d'abord, il renforce le papier indicateur dans la zone où il lest mouillé par la sécrétion en cours d'examen. Sans le ruban, le papier indicateur a tendance à s'appliquer contre les parois de l'éprouvette dans laquelle on procède à l'examen, avec la possibilité que, par capillarité, la sécrétion puisse non seulement contourner la zone de réaction mais encore imprégner la zone d'indicateur, ce qui donnerait des résultats erronés.
En deuxième lieu, la présence de ruban imperméable aux gaz permet la libération de la totalité du gaz depuis la partie supérieure de la bande de libération des gaz, aussi près que possible de la bande d'indicateur, ce qui améliore la précision et l'homogénéité des résultats. Finalement, le ruban protège l'enzyme de l'uréase dans la bande de réaction d'un contact avec l'air pendant le stockage du papier indicateur et permet d'obtenir une longue durée de conservation de l'indicateur.
La bande d'arrêt est disposée sur le papier indicateur au voisinage de la bande de libération de gaz ou en est séparée par r une bande vierge 2a comme repré- senté eur la fig. 2. La bande d'arrêt prévue dans le papier indicateur conforme à l'invention a pour rôle d'empêcher la migration du liquide vers le haut du papier par capillarité grâce à la présence d'une bande d'arrêt efficace, tout changement de couleur de la bande d'indicateur sera due uniquement au gaz libéré de la bande de libération des gaz et non pas à l'acidité ou l'alcalinité de l'un quelconque des réactifs des autres bandes du papier indicateur.
On peut utiliser n'importe lequel des produits classiques d'imprégnation du papier qui sont conçus pour empêcher un passage par capillarité du liquide à travers le papier, en vue de créer une bande d'arrêt efficace dans le papier indicateur conforme à l'invention. Le produit d'imprégnation doit être inerte, c'est-à-dire chimiquement stable, et doit être retenu de façon tenace dans le produit absorbant dont est fait le papier indicateur.
Par exemple, dans la zone constituant la bande d'arrêt, le papier indicateur peut être imprégné d'un produit tel qu'une peinture, un vernis, un émail, des compositions plastiques, etc... Des compositions plastiques utiles comprennent des polymères et des copolymères du chlorure de vinyle, de l'acétate de vinyle, de l'acide acrylique et de ses esters, de l'acide méthylac rylique et de ses esters, etc... On a constaté que le méthacrylate de méthyle polymérisé constitue une matière plastique particulièrement efficace pour former une bande d'arrêt dans le papier indicateur de la présente invention.
La longueur de la bande d'arrêt doit être suffisante pour assurer qu'il ne se produise pas de migration Idu liquide à travers celle-ci jusque dans la bande d'indicateur let elle doit être cependant suffisamment courte pour que le gaz dégagé par la bande de libération de gaz n'ait qu'une faible distance à parcourir avant de venir en contact avec la bande d'indicateur. On préfère une longueur comprise entre 1,6 et 6,3 mm.
Conformément au mode de réalisation de la présente invention illustré sur la fig. 2 et dans lequel les bandes Ide réaction et de libération sont couvertes d'un ruban plastique, il est désirable de prévoir une zone contrôlée pour la libération de gaz à partir du bord supérieur de la bande de libération de gaz.
Lorsqu'on forme la bande d'arrêt, on applique la matière d'imprégnation à la bande dans la zone devant être occupée par la bande d'arrêt. Pour obtenir une viscosité satisfais, ante en vue de l'imprégnation, on applique habituellement les produits d'im prégnation sous forme de solutions dans des solvants volatils et, après l'imprégnation, on laisse la bande sécher pour assurer une évaporation complète des solvants. Dans le cas de produits d'imprégnation comme des peintures et des vernis, on peut chauffer la bande pendant l'opération ide séchage pour accélérer le durcissement de ces produits.
Le papier indicateur conforme à l'invention comporte une bande d'indicateur voisine de la bande d'arrêt. La fonction de cette bande d'indicateur est d'absorber le gaz libéré par la bande de libération du gaz et de constituer un moyen pour son dosage. La zone du papier indicateur qui est occupée par la bande d'indicateur est uniformément imprégnée d'une subsx tance pouvant neutraliser le gaz dégagé (une substance acide lorsque le gaz libéré est de l'ammoniac et une substance basique lorsque le gaz est de l'anhydride oarbonique) et un indicateur pouvant changer de couleur à la fin de la neutralisation ou avant.
L'indicateur utilisé doit exhiber un changement de couleur facile à observer dans la gamme de pH atteinte pen dant la neutralisation qui se produit ! dans le papier indicateur. Cette réaction se produit dans des conditions essentiellement anhydres, étant donné que la seule humidité présente est la teneur en humidité d'équilibre du papier qui est normalement comprise entre 5 et 10 O/o en poids.
Dans le cas des papiers indicateurs dans lesquels le gaz dégagé est de l'ammoniac (comme dans le dosage de l'azote de l'urée contenu dans le sérum), des substances acides qui constituent des agents de neutralisation efficaces dans la bande d'indicateur sont des acides comme l'acide citrique, l'acide oxalique, l'acide maléique, l'acide benzoïque, l'acide sulfosalicylique, l'acide tartrique, etc... La gamme de pH de l'indicateur utilisé pour signaler le point final de la réaction de neutralisation est critique. L'indicateur doit être entièrement sous la forme acide en présence de la substance acide que contient la bande d'indicateur. En outre, l'indicateur doit être entièrement sous forme basique à un pH ne dépassant pas celui auquel l'ammoniac cesse d'être absorbé dans la bande d'indicateur.
On a constaté qu'il ne se produit pas d'absorption de l'ammoniac dans un papier imprégné d'une substance acide dont le pH dépasse environ 6,5. Ainsi, l'indicateur doit être sous forme basique et à un pH de 6,5 ou moins. Des indicateurs utiles comprennent donc le Bleu de bromo-thymol brom, le Rouge alizarine S, le Bleu de bromo-lphénol, le Pounpre de bromocrésol, le Vert de bromo-crésol, le Rouge de méthyle, etc ..
Lorsque la bande d'indi cateur ! est imprégnée d'un acide relativement fort comme l'acide sulfosalicylique, on préfère générales ment un indicateur comme le Bleu de bromophénol, étant donné qu'il change de couleur dans une gamme de pH de 3 à 4,6, Avec un acide plus faible, comme l'acide citrique, un indicateur plus basique comme le
Pourpre de bromo-crésol qui change de couleur dans une gamme de pH de 5,2 à 6,7 est satisfaisant. Le
Vert de bromo-crésol constitue un indicateur préféré et un papier indicateur dont la bande d'indicateur est imprégnée d'acide tartrique et de Vert de bromocrésol est particulièrement efficace pour le dosage de l'azote de l'urée dans le sérum.
Dans le cas de papiers indicateurs dans lesquels le gaz dégagé est de l'anhydride carbonique, la bande , d'in ! dicateur est imprégnée d'une substance basique conçue pour neutraliser l'anhydride carbonique dégagé et d'un indicateur. Des substances basiques appropriées comprennent les carbonates, les phosphates et les acétates d'un métal alcalin, comme le phosphate de potassium, le carbonate de lithium, le carbonate de sodium, le carbonate de potassium, l'acétate de sodium, l'acétate de potassium, le phosphate de sodium, etc...
L'indicateur doit être entièrement sous forme basique en présence de la substance basique se trouvant dans la bande d'indicateur et doit être entièrement amené sous sa forme acide à un pH qui n'est pas inférieur à celui auquel l'anhydride carbonique cesse d'être absonbé dans la bande d'indicateur. Des indicateurs utiles comprennent la phénolphtaléine, la thymolphtaléine du thymol, le bleu de thymol, le pourpre de méthacrésol, etc....
On obtient la bande d'indicateur en mettant l'indicateur en contact, dans la zone devant être occupée par la bande d'indicateur, avec une solution de la substance acide ou basique et de l'indicateur dans un solvant volatil et en laissant ensuite sécher la feuille.
Etant donné que le gaz dégagé par la bande de libération du gaz est en réalité titré dans la bande d'indicateur, il est apparent qu'on peut faire varier facilement la sensibilité de la bande d'indicateur en réglant la quantité de substance basique ou acide appliquée dans la bande d'indicateur. Pour les papiers indicateurs d'une sensibilité élevée, seule une petite quantité de substance acide ou basique se trouve dans la bande d'indicateur, tandis que, pour les feuilles destinées à doser de plus grandes quantités de substances biochimiques dans la sécrétion, une plus grande quantité de substance acide ou basique est utilisée. On peut régler la quantité de substance acide ou basique utilisée pour former la bande d'indicateur en faisant varier la concentration de la solution d'imprégnation ou le volume appliqué à la feuille, ou ces deux facteurs.
Le changement de couleur qu'on observe dans la bande d'indicateur est proportionnel à la quantité de gaz dégagée par la bande de libération du gaz, quian- tité qui est elle-même proportionnelle à la quantité de substance b l'air à la température ambiante mais à l'abri des courants d'air. Il faut 0,48 mi de solution.
On applique sur le papier indicateur un ruban de papier (ruban Scotch No. 26ri , jaune de la Minne- sota Mining and Manufacturing Co ) de 25,4 mm Ide large avec un rouleau en caoutchouc, à une distance de 6,3 à 31,7 mm du bord de référence.
On coupe la feuille à une largeur de 82,5 mm, en calculant cette distance depuis le bord de référence.
On applique une solution de 0,1 O/o en poids de
Pourpre de Ibromo-crésol dans de l'acide citrique 0,008 M dans de l'alcool éthylique à 95 O/o, sur une bande de 12,7 mm de large et à une distance de 41,2 à 54 mm du bord de référence. On laisse la feuille sécher à l'air, mais à l'abri des courants d'air. I1 faut environ 0,5 rul de solution. On coupe ensuite la feuille perpendiculairement au bord de référence pour former 48 papiers indicateurs dont chacun a 82,5 mm Ide long et 6,3 mm de large. On place les bandes dans des éprouvettes an Pyrex , on les sèche dans un dessiccateur et on bouche à l'émeri.
Exemple 2
On utilise une longue feuille de papier Whatman 3MM, de 82,5 mm de large et de 0,4 mm d'épaisseur comme matière de départ pour former des papiers indicateurs pour le dosage de l'azote de l'urée dans le sérum. On appelle l'un des bords longs du papier le bord de référence.
On applique un extrait d'uréase tamponné, préparé comme décrit dans l'exemple 1, pour imprégner la feuille sur une bande de 12,7 mm de large, s'étendant à 6,3 à 19 mm du bord de référence. On applique 0,016mol de solution par mm de papier. On sèche à la feuille à l'air à la température ambiante, mais à l'abri des courants d'air, pour faire évaporer les solvants présents dans les solutions d'extrait d'uréase et de carbonate de potassium. On recouvre ensuite les deux faces des portions imprégnées de la feuille d'un ruban de papier de 25,4 mm de largeur ( ruban Scotch No. 267 , jaune, de la Minnesota
Mining and Manufacturing Co ). Le ruban de papier couvre ainsi la feuille sur une bande située à 6,3 à 31,7 mm du bord de référence.
Une solution de résine de méthacrylate de méthyle polymérisé (enduit transparent de Krylon
No. 150 de la Krylon Inc., à Norristown: 2 parties-alcool éthylique: 1 partie) est appliquée en une quantité suffisante pour saturer le papier sur une bande de 3,17 mm de large s'étendant à une distance de 38,1 à 41,2 mm du bord de référence.
On applique ensuite une solution contenant 0,2 O/o de Vert de bromo-crésol, en poids, et 0,6 0/o d'acide tartrique, en poids dans 95 O/o d'alcool éthylique, sur une bande de 12,7 mm de large s'étendant à 41,2 à 54 nun du bord dv référence. Il faut 0,016 ml Ide solution par mm de papier. On laisse ensuite la feuille sécher à l'air, mais. à l'abri des courants d'air, pour faire évaporer les solvants présents dans les solutions de résine et acide tartrique-Vert de bromo-crésol. On coupe ensuite la feuille perpendiculairement au bord de référence pour former une série de papiers indica tsurs ayant chacun 82,5 mm de long et 6,3 mm de large.
Les papiers indicateurs résultants sont placés dans des éprouvettes, séchés dans un dessiccateur et on les bouche à l'émeri.
Les papiers indicateurs préparés conformément aux exemples présentent les caractéristiques suivantes, données en se référant à la fig. 2.
Réfé Description Distance Longueur rence à partir du de la bord de réfé- bande,
rence, mm mm
la Bande vierge 0-6,35 6,3 1 * Band de
réaction 6,35-19 12,7
2 *Bandede 19-31,7 12,7
libération
de gaz
2a Bande vierge 31,7-38,1 6,3
3 Bande d'arrêt 38,1-41,2 3,1
4 Bande d'in
cateur 41,2-54 12,7
4a Bande vierge 54-82,5 28,5 t Bandes recouvertes d'un ruban de papier (référence 5 sur
le dessin).
Des papiers indicateurs préparés comme décrit ci-dessus sont utiles pour la détermination quantitative de l'azote de l'urée présent dans 0,1 à 0,2 ml de sérum humain. La précision du dosage en utilisant ces bandes est de t 3 mg d'azote de l'ureé dans 100 g de sérum lorsque les teneurs en azote de l'urée sont comprises entre 10 et 60 mg/100 ml de sérum.
Quand on mesure la quantité d'azote de l'urée présente dans un sérum en utilisant une bande d'indicateur préparée comme dans les exemples précédents, on place 0,1 mi de sérum dans une petite éprouvette. La longueur totale de l'éprouvette doit dépasser celle du papier indicateur qui, par exemple, a une longueur de 82,5 mm. On introduit le papier dans l'éprouvette contenant le sérum de manière telle que e la bande vierge la soit en contact avec le sérum.
On bouche l'éprouvette à l'émeri, on la dispose verticalement, et, après 30 minutes, on compare l'aspect de la bande d'indicateur avec un tableau de couleurs étalons qu'on a préparé en effectuant l'analyse avec du sérum contenant des quantités variables d'azote de l'urée.
Dès que la bande vierge la est en contact avec le sérum, dans l'éprouvette, le sérum commence à migrer vers le haut du papier indicateur par capillarité et passe dans la bande de réaction. L'uréase tamponné se trouvant dans la bande de réaction réagit avec l'azote de l'urée présent dans le sérum pour former de l'ammoniac. En présence du tampon au phosphate, le pH dans la bande de réaction imprégnée est de 7,6. Dans ces conditions, une partie appréciable de l'ammoniac formé par la réaction chimique de l'uréase avec l'azote de l'urée est dissoute dans le liquide qui imprègne la bande de réaction. La migration du liquide vers le haut du papier indicateur se poursuit par capillarité en entraînant le liquide contenant l'ammoniac en dissolution dans la bande de libération de gaz.
Le carbonate de potassium se trouvant dans la bande de libération du gaz se dissout dans le liquide qui imprègne cette bande, ce qui fait monter rapidement le pH à 10 ou plus. Dans ces conditions basiques, l'ammoniac dissous est libéré sous forme d'un gaz qui est dégagé à la partie supérieure de la bande de libération du gaz, c'est-à-dire à l'extrémité supérieure du ruban de papier qui recouvre la bande de réaction et la bande de libération du gaz. L'ammoniac gazeux libéré neutralise la substance acide de la bande d'indicateur en déterminant une augmentation du pH dans cette bande avec un changement de couleur résultant de l'indicateur. Par suite de la présence de la bande d'arrêt qui est imprégnée de résine de méthacrylate de méthyle imperméable, le liquide basique présent dans la bande de libération du gaz ne peut pas passer dans la bande d'indicateur par capillarité.
Ainsi, tout changement de couleur observé dans la bande d'indicateur est dû uniquement à l'ammoniac formé par la réaction de l'uréase avec l'azote de l'urée dans le sérum examiné.
Le changement de couleur obersvé dans la bande d'indicateur occupe des proportions de plus en plus grandes de la longueur de la bande d'indicateur à mesure que la concentration en azote de l'urée dans le sérum augmente. Par exemple, pour une période d'examen de 30 minutes, avec un papier indicateur de l'exemple 2 et 0,1 ml de sérum ayant une teneur normale en azote de l'urée (10 mg pour cent), la bande
d'indicateur a une couleur bleue sur environ 10 /o de sa longueur. Pour une teneur de 30 mg pour cent, la
bande bleue s'étend vers le haut sur environ 30 Oio de la longueur de la bande d'indicateur. Pour une teneur de 75 mg pour cent, la bande d'indicateur est entièrement bleue.
Pour des teneurs nettement élevées d'azote de l'urée dans le sérum, par exemple de 900 mg pour cent dans des conditions d'urémide, il se produit un
changement de couleur brusque dans la longueur entière de la bande d'indicateur moins de 2 minutes après que le sérum a atteint la bande de libération du gaz. De ce fait, un papier indicateur selon la présente invention est très précieux en chirurgie. Des papiers indicateurs selon la présente invention sont également précieux dans le tri des groupes de culture, pour lequel les méthodes antérieures se sont révélées beaucoup trop compliquées.
REVENDICATIONS
I. Indicateur permettant de déterminer la quantité d'une substance contenue dans un liquide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend une feuille de matière absorbante, imprégnée de plusieurs réactifs suivant des bandes s'étendant transversalement à la feuille, ces bandes comprenant une première bande située à l'une des extrémités de la feuille imprégnée d'un réactif formant avec la substance biochimique un gaz, une seconde bande adjacente à la première imprégnée d'une substance libérant ledit gaz, une troisième bande voisine de la seconde imprégnée d'un produit inerte empêchant un écoulement par capillarité à travers cette troisième bande, et une quatrième bande voisine de la troisième bande imprégnée d'un indicateur changeant de couleur proportionnellement à la quantité dudit gaz.
II. Utilisation de l'indicateur selon la revendication I pour déterminer la quantité d'une substance contenue dans un liquide biologique, caractérisé en ce qu'on introduit, dans une éprouvette contenant un faible volume dosé de la sécrétion, l'indicateur, de manière telle que la première bande de réaction soit imprégnée du liquide et, après un intervalle de temps défini, on compare la couleur conférée à la quatrième bande avec un tableau de couleurs étalons.