Procédé de purification de l'hydroxocobalamine
La présente invention concerne un procédé permettant la séparation et la purification de l'hydroxo- cobalamine (aussi appelée vitamine B 12b) à partir de mélanges contenant cette substance.
On sait que la vitamine B 12b se distingue de la vitamine B 12 (ou cyanocobalamine) par le fait que dans la première le cobalt porte un groupe hy- droxy qui est remplacé dans la seconde par un groupe cyan.
Pour les usages pharmaceutiques, on tend au jour, d'hui à préférer l'hydroxocobalamine à la cyanocobalamine, car la première qui présente des pro piétés basiques entre plus facilement dans le méta bolismle des individus.
Pour fabriquer l'hydroxocobalamine, il est usuel de partir de la cyanocobalamine, à laquelle on fait subir divers traitements physiques ou chimiques.
Ainsi, une technique connue prévoit de réduire la cyanocobalamine par une hydrogénation catalytique qui la transforme en cobalamine. On oxyde ensuite la solution pour la transformer en hydroxocobalamine.
Selon un procédé connu on peut aussi effectuer l'hydrogénation sans catalyseur, en utilisant Ide l'lhydrogène naissant obtenu in situ par contact d'une solution acide de la cyanocobalamine avec du zinc granulé, après quoi l'oxydation est effectuée par barbotage d'air dans le liquide obtenu dilué d'eau.
Le produit obtenu par ces divers procédés doit subir des purifications primaires avant d'être utilisé.
Ainsi, dans le cas du dernier procédé visé, on traite la solution obtenue après l'oxydation par une base minérale telle que la soude, qui précipite les sels de zinc sous forme d'hydroxyde. On filtre pour éliminer ce dernier et on évapore sous vide le filtrat. Le résidu est repris par une petite quantité d'alcool mé plique. On filtre et on évapore le filtrat: on oient alors l'hydroxocobalamine brute.
Pour passer du produit brut, au produit techniquement pur, il est connu de, procéder, de la sorte: on redissout l'hydroxocobalamine brute dans l'eau, exempte de CO2, et on règle le pH à une valeur comprise entre 8,5 et 9,5. On ajoute ensuite un solvant organique soluble dans l'eau, appartenant au groupe formé par l'acétone, le dioxane et le tétrahydrofurane. Ces solvants sont désignés ci-après par solvants préférés . Ces corps sont utilisés à raison d'environ 80% de solvant pour 20l /o de solution aqueuse.
Puis on laisse reposer à température basse (5 à 100 C par exemple), et on obtient par cristallisation des cristaux d'hydroxocobalamine à 70 '0/o de pureté environ, qui constituent l'hydroxocobalamine technique.
Les 30 /o d'impuretés sont constitués par de l'humidité, par de la cyanocobalamine n'ayant pas réagi, et par des sels entraînés pendant la cristallination précédente.
Il est connu aussi qu'on peut améliorer la pureté du produit technique en soumettant celui-ci à une séparation c ! hromatographique, principalement sur une colonne d'alumine. On peut ainsi éliminer une partie importante de la cyanocobalamine qui n'a pas réagi.
En effectuant une élution, on recueille alors une hydroxocobalamine enrichie (à 80 % de pureté par exemple). On a ainsi séparé la cyanocobalamine et une ¯ grande partie des sels. I1 reste toutefois une petite quantité de sels, adsorbés en même temps que l'hydroxocobalamine par l'alumine.
Cependant ces impuretés peuvent compromettre la stabilité de lthydroxocobalamine qui peut se dégrader à la longue. L'instabilité Ide 11hydroxocobala- mine est d'ailleurs connue par la littérature, et on a proposé l'adjonction. dans les solutions dthydroxo- cobalamine de tampons ou de stabilisants pour y remédier, mais ces corps risquent de réduire son efficacité thérapeutique.
Le procédé qui fait l'objet de la présente invention remédie aux inconvénients des procédés antérieurs de purification, en. permettant d'arriver à un produit d'une très grande richesse (plus de 95 /o de pureté) et par suite d'une haute stabilité. Les solutions aqueuses d'hydroxocobalamine ainsi obtenues peuvent présenter un pH voisin de 8, et néanmoins demeurer stables, pendant plusieurs mois, lorsqu'elles sont stockées à température ambiante mais à l'abri de la lumière.
Suivant l'invention, après avoir fait subir, par exemple d'une façon en elle-même connue, un traite ment t chromatographique à l'lhydroxocobalamine de pureté teclnique, et après avoir effectué une élution de la colonne chromatographique au moyen d'un solvant organique soluble dans l'eau, on traite l'éluat ainsi obtenu par un acide fort pour former un sel acide d'hydroxocobalamine et on soumet ce sel à un passage successivement sur deux résines échangeuses d'ions, la première étant une résine neutre qui retient les impuretés salines en laissant passer l'hydroxocobalamine, et la seconde une résine basique, qui fixe l'acide en régénérant l'hydroxocobalamine.
La chromatographie est réalisée de préférence en envoyant sur une colonne d'alumine une dissolution d'hydroxocobalamine, de pureté technique dans une solution aqueuse d'un solvant préféré (acétone, dioxane, tétrahydroiFurane), la concentration du solvant étant comprise entre 75 oxo et 85 0/o, avantageusement 80 O/o.
L'élution est effectuée en utilisant une solution aqueuse du même solvant que pour la chromatographie, mais avec une teneur en eau plus forte, par exemple comprise entre 40 et 80 /0.
L'hydroxocobalamine obtenue après l'élution a un pH d'environ 7.
Elle est acidifiée par un acide fort tel que HCl ou H2SO4 de façon que le pH de la solution descende entre 1, 2 et 3. On forme ainsi un sel dthydroxo- cobalamine (chlorhydrate, sulfate par exemple). Ce sel est séparé par cristallisation et les cristaux ainsi obtenus sont réunis en solution aqueuse. On obtient ainsi une solution de chlorhydrate ou de sulfate d'hydroxocobalamine, dont le pH est de 3,5 à 4 environ.
Cette solution est ensuite envoyée sur les résines purificatrices.
La première résine échangeuse d'ions utilisée est du type neutre. Elle peut être obtenue en polyméri sant . un monomère anionique dans les pores d'une résine échangeuse anionique (ou basique) ou encore par polymérisation d'un monomère cationique dans une résine échangeuse cationique (ou acide).
Le polymère linéaire résultant est bloqué à l'intérieur de la résine échangeuse qui se trouve ainsi réticulée. On obtient un produit stable, physiquement et chirniquement, comportant des échangeurs anioniques et cationiques, mélangés à l'échelle moléculaire.
Des résines de ce genre sont généralement dési guées par l'expression résines à retardement d'ions , du fait que l'écoulement des ions dans la colonne de filtrage est retardé en raison des propriétés d'adsorption ioniques de la résine.
Dans le cas de l'invention cette résine fixe les sels neutres entraînés par lEhydroxocobalamine et elle peut être régénérée par simple lavage à l'eau purifiée.
La résine basique ou anionique comporte de préférence un groupe actif de base forte. Elle peut être préparée, par exemple, à partir d'amines aromatiques et de phénol. On peut également utiliser des résines du type polystyrène ammonium quaternaire. Ces résines peuvent être régénérées par passage à contrecourant d'une solution diluée fraîche de composés basiques (soude, ammoniac, etc.) et lavage ultérieur.
Le fait d'utiliser une résine basique forte après la résine neutre est contraire à la pratique Ide laboratoire connue consistant à utiliser la filtration sur la résine neutre à la fin des opérations.
Les résines sont de préférence introduites dans des colonnes superposées qui sont traversées successivement par la solution à purifier. Chacune de ces colonnes comporte un fond poreux pour retenir les grains de la résine.
L'exécution du procédé est contrôlée par le pH de la solution recueillie après la dernière colonne qui doit être au moins égal à 7. Pour éviter la rétention d'une trop grande quantité de produit dans les colonnes, on peut pousser la solution après son introduction, en envoyant à la suite de l'eau déminéralisée.
Le liquide obtenu à la sortie des colonnes peut être à nouveau cristallisé par addition d'un solvant préféré. Les cristaux formés sont recueillis par filtration, lavés par un solvant préféré ou à l'éther, puis séchés. On peut ainsi obtenir un produit de concentration au moins égale à 95 /o.
On va maintenant décrire Ide façon plus détaillée certaines modalités pratiques du procédé. On supposera, pour fixer les idées, que lthydroxocobalamine a été préparée en utilisant de l'hydrogène naissant obtenu par contact d'une solution acide de cyanocobalamine avec du zinc granulé.
La solution aqueuse d'hydroxocobalamine brute doit d'abord être débarrassée des sels solubles de zinc qu'elle contient. A cet effet, on transforme ces sels en hydroxyde de zinc insoluble par action d'une base minérale telle que NaOH, NH4OH, Ba(OH)2, en portant le pH de la solution à une valeur supérieure ou égale à 8,5. On filtre pour éliminer l'hydroxyde de zinc qui s'est précipité, et on évapore sous vide à sec le filtrat. Le résidu, repris par une petite quantité d'alcool méthylique, donne une solution rouge. On filtre, puis on évapore le filtrat pour obtenir l'hydroxocobalamine brute.
On dilue ensuite la solution aqueuse obtenue, en ajoutant l'un des solvants organiques suivants, solubles dans l'eau ; tétrahydrofurane, dioxane ou acétone.
La quantité de solvant ajoutée est telle que la solution obtenue contienne de 75 à 85' /o de solvant organique pour 25 à 15 /o ! d'eau. On utilise en général un mélange 80/20. Ce mélange dissout suffisamment la cyanocobalamine ou l'hydroxocobalamine pour permettre la préparation de la solution à utiliser.
Cette solution est alors soumise à une chromato- graphie sus une colonne d'alumine après avoir ajusté le pH de la solution et celui de la colonne à la meme valeur 7. L'alumine retient plus fortement l'hydroxocobalamine que la cyanocobalamine, l'enlève de la solution et la fixe à un niveau différent de la cyanocobalamine.
Pour éluer, c'est-à-dire pour retirer ensuite l'hydroxocobalamine qui a été fixée sur l'alumine, on utilise une solution comprenant le même solvant, mais dont la teneur en eau a été augmentée. On met ainsi à profit la solubilité plus grande Ide l'hydroxo- cobalamine, l'adsorption, du produit sur l'alumine n'étant plus suffisante pour retenir le produit fixé.
On utilise, en général, pour l'élution, des solutions contenant 50 /o de solvant et 50 o d'eau, mais on peut utiliser des solutions contenant de 20 à 60 % de solvant, et donc de 80 à 40 o/o d'eau.
Plus la teneur en eau est faible, plus l'extraction du produit de la colonne d'alumine est longue, mais en revanche les séparations entre les divers produits adsorbés sont plus nettes.
Conformément à l'invention, la fraction d'éluat contenant l'hydroxocobalamine à la sortie de la colonne d'alumine, est acidifiée par un excès d'acide fort convenablement choisi (HCl, H2SO4, etc.) de sorte que le pH de la solution est amené entre 1 2 et 3. Puis la solution est additionnée de 9 volumes du solvant utilisé pour l'opération précédente. En présence de l'acide, l'hydroxocobalamine qui pré- sente des propriétés basiques, forme un sel (dldor- hydrate ou sulfate) qu'on laisse cristalliser à une température comprise entre 5 et 100 C, et on obtient des cristaux rouges du sel d'hydroxocobalamine, qui sont isolés par filtration, puis lavés à l'acétone et à l'éther.
Ils sont ensuite redissous dans l'eau distillée, et cette nouvelle solution est alors passée sur une colonne de résine neutre capable de fixer les impuretés, tout en laissant passer le sel d'hydroxocobalamine.
Par exemple, cette résine peut être l'une de celles connues sous la marque de fabrique Retardion et vendues par la firme The Dow Chemical Company, Midland, Michigan.
Une telle résine est constituée par des grains très fins, qui peuvent être placés sur une couche de 10 à 50 cm de haut environ. La filtration est effectuée à température ambiante avec un débit d'environ 3 ml/minute.
La résine retient les sels entraînés avec l'hydroxocobalamine mais sans fixer complètement ceuxmoi, ce qui permet de régénérer la résine par lavage ultérieur à l'eau.
On vérifie l'absence de sels par des prélèvements du filtrat. Par exemple, si l'acidification a été effectuée par H2SO4, on contrôle l'absence de chlorures libres dans la solution.
La solution ayant subi cette première, purification par résine neutre passe ensuite sur une colonne contenant une résine basique échangeuse d'ions, qui par conséquent arrête les ions acides. Cette dernière colonne retient les ions chlore ou sulfate combinée à la cobalamine et régénère ainsi l'hydroxocobalamine qui reste en solution à la sortie de la colonne.
On peut utiliser une résine échangeuse d'anions fortement basique, constituée par exemple par des particules sphériques de 300 à 900 microns d'un copolymère de styrène et divinylbenzène possédant des radicaux ammonium quaternaires. Le débit horaire pour une telle résine est de préférence compris entre 0,5 et 1,5 m0 par m2 de résine.
Cette résine peut être régénérée par 50 à 80 g de soude caustique en solution à 5'0/o par litre de résine.
Des résines basiques fortes Ide ce genre sont des produits industriels usuels.
L'hydroxocobalamine, peut être identifiée par les tests classiques : chromatographie, coefficient de partage entre l'alcool benzylique et l'eau, courbes de titrage acidimétrique ou spectrographie.
Des méthodes particulières dont il sera question plus loin peuvent être utilisées pour contrôler la pureté de l'hydroxocobalamine obtenue après le traitement conforme à l'invention.
Exemple I - Exemple témoin:
On a préparé comme suit l'lhydroxocobalamine à purifier:
On dissout 0, 20 g de cyanocobalamine dans 50 cm3 d'une solution décinormale d'acide chlor- hydrique. Cette solution est passée sur une colonne de 40 g de zinc métallique granulé (500 à 1400 microns). Lorsque toute la solution a été introduite et passée sur la colonne, on lave cette Idernière deux fois de suite avec 10 orn3 d'eau distillée.
On recueille les liquides dans un flacon où barbote un courant d'air pendant toute l'opération.
L'oxydation par l'air est poursuivie pendant 10 minutes après réception de la dernière eau de lavage. La solution est alors rouge rubis.
Le pH de cette solution est ajusté à 8,5 par addition d'une solution décinormale de soude caustique pour précipiter Ie zinc. On filtre. On ramène le pH de la solution à 7. On a tainsi 70 cc de solution environ, auxquels on ajoute 280OC de tétrahydrofu- rane, et l'on passe sur une colonne d'alumine chromatographique de 30 mm de diamètre et 120 mm de haut. La durée de passage est de 1 heure. Cette alumine a été au préalïable tamponnée au pH 7. L'élution est effectuée au moyen d'un mélange à parties égales d'eau et de tétrahydrofurane.
On recueille la portion colorée, soit 50 cc, riche en hydroxocobalamine.
Cette fraction est additionnée de tétrahydrofurane de façon à n'avoir que 10 /o d'eau, puis on amorce la cristallisation avec quelques cristaux d'hydroxocobalamine, et on laisse cristalliser entre 5 et 100 pendant 24 heures.
Les cristaux sont recueillis par filtration, puis lavés à l'acétone et à l'éther, et séchés sous vide à la température ambiante. On obtient ainsi 0,15 g de cristaux représentant sensiblement 0,12 g d'hydroxo- cobalamine pure soit une pureté de 806/o.
Exemple Il:
On opère comme pour l'exemple I jusqu'à la sortie de la colonne d'alumine.
L'éluat riche est acidifié jusqu'à un pH de 1,2 au moyen d'un excès d'acide chlorhydrique, puis on y ajoute du tétrahydrofurane de façon à n'avoir au maximum que 10 e/o, d'eau dans la solution. On laisse cristalliser entre 5 et 100 C.
Les cristaux rouges de chlorocobalamine formés sont recueillis par filtration et lavés à l'acétone et à l'éther.
On dissout ces cristaux dans l'eau distillée à raison de 50 cm3 d'eau pour 0,20 g de cristaux.
La solution ainsi obtenue est passée sur deux
colonnes superposées. Tout d'abord, sur une première colonne à résine dénommée Retar, dion de la firme Dow CheminaI Company (Retardion ll A 8) de 25 mm de diamètre et de 100 mu de hauteur.
A la sortie de la première colonne, le liquide passe dans la seconde, de même taille, qui contient une résine basique forte, telle que celle dénommée
Dowex 2 de la Société Dow.
La vitesse de passage sur ces colonnes est réglée
à 2 cc/minute.
Lorsque le liquide commence à devenir rosé à la sortie de la 2e colonne, on recueille la solution.
Pendant toute la durée de l'opération, on envoie un
courant d'azote pur 'dans le flacon de réception pour
éviter l'action du gaz carbonique de l'air sur l'hy droxocobalamine.
On chasse ensuite la solutionemère retenue dans
la première colonne par un volume d'eau déminé
ralisée égal à celui retenu dans la colonne. Puis après
avoir démonté la première colonne, on chasse la solution retenue dans la seconde colonne par un volume égal (2 fois 10 cc d'eau déminéralisée).
Après addition de 9 volumes de tétrahydrofurane, au liquide recueilli, celuimci cristallise entre 5 et 100 C comme précédemment.
Les cristaux qui se sont formés sont recueillis par filtration, lavés à l'acétone et à l'éther et séchés sous vide.
On obtient ainsi 0, 12 g de cristaux, représentant sensiblement 0,115 g d'hydroxocobalamine pure, soit une pureté de 96/o.
Exemple ICI :
Une solution de 32 g d'hydroxooebalamine brute préparée par voie acide est ajustée à un pH de 7.
On a 9 litres de solution. On ajoute 36 litres d'acétone, et on passe sur une colonne d'alumine chromatographique de 120mm de diamètre et 300mm de haut, qui a été au préalable tamponnée au pH 7. Le passage est effectué en 8 heures. L'élution est effectuée au moyen d'un mélange à parties égales d'eau et d'acétone.
On recueille 4 litres de produit coloré riche en hydroxocobalamine.
L'éluat riche est acidifié jusqu'à un pH de 1,5 au moyen d'acide sulfurique, puis on ajoute de l'acétone de façon à avoir au maximum 10 % d'eau dans la solution.
On laisse cristalliser pendant 24 heures entre 5 et 100. Les cristaux rouges de sulfate d'hydroxocobalamine sont recueillis par filtration, et lavés à l'acétone et à l'éther. Ces cristaux sont dissous dans l'eau distillée à raison de 50 cm8 d'eau pour 0,2 g de cristaux, soit environ 7,5 litres au total.
La solution ainsi obtenue est passée en 3 heures environ sur deux colonnes, d'abord une colonne à résine dénommée Retardion 11 A 8 , puis une colonne à résine dénommée Amberlite IRA 400 de la firme RolDm & Haas, Plhiladelphie. Ces deux colonnes ont 600 mm de diamètre et 250 mm de haut.
A la sortie des colonnes, le liquide rosé est recueilli sous azote. On ajoute 9 volumes d'acétone,
et on cristallise pendant 24 heures entre 0 et 100.
Les cristaux formés sont recueillis par filtration, lavés
à l'acétone et à l'éther, puis séchés sous vide. On obtient 26 grammes d'hydroxocobalamine représentant
25 g de produit pur, soit une pureté de 96 %.
L'hydroxocobalamine purifiée par le procédé
conforme à l'invention se présente sous forme de cristaux rouge sombre, solubles dans l'eau et dans l'alcool, insolubles dans le chloroforme, l'éther et l'acétone.
Cette hydroxocobalamine est stable à pH 8 en solution aqueuse, sans addition de stabilisateurs ou de tampons, ce qui prouve sa grande pureté. Celle
ci est d'ailleurs démontrée aussi par la courbe de
pH, par les titrages biologiques (sur souches dans des milieux carencés en vitamine B 12 b), ou aussi par spectrographie optique.
Hydroxocobalamin purification process
The present invention relates to a process for the separation and purification of hydroxocobalamin (also referred to as vitamin B 12b) from mixtures containing this substance.
It is known that vitamin B 12b is distinguished from vitamin B 12 (or cyanocobalamin) by the fact that in the first the cobalt carries a hydroxy group which is replaced in the second by a cyan group.
For pharmaceutical uses, today there is a tendency to prefer hydroxocobalamin to cyanocobalamin, because the former, which presents basic properties, enters more easily into the metabolism of individuals.
In order to manufacture hydroxocobalamin, it is usual to start from cyanocobalamin, to which various physical or chemical treatments are subjected.
Thus, a known technique provides for reducing the cyanocobalamin by a catalytic hydrogenation which transforms it into cobalamin. The solution is then oxidized to transform it into hydroxocobalamin.
According to a known process, it is also possible to carry out the hydrogenation without a catalyst, using nascent hydrogen obtained in situ by contact of an acid solution of cyanocobalamin with granulated zinc, after which the oxidation is carried out by bubbling air in the liquid obtained diluted with water.
The product obtained by these various processes must undergo primary purifications before being used.
Thus, in the case of the latter process referred to, the solution obtained after the oxidation is treated with an inorganic base such as sodium hydroxide, which precipitates the zinc salts in the form of hydroxide. It is filtered to remove the latter and the filtrate is evaporated in vacuo. The residue is taken up in a small quantity of methyl alcohol. The filtrate is filtered and evaporated: the crude hydroxocobalamin is then oient.
To switch from the crude product to the technically pure product, it is known to proceed as follows: the crude hydroxocobalamin is redissolved in water, free of CO2, and the pH is adjusted to a value between 8.5 and 9.5. A water-soluble organic solvent belonging to the group formed by acetone, dioxane and tetrahydrofuran is then added. These solvents are hereinafter referred to as preferred solvents. These bodies are used at a rate of approximately 80% solvent per 20l / o aqueous solution.
Then it is left to stand at low temperature (5 to 100 ° C. for example), and crystals of hydroxocobalamin at 70% of approximately purity are obtained by crystallization, which constitute technical hydroxocobalamin.
The 30% of impurities are constituted by humidity, by unreacted cyanocobalamin, and by salts entrained during the preceding crystallination.
It is also known that the purity of the technical product can be improved by subjecting it to separation c! hromatographic, mainly on an alumina column. It is thus possible to eliminate a significant part of the cyanocobalamin which has not reacted.
By performing an elution, an enriched hydroxocobalamin is then collected (at 80% purity for example). The cyanocobalamin and a large part of the salts were thus separated. However, a small amount of salts remains, adsorbed at the same time as the hydroxocobalamin by the alumina.
However, these impurities can compromise the stability of the hydroxocobalamin which can degrade over time. The instability of hydroxocobalamine is moreover known from the literature, and the addition has been proposed. in hydroxocobalamin solutions of buffers or stabilizers to remedy this, but these bodies may reduce its therapeutic effectiveness.
The process which is the subject of the present invention overcomes the drawbacks of the prior purification processes, by. allowing to arrive at a product of very great richness (more than 95 / o purity) and consequently of a high stability. The aqueous solutions of hydroxocobalamin thus obtained can have a pH close to 8, and nevertheless remain stable, for several months, when they are stored at ambient temperature but protected from light.
According to the invention, after having subjected, for example in a manner known per se, a chromatographic treatment with hydroxocobalamin of technical purity, and after having carried out an elution of the chromatographic column by means of a organic solvent soluble in water, the eluate thus obtained is treated with a strong acid to form an acid salt of hydroxocobalamin and this salt is passed successively through two ion exchange resins, the first being a neutral resin which retains saline impurities by letting the hydroxocobalamin pass, and the second a basic resin, which fixes the acid by regenerating the hydroxocobalamin.
The chromatography is preferably carried out by sending on an alumina column a solution of hydroxocobalamin, of technical purity in an aqueous solution of a preferred solvent (acetone, dioxane, tetrahydroFuran), the concentration of the solvent being between 75 oxo and 85 0 / o, advantageously 80 O / o.
The elution is carried out using an aqueous solution of the same solvent as for the chromatography, but with a higher water content, for example between 40 and 80/0.
The hydroxocobalamin obtained after the elution has a pH of about 7.
It is acidified with a strong acid such as HCl or H2SO4 so that the pH of the solution drops between 1, 2 and 3. A hydroxocobalamin salt is thus formed (hydrochloride, sulphate for example). This salt is separated by crystallization and the crystals thus obtained are combined in aqueous solution. A solution of hydrochloride or of hydroxocobalamin sulphate is thus obtained, the pH of which is approximately 3.5 to 4.
This solution is then sent to the purifying resins.
The first ion exchange resin used is of the neutral type. It can be obtained by polymerizing. an anionic monomer in the pores of an anionic (or basic) exchange resin or else by polymerization of a cationic monomer in a cationic (or acid) exchange resin.
The resulting linear polymer is blocked inside the exchange resin which is thus crosslinked. A physically and chemically stable product is obtained, comprising anionic and cationic exchangers, mixed at the molecular level.
Resins of this kind are generally referred to as ion retardation resins, since the flow of ions into the filter column is retarded due to the ionic adsorption properties of the resin.
In the case of the invention, this resin fixes the neutral salts entrained by the hydroxocobalamin and it can be regenerated by simple washing with purified water.
The basic or anionic resin preferably has a strong base active group. It can be prepared, for example, from aromatic amines and phenol. It is also possible to use resins of the quaternary ammonium polystyrene type. These resins can be regenerated by countercurrent passage of a fresh dilute solution of basic compounds (soda, ammonia, etc.) and subsequent washing.
Using a strong basic resin after the neutral resin is contrary to the known laboratory practice of using neutral resin filtration at the end of operations.
The resins are preferably introduced into superimposed columns which are successively crossed by the solution to be purified. Each of these columns has a porous bottom to retain the grains of the resin.
The execution of the process is controlled by the pH of the solution collected after the last column which must be at least equal to 7. To avoid the retention of too large a quantity of product in the columns, the solution can be pushed after its introduction, sending demineralized water as a result.
The liquid obtained at the outlet of the columns can be crystallized again by adding a preferred solvent. The crystals formed are collected by filtration, washed with a preferred solvent or with ether, and then dried. It is thus possible to obtain a product with a concentration of at least 95%.
Certain practical modalities of the process will now be described in more detail. Assume, for the sake of clarity, that the hydroxocobalamin was prepared using nascent hydrogen obtained by contacting an acid solution of cyanocobalamin with granulated zinc.
The crude aqueous hydroxocobalamin solution must first be freed from soluble zinc salts it contains. For this purpose, these salts are converted into insoluble zinc hydroxide by the action of an inorganic base such as NaOH, NH4OH, Ba (OH) 2, bringing the pH of the solution to a value greater than or equal to 8.5. It is filtered to remove the precipitated zinc hydroxide, and the filtrate is evaporated in vacuo to dryness. The residue, taken up in a small quantity of methyl alcohol, gives a red solution. It is filtered, then the filtrate is evaporated to obtain the crude hydroxocobalamin.
The aqueous solution obtained is then diluted by adding one of the following organic solvents, soluble in water; tetrahydrofuran, dioxane or acetone.
The amount of solvent added is such that the solution obtained contains from 75 to 85% of organic solvent for 25 to 15%! of water. In general, an 80/20 mixture is used. This mixture dissolves enough cyanocobalamin or hydroxocobalamin to allow preparation of the solution to be used.
This solution is then subjected to chromatography on an alumina column after having adjusted the pH of the solution and that of the column to the same value 7. Alumina retains hydroxocobalamin more strongly than cyanocobalamin. removes from solution and fixes it at a different level than cyanocobalamin.
To elute, that is to say to subsequently remove the hydroxocobalamin which has been attached to the alumina, a solution is used comprising the same solvent, but the water content of which has been increased. The greater solubility of the hydroxocobalamin is thus exploited, the adsorption of the product on the alumina no longer being sufficient to retain the fixed product.
In general, solutions containing 50 / o of solvent and 50 o of water are used for the elution, but solutions containing 20 to 60% solvent, and therefore 80 to 40 o / o, can be used. of water.
The lower the water content, the longer the extraction of the product from the alumina column, but on the other hand the separations between the various adsorbed products are more distinct.
In accordance with the invention, the eluate fraction containing hydroxocobalamin at the outlet of the alumina column is acidified with an excess of suitably chosen strong acid (HCl, H2SO4, etc.) so that the pH of the solution is brought to between 1 2 and 3. Then the solution is added with 9 volumes of the solvent used for the previous operation. In the presence of acid, hydroxocobalamin, which exhibits basic properties, forms a salt (ddorhydrate or sulfate) which is left to crystallize at a temperature between 5 and 100 ° C., and red crystals of the mineral are obtained. hydroxocobalamin salt, which are isolated by filtration, then washed with acetone and ether.
They are then redissolved in distilled water, and this new solution is then passed through a column of neutral resin capable of fixing the impurities, while allowing the hydroxocobalamin salt to pass.
For example, this resin can be one of those known under the trademark Retardion and sold by The Dow Chemical Company, Midland, Michigan.
Such a resin consists of very fine grains, which can be placed on a layer approximately 10 to 50 cm high. Filtration is carried out at room temperature with a flow rate of approximately 3 ml / minute.
The resin retains the salts entrained with the hydroxocobalamin but without completely fixing them to me, which makes it possible to regenerate the resin by subsequent washing with water.
The absence of salts is verified by samples of the filtrate. For example, if the acidification has been carried out by H2SO4, the absence of free chlorides in the solution is checked.
The solution having undergone this first purification by neutral resin then passes through a column containing a basic ion exchange resin, which consequently stops the acid ions. This last column retains the chlorine or sulfate ions combined with the cobalamin and thus regenerates the hydroxocobalamin which remains in solution at the outlet of the column.
It is possible to use a strongly basic anion exchange resin, constituted for example by spherical particles of 300 to 900 microns of a copolymer of styrene and divinylbenzene having quaternary ammonium radicals. The hourly flow rate for such a resin is preferably between 0.5 and 1.5 m0 per m2 of resin.
This resin can be regenerated by 50 to 80 g of caustic soda in solution at 5'0 / o per liter of resin.
Strong basic resins of this kind are common industrial products.
Hydroxocobalamin can be identified by standard tests: chromatography, partition coefficient between benzyl alcohol and water, acidimetric titration curves or spectrography.
Particular methods which will be discussed below can be used to check the purity of the hydroxocobalamin obtained after the treatment in accordance with the invention.
Example I - Sample witness:
The hydroxocobalamin to be purified was prepared as follows:
0.20 g of cyanocobalamin is dissolved in 50 cm3 of a decinormal solution of hydrochloric acid. This solution is passed through a column of 40 g of granulated metallic zinc (500 to 1400 microns). When all the solution has been introduced and passed through the column, this last one is washed twice in succession with 10 μm of distilled water.
The liquids are collected in a flask where an air stream is bubbled throughout the operation.
Oxidation by air is continued for 10 minutes after receipt of the last wash water. The solution is then ruby red.
The pH of this solution is adjusted to 8.5 by adding a decinormal solution of caustic soda to precipitate the zinc. We filter. The pH of the solution is brought back to 7. Approximately 70 cc of solution is thus added, to which 280OC of tetrahydrofuran is added, and one passes through a chromatographic alumina column 30 mm in diameter and 120 mm high. . The passage time is 1 hour. This alumina has previously been buffered to pH 7. Elution is carried out using a mixture of equal parts of water and tetrahydrofuran.
The colored portion, ie 50 cc, rich in hydroxocobalamin is collected.
This fraction is added with tetrahydrofuran so as to have only 10 / o water, then crystallization is initiated with a few crystals of hydroxocobalamin, and allowed to crystallize between 5 and 100 for 24 hours.
The crystals are collected by filtration, then washed with acetone and with ether, and dried under vacuum at room temperature. 0.15 g of crystals are thus obtained, representing approximately 0.12 g of pure hydroxocobalamin, ie a purity of 806%.
Example He:
The procedure is as for Example I until the outlet of the alumina column.
The rich eluate is acidified to a pH of 1.2 by means of an excess of hydrochloric acid, then tetrahydrofuran is added to it so as to have at most only 10 e / o, of water in the solution. Allowed to crystallize between 5 and 100 C.
The red crystals of chlorocobalamin formed are collected by filtration and washed with acetone and with ether.
These crystals are dissolved in distilled water at a rate of 50 cm3 of water per 0.20 g of crystals.
The solution thus obtained is passed over two
stacked columns. First, on a first resin column called Retar, dion from the Dow CheminaI Company (Retardion II A 8) 25 mm in diameter and 100 μm in height.
At the outlet of the first column, the liquid passes into the second, of the same size, which contains a strong basic resin, such as that called
Dowex 2 from the Dow Company.
The speed of passage on these columns is regulated
at 2 cc / minute.
When the liquid begins to turn pink at the outlet of the 2nd column, the solution is collected.
Throughout the operation, we send a
stream of pure nitrogen in the receiving flask to
avoid the action of carbon dioxide in the air on hy droxocobalamin.
The parent solution retained in
the first column by a volume of demined water
achieved equal to that retained in the column. Then after
having dismantled the first column, the solution retained in the second column is driven off with an equal volume (2 times 10 cc of demineralized water).
After adding 9 volumes of tetrahydrofuran to the liquid collected, the latter crystallizes between 5 and 100 ° C. as above.
The crystals which formed are collected by filtration, washed with acetone and with ether and dried in vacuo.
0.12 g of crystals are thus obtained, representing approximately 0.115 g of pure hydroxocobalamin, ie a purity of 96%.
Example HERE:
A solution of 32 g of crude hydroxooebalamine prepared by the acid route is adjusted to a pH of 7.
We have 9 liters of solution. 36 liters of acetone are added, and one passes through a column of chromatographic alumina 120 mm in diameter and 300 mm high, which has previously been buffered to pH 7. The passage is carried out in 8 hours. Elution is carried out using a mixture of equal parts of water and acetone.
4 liters of colored product rich in hydroxocobalamin are collected.
The rich eluate is acidified to a pH of 1.5 by means of sulfuric acid, then acetone is added so as to have a maximum of 10% water in the solution.
The mixture is left to crystallize for 24 hours between 5 and 100. The red crystals of hydroxocobalamin sulphate are collected by filtration, and washed with acetone and with ether. These crystals are dissolved in distilled water at a rate of 50 cm8 of water per 0.2 g of crystals, or approximately 7.5 liters in total.
The solution thus obtained is passed in about 3 hours through two columns, first a resin column called Retardion 11 A 8, then a resin column called Amberlite IRA 400 from the firm RolDm & Haas, Philadelphia. These two columns are 600 mm in diameter and 250 mm high.
On leaving the columns, the pink liquid is collected under nitrogen. 9 volumes of acetone are added,
and crystallized for 24 hours between 0 and 100.
The crystals formed are collected by filtration, washed
with acetone and ether, then dried under vacuum. 26 grams of hydroxocobalamin are obtained, representing
25 g of pure product, ie a purity of 96%.
Hydroxocobalamin purified by the process
in accordance with the invention is in the form of dark red crystals, soluble in water and in alcohol, insoluble in chloroform, ether and acetone.
This hydroxocobalamin is stable at pH 8 in aqueous solution, without the addition of stabilizers or buffers, which proves its high purity. That
This is also demonstrated by the curve of
pH, by biological titrations (on strains in media deficient in vitamin B 12 b), or also by optical spectrography.