Procédé de fabrication d'une préparation corticotropique à action prolongée La présente invention a pour objet un procédé de fabrication d'une préparation corticotropique à action entretenue ou prolongée.
Dans la fabrication de produits corticotropiques à effet entretenu ou action prolongée, on s'est efforcé de produire une préparation corticotropique insolu ble qui, lorsqu'elle est administrée par voie sous- cutanée ou intramusculaire, a pour effet d'introduire la corticotropine dans le courant sanguin et de là dans les glandes surrénales. Une difficulté rencontrée avec ces préparations est que celles-ci n'ont qu'une durée d'existence relativement courte, à moins que l'on emploie des doses intolérables.
Une autre diffi- culté est que celles-ci ne fournissent pas la matière corticotropique uniformément au courant sanguin. En outre, ces préparations n'ont pas une stabilité sûre.
Seules les solutions aqueuses usuelles de substan ces d'hormones corticotropiques ont, après injection, une durée d'action relativement courte et l'effet tend à s'élever jusqu'à une pointe pendant un certain laps de temps et ensuite à diminuer jusqu'à un point situé au-dessous du niveau de valeur désirée. Par exemple, la plupart des transformations hématologi ques et métaboliques ordinairement étudiées sont produites du fait que l'hormone corticotropique atteint un maximum d'effet à la quatrième heure après l'administration,
cet effet étant en régression complète à la huitième heure. Afin de maintenir un niveau moyen d'ensemble de la valeur désirée, il est nécessaire d'administrer une quantité de la substance d'hormones produisant un effet maximum .à la qua trième heure et, au moment où cet effet maximum est produit, il y a un excès de valeur au-dessus de ce qui est désiré.
Bien que les substances d'hormones puissent avoir un effet sur une période de huit heures, il est nécessaire de les administrer à des intervalles de six heures ou moins afin de maintenir le niveau d'ensemble et, aux périodes de pointe, il y a un excès d'utilisation de l'activité et, en consé quence, une perte de la substance de valeur. Il y a un besoin de préparations réduisant l'effet pendant les périodes de pointe n tout en maintenant un niveau supérieur de l'effet pendant toute la période de traitement.
L'invention concerne un procédé de fabrication d'une préparation corticotropique pouvant être admi- nistrée par voie sous-cutanée ou intramusculaire pour fournir la corticotropine au courant sanguin pendant un laps de temps extrêmement long. Avec ce procédé de fabrication, 1a corticotropine reste active et est distribuée d'une manière uniforme pendant une lon gue période.
Le procédé permet de régler la prépa ration pour la distribution de la substance active dans le courant -sanguin pendant des périodes choisies, qui peuvent être une période moyenne ou une période très prolongée. Le procédé permet de faire varier la durée de la stimulation par la préparation et de fabriquer une substance stimulant les glandes sur rénales; qui reste stable sous de longues conditions de stockage.
Le complexe corticotropique obtenu par le procédé de l'invention a une action intense et prompte lorsqu'il est administré, tout en produisant une stimulation relativement uniforme des glandes surrénales pendant un long laps de temps, puis en stimulant en même temps plus nettement l'alimen- tation naturelle ou sécrétion de l'hormone par les glandes pituitaires.
Divers autres caractéristiques ressortent de la description détaillée qui suit.
Le procédé de fabrication de l'invention donne une préparation corticotropique qui montre une action prolongée par administration sous-cutanée ou intramusculaire et qui est constituée généralement par une suspension aqueuse contenant de 20 à 500 unités sous-cutanées (Codex Américain) par ml de corticotropine, de 0,1 à 2,5 mg de tannate par 100 unités sous-cutanées de corticotropine, au moins 0,
25 mg de zinc par 100 unités sous-cutanées de cor- ticotropine et de 6 à 60 mg de gélatine partiellement hydrolysée par 100 unités sous-cutanées de cortico- tropine, au moins une partie de cette suspension aqueuse étant constituée par un complexe de zinc- corticotropine-gélatine-tannate.
Au cours des expériences qui ont préludé à l'in vention, on a constaté que de la corticotropine tirée de tissus pituitaires de porcins, lorsqu'elle est com binée avec un sel de zinc et de l'acide tannique, donne lieu à la formation d'un complexe zinc-corti- cotropine-tannate qui est essentiellement inactif lors de l'administration sous-cutanée ou intramusculaire, c'est-à-dire que son activité est d'une durée si prolon gée qu'il n'y a pas d'effets détectables en clinique. Cependant,
l'utilisation avec l'hormone adrénocorti- cotropique porcine d'un complexe zinc-corticotro- pine-gélatine-tannate évite ce problème. D'autre part, on a trouvé que l'utilisation avec l'hormone adréno- corticotropique bovine d'un complexe zinc-cortico- tropine donne un produit ayant une action prolongée et contrôlée désirable lors de ;l'injection sous-cutanée ou intramusculaire.
La terminologie unités sous-cutanées se réfère aux normes- de corticotropine sous-cutanée du codex américain XV.
La préparation corticotropique obtenue par le procédé de l'invention est appropriée pour l'admi- nistration à des animaux et êtres humains par tous moyens, mais il est évident qu'étant donné que la base de son action prolongée est la formation d'un dépôt dans les tissus, on préfère que son administra tion se fasse, dans le cas de l'administration paren térale, par une autre voie que la voie intraveineuse. Une action corticotropique prolongée particulière ment désirable peut être obtenue lorsque cette pré paration est administrée par voie sous-cutanée ou intramusculaire.
La corticotropine qui peut être utilisée dans cette préparation corticotropique comprend :des substances à 1a fois de grande et de faible puissance ; le procédé de fabrication est applicable aux substances extraites de glandes pituitaires animales et aux préparations synthétiques :dé ces substances actives.
Cependant, les meilleurs résultats doivent être obtenus lorsque la corticotropine comprise dans cette préparation est de grande pureté et a une puissance d'au moins 20 unités sous-cutanées par milligramme. Des résul tats particulièrement désirables peuvent être obtenus avec de la corticotropine ayant une puissance d'au moins 40 unités sous-cutanées par milligramme. De même,
bien que la corticotropine utilisée dans la mise en aeuvrë de l'invention puisse être tirée de glandes pituitaires de toutes espèces animales, les meilleurs résultats peuvent être obtenus avec de la corticotropine tirée de tissus pituitaires de bovins et porcins, la corticotropine tirée de glandes pituitaires de porcins étant particulièrement désirable.
Un exemple de la corticotropine est la prépara tion décrite dans le brevet américain No 2739099 déposé le 3 juillet 1950.
De même, une composition de corticotropine désirable peut être obtenue par le procédé d'épura tion à l'oxycellulose du brevet américain No 2669536 déposé le 15 août 1950, dans lequel l'épuration est effectuée par adsorption et élution sur des matières cellulosiques.
Bien que la corticotropine puisse être comprise dans cette suspension aqueuse à une concentration entre 20 et 500 unités sous-cutanées par cm3, on préfère, pour des applications pratiques, utiliser la corticotropine à une concentration entre 40 et 100 unités sous-cutanées par cm3.
Le constituant tannate de cette préparation corti- cotropique peut être tiré :de l'acide tannique de qua lité pharmaceutique. Bien que le tannate puisse être compris dans cette préparation à une concentration entre 0,1 et 2,5 mg par 100 unités sous-cutanées de corticotropine, les meilleurs résultats peuvent être obtenus avec une concentration de tannate de 0,2 à 1,
0 mg par 100 unités sous-cutanées de cortico- tropine et les résultats particulièrement désirables sont obtenus avec de l'acide tannique à une concen tration d'environ 0,4 mg par 100 unités sous-cuta nées de corticotropine.
Le constituant zinc de cette préparation cortico- tropique peut être tiré de tous sels de zinc, mais on préfère naturellement utiliser un sel de zinc soluble dans l'eau, tel qu'acétate de zinc. Bien que le zinc puisse être compris dans cette suspension aqueuse, à une concentration d'au moins 0,25 mg par 100 unités sous-cutanées de corticotropine pour des usages pra tiques, on préfère utiliser le zinc à une concentration entre 0,5 et 2,0 mg par 100 unités sous-cutanées de corticotropine.
Au cours des expériences qui ont conduit à l'in vention, on a déterminé, dans des essais de tolérance avec des animaux, qu'un complexe zinc-corticotro- pine-tannate semble être susceptible d'inactivation par :les tissus. Cet effet d'inactivation par les tissus empêche l'absorption de corticotropine dans le cou rant sanguin à partir d'un dépôt formé dans les tissus. En conséquence, on obtient une vitesse réduite de distribution de corticotropine dans le courant sanguin et il peut être produit un niveau sanguin au-dessous de celui auquel la glande surrénale réagit à la corticotropine exogène.
En outre, dans de nom breux cas, il peut ne pas y avoir d'effet ostensible par la corticotropine administrée sur la glande sur rénale et il peut y avoir une perte apparente d'acti vité corticotropique. En conséquence, on a trouvé que l'inclusion dans ce complexe d'une gélatine par tiellement hydrolysée agit à l'encontre de ce phéno mène d'inactivation par les tissus.
En outre, la quan tité de gélatine incluse dans ce complexe peut être réglée pour faire varier la vitesse à laquelle la corti- cotropine est distribuée dans le courant sanguin et, en conséquence, elle peut être réglée dans les limites de la durée d'action de la préparation corticotropi- que. En même temps, on obtient par l'inclusion dans ce complexe de gélatine une activité corticotropique renforcée sans effet apparent sur la durée d'action de la composition.
De plus, ce constituant gélatine sert à accroître la stabilité, non seulement de la composition, mais spécialement du constituant tan- nate. De plus, le constituant gélatine sert à réduire toute irritation locale qui pourrait autrement être observée avec le complexe.
Le constituant gélatine de cette préparation cor- ticotropique doit être de qualité pharmaceutique et non antigène. L'hydrolyse partielle de la gélatine peut être obtenue en traitant à l'autoclave une solu tion convenable de gélatine à une pression d'environ 1,05 kg au cm2 pendant huit heures environ.
Bien que la gélatine puisse être contenue dans cette composition sous une concentration de 2 à 60 mg par 100 unités sous-cutanées de corticotro- pine, les meilleurs résultats sont obtenus avec une concentration de gélatine de 6 à 20 mg par 100 uni tés sous-cutanées de corticotropine et des résultats particulièrement désirables sont assurés avec environ 15 mg de gélatine par 100 unités sous-cutanées de corticotropine.
Il est possible de faire varier sur une gamme considérable la durée d'action obtenue avec cette préparation corticotropique en réglant les concen trations des constituants zinc et tannate dans le complexe, de même qu'en faisant varier comme précédemment décrit le constituant gélatine.
Il est désirable que la préparation corticotropi- que ait un pH entre 4 et 8 et l'on préfère que la suspension aqueuse ait un pH d'environ 5.
Au moins une partie des quatre ingrédients prin cipaux contenus dans la suspension aqueuse, à savoir le zinc, la corticotropine, le tannate et la gélatine, est sous forme d'un complexe insoluble dans l'eau. La suspension aqueuse contient donc une phase solide et une phase liquide (aqueuse), la phase solide com prenant au moins une partie des quatre ingrédients principaux en combinaison chimique telle que le complexe soit séparable comme une entité de la phase liquide. Une partie de l'un quelconque des ingrédients principaux peut être comprise dans cette préparation corticotropique comme constituant de la phase liquide et, dans certains cas,
il peut être désirable de prévoir la corticotropine dans cette composition à la fois sous la forme soluble et sous la forme insoluble, de manière qu'elle puisse avoir un effet corticotropique à la fois immédiat et pro longé.
La formation de cette préparation corticotropi- que et spécialement la production de ce complexe insoluble dans l'eau comprennent généralement un mélange des ingrédients principaux dans un milieu aqueux jusqu'à ce que la combinaison d'au moins une partie de ces ingrédients ait été obtenue.
En conséquence, on conçoit que la matière première est habituellement une solution aqueuse contenant la concentration désirée de corticotropine. On a toute fois prouvé que l'ordre de succession selon lequel les ingrédients restants sont combinés avec cette solu tion aqueuse de corticotropine peut varier pour modi fier les caractéristiques du produit résultant. D'une part, si cette solution aqueuse de corticotropine est tout d'abord combinée avec de l'acide tannique, l'addition subséquente à cette solution du constituant zinc peut être effectuée dans une gamme de pH relativement large.
D'autre part, lorsque la solution aqueuse de corticotropine est tout d'abord combi née avec le sel de zinc, l'addition subséquente à cette solution d'acide tannique doit être effectuée à un pH alcalin d'environ 7,4.
Il est désirable d'additionner le constituant géla tine en dernier lieu, mais il peut être mélangé en pre mier avec la corticotropine. On peut faire varier les quantités de zinc et d'acide tannique ajoutées suivant l'ordre d'addition de l'hormone adrénocorticotropi- que de 1a gélatine et d'autres agents stabilisateurs ou conservateurs.
Certains autres ingrédients peuvent être contenus dans cette préparation corticotropique, spécialement pour accroître sa stabilité et sa durée de conserva tion. Par exemple, la cystéine sert à stabiliser tous les ingrédients principaux de cette composition. La cystéine produit tout d'abord une insolubilisation de tout zinc soluble dans la préparation, en réduisant ainsi l'irrigation locale qui peut être produite par l'ion de zinc.
En outre, la cystéine semble retarder les transformations chimiques se produisant dans les constituants acide tannique, hormone adrénocorti- cotropique et gélatine de cette composition. De même, la cystéine semble se combiner avec ce complexe insoluble dans l'eau pour rester à l'endroit d'injec tion et elle peut exercer ses propriétés antioxydantes dans les tissus.
La cystéine peut être contenue dans cette suspension aqueuse à une concentration entre 0,2 et 2,0 mg par 100 unités sous-cutanées de corti- cotropine. Cependant, les meilleurs résultats peuvent être obtenus avec une concentration de cystéine d'environ 1 mg par 100 unités sous-cutanées de cor- ticotropine.
En outre, des agents antibactériels, tels que paraminobenzoate de méthyle et de propyle, peuvent être combinés avec cette préparation corticotropique, en particulier lorsqu'elle est destinée à servir de pro duits d'injection multiples.
Des résultats satisfaisants ont été obtenus en utilisant le paraminobenzoate de méthyle à une concentration d'environ 0,1 à 0,2 % (poids/volume), tandis que le paraminobenzoate de propyle peut être contenu dans cette suspension aqueuse à une concentration d'environ 0,01 à 0,02 0/0 (poids/volume). Du phénol peut aussi être employé.
Le procédé de l'invention est illustré par les exemples détaillés qui suivent. <I>Exemple 1</I> 500 mg de substance de corticotropine bovine épurée à l'oxycellulose furent mélangés à 50 ml d'eau. 1,0 % de thiourée fut ajouté et le pH réglé à 6,5 avec une solution de soude caustique à 20 0/0.
Le mélange fut placé dans un flacon de verre fermé hermétiquement. Le récipient et le produit qu'il contenait furent placés dans un four à air chauffé à 100 -'- 5Q C pendant 6 heures. Après retrait du four le liquide fut refroidi à environ 300 C et filtré à travers un filtre de verre fritté moyen.
Le précipité fut lavé à l'eau pour amener le volume du filtrat à 50 ml. 12 ml d'une solution à 5,01% d'acétate de zinc cristallin furent ajoutés à 50 ml de la solution ci-dessus de corticotropine. Le pH fut réglé à 7,
5 avec une solution à 3 % d'hydrate de sodium et on laissa le mélange reposer pendant une demi-heure. Le mélange fut centrifugé et la couche surnageante fut retirée.
Le précipité contenant la corticotropine fut remis en suspension dans 50 ml d'eau contenant 2,0 g de gélatine partiellement hydrolysée. 24 ml d'une solution à 1 % d'acide tannique furent ajoutés à la suspension résultante.
Le pH de la solution fut ensuite réglé à 6,0 avec une solution d'hydrate de sodium à 3 0/0. 24 ml de cystéine à 1,0 % furent ajoutés et le pH fut réglé à 6,0. On ajouta 2 ml de glycérine, 0,6 g de phénol et de l'eau pour donner 120 ml au pH 6,1. La suspension fut bien mélangée et on versa 2,2 ml dans chaque flacon. L'air se trou vant dans les flacons fut chassé par de l'azote, puis les flacons furent bouchés et fermés hermétiquement.
La stérilisation fut effectuée en chauffant à l'auto clave entre 116 et 1210 C pendant 15 minutes.
Le produit fini se montra stérile à l'essai suivant le procédé classique du Codex américain et sa puis lance fut déterminée par le procédé d'essai sous- cutané du Codex américain comme étant de 104 8,4 unités par ml, aucune perte de puissance n'étant indiquée après chauffage à l'autoclave. La nature physique était excellente. Ce produit assura une stimulation surrénale pendant plus de 96 heures, après une seule injection.
<I>Exemple II</I> 500 mg de substance corticotropique bovine épu rée à l'oxycellulose furent mélangés avec 25 ml d'eau. 0,25 % -de chlorhydrate de pyridoxine furent ajoutés et le pH fut réglé à 4,7 avec de l'hydrate de sodium. Ce mélange fut chauffé à 95 à 1001) C pen dant 4 heures un quart, puis fut .refroidi et dilué à 70 ml avec de l'eau.
Le pH fut réglé à 6,5 avec de l'hydrate de sodium et la préparation fut ensuite filtrée pour retirer la matière insoluble au pH 6,5. 560 mg d'acétate de zinc cristallin furent ajoutés au filtrat et le pH fut réglé à 7,5 avec une solution d'hydrate de sodium à -3 0/0. Le mélange fut centri fugé et la couche surnageante fut enlevée. Le préci pité zinc-corticotropine fut remis en suspension dans 70 ml d'eau contenant 2,5 g de gélatine partiellement hydrolysée.
On ajouta 11,2 ml d'une solution à 0,5 '% d'acide tannique, puis 14 ml d'une solution à 2,0 % de L-cystéine et 30 ml d'eau contenant 0,7 g de phénol et 2,5 ml de glycérine.
Le pH fut réglé à 6,0 avec de l'hydrate de sodium. 2,3 ml de la sus pension furent versés .dans chaque flacon, les flacons étant ensuite bouchés hermétiquement, puis chauffés à l'autoclave pendant 15 minutes avec de la vapeur d'eau sous 1,05 kg/cm2 (116 à 121o C).
Le produit fini se montra stérile à l'essai. La puissance déterminée par le procédé d'essai sous- cutané donna une valeur de 97,5 9,2 unités par ml. Ce produit assura une forte stimulation surrénale pendant environ 48 heures après une seule injection sous-cutanée de 0,1 ml à des rats ou après des doses de 100 et 200 unités à des humains. <I>Exemple III</I> Une hormone adrénocorticotropique brute fut préparée par le procédé d'extraction à l'acide chlo- rhydrique-acétone à partir de glandes pituitaires por cines.
L'hormone adrénocorticotropique brute fut soumise au procédé d'absorption à l'oxycellulose. 400 mg de l'hormone adrénocorticotropique épurée à l'oxycellulose furent mélangés à l'eau et au chlo- rhydrate de pyridoxine au pH 4,7 et chauffés à 95 à 1000 C pendant 5 heures. Après refroidissement à 50o C environ, le produit fut filtré pour enlever la matière inactive insoluble. Le précipité fut lavé à l'eau pour porter le volume total du filtrat à 40 ml.
Ce dernier fut filtré stérile à travers une bougie Selas 02. 128 mg d'acide tannique dans 25 ml d'eau furent ajoutés au filtrat à travers la bougie. Ensuite 1,056 g d'acétate de zinc cristallin dans 25 ml d'eau et 9,6 g de gélatine partiellement hydrolysée dans 25 ml d'eau furent aussi ajoutés séparément à travers la bougie stérile.
Puis on ajouta par filtrage stérile 200 ml d'eau chaude contenant 640 mg de cystéine, 600 mg de parabène de méthyle et 60 mg de parabène de propyle. 10 ml d'eau furent ajoutés après chaque filtrage pour éliminer par lavage les ingrédients précédents de la bougie.
Le volume final de la suspension stérile était .de 320 ml. 2,5 ml de la suspension furent versés d'une manière aseptique dans des flacons à large embouchure de 6 ml et les flacons furent bouchés aseptiquement. Les flacons furent ensuite soumis à congélation et séchés sous vide, puis fermés hermétiquement de façon aseptique avec des capsules d'aluminium classiques.
Le produit fini se montra stérile à l'essai. Une addition entre 1,0 et 5,9 ml d'eau ou de saumure produisit une excellente suspension uniforme du complexe insoluble d'hormone adrénocorticotropique. La puissance donna à l'essai 234 19 unités par flacon par le procédé sous-cutané du Codex amé ricain. Le produit fini reconstitué avec la saumure produisit une stimulation surrénale continue pen dant 48 à 72 heures après une seule injection. La tolérance locale était excellente. <I>Exemple IV</I> Le produit fut préparé comme à 'l'exemple III.
Au moment d'ajouter la cystéine, ainsi que le para- bène de méthyle et de propyle, on ajouta aussi de la gélatine: 6,5 ml d'une solution aqueuse à 32 % de gélatine, préalablement chauffée à l'autoclave à 1200 C pendant 4 à 8 -heures. Cette quantité de gélatine donna environ 6 mg de gélatine partielle ment hydrolysée par ml dans le produit fini.
Après lyophilisation, ce produit se reconstitua excellemment et on constata qu'il présentait après injection une plus forte stimulation surrénale que le produit préparé comme à l'exemple III. Il n'y eut pas de changement apparent dans la durée d'efficacité.
<I>Exemple V</I> Une hormone adrénocorticotropique brute fut préparée par l'extraction à l'acide chlorhydrique-acé- tone à partir de glandes pituitaires de porcs. L'hor mone adrénocorticotropique brute fut soumise à l'adsorption à l'oxycellulose. 400 mg de l'hormone adrénocorticotropique épurée à l'oxycellulose furent mélangés avec de l'eau et du chlorhydrate de pyri doxine au pH 4,7 et chauffés à 95 à<B>1000</B> C pendant 5 heures.
Après refroidissement à 501, C environ, le produit fut filtré pour retirer la matière inactive inso luble. Le précipité fut lavé à l'eau pour porter le volume total du filtrat à 40 ml. Ce dernier fut filtré stérile à travers une bougie Selas 02. On ajouta au filtrat, à travers la bougie, 256 mg d'acide tannique dans 25 m1 d'eau pour fournir 0,8 mg d'acide tanni que par ml de produit final. Ensuite 1,056 g d'acé tate de zinc cristallin dans 25 ml d'eau et 9,6 g de gélatine partiellement hydrolysée se trouvant dans 25 ml d'eau, furent également ajoutés séparément à travers la bougie stérile.
Après cela, on ajouta par filtrage stérile 200 ml d'eau chaude contenant 640 mg de cystéine, 600 mg de parabène de méthyle et 60 mg de parabène de propyle. 10 ml d'eau furent ajoutés après chaque filtrage pour éliminer par lavage les ingrédients précédents de la bougie. Le volume final de la suspension stérile était de 320 ml. La suspension fut versée d'une manière aseptique à raison de 2,5 ml dans des flacons à large embou chure de 6 ml et les flacons furent bouchés de façon aseptique.
Les flacons furent ensuite congelés et séchés sous vide, puis fermés aseptiquement avec des capsules d'aluminium classiques. On constata que ce produit donnait lieu à une stimulation surrénale de plus de 96 heures après administration sous- cutanée d'urne seule .dose.
<I>Exemple VI</I> Une hormone adrénocorticotropique brute fut préparée par extraction à l'acide chlorhydrique-acé- tone à partir de glandes pituitaires de porcs. L'hor mone adrénocorticotropique brute fut soumise à l'adsorption à l'oxycellulose. 400 mg d'hormone adronocorticotropique épurée à l'oxycellulose furent mélangés à l'eau et au chlorhydrate de pyridoxine au pH 4,7 et chauffés entre 95 et 1000 C pendant 5 heures. Après refroidissement à environ 501, C,
le produit fut filtré pour retirer 1a matière insoluble inactive. Le précipité fut lavé à l'eau pour porter le volume total du filtrat à 40 ml. Ce dernier fut filtré stérile à travers une bougie Selas 02. On ajouta au filtrat à travers la bougie 128 mg d'acide tannique dans 25 ml d'eau.
On ajouta ensuite 0,528 g d'acé tate de zinc cristallin se trouvant dans 25 ml d'eau et 9,6 g de gélatine partiellement hydrolysée se trou vant dans 25 ml d'eau, également à travers la bougie stérile. Ceci fournit 0,5 mg de zinc par ml de produit final.
Ensuite on ajouta par filtrage stérile 200<B>MI</B> d'eau chaude contenant 640 mg de cystéine, 600 mg de parabène de méthyle et 60 mg de parabène de propyle. 40 ml d'eau furent ajoutés après chaque, filtrage pour enlever par lavage les ingrédients pré cédents de la bougie. Le volume final -de la suspen sion stérile était de 320 ml.
La suspension fut versée de façon aseptique à raison de 2,5 ml dans des flacons à large embouchure de 6 ml et ces flacons furent bouchés aseptiquement. Les flacons furent ensuite congelés et séchés sous vide, puis fermés hermétiquement de façon aseptique à l'aide de cap sules d'aluminium classiques.
On constata que le produit agissait pendant envi ron 48 heures avec une intensité de réaction égale ou supérieure à celle du produit contenant 1,0 mg de zinc par ml de produit final, tel que préparé à l'exemple III.
<I>Exemple VII</I> Une solution aqueuse d'hormone adrénocortico- tropique de porcs, en une quantité de 40 cm3, conte nant 640 unités par cm3 d'hormone adrénocortico- tropique, fut filtrée à travers une bougie Selas dans un récipient stérile. Une solution aqueuse, en une quantité de 25 cm-, contenant 120 mg d'acide tanni que, fut aussi filtrée dans le récipient stérile.
Ensuite, 1,056g d'acétate de zinc, dans 25 cm3 d'eau, fut filtré dans le récipient stérile. La bougie Selas fut lavée après chaque filtrage avec 10 cm3 d'eau.
Après cela, une solution aqueuse ayant la composition suivante fut filtrée à travers la bougie Selas dans le récipient stérile cystéine 320 mg parabène de méthyle 600 mg parabène de propyle 60 mg une solution aqueuse contenant 32 % de gélatine hydrolysée par chauffage à l'autoclave pendant 8 heures 6,25 cm3 eau 95 cm3 De l'eau fut filtrée dans le récipient stérile en une quantité voulue pour donner un volume final dans ce dernier de 320 cm3.
La suspension liquide résultante fut versée à rai son de 2,5 ml dans des flacons de 6 ml. Les flacons remplis furent ensuite soumis à lyophilisation. A l'analyse, on détermina qu'il y avait une acti vité de 233 unités d'hormone adrénocorticotropique par flacon. Ce produit montra, en clinique, une plus grande activité d'hormone adrénocorticotropique qu'un produit comparable sans gélatine.
De même, le produit montra une durée d'action d'environ 48 heures.
On constata que ce produit avait, en clinique, une durée d'action d'environ 72 heures.
<I>Exemple VIII</I> Le produit fut obtenu par le procédé de l'exem ple II, sauf que l'hormone adrénocorticotropique ayant une puissance d'environ 150 unités par mg fut substituée à celle ayant une puissance d'environ 75 unités par mg, décrite dans cet exemple. En conséquence, le produit résultant avait une activité d'hormone adrénocorticot-ropiqu.e double ,de celle de l'exemple II.
On a trouvé que les quantités relatives de zinc, acide tannique et hormone adrénocorticotropique des formules précédentes peuvent varier pour réaliser le réglage de l'adsorption pendant des laps de temps de 1 à 6 jours ou plus.
Process for the production of a corticotropic preparation with prolonged action The present invention relates to a process for the manufacture of a corticotropic preparation with sustained or prolonged action.
In the manufacture of sustained-acting or long-acting corticotropic products, attempts have been made to produce an insoluble corticotropic preparation which, when administered subcutaneously or intramuscularly, has the effect of introducing corticotropin into the body. blood stream and from there to the adrenal glands. A difficulty encountered with these preparations is that they have only a relatively short shelf life, unless intolerable doses are employed.
Another difficulty is that these do not supply corticotropic material uniformly to the blood stream. In addition, these preparations do not have a certain stability.
Only the usual aqueous solutions of corticotropic hormone substances have, after injection, a relatively short duration of action and the effect tends to rise to a peak for a certain period of time and then to decrease to a point of at a point below the desired value level. For example, most of the hematologic and metabolic changes ordinarily studied are produced because the corticotropic hormone reaches its maximum effect at the fourth hour after administration.
this effect being in complete regression at the eighth hour. In order to maintain an overall average level of the desired value, it is necessary to administer an amount of the hormone substance which produces maximum effect at the fourth hour and, at the time when this maximum effect is produced, it is necessary to administer an amount of the hormone substance which produces maximum effect. there is an excess of value above what is desired.
Although hormone substances can have an effect over an eight hour period, it is necessary to administer them at intervals of six hours or less in order to maintain the overall level and at peak times there is an overuse of the activity and, as a consequence, a loss of the valuable substance. There is a need for preparations reducing the effect during peak periods while maintaining a higher level of effect throughout the treatment period.
The invention relates to a method of making a corticotropic preparation which can be administered subcutaneously or intramuscularly to deliver corticotropin to the blood stream for an extremely long period of time. With this manufacturing process, the corticotropin remains active and is distributed in a uniform manner for a long period of time.
The method allows the preparation for the delivery of the active substance to be regulated in the blood stream during selected periods, which may be a medium period or a very prolonged period. The process makes it possible to vary the duration of the stimulation by the preparation and to manufacture a substance which stimulates the glands on the kidneys; which remains stable under long storage conditions.
The corticotropic complex obtained by the method of the invention has an intense and prompt action when administered, while producing a relatively uniform stimulation of the adrenal glands for a long period of time, and then at the same time more markedly stimulating the adrenal gland. Natural supply or secretion of the hormone by the pituitary glands.
Various other characteristics emerge from the detailed description which follows.
The manufacturing process of the invention gives a corticotropic preparation which shows a prolonged action by subcutaneous or intramuscular administration and which generally consists of an aqueous suspension containing from 20 to 500 subcutaneous units (American Codex) per ml of corticotropin. , 0.1 to 2.5 mg of tannate per 100 subcutaneous corticotropin units, at least 0,
25 mg of zinc per 100 subcutaneous units of corticotropin and from 6 to 60 mg of gelatin partially hydrolyzed by 100 subcutaneous units of corticotropin, at least part of this aqueous suspension consisting of a zinc complex - corticotropin-gelatin-tannate.
During the experiments which preceded the invention, it was found that corticotropin obtained from pituitary tissues of pigs, when combined with a zinc salt and tannic acid, gives rise to the formation of a zinc-corticotropin-tannate complex which is essentially inactive during subcutaneous or intramuscular administration, i.e. its activity is of such a prolonged duration that there is no has no clinically detectable effects. However,
the use of a zinc-corticotropine-gelatin-tannate complex with porcine adrenocorticotropic hormone avoids this problem. On the other hand, it has been found that the use with bovine adrenocorticotropic hormone of a zinc-cortico-tropin complex gives a product having a desirable prolonged and controlled action upon subcutaneous or intramuscular injection. .
The terminology subcutaneous units refers to the standards of subcutaneous corticotropin of the American Codex XV.
The corticotropic preparation obtained by the process of the invention is suitable for administration to animals and humans by any means, but it is obvious that since the basis of its prolonged action is the formation of a deposition in the tissues, it is preferred that its administration be effected, in the case of parenteral administration, by a route other than the intravenous route. A particularly desirable prolonged corticotropic action can be obtained when this preparation is administered subcutaneously or intramuscularly.
The corticotropin which can be used in this corticotropic preparation includes: both high and low potency substances; the manufacturing process is applicable to substances extracted from animal pituitary glands and to synthetic preparations: of these active substances.
However, the best results should be obtained when the corticotropin included in this preparation is of high purity and has a potency of at least 20 subcutaneous units per milligram. Particularly desirable results can be obtained with corticotropin having a potency of at least 40 subcutaneous units per milligram. Likewise,
although the corticotropin used in the implementation of the invention can be obtained from pituitary glands of all animal species, the best results can be obtained with corticotropin obtained from pituitary tissues of cattle and pigs, corticotropin obtained from pituitary glands pigs being particularly desirable.
An example of corticotropin is the preparation described in U.S. Patent No. 2,739,099 filed July 3, 1950.
Likewise, a desirable corticotropin composition can be obtained by the oxycellulose scrub method of US Patent No. 2,669,536, filed Aug. 15, 1950, wherein the scrub is effected by adsorption and elution on cellulosic materials.
Although corticotropin can be included in this aqueous suspension at a concentration of between 20 and 500 subcutaneous units per cm3, it is preferred, for practical applications, to use corticotropin at a concentration of between 40 and 100 subcutaneous units per cm3.
The tannate component of this corticotropic preparation can be obtained: tannic acid of pharmaceutical grade. Although tannate can be included in this preparation at a concentration between 0.1 and 2.5 mg per 100 subcutaneous corticotropin units, the best results can be obtained with a tannate concentration of 0.2 to 1,
0 mg per 100 subcutaneous corticotropin units and particularly desirable results are obtained with tannic acid at a concentration of about 0.4 mg per 100 subcutaneous corticotropin units.
The zinc component of this corticosteroid preparation can be derived from any zinc salt, but it is naturally preferred to use a water soluble zinc salt such as zinc acetate. Although zinc can be included in this aqueous suspension, at a concentration of at least 0.25 mg per 100 subcutaneous corticotropin units for practical uses, it is preferred to use zinc at a concentration between 0.5 and 2.0 mg per 100 subcutaneous corticotropin units.
During the experiments which led to the invention, it was determined, in tolerance tests with animals, that a zinc-corticotropine-tannate complex appears to be capable of inactivation by: tissues. This inactivating effect by the tissues prevents the absorption of corticotropin into the blood stream from a deposit formed in the tissues. As a result, a reduced rate of corticotropin delivery to the blood stream is obtained and a blood level may be produced below that at which the adrenal gland responds to exogenous corticotropin.
In addition, in many cases there may not be a conspicuous effect of corticotropin administered to the renal gland and there may be an apparent loss of corticotropic activity. Consequently, it has been found that the inclusion in this complex of a partially hydrolyzed gelatin acts against this phenomenon of inactivation by the tissues.
In addition, the amount of gelatin included in this complex can be adjusted to vary the rate at which corticotropin is distributed into the blood stream and, therefore, can be adjusted within the limits of the duration of action. corticotropic preparation. At the same time, by the inclusion in this gelatin complex, an enhanced corticotropic activity is obtained with no apparent effect on the duration of action of the composition.
In addition, this gelatin component serves to increase the stability, not only of the composition, but especially of the tanate component. Additionally, the gelatin component serves to reduce any local irritation that might otherwise be observed with the complex.
The gelatin component of this corticotropic preparation should be of pharmaceutical grade and not antigenic. Partial hydrolysis of gelatin can be achieved by autoclaving a suitable gelatin solution at a pressure of about 1.05 kg per cm2 for about eight hours.
Although gelatin may be contained in this composition at a concentration of 2 to 60 mg per 100 subcutaneous corticotropin units, the best results are obtained with a gelatin concentration of 6 to 20 mg per 100 subcutaneous units. corticotropin and particularly desirable results are achieved with approximately 15 mg of gelatin per 100 subcutaneous corticotropin units.
It is possible to vary over a considerable range the duration of action obtained with this corticotropic preparation by adjusting the concentrations of the zinc and tannate constituents in the complex, as well as by varying the gelatin constituent as previously described.
It is desirable that the corticotropic preparation has a pH between 4 and 8 and it is preferred that the aqueous suspension has a pH of about 5.
At least part of the four main ingredients contained in the aqueous suspension, namely zinc, corticotropin, tannate and gelatin, is in the form of a complex insoluble in water. The aqueous suspension therefore contains a solid phase and a liquid phase (aqueous), the solid phase comprising at least part of the four main ingredients in chemical combination such that the complex is separable as an entity from the liquid phase. Part of any of the main ingredients can be included in this corticotropic preparation as a component of the liquid phase and in some cases
it may be desirable to provide corticotropin in this composition both in soluble form and in insoluble form, so that it may have both immediate and prolonged corticotropic effect.
The formation of this corticotropic preparation and especially the production of this water insoluble complex generally involves mixing the main ingredients in an aqueous medium until the combination of at least a part of these ingredients has been obtained. .
Accordingly, it will be appreciated that the starting material is usually an aqueous solution containing the desired concentration of corticotropin. However, it has been shown that the order of succession in which the remaining ingredients are combined with this aqueous corticotropin solution can vary to modify the characteristics of the resulting product. On the one hand, if this aqueous corticotropin solution is first combined with tannic acid, the subsequent addition to this solution of the zinc component can be carried out over a relatively wide pH range.
On the other hand, when the aqueous corticotropin solution is first combined with the zinc salt, the subsequent addition to this tannic acid solution should be made at an alkaline pH of about 7.4.
It is desirable to add the gelatin component last, but it can be mixed first with the corticotropin. The amounts of zinc and tannic acid added can be varied according to the order of addition of the adrenocorticotropic hormone from the gelatin and other stabilizing or preserving agents.
Certain other ingredients may be contained in this corticotropic preparation, especially to increase its stability and shelf life. For example, cysteine serves to stabilize all of the main ingredients in this composition. Cysteine first produces insolubilization of any soluble zinc in the preparation, thereby reducing the local irrigation which may be produced by the zinc ion.
In addition, cysteine appears to retard chemical changes occurring in the tannic acid, adrenocortico-tropic hormone and gelatin constituents of this composition. Likewise, cysteine appears to combine with this water-insoluble complex to remain at the site of injection and it can exert its antioxidant properties in tissues.
Cysteine may be contained in this aqueous suspension at a concentration of between 0.2 and 2.0 mg per 100 subcutaneous units of corticotropin. However, the best results can be obtained with a cysteine concentration of about 1 mg per 100 subcutaneous units of corticotropin.
In addition, antibacterial agents, such as methyl propyl paraminobenzoate, can be combined with this corticotropic preparation, particularly when it is intended to serve as multiple injection products.
Satisfactory results have been obtained using methyl paraminobenzoate at a concentration of about 0.1 to 0.2% (w / v), while propyl paraminobenzoate can be contained in this aqueous suspension at a concentration of about 0.01 to 0.02 0/0 (weight / volume). Phenol can also be used.
The process of the invention is illustrated by the detailed examples which follow. <I> Example 1 </I> 500 mg of oxycellulose-purified bovine corticotropin substance was mixed with 50 ml of water. 1.0% thiourea was added and the pH adjusted to 6.5 with 20% caustic soda solution.
The mixture was placed in a tightly closed glass vial. The container and the product it contained were placed in an air oven heated to 100 ° -5 ° C. for 6 hours. After removal from the oven the liquid was cooled to about 300 ° C and filtered through a medium sintered glass filter.
The precipitate was washed with water to bring the volume of the filtrate to 50 ml. 12 ml of a 5.01% solution of crystalline zinc acetate was added to 50 ml of the above corticotropin solution. The pH was adjusted to 7,
5 with 3% sodium hydrate solution and the mixture was allowed to stand for half an hour. The mixture was centrifuged and the supernatant layer was removed.
The precipitate containing corticotropin was resuspended in 50 ml of water containing 2.0 g of partially hydrolyzed gelatin. 24 ml of a 1% tannic acid solution was added to the resulting suspension.
The pH of the solution was then adjusted to 6.0 with 30% sodium hydrate solution. 24 ml of 1.0% cysteine was added and the pH was adjusted to 6.0. 2 ml of glycerin, 0.6 g of phenol and water were added to give 120 ml at pH 6.1. The suspension was mixed well and 2.2 ml was poured into each vial. The air in the vials was removed with nitrogen, then the vials were stoppered and sealed.
Sterilization was carried out by heating in an autoclave between 116 and 1210 C for 15 minutes.
The finished product was shown to be sterile when tested according to the classic American Codex method and its release was determined by the American Codex subcutaneous test method to be 104 8.4 units per ml, no loss of potency. not indicated after heating in an autoclave. The physical nature was excellent. This product will provide adrenal stimulation for over 96 hours after a single injection.
<I> Example II </I> 500 mg of oxycellulose-purified bovine corticotropic substance were mixed with 25 ml of water. 0.25% pyridoxine hydrochloride was added and the pH was adjusted to 4.7 with sodium hydrate. This mixture was heated to 95-100 ° C for 4 ½ hours, then cooled and diluted to 70 ml with water.
The pH was adjusted to 6.5 with sodium hydrate and the preparation was then filtered to remove insoluble material at pH 6.5. 560 mg of crystalline zinc acetate was added to the filtrate and the pH was adjusted to 7.5 with -30% sodium hydrate solution. The mixture was centrifuged and the supernatant layer was removed. The zinc-corticotropin precipitate was resuspended in 70 ml of water containing 2.5 g of partially hydrolyzed gelatin.
11.2 ml of a 0.5% solution of tannic acid were added, followed by 14 ml of a 2.0% solution of L-cysteine and 30 ml of water containing 0.7 g of phenol. and 2.5 ml of glycerin.
The pH was adjusted to 6.0 with sodium hydrate. 2.3 ml of the suspension was poured into each flask, the flasks then being hermetically sealed, then heated in the autoclave for 15 minutes with water vapor at 1.05 kg / cm2 (116 to 121o C ).
The finished product was found to be sterile on testing. The potency determined by the subcutaneous test method gave a value of 97.5 9.2 units per ml. This product will provide strong adrenal stimulation for approximately 48 hours after a single subcutaneous injection of 0.1 ml in rats or after doses of 100 and 200 units in humans. <I> Example III </I> A crude adrenocorticotropic hormone was prepared by the hydrochloric acid-acetone extraction process from por cine pituitary glands.
Crude adrenocorticotropic hormone was subjected to the oxycellulose absorption process. 400 mg of the oxycellulose purified adrenocorticotropic hormone was mixed with water and pyridoxine hydrochloride at pH 4.7 and heated at 95-1000 C for 5 hours. After cooling to about 50 ° C, the product was filtered to remove the insoluble inactive material. The precipitate was washed with water to bring the total volume of the filtrate to 40 ml.
The latter was filtered sterile through a Selas 02 candle. 128 mg of tannic acid in 25 ml of water was added to the filtrate through the candle. Then 1.056 g of crystalline zinc acetate in 25 ml of water and 9.6 g of partially hydrolyzed gelatin in 25 ml of water were also added separately through the sterile candle.
Then 200 ml of hot water containing 640 mg of cysteine, 600 mg of methyl paraben and 60 mg of propyl paraben were added by sterile filtering. 10 ml of water was added after each filtering to wash off the previous ingredients from the candle.
The final volume of the sterile suspension was 320 ml. 2.5 ml of the suspension was aseptically poured into 6 ml wide mouth vials and the vials were aseptically stoppered. The vials were then frozen and dried under vacuum, then aseptically sealed with conventional aluminum caps.
The finished product was found to be sterile on testing. Addition of 1.0 to 5.9 ml of water or brine produced an excellent uniform suspension of the insoluble adrenocorticotropic hormone complex. Potency gave the test 234 19 units per vial by the US Codex subcutaneous method. The finished product reconstituted with the brine produced continuous adrenal stimulation for 48 to 72 hours after a single injection. Local tolerance was excellent. <I> Example IV </I> The product was prepared as in Example III.
When adding the cysteine, as well as the methyl and propyl parabene, gelatin was also added: 6.5 ml of a 32% aqueous gelatin solution, previously heated in an autoclave at 1200 C for 4 to 8 hours. This amount of gelatin gave about 6 mg of partially hydrolyzed gelatin per ml in the finished product.
After lyophilization, this product was reconstituted excellently and it was found that after injection it exhibited a stronger adrenal stimulation than the product prepared as in Example III. There was no apparent change in the duration of effectiveness.
<I> Example V </I> Crude adrenocorticotropic hormone was prepared by hydrochloric acid-acetone extraction from pig pituitary glands. The crude adrenocorticotropic hormone was subjected to oxycellulose adsorption. 400 mg of the oxycellulose purified adrenocorticotropic hormone was mixed with water and pyri doxin hydrochloride, pH 4.7 and heated to 95 at <B> 1000 </B> C for 5 hours.
After cooling to about 501 ° C, the product was filtered to remove insoluble inactive material. The precipitate was washed with water to bring the total volume of the filtrate to 40 ml. The latter was filtered sterile through a Selas 02 candle. 256 mg of tannic acid in 25 ml of water were added to the filtrate through the candle to provide 0.8 mg of tannic acid per ml of final product. . Then 1.056 g of crystalline zinc acetate in 25 ml of water and 9.6 g of partially hydrolyzed gelatin in 25 ml of water were also added separately through the sterile candle.
After that, 200 ml of hot water containing 640 mg of cysteine, 600 mg of methyl paraben and 60 mg of propyl paraben were added by sterile filtering. 10 ml of water was added after each filtering to wash off the previous ingredients from the candle. The final volume of the sterile suspension was 320 ml. The suspension was poured aseptically at 2.5 ml into 6 ml wide mouth vials and the vials were aseptically stoppered.
The vials were then frozen and dried under vacuum, then aseptically closed with conventional aluminum caps. This product was found to give rise to adrenal stimulation for more than 96 hours after subcutaneous administration of the urn alone.
<I> Example VI </I> Crude adrenocorticotropic hormone was prepared by hydrochloric acid-acetone extraction from pig pituitary glands. The crude adrenocorticotropic hormone was subjected to oxycellulose adsorption. 400 mg of adronocorticotropic hormone purified with oxycellulose were mixed with water and pyridoxine hydrochloride at pH 4.7 and heated at 95-1000 C for 5 hours. After cooling to about 501, C,
the product was filtered to remove inactive insoluble material. The precipitate was washed with water to bring the total volume of the filtrate to 40 ml. The latter was filtered sterile through a Selas 02 candle. 128 mg of tannic acid in 25 ml of water were added to the filtrate through the candle.
Then 0.528 g of crystalline zinc acetate in 25 ml of water and 9.6 g of partially hydrolyzed gelatin in 25 ml of water were added, also through the sterile candle. This provides 0.5 mg of zinc per ml of final product.
Then 200 <B> MI </B> hot water containing 640 mg of cysteine, 600 mg of methyl paraben and 60 mg of propyl paraben were added by sterile filtering. 40 ml of water were added after each filtering to wash off the previous ingredients of the candle. The final volume of the sterile suspension was 320 ml.
The suspension was aseptically poured at 2.5 ml into 6 ml wide mouth vials and these vials were aseptically stoppered. The vials were then frozen and dried under vacuum, then aseptically sealed using conventional aluminum caps.
The product was found to act for about 48 hours with a reaction intensity equal to or greater than that of the product containing 1.0 mg of zinc per ml of final product, as prepared in Example III.
<I> Example VII </I> An aqueous solution of swine adrenocortico-tropic hormone, in an amount of 40 cm3, containing 640 units per cm3 of adrenocortico-tropic hormone, was filtered through a Selas candle in a sterile container. An aqueous solution, in an amount of 25 cc, containing 120 mg of tannic acid, was also filtered into the sterile container.
Then 1.056g of zinc acetate, in 25 cm3 of water, was filtered into the sterile container. The Selas candle was washed after each filtering with 10 cm3 of water.
After that, an aqueous solution having the following composition was filtered through the Selas candle into the sterile container cysteine 320 mg methyl paraben 600 mg propyl paraben 60 mg an aqueous solution containing 32% gelatin hydrolyzed by heating in the autoclave for 8 hours 6.25 cm3 water 95 cm3 Water was filtered into the sterile container in an amount desired to give a final volume in the latter of 320 cm3.
The resulting liquid suspension was poured in an amount of 2.5 ml into 6 ml vials. The filled vials were then subjected to lyophilization. On analysis, it was determined that there was an activity of 233 units of adrenocorticotropic hormone per vial. This product showed, in the clinic, greater adrenocorticotropic hormone activity than a comparable product without gelatin.
Likewise, the product showed a duration of action of approximately 48 hours.
This product was found to have a clinical duration of action of approximately 72 hours.
<I> Example VIII </I> The product was obtained by the process of Example II, except that the adrenocorticotropic hormone having a potency of about 150 units per mg was substituted for that having a potency of about 75 units per mg, described in this example. As a result, the resulting product had double adrenocorticotropic hormone activity, as in Example II.
It has been found that the relative amounts of zinc, tannic acid and adrenocorticotropic hormone of the foregoing formulas can vary to achieve adsorption control for periods of 1 to 6 days or more.