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Verfahren zur Herstellung von intravenös anwendbaren Antikörperpräparaten humanen Ursprungs Die intravenöse Verabreichung von Gamma-Glo- bulin- bzw. Antikörperpräparaten, ist der intramuskulären Anwendung aus verschiedenen Gründen vorzuziehen: - Das Gamma-Globulin kommt rascher zur Wirkung. - Es findet kein Verlust durch Proteolyse am Injektionsort statt.
- Die grössere Wirksamkeit einer Dosis gestattet, den gewünschten Effekt mit geringeren Mengen zu erzielen, wodurch die Behandlung wesentlich billiger wird.
- Die bei der intramuskulären Applikation grösserer Gamma-Globulinmengen unvermeidlichen Schmerzen an der Einstichstelle fallen weg.
Bis heute war es nicht möglich, auch noch so sorgfältig hergestellte Gamma-Globulinpräparate regelmässig intravenös zu applizieren. Ein gewisser Prozentsatz von Empfängern reagierte auf intravenöse Gamma-Globulingaben regelmässig mit mehr oder weniger ausgeprägten, vielfach aber sogar bedrohlichen, anaphylaktoiden Reaktionen.
Die Reaktionen sind einerseits bedingt durch die Tatsache, dass es sich bei Gamma-Globuhnpräparaten notwendigerweise um Präparate handelt, die aus einem einer sehr grossen Anzahl von Individuen entstammenden Ausgangsmaterial gewonnen. werden. Anderseits sind die Reaktionen empfängerseitig bedingt.
Es ist möglich, durch Zusätze zu den Gamma- Globulinlösungen oder durch gleichzeitige, vorausgehende oder nachfolgende Verabreichung anderer Medikamente (z. B. Antihistaminika u. a.) die Reaktionen zu unterdrücken oder mindestens stark abzuschwächen.
Durch langsame Infusion sehr verdünnter Gamma- Globulinlösungen lässt sich eine allfällig auftretende Reaktion sehr genau unter Kontrolle halten. Ein Patient, der auf eine Gamma-Globulininfusion reagiert hat, tritt nach Abklingen der Reaktion regelmässig in eine Refraktärperiode von etwa 4 Tagen Dauer ein. Während dieser Periode werden vom Patienten beliebig grosse Gamma-Globulinmengen intravenös reaktionslos ertragen.
Weiter wurde gefunden, dass - einerseits die unerwünschten Reaktionen: parallel gehen der antikomplementären Aktivität des Gamma-Globulins und - anderseits die antikomplementäre Aktivität des Gamma-Globulins vorwiegend an höhermolekulare Aggregate mit Sed'imentationskonstanten S20>7 Svedberg-Einheiten gebunden ist. Jedoch ist auch natives Gamma-Globulin, in dem sich in der Ultra- zeritrifuge keine Teilchen mit S2,>7 mehr nachweisen lassen, immer noch antikomplementär.
- Ein durch Ultrazentrifugation von allen. Anteilen mit S2o > 7 befreites Gamma-Globulin wird intra- venös meist gut vertragen.
Es ist bekannt, dass sich Gamma-Globulinpräpa- rate zu kleineren Teilchen partiell abbauen lassen, ohne dass dabei ihre spezifische Antikörper-Wirksam- keit Schaden erleidet. Wir haben gefunden, dass diese Präparate intravenös durchwegs reaktionslos vertragen werden. Sie stellen somit gegenüber den bisher zur Verfügung stehenden einen, erheblichen Fortschritt dar.
Der chemische Angriff auf die Gamma-Globulin- moleküle zum Zwecke des Abbaus zu kleineren Einheiten kann sich gegen verschiedenartige Bindungen im Molekül richten, wie z. B. Säureamidbindungen (Peptidbindungen) oder -S-S-Brücken oder mehrere Arten von Bindungen gleichzeitig.
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Zur reduktiven Aufspaltung von -S-S-Brücken können in erster Linie Sulfide oder Substanzen dienen, die selber Träger von -SH-Gruppen sind.
Praktisch lässt sich dieser Abbau sehr leicht bewerkstelligen mit Cystein, Cysteamin oder Glutathion. Diese Substanzen haben den Vorteil, ungiftig zu sein. Der Nachteil ist jedoch, dass Substanzen dieses Typs in Lösung leicht oxydieren und dabei unwirksam werden. Auch schon zu -SHHS- gespaltene Brückenverbindungen werden leicht rückoxydiert zu Disulfidbrücken. Man kommt auf diesem Wege nur zu beständigen Lösungen, sofern man für eine endgültige Blockierung der freigesetzten -SH-Gruppen sorgt, was möglich ist durch Anwendung von Jodacetamid, Sulfit usw.
Zur oxydativen Aufspaltung von Disulfidbrücken kommen als Reagenzien Perameisensäure, Peressig- säure, Wasserstoffperoxyd usw. in Frage. Eine oxy- dative Aufspaltung der Disulfidbrücken ist weitgehend irreversibel.
Eine Spaltung intramolekularer Bindungen kann allein durch pH-Verschiebung erreicht werden. Die komplementäre Wirkung des Gamma-Globulins kann schon durch blosses Inkubieren der Lösung bei pH- Werten unter 5, während eines Tages, bei 37 , weitgehend abgeschwächt werden.
Rascher verläuft die Reaktion, wenn sie mit einem Katalysator (Ferment, proteolytisch wirksame Fer- mentbruchstücke oder andere Substanzen) durchgeführt wird. Da nur ein beschränkter Abbau erwünscht ist, kann es vorteilhaft sein, das Ferment nicht bei den für seine Aktivität optimalen Bedingungen einwirken zu lassen.
Man arbeitet beispielsweise bei Temperaturen zwischen 0 und 20 und bei pH-Werten, die um 1 bis 4 Einheiten vom pH-Optimum entfernt liegen.
Der Abbruch der Fermentwirkung lässt sich nur dann allein durch pH-Verschiebung genügend vollständig erzielen, wenn das pH-Optirnum in extrem saurem oder alkalischem Gebiet liegt. In denn andern Fällen wäre eine Hemmung des Ferments unerläss- lich, sofern sich dieses nicht quantitativ aus dem Reaktionsgemisch entfernen lässt. Da eine quantitative Entfernung eines Fermentes meist nur mit grossen Schwierigkeiten möglich ist, ist es von Anfang an vorzuziehen, mit an unlösliche Träger gebundenen Fermenten zu arbeiten.
Dies bringt den weiteren Vorteil mit sich, dass, im Fälle das verwendete Ferment Anti- gencharakter aufweist, kein Antigen zurückbleibt.
Die Veränderung der Gamma-Globulinmoleküle sollte so weit gehen, dass sich nachher keine Partikeln mehr nachweisen lassen, die eine Sedimentationskon- stante S2, > 7 Svedberg-Einheiten aufweisen (gemessene Werte für die Sedimentationskonstanten, umgerechnet auf die Standardbedingungen: 20 , Lösungsmittel Wasser, Proteinkonzentration extrapoliert auf 0), und vor allem, dass das Präparat nicht mehr antikomplementär ist. Die abgebauten Präparate können nach Einstellen der gewünschten Konzentration eventuell direkt konfektioniert werden.
Es ist aber auch möglich, durch Fällen (Aussalzen, Azetonfällung usw.) und Wiederauflösen zu den endgültigen Präparaten zu kommen.
Beispiel 1 Eine Lösung von 8 g Gamma-Globulin in etwa 50 ml 2,25 % iger (0,3 m) Glycinlösung wird mit 40 mg kristallisiertem Pepsin versetzt. Das pH wird mit 0,1n Salzsäure auf 4,0 eingestellt. Die Lösung wird nun mit 0,9 % iger (0,15 m) NaCI-Lösung auf 100 ml Volumen gebracht. Diese Lösung wird während 3 Std. bei 37 inkubiert. Danach wird das pH mit 0,1n NaOH vorsichtig auf 7,30 eingestellt.
Die antikomplementäre Wirkung von nativem Gamma Globulin wirkt sich im Hämolysetest mit Schaferythrocyten bis zu einer Verdünnung von 1 : 2048, das heisst bis zu einer Gamma-Globulinkon- zentration von 4 mg % aus. Das abgebaute Gamma- Globulin weist im gleichen System keine antikomplementäre Wirkung mehr auf.
Im abgebauten Gamma-Globulin lassen sich in der Ultrazentrifuge keine Teilchen mit einer Sedimen- tationskonstanten S2 o > 7 Svedberg-Einheiten mehr nachweisen.
Beispiel 2 Ein dem Pepsinabbau analoger Effekt lässt sich durch blosses Einstellen des pH-Wertes auf 4,0 und 17stündige Inkubation bei 37 erreichen. Nach Rückneutralisation auf pH 7,3 ist auch hier die antikom- plementäre Wirkung verschwunden.
Immunoelektrophoretisch erleiden die Gamma- Globulinpräparate bei obigen Versuchsbedingungen keine nennenswerte Änderungen. Bei höheren Pepsinkonzentrationen (Verhältnis Pepsin: Gamma-Globu- lin = 1 : 20) kommt es zu einem so weitgehenden Abbau, dass er sich immunoelektrophoretisch in einer Aufspaltung der Gamma-Globulinfraktion in eine rascher und eine langsamer wandernde Komponente mit einer gemeinsamen Antigendeterminanten äussert.
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Process for the production of intravenously applicable antibody preparations of human origin The intravenous administration of gamma globulin or antibody preparations is preferable to intramuscular application for various reasons: - The gamma globulin takes effect more quickly. - There is no loss due to proteolysis at the injection site.
- The greater effectiveness of a dose allows the desired effect to be achieved with smaller amounts, which makes the treatment much cheaper.
- The unavoidable pain at the injection site with the intramuscular application of larger amounts of gamma globulin is eliminated.
Up until now it has not been possible to regularly administer intravenous gamma globulin preparations, no matter how carefully manufactured. A certain percentage of recipients reacted regularly to intravenous gamma globulin administration with more or less pronounced, but often even threatening, anaphylactoid reactions.
On the one hand, the reactions are due to the fact that gamma globule preparations are necessarily preparations obtained from a starting material derived from a very large number of individuals. will. On the other hand, the reactions are dependent on the recipient.
It is possible to suppress the reactions or at least greatly weaken them by adding them to the gamma globulin solutions or by simultaneous, preceding or subsequent administration of other drugs (e.g. antihistamines, etc.).
Any reaction that may occur can be kept very precisely under control by slowly infusing very dilute gamma globulin solutions. A patient who has reacted to a gamma globulin infusion regularly enters a refractory period of around 4 days after the reaction has subsided. During this period, the patient can endure any large amounts of gamma globulin intravenously without reaction.
It was also found that - on the one hand, the undesirable reactions: go parallel to the anti-complementary activity of gamma globulin and - on the other hand, the anti-complementary activity of gamma globulin is predominantly bound to higher molecular weight aggregates with sedimentation constants S20> 7 Svedberg units. However, native gamma globulin, in which no particles with S2,> 7 can no longer be detected in the ultra-citrifuge, is still anti-complementary.
- One by ultracentrifugation of all. Gamma globulin freed with S2o> 7 is usually well tolerated intravenously.
It is known that gamma globulin preparations can be partially broken down into smaller particles without their specific antibody effectiveness being damaged. We have found that intravenous drugs are consistently tolerated without reaction. They therefore represent a significant step forward compared to those previously available.
The chemical attack on the gamma globulin molecules for the purpose of breaking them down into smaller units can be directed against various types of bonds in the molecule, such as B. acid amide bonds (peptide bonds) or -S-S bridges or several types of bonds at the same time.
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For the reductive splitting of -S-S-bridges, sulfides or substances which are themselves carriers of -SH groups can primarily serve.
In practice, this breakdown can be achieved very easily with cysteine, cysteamine or glutathione. These substances have the advantage of being non-toxic. The disadvantage, however, is that substances of this type easily oxidize in solution and become ineffective. Bridge compounds that have already been cleaved to form -SHHS- are also easily reoxidized to form disulfide bridges. Permanent solutions can only be obtained in this way, provided that the released -SH groups are finally blocked, which is possible by using iodoacetamide, sulfite, etc.
For the oxidative splitting of disulfide bridges, performic acid, peracetic acid, hydrogen peroxide, etc. come into question as reagents. Oxidative splitting of the disulfide bridges is largely irreversible.
Cleavage of intramolecular bonds can only be achieved by shifting the pH. The complementary effect of the gamma globulin can be largely weakened by merely incubating the solution at pH values below 5 for one day at 37.
The reaction proceeds more quickly if it is carried out with a catalyst (ferment, proteolytically active ferment fragments or other substances). Since only a limited breakdown is desired, it can be advantageous not to allow the ferment to act under the optimal conditions for its activity.
One works, for example, at temperatures between 0 and 20 and at pH values which are 1 to 4 units away from the pH optimum.
The termination of the fermentation effect can only be achieved sufficiently completely by shifting the pH if the pH optimum is in an extremely acidic or alkaline area. In other cases, inhibition of the ferment would be essential if it cannot be quantitatively removed from the reaction mixture. Since a quantitative removal of a ferment is usually only possible with great difficulty, it is preferable from the beginning to work with ferments bound to insoluble carriers.
This has the further advantage that if the ferment used has an antigenic character, no antigen remains.
The change in the gamma globulin molecules should go so far that afterwards no more particles can be detected which have a sedimentation constant S2,> 7 Svedberg units (measured values for the sedimentation constants, converted to the standard conditions: 20, solvent water, Protein concentration extrapolated to 0), and above all that the preparation is no longer anti-complementary. After setting the desired concentration, the degraded preparations can possibly be packaged directly.
However, it is also possible to arrive at the final preparations by precipitation (salting out, acetone precipitation, etc.) and redissolving.
Example 1 A solution of 8 g of gamma globulin in about 50 ml of 2.25% (0.3 M) glycine solution is mixed with 40 mg of crystallized pepsin. The pH is adjusted to 4.0 with 0.1N hydrochloric acid. The solution is now brought to a volume of 100 ml with 0.9% (0.15 M) NaCl solution. This solution is incubated at 37 for 3 hours. The pH is then carefully adjusted to 7.30 with 0.1N NaOH.
The anti-complementary effect of native gamma globulin has an effect in the hemolysis test with sheep erythrocytes up to a dilution of 1: 2048, that is up to a gamma globulin concentration of 4 mg%. The degraded gamma globulin no longer has any anti-complementary effects in the same system.
Particles with a sedimentation constant S2 o> 7 Svedberg units can no longer be detected in the degraded gamma globulin in the ultracentrifuge.
Example 2 An effect analogous to the pepsin degradation can be achieved by simply adjusting the pH to 4.0 and incubating at 37 for 17 hours. After re-neutralization to pH 7.3, the anti-complementary effect has also disappeared here.
Immunoelectrophoretically, the gamma globulin preparations do not undergo any significant changes under the above test conditions. At higher pepsin concentrations (ratio of pepsin: gamma globulin = 1:20), the degradation is so extensive that it manifests itself immunoelectrophoretically as a splitting of the gamma globulin fraction into a faster and a slower moving component with a common antigen determinant.