Verfahren zur Herstellung neuer d' 4-Pregnadiene Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung neuer J1.-1-Pregnadiene der Formel
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in der R eine freie oder veresterte Hydroxygruppe, Y zwei Wasserstoffatome, eine Oxogruppe oder Wasserstoff und eine freie oder veresterte Hydroxy- gruppe, X1 Wasserstoff, Chlor oder Fluor und X2 Chlor oder Fluor bedeuten.
In den Estern können die Säurereste solche von gesättigten oder ungesättigten aliphatischen oder cy- cloaliphatischen, von aromatischen oder heterocycli- schen Carbonsäuren sein, beispielsweise der Ameisen säure, Essigsäure, Propionsäure, der Buttersäuren, Valeriansäuren, wie n-Valeriansäure und Trimethyl- essigsäure, der Capronsäuren, wie ss-Trimethylpropion- säure,
der gesättigten oder ungesättigten önanth-, Capryl-, Pelargon-, Caprin-, Undecylsäuren, der Laurin-, Myristin-, Palmitin- oder Stearinsäuren, z.
B. Undecylensäure und ölsäure, der Cyclopentyl-, Cyclohexyl- oder Phenyl-essigsäuren oder -propion- säuren, der Benzoesäure, Phenoxy-alkansäuren wie Phenoxy - essigsäure, p - Chlor - phenoxy - essigsäure, 2.4-Dichlor-phenoxy-essigsäure, 4-tert.-Butyl-phenoxy- essigsäure,
3-Phenoxy-propionsäure und 4-Phenoxy- buttersäure, der Furan-2-carbonsäure, 5-tert.-Butyl- furan - 2 - carbonsäure, 5-Brom furan-2-carbonsäure, der Nicotinsäuren, von ss-Keto-carbonsäuren, z. B.
der Acetessig-, Propionylessib, Butyrylessig- und Capronylessigsäure, von Aminosäuren, wie Di- äthylaminoessigsäure, Asparaginsäure usw. Anstelle von Carbonsäureresten können auch solche von Sulfonsäuren, ferner von Phosphor-, Schwefel- oder Halogenwasserstoffsäuren vorliegen.
Besondere Bedeutung kommt solchen Estern zu, die eine wasserslöslichmachende Gruppe, wie eine Carboxyl- oder Aminogruppe, aufweisen, da sie zur Herstellung von wässrigen Lösungen Verwendung finden können. Es sind dies vor allem die Halbester, z. B. von Dicarbonsäuren, z.
B. von der Oxal-, Bernstein-, Malein-, Glutar-, Dimethylglutar-, Pime- lin-, Acetondicarbon-, Acetylendicarbon-, Phthal-, Tetrahydrophthal-, Hexahydrophthal-, Endomethylen- tetrahydrophthal'-, Endomethylen-hexahydrophthal-, Endoxy-hexahydrophthal-, Endoxy-tetrahydrophthal- säure, Camphersäure,
Cyclopropan-, Cyclobutandi- carbonsäure, Diglykolsäure, Äthylenbisglykolsäure, Polyäthylenbisglykolsäuren, Furan-, Dihydrofuran-, Tetrahydrofurandicarbonsäuren, Chinolin- und Cin- chomeronsäure sowie Thioglykolsäureester.
Die Verfahrensprodukte zeichnen sich durch eine hohe biologische Wirkung aus. Besonders zu nennen sind die 6a-Chlor- und 6a-Fluorderivate von 16a- Methyl-prednisolon, 16a-Methyl-prednison, 16a-Me- thyl-9a-fluor- und 16a-Methyl-9a-chlor-prednisolon und -prednison, sowie die entsprechenden 21-Ester, wie 21-Trimethylacetate, 21-Cyclopentylpropionate,
21-Phenylpropionate und die 21-Ester von Dicarbon- säuren, z. B. der Bernsteinsäure, die im Leberglyko- gen- und Granulomtest eine hohe Wirkung aufweisen. Im Gegensatz zu manchen in 6a- und 16a-Stellung nicht substituierten Corticosteroiden zeigen die ge nannten Pregnadiene die Nebenwirkung der Reten- tion von Natrium nicht oder nur in untergeordnetem Masse.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der neuen J1.-I-Pregnadiene ist dadurch gekennzeich net, dass man d-I-Pregnene der Formel
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in 1,2-Stellung dehydriert. Die Einführung der 1,2- Doppelbindung in die Ausgangsstoffe kann durch Be handlung mit dehydrierend wirkenden Selenverbin- dungen oder durch Einwirkung von aeroben Kulturen von 1,2-dehydrierenden Mikroorganismen erreicht werden.
Als dehydrierend wirkende Selenverbindungen kommen vor allem Selendioxyd, z. B. in sublimierter Form, oder selenige Säure in Betracht. Die Reaktion kann dabei in einem wässrigen oder nichtwässrigen Lösungsmittel stattfinden. Es können organische Lö sungsmittel verwendet werden, vor allem solche, welche bei der für die Reaktion gewählten Tempe ratur mit der dehydrierend wirkenden Selenverbin- dung nicht oder nur in untergeordnetem Ausmass reagieren.
Als solche Lösungsmittel haben sich be sonders tertiäre Alkohole, wie tert. Butanol und tert. Amylalkohol, z. B. in Gegenwart von Basen, wie tertiären organischen Aminen, z. B. Pyridin und Collidin, bewährt. Die Reaktionsmischung kann man gegebenenfalls unter Druck erwärmen oder am Rück fluss kochen. Nach Ablauf der Reaktion kann das Gemisch vom gebildeten Selen abfiltriert und aus dem Filtrat das Reaktionsprodukt nach bekannten Methoden isoliert werden.
Für die Einführung der 1,2-Doppelbindung auf mikrobiologischem Wege verwendet man z. B. aerobe Kulturen von Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophio- bolus heterostrophus, Ophiobolus Miyabeanus,
Di- dymella lycopersici oder von Corynebacterium sim- plex. Zur Durchführung des mikrobiologischen Ver fahrens kann man die Ausgangsstoffe mit Kulturen der genannten Mikroorganismen unter an sich be kannten aeroben Bedingungen inkubieren. Das Wachstum erfolgt z. B. in Oberflächenkultur oder, technisch vorteilhaft, submers, wobei man schüttelt oder rührt.
Die Kulturen enthalten vorteilhaft assi- milierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das prak tisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschil dert: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sog. Tieftankverfahren bekannt sind.
Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Disper sion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol, zu und inkubiert weiter. Schliesslich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die J1.-l-Pregnadiene in an sich be kannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Über führung in funktionelle Derivate, wie Ester und der gleichen.
Dieselben Umsetzungen lassen sich auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen der genannten Organismen zuerst abtrennt und unter Ausschluss der wachsenden Kulturen verwendet. So kann man z. B. das von entsprechenden aeroben Kulturen der ge nannten Organismen gebildete Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die ge nannten Ausgangsstoffe diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren.
In erhaltenen Verbindungen mit freien Hydroxy- gruppen können diese z. B. mit den eingangs ge nannten Säuren, ihren Halogeniden, Anhydriden und Thiolderivaten sowie Ketenen verestert werden; auch Umesterungsmethoden lassen sich anwenden. Zur Herstellung von wasserlöslichen Salzen können die Halbester in an sich bekannter Weise, z.
B. mit Alkalimetallhydroxyden, -karbonaten, -bikarbonaten, insbesondere mit Natriumbikarbonat, ferner mit or ganischen Basen, wie Äthanolamin, Diäthanolamin, Triäthanolamin, Dibenzyläthyl'endiamin, Ephedrin, oder a-1-Phenyl-2-methyl-amino-propan umgesetzt werden. Der besondere Vorteil dieser Halbester be steht darin, dass sie mit den genannten organischen oder anorganischen Basen verhältnismässig stabile wässrige Lösungen bilden.
In erhaltenen Verbindungen mit veresterten Hy- droxygruppen können diese durch chemische oder enzymatische Hydrolyse, beispielsweise unter Ver wendung saurer oder basischer Mittel, oder durch Umesterung in freie Hydroxygruppen verwandelt werden.
Die 11-Hydroxyverbindungen können in die ent sprechenden I1-Oxo-verbindungen überführt werden, z. B. indem man die üblichen Dehydrierungsmittel, z. B. Chromtrioxyd in Eisessig oder den Chrom- trioxyd-Pyridin-Komplex, verwendet.
Als spezifische Ausgangsstoffe seien genannt die 16a-Methyl-6a-chlor- und 16a-Methyl-6a-fluor- derivate von 17a-Hydroxy-desoxycorticosteron, Cor- tison, Hydrocortison, 9a-Chlor- und 9a-Fluor-hydro- cortison- und -cortison, sowie ihre 11- und 21-Ester, insbesondere ihre 21-Monoester. Die genannten Aus gangsstoffe sind neu; ihre Herstellung ist im Schweizer Patent Nr.<B>376105</B> beschrieben.
Die Temperaturen sind in den nachfolgenden Beispielen in Celsiusgraden angegeben.
<I>Beispiel 1</I> Eine Suspension von 500 mg J4-16a-Methyl-6a- chlor-pregnen-17a,21-diol-3,11,20-trion-21-acetat in 25 cm-' wasserfreiem tert.-Butanol, 150 mg Selen dioxyd und 0,05 cm3 Pyridin wird 70 Stunden in Stickstoffatmosphäre am Rückfluss gekocht. Nach dem Kühlen verdünnt man die Mischung mit 50 cm3 Essigsäureäthylester, filtriert über Celite (Marken produkt) und wäscht das Filter gut mit Essigsäure- äthylester nach.
Die vereinigten Äthylacetatlösungen werden im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand mit Wasser behandelt und dann filtriert. Den getrockneten Rückstand adsorbiert man an eine Säule von 25 g gewaschenem Aluminiumoxyd und eluiert diese mit Benzol Äther und Äther, vereinigt die Fraktionen, dampft sie zur Trockne ein und kristallisiert aus Aceton-Hexan um. Man erhält so 150 mg J1,4-16a-Methyl-6a-chlor-pregnadien-17a,21- diol-3,11,20-trion-21-acetat.
<I>Beispiel 2</I> Man kocht eine Mischung von 500 mg 44-16a Methyl-6a-chlor-pregnen-11,ss,17a,21-triol-3,20-dion- 21-acetat, 25 cm- wasserfreiem tert.-Butanol, 150 mg Selendioxyd und 0,05 cm3 Pyridin 70 Stunden in einer Stickstoffatmosphäre am Rückfluss. Nach dem Kühlen verdünnt man die Reaktionsmischung mit 50 cm3 Essigsäureäthylester und filtriert über Celite ,
wäscht das Filter gut mit Essigsäureäthyl- ester nach und dampft die vereinigten Filtrate im Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand wird mit Wasser behandelt, filtriert, der getrocknete Rück stand an eine Kolonne von 25 g gewaschenem Alu miniumoxyd adsorbiert, und die kristallinen Frak tionen werden mit Benzol-Ather und Äther eluiert. Man vereinigt die Fraktionen,
kristallisiert sie aus Aceton-Hexan um und erhält das 41.4-16a-Methyl- 6a -chlor - pregnadien-l l ss,17a,21-triol-3,20-dion-21- acetat.
<I>Beispiel 3</I> Eine Mischung von 500 mg 44-16a-Methyl-6a- fluor-pregnen- 11ss,17 ,21 -triol-3,20-dion-21-acetat, 25 cm-' wasserfreiem tert.-Butanol, 150 mg Selen dioxyd und 0,05 cm3 Pyridin wird in Stickstoff atmosphäre 70 Stunden am Rückfluss gekocht.
Man kühlt, verdünnt die Mischung mit 50 cm3 Essig- säureäthyl'ester, filtriert über Celite und wäscht den Rückstand gut mit Essigsäureäthylester nach. Das Filtrat und die Waschlösungen werden vereinigt, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet, filtriert und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Man behandelt den Rückstand mit Wasser, filtriert den Niederschlag ab, trocknet ihn und adsorbiert ihn an 25 g gewaschenes Alumi niumoxyd.
Die durch Eluieren mit Benzol-Äther und Äther und Umkristallisieren aus Aceton-Hexan er haltenen Fraktionen ergeben das 41,4-16a-Methyl- 6a -fluor - pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion-21- acetat vom F.
etwa 240a mit Zers., [ ]D = + 71 bis +77a (c = 1% Chloroform), das sich zum di,4-16a- Methyl - 6a - fluor - pregnadien-11 fl,17a,21-triol-3,20- dion hydrolysieren lässt.
F. 229-232,5a. [a]D = + 69,40 (c = 0,39 /a in Dioxan). = 234 mu; E = 16 800. <I>Beispiel 4</I> Eine Mischung von 3 g J4-16a-Methyl-6a-chlor- 9a-fluor-pregnen-l lss,17a,21 triol-3,20-dion-21-acetat, 150 cm3 wasserfreiem tert.-Butanol, 900 mg Selen dioxyd und 0,3 cm3 Pyridin wird in einer Stickstoff atmosphäre 70 Stunden am Rückfluss gekocht,
dann gekühlt und mit Essigsäureäthylester verdünnt. Man filtriert die Mischung über Celite , wäscht den Rück stand mit Essigsäureäthylester nach, vereinigt das Filtrat und die Waschlösungen und dampft unter ver mindertem Druck zur Trockne ein. Den Rückstand behandelt man mit Wasser, filtriert das ausgefallene Produkt ab, adsorbiert es nach dem Trocknen an 150 g gewaschenem Aluminiumoxyd.
Die mit Benzol- Äther und Äther erhaltenen Fraktionen werden ver einigt und nach dem Eindampfen aus Aceton-Hexan kristallisiert, wobei das di#4-16a-Methyl-6a-chlor-9a- fluor - pregnadien - 11ss,17 ,21 - triol - 3,20-dion-21- acetat erhalten wird.
<I>Beispiel 5</I> Man kocht eine Mischung von 1 g 44-16a-Me- thyl - 6 ,9a - difluor - pregnen -1 l/3,17a,21-triol-3,20- dion-21-acetat, 50 cm3 wasserfreiem tert.-Butanol, 300 mg Selendioxyd und 0,1 cm3 Pyridin in einer Stickstoffatmosphäre 70 Stunden am Rückfluss, kühlt,
verdünnt mit Essigsäureäthylester und filtriert über Celite . Das Filter wird gut mit Essigester gewaschen, die Waschlösung mit dem Filtrat ver einigt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird mit Wasser be handelt, der Niederschlag abgetrennt, getrocknet und chromatographiert. Man erhält so das d1.4-16a#-Me- thyl - 6a,9a-difluor-pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,
20- dion-21-acetat. Nach mehrmaligem Umkristallisieren aus Aceton-Hexan schmilzt die analytisch reine Ver bindung schliesslich bei 277-282a.
[a]D = + 71,2- (c = 0,69% in Dioxan). UV-Absorption:
EMI0003.0152
= 16 700. Durch Hydrolyse mit Natriumhydroxyd in Me thanol erhält man die freie 21-Verbindung: F. 260,5-263a.
[a] D = + 68,9- (c = 0,55 % in Dioxan).
EMI0003.0168
a = 16000.
<I>Beispiel 6</I> Man stellt 30 Kulturen von Corynebacterium simpler ATCC 6946 auf einem 0,1% igem Hefe- extrakt in destilliertem Wasser, welcher in Portionen zu 30 cm3 je in einem Erlenmeyer-Kölbchen von 125 cm3 aufgeteilt wird, her,
indem man die Medien mit einer 24 Stunden alten Kultur auf dem gleichen Medium inokuliert und 24 Stunden bei 28" inkubiert.
Zu jeder dieser Kulturen gibt man 1 cm3 einer äthanolischen Lösung von 44-16a-Methyl-6a-chlor- pregnen - I lss,17a,21 - triol - 3,20-dion-21-acetat, die 10 mg des Steroids enthält und kurz vor Gebrauch in destilliertem Äthanol und ohne Erhitzen hergestellt wurde. Man inkubiert weitere 48 Stunden unter Rühren und bei einer gleichmässigen Temperatur von 28 . Bei andern Versuchen wurde die Inkuba tionszeit mit dem gleichen Resultat auf 72 Stunden ausgedehnt.
Der Flascheninhalt wird dann in 3 Portionen auf geteilt, jede dieser Portionen 5mal mit 500 cm3 Methylendichlorid ausgezogen, die Auszüge vereinigt, mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natrium sulfat getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck und bei niederer Temperatur zur Trockne ein gedampft. Das so erhaltene Produkt enthält dag z11,4- 16a - Methyl - 6a-chlor-pregnadien-1 lss,17a,21- triol-3,20-dion.
Dieses kann wie folgt zum 21-Acetat verestert werden: Das rohe Produkt wird in 3 cm3 Pyridin gelöst, mit 3 cm3 Essigsäureanhydrid versetzt, 20 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, in Wasser ge gossen und mit Methylendichlorid ausgezogen. Der Extrakt wird mit verdünnter Salzsäure mit 5 1/o iger Kaliumcarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft.
Man adsorbiert den Rück stand an eine Kolonne von 15 g gewaschenem Alu miniumoxyd, eluiert mit Benzol-Äther <B>(80:</B> 20), wo bei man 70 mg Al.4-16a-Methyl-6a-chlor-pregnadien- 11/3,17a,21-triol-3,20-dion-21-acetat erhält.
Reinigt man das mikrobiologisch erhaltene rohe Produkt direkt durch Adsorption an 15 g Silicium oxyd und Eluieren der Kolonne mit Chloroform- Äther, erhält man das 41,4-16a-Methyl-6a-chlor- pregnadien-11 ss,17a,21-triol-3,20-dion.
In analoger Weise lassen sich die in den Bei spielen 1, 3, 4, 5 und 6 verwendeten 44-Pregnen- verbindungen in 1,2-Stellung dehydrieren.
In gleicher Weise, jedoch unter Verwendung von Kulturen von Didymella lycopersici, können die obengenannten Ausgangsmaterialien in der 1,2-Stel- lung dehydriert werden.
Die so erhaltenen Steroide können wie folgt in 21-Stellung verestert werden: a) 4,09 g 1-Dehydro-6a-chlor-l6a-methyl-hydro- cortison werden in 10 em3 Pyridin gelöst und nach Abkühlen auf 0 unter Stickstoff im Verlauf von 30 Minuten mit einer Auflösung von 1,2 g Cyclo- propylcarbonsäurechlorid in 5 cm3 Pyridin versetzt. Man lässt über Nacht bei Raumtemperatur unter Stickstoff stehen und giesst die Reaktionslösung auf ein Gemisch von fein zerkleinertem Eis und Salz säure.
Das Reaktionsprodukt wird in Chloroform- Tetrahydrofuran - Mischung (3 : 2) aufgenommen. Man wäscht den Extrakt mit Wasser, verdünnter Salzsäure, Natriumbikarbonatlösung und mehrmals mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat, filtriert und dampft ein.
Der erhaltene 1-Dehydro-6a-chlor-16a- methyl - hydrocortison - 21- cyclopropyl-carbonsäure- ester wird aus Aceton-Methanol umkristallisiert; das Produkt gibt mit Blautetrazol und doppeltnormaler Natronlauge in der Kälte keine unmittelbare Blau färbung.
In analoger Weise erhält man durch Umsetzen. von 1 - Dehydro - 6a - fluor-16a-methyl-hydrocortison und Cyclopropyl-carbonsäurechlorid in Pyridin den 1- Dehydro - 6a - fluor-16cc-methyl-hydrocortison-21- cyclopropylcarbonsäureester, der mit Blautetrazol und doppeltnormaler Natronlauge in der Kälte keine unmittelbare Blaufärbung gibt.
0,56 cm3 Trimethylessigsäurechlorid werden unter Rühren in Stickstoffatmosphäre in 10 cm3 reinem, trockenem Pyridin bei 0 gelöst. Zur erhaltenen klaren, farblosen Lösung lässt man innerhalb 5 Mi nuten eine Auflösung von 0,50 g 6a-Fluor-16a-me- thyl-prednisolon in 5 cm3 reinem, trockenem Pyridin unter stetem Rühren bei 0 in Stickstoffatmosphäre zufliessen.
Die Reaktionslösung wird 8 Stunden bei 0 unter Stickstoff stehengelassen; nach dieser Reak tionsdauer lässt sich im Reaktionsgemisch mittels Dünnschichtchromatographie nach E. Stahl kein freies 6a-Fluor-16a-methyl-prednisolon mehr nachweisen (Lösungsmittelsystem Benzol-Essigester 3 : 7; Indika tor 50o/oige Schwefelsäure). Die Reaktionslösung wird nun auf Eiswasser ausgetragen und mit ver dünnter Salzsäure angesäuert. Man extrahiert die Reaktionsprodukte mit Essigester und wäscht den Essigester-Extrakt der Reihe nach mit verdünnter Salzsäure, Wasser, verdünnter Soda und Wasser, trocknet ihn über Natriumsulfat, filtriert und dampft ihn ein.
Der weisse, fein kristalline Rückstand (0,62 g) wird aus Äther-Methylenchlorid umkristallisiert und liefert 0,48 g reines 6a-Fluor-16a-methyl-prednisolon- 21-trimethylacetat, das mit Blautetrazol und doppelt normaler Natronlauge in der Kälte keine unmittel bare Blaufärbung gibt.
Smp. 198-200 mit Sintern ab etwa 190 . ", (Feinsprit) = 243-244 in 1r (e <I>-</I> 15 800).
In analoger Weise gewinnt man durch Umsetzen von 6a,9a-Difluor-16a-methyl-prednisolon und Tri- methylessigsäurechlorid in Pyridin bei 0 das 6a,9a- Difluor -16a - methyl - prednisolon-21-trimethylacetat mit einer Ausbeute von 92-9311/9. Das Produkt zeigt Dimorphie; die eine Modifikation schmilzt bei 229 bis 230 mit Sintern ab etwa 220 , die andere schmilzt bei 254-255 unter Sintern von 251 an.
[a]29' == + 72,7 1" (c = 1,034 /o in Dioxan). 2.",." (Feinsprit) = 238-239 m( (e =<B>16600</B> bis <B>16900).</B>
b) In analoger Weise gewinnt man durch Um setzen von 1- Dehydro - 6a-fluor-16a-methyl-hydro- cortison und Trimethyl-acetylchlorid in Pyridin 1-De hydro-6a-fluor-16a-methyl-hydrocortison-21-trimethyl- acetat, das mit Blautetrazol und doppeltnormaler Natronlauge in der Kälte keine unmittelbare Blau färbung gibt.
c) 4,10 g 1-Dehydro-6a,9a-difluor-16a-methyl- hydrocortison werden in 50 cm3 Pyridin mit 2,0 g Bernsteinsäureanhydrid auf dem siedenden Wasser bad während 30 Minuten unter Stickstoff erwärmt. Nach dem Abkühlen trägt man in Eiswasser aus, säuert mit Eisessig an, nutscht das ausgefällte Reak tionsprodukt nach Stehenlassen über Nacht ab, wäscht mit Wasser aus und trocknet. Man erhält das 1-Dehydro - 6a,9a -difluor-16a-methyl-hydrocortison- 21-hemisuccinat.
Nach derselben Arbeitsweise gewinnt man durch Umsetzen von Bernsteinsäureanhydrid mit 1-Dehydro- 6a-chlor-9a-fluor-16a-methyl-hydrocortison das 1-De- hydro - 6a - chlor-9a-fluor-16a-methyl-hydrocortison- 21-hemisuccinat.
Process for the preparation of new d'4-pregnadienes The present invention relates to a process for the preparation of new J1.-1-pregnadienes of the formula
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in which R is a free or esterified hydroxyl group, Y is two hydrogen atoms, an oxo group or hydrogen and a free or esterified hydroxyl group, X1 is hydrogen, chlorine or fluorine and X2 is chlorine or fluorine.
In the esters, the acid radicals can be those of saturated or unsaturated aliphatic or cycloaliphatic, aromatic or heterocyclic carboxylic acids, for example formic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, valeric acids, such as n-valeric acid and trimethyl acetic acid Caproic acids, such as ß-trimethylpropionic acid,
the saturated or unsaturated oenanthic, caprylic, pelargonic, capric, undecylic acids, lauric, myristic, palmitic or stearic acids, e.g.
B. Undecylenic acid and oleic acid, cyclopentyl-, cyclohexyl- or phenyl-acetic acids or -propionic acids, benzoic acid, phenoxy-alkanoic acids such as phenoxy-acetic acid, p-chloro-phenoxy-acetic acid, 2,4-dichloro-phenoxy-acetic acid, 4 -tert-butyl-phenoxy-acetic acid,
3-phenoxy-propionic acid and 4-phenoxy-butyric acid, of furan-2-carboxylic acid, 5-tert-butyl-furan-2-carboxylic acid, 5-bromo furan-2-carboxylic acid, of nicotinic acids, of ß-ketocarboxylic acids , e.g. B.
of acetoacetic, propionylessib, butyrylacetic and caproyl acetic acid, of amino acids such as diethylaminoacetic acid, aspartic acid, etc. Instead of carboxylic acid residues, those of sulfonic acids, and also of phosphoric, sulfuric or hydrohalic acids, can be present.
Esters which have a water-solubilizing group, such as a carboxyl or amino group, are of particular importance since they can be used for the preparation of aqueous solutions. These are mainly the half-esters, e.g. B. of dicarboxylic acids, e.g.
B. from the oxal, amber, male, glutar, dimethylglutar, pimeline, acetone dicarbon, acetylenedicarbon, phthal, tetrahydrophthal, hexahydrophthal, endomethylene tetrahydrophthal, endomethylene hexahydrophthal, Endoxy-hexahydrophthalic, endoxy-tetrahydrophthalic acid, camphoric acid,
Cyclopropane, cyclobutanedicarboxylic acid, diglycolic acid, ethylene bisglycolic acid, polyethylene bisglycolic acids, furan, dihydrofuran, tetrahydrofuran, tetrahydrofuran dicarboxylic acids, quinoline and cinchomeronic acid and thioglycolic acid esters.
The process products are characterized by a high biological effect. Particular mention should be made of the 6a-chloro and 6a-fluoro derivatives of 16a-methyl-prednisolone, 16a-methyl-prednisone, 16a-methyl-9a-fluoro- and 16a-methyl-9a-chloro-prednisolone and -prednisone, and the corresponding 21-esters, such as 21-trimethylacetate, 21-cyclopentylpropionate,
21-phenylpropionates and the 21-esters of dicarboxylic acids, e.g. B. succinic acid, which has a high effect in liver glycogen and granuloma tests. In contrast to some corticosteroids which are unsubstituted in the 6a and 16a positions, the aforementioned pregnadienes do not show the side effect of retention of sodium, or only to a minor extent.
The process according to the invention for the preparation of the new J1.-I-pregnadienes is characterized in that d-I-pregnenes of the formula
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dehydrated in the 1,2-position. The 1,2-double bond can be introduced into the starting materials by treatment with dehydrating selenium compounds or by the action of aerobic cultures of 1,2-dehydrating microorganisms.
As dehydrating selenium compounds are mainly selenium dioxide, z. B. in sublimed form, or selenious acid into consideration. The reaction can take place in an aqueous or non-aqueous solvent. Organic solvents can be used, especially those which do not react or react only to a minor extent with the dehydrogenating selenium compound at the temperature chosen for the reaction.
Such solvents have been particularly tertiary alcohols, such as tert. Butanol and tert. Amyl alcohol, e.g. B. in the presence of bases such as tertiary organic amines, e.g. B. pyridine and collidine, proven. The reaction mixture can optionally be heated under pressure or refluxed. After the reaction has ended, the selenium formed can be filtered off from the mixture and the reaction product can be isolated from the filtrate by known methods.
For the introduction of the 1,2 double bond in a microbiological way one uses z. B. aerobic cultures of Fusarium solani, Fusarium caucasicum, Calonectria decora, Alternaria passiflorae, Ophiobolus heterostrophus, Ophiobolus Miyabeanus,
Di- dymella lycopersici or from Corynebacterium simplex. To carry out the microbiological process, the starting materials can be incubated with cultures of the microorganisms mentioned under aerobic conditions which are known per se. The growth occurs z. B. in surface culture or, technically advantageous, submerged, shaking or stirring.
The cultures advantageously contain assimilable carbon, in particular carbohydrates, and possibly growth substances, for example corn steep liquor or beer wort, and inorganic salts. Natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions can therefore be used. The practically simplest process is described below: The organisms are grown in equipment and under conditions similar to those known as deep-tank processes in antibiotic production.
After the cultures have developed, the starting materials mentioned are added in a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and the incubation continues. Finally, the mycelium is separated, the filtrate and / or the mycelial mass is extracted and the J1.-l-pregnadienes are isolated from the extract in a manner known per se, e.g. B. by segregation processes, adsorption, chromatography, crystallization, over leadership in functional derivatives such as esters and the like.
The same reactions can also be carried out by first separating the active enzymes from corresponding aerobic cultures of the organisms mentioned and using them to the exclusion of the growing cultures. So you can z. B. separate the mycelium formed by the corresponding aerobic cultures of the organisms mentioned, suspend in water or buffer solutions, add the starting materials mentioned to these slurries and incubate.
In compounds obtained with free hydroxyl groups, these can, for. B. be esterified with the acids mentioned above, their halides, anhydrides and thiol derivatives and ketenes; Transesterification methods can also be used. For the preparation of water-soluble salts, the half-esters can be used in a manner known per se, e.g.
B. with alkali metal hydroxides, carbonates, bicarbonates, in particular with sodium bicarbonate, also with or ganic bases such as ethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, dibenzylethylenediamine, ephedrine, or a-1-phenyl-2-methyl-aminopropane are implemented . The particular advantage of these half-esters is that they form relatively stable aqueous solutions with the organic or inorganic bases mentioned.
In the compounds obtained with esterified hydroxy groups, these can be converted into free hydroxy groups by chemical or enzymatic hydrolysis, for example using acidic or basic agents, or by transesterification.
The 11-hydroxy compounds can be converted into the corresponding I1-oxo compounds, e.g. B. by using the usual dehydrating agents, e.g. B. chromium trioxide in glacial acetic acid or the chromium trioxide-pyridine complex is used.
The 16a-methyl-6a-chloro and 16a-methyl-6a-fluoro derivatives of 17a-hydroxy-deoxycorticosterone, cortisone, hydrocortisone, 9a-chloro- and 9a-fluoro-hydrocortisone- and cortisone, as well as their 11 and 21 esters, especially their 21 monoesters. The starting materials mentioned are new; their production is described in Swiss patent no. 376105 </B>.
In the examples below, the temperatures are given in degrees Celsius.
<I> Example 1 </I> A suspension of 500 mg J4-16a-methyl-6a-chloro-pregnen-17a, 21-diol-3,11,20-trione-21-acetate in 25 cm- 'anhydrous tert .-Butanol, 150 mg selenium dioxide and 0.05 cm3 pyridine are refluxed for 70 hours in a nitrogen atmosphere. After cooling, the mixture is diluted with 50 cm3 of ethyl acetate, filtered through Celite (branded product) and the filter is rewashed well with ethyl acetate.
The combined ethyl acetate solutions are evaporated to dryness in vacuo, the residue is treated with water and then filtered. The dried residue is adsorbed on a column of 25 g of washed aluminum oxide and eluted with benzene, ether and ether, the fractions are combined, evaporated to dryness and recrystallized from acetone-hexane. 150 mg of J1,4-16a-methyl-6a-chloro-pregnadiene-17a, 21-diol-3,11,20-trione-21-acetate are obtained in this way.
<I> Example 2 </I> A mixture of 500 mg 44-16a methyl-6a-chloro-pregnen-11, ss, 17a, 21-triol-3,20-dione-21-acetate, 25 cm- anhydrous tert-butanol, 150 mg selenium dioxide and 0.05 cm3 pyridine under reflux for 70 hours in a nitrogen atmosphere. After cooling, the reaction mixture is diluted with 50 cm3 of ethyl acetate and filtered through Celite,
the filter was washed well with ethyl acetate and the combined filtrates were evaporated to dryness in vacuo. The residue is treated with water, filtered, the dried residue was adsorbed on a column of 25 g of washed aluminum oxide, and the crystalline fractions are eluted with benzene ether and ether. The factions are united
recrystallizes it from acetone-hexane and receives 41.4-16a-methyl-6a-chloro-pregnadiene-l lss, 17a, 21-triol-3,20-dione-21-acetate.
<I> Example 3 </I> A mixture of 500 mg 44-16a-methyl-6a-fluoro-pregnen- 11ss, 17, 21 -triol-3,20-dione-21-acetate, 25 cm- 'anhydrous tert .-Butanol, 150 mg selenium dioxide and 0.05 cm3 pyridine are refluxed for 70 hours in a nitrogen atmosphere.
It is cooled, the mixture is diluted with 50 cm3 of ethyl acetate, filtered through Celite and the residue is washed thoroughly with ethyl acetate. The filtrate and wash solutions are combined, washed with water, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is treated with water, the precipitate is filtered off, dried and adsorbed onto 25 g of washed aluminum oxide.
The fractions obtained by eluting with benzene-ether and ether and recrystallization from acetone-hexane give the 41,4-16a-methyl-6a-fluorine-pregnadiene-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione-21- acetate from F.
about 240a with dec., [] D = + 71 to + 77a (c = 1% chloroform), which leads to di, 4-16a-methyl-6a-fluoro-pregnadien-11 fl, 17a, 21-triol-3 , 20-dione can be hydrolyzed.
F. 229-232.5a. [a] D = + 69.40 (c = 0.39 / a in dioxane). = 234 mu; E = 16 800. <I> Example 4 </I> A mixture of 3 g of J4-16a-methyl-6a-chloro-9a-fluoro-pregnen-lss, 17a, 21 triol-3,20-dione-21 acetate, 150 cm3 of anhydrous tert-butanol, 900 mg of selenium dioxide and 0.3 cm3 of pyridine are refluxed for 70 hours in a nitrogen atmosphere,
then cooled and diluted with ethyl acetate. The mixture is filtered through Celite, the residue is washed with ethyl acetate, the filtrate and the washing solutions are combined and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is treated with water, the precipitated product is filtered off and, after drying, it is adsorbed on 150 g of washed aluminum oxide.
The fractions obtained with benzene ether and ether are combined and, after evaporation, crystallized from acetone-hexane, the di # 4-16a-methyl-6a-chloro-9a-fluoro-pregnadiene - 11ss, 17, 21 - triol - 3,20-dione-21-acetate is obtained.
<I> Example 5 </I> A mixture of 1 g of 44-16a-methyl-6, 9a-difluoro-pregnen -1 l / 3.17a, 21-triol-3,20-dione-21 is boiled acetate, 50 cm3 of anhydrous tert-butanol, 300 mg of selenium dioxide and 0.1 cm3 of pyridine in a nitrogen atmosphere under reflux for 70 hours, cools,
diluted with ethyl acetate and filtered through Celite. The filter is washed well with ethyl acetate, the washing solution is combined with the filtrate and evaporated to dryness under reduced pressure. The residue is treated with water, the precipitate is separated off, dried and chromatographed. The d1.4-16a # -methyl - 6a, 9a-difluoro-pregnadiene-11ss, 17a, 21-triol-3,
20-dione-21-acetate. After repeated recrystallization from acetone-hexane, the analytically pure compound finally melts at 277-282a.
[a] D = + 71.2- (c = 0.69% in dioxane). UV absorption:
EMI0003.0152
= 16,700. The free 21-compound is obtained by hydrolysis with sodium hydroxide in methanol: F. 260.5-263a.
[a] D = + 68.9- (c = 0.55% in dioxane).
EMI0003.0168
a = 16,000.
<I> Example 6 </I> 30 cultures of Corynebacterium simpler ATCC 6946 are placed on a 0.1% yeast extract in distilled water, which is divided into portions of 30 cm3 each in a small Erlenmeyer flask of 125 cm3, here,
by inoculating the media with a 24 hour old culture on the same medium and incubating at 28 "for 24 hours.
To each of these cultures, 1 cm3 of an ethanolic solution of 44-16a-methyl-6a-chlorine-pregnen - I lss, 17a, 21 - triol - 3,20-dione-21-acetate, which contains 10 mg of the steroid and shortly before use in distilled ethanol and without heating. It is incubated for a further 48 hours with stirring and at a constant temperature of 28. In other experiments the incubation time was extended to 72 hours with the same result.
The contents of the bottle are then divided into 3 portions, each of these portions extracted 5 times with 500 cm3 of methylene dichloride, the extracts combined, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness under reduced pressure and at low temperature. The product obtained in this way contains dag z11,4-16a-methyl-6a-chloro-pregnadiene-1 lss, 17a, 21-triol-3,20-dione.
This can be esterified to 21-acetate as follows: The crude product is dissolved in 3 cm3 of pyridine, 3 cm3 of acetic anhydride are added, it is left to stand for 20 hours at room temperature, poured into water and extracted with methylene dichloride. The extract is washed with dilute hydrochloric acid with 5 1 / o strength potassium carbonate solution and water, dried over anhydrous sodium sulfate, filtered and evaporated to dryness.
The residue is adsorbed on a column of 15 g of washed aluminum oxide, eluted with benzene-ether <B> (80: </B> 20), where 70 mg of Al.4-16a-methyl-6a-chlorine- pregnadiene-11 / 3,17a, 21-triol-3,20-dione-21-acetate.
If the microbiologically obtained crude product is purified directly by adsorption on 15 g of silicon oxide and eluting the column with chloroform ether, 41,4-16a-methyl-6a-chloropregnadiene-11ss, 17a, 21-triol- 3,20-dione.
The 44-pregnene compounds used in Examples 1, 3, 4, 5 and 6 in the 1,2-position can be dehydrogenated in an analogous manner.
In the same way, but using cultures of Didymella lycopersici, the abovementioned starting materials can be dehydrated in the 1,2-position.
The steroids obtained in this way can be esterified in the 21-position as follows: a) 4.09 g of 1-dehydro-6a-chloro-16a-methyl-hydrocortisone are dissolved in 10 cubic meters of pyridine and after cooling to 0 under nitrogen in the course A solution of 1.2 g of cyclopropylcarboxylic acid chloride in 5 cm3 of pyridine is added over a period of 30 minutes. The mixture is left to stand under nitrogen at room temperature overnight and the reaction solution is poured into a mixture of finely crushed ice and hydrochloric acid.
The reaction product is taken up in a chloroform-tetrahydrofuran mixture (3: 2). The extract is washed with water, dilute hydrochloric acid, sodium bicarbonate solution and several times with water, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated.
The 1-dehydro-6a-chloro-16a-methyl-hydrocortisone-21-cyclopropyl-carboxylic acid ester obtained is recrystallized from acetone-methanol; With blue tetrazole and double normal sodium hydroxide solution, the product does not immediately turn blue in the cold.
In an analogous way one obtains by converting. from 1 - dehydro - 6a - fluoro-16a-methyl-hydrocortisone and cyclopropyl-carboxylic acid chloride in pyridine to 1-dehydro-6a - fluoro-16cc-methyl-hydrocortisone-21-cyclopropyl carboxylic acid ester, which with blue tetrazole and double normal sodium hydroxide solution is not immediate in the cold Blue color there.
0.56 cm3 of trimethyl acetic acid chloride are dissolved in 10 cm3 of pure, dry pyridine at 0 while stirring in a nitrogen atmosphere. A solution of 0.50 g of 6a-fluoro-16a-methyl-prednisolone in 5 cm3 of pure, dry pyridine is allowed to flow into the clear, colorless solution obtained within 5 minutes, with constant stirring at 0 in a nitrogen atmosphere.
The reaction solution is left to stand for 8 hours at 0 under nitrogen; After this reaction time, no more free 6a-fluoro-16a-methyl-prednisolone can be detected in the reaction mixture by thin-layer chromatography according to E. Stahl (solvent system benzene-ethyl acetate 3: 7; indicator 50% sulfuric acid). The reaction solution is then poured onto ice water and acidified with dilute hydrochloric acid. The reaction products are extracted with ethyl acetate and the ethyl acetate extract is washed in sequence with dilute hydrochloric acid, water, dilute soda and water, dried over sodium sulfate, filtered and evaporated.
The white, finely crystalline residue (0.62 g) is recrystallized from ether methylene chloride and yields 0.48 g of pure 6a-fluoro-16a-methyl-prednisolone-21-trimethylacetate, which cannot be mixed with blue tetrazole and double normal sodium hydroxide solution in the cold gives an immediate blue color.
Mp. 198-200 with sintering from around 190. ", (Fine liquor) = 243-244 in 1r (e <I> - </I> 15 800).
By reacting 6a, 9a-difluoro-16a-methyl-prednisolone and trimethylacetic acid chloride in pyridine at 0, the 6a, 9a-difluoro-16a-methyl-prednisolone-21-trimethylacetate is obtained in an analogous manner with a yield of 92-9311 / 9. The product shows dimorphism; one modification melts at 229 to 230 with sintering from around 220, the other melts at 254-255 with sintering from 251.
[a] 29 '== + 72.7 1 "(c = 1.034 / o in dioxane). 2.",. "(fine spirit) = 238-239 m ((e = <B> 16600 </B> to <B> 16900). </B>
b) In an analogous manner, 1-De hydro-6a-fluoro-16a-methyl-hydrocortisone-21-trimethyl is obtained by putting 1-dehydro-6a-fluoro-16a-methyl-hydrocortisone and trimethyl-acetyl chloride in pyridine - acetate, which with blue tetrazole and double normal sodium hydroxide solution does not immediately turn blue in the cold.
c) 4.10 g of 1-dehydro-6a, 9a-difluoro-16a-methyl-hydrocortisone are heated in 50 cm3 of pyridine with 2.0 g of succinic anhydride on a boiling water bath for 30 minutes under nitrogen. After cooling, it is poured into ice water, acidified with glacial acetic acid, and the precipitated reaction product is filtered off with suction after leaving to stand overnight, washed with water and dried. The 1-dehydro-6a, 9a-difluoro-16a-methyl-hydrocortisone-21-hemisuccinate is obtained.
By reacting succinic anhydride with 1-dehydro-6a-chloro-9a-fluoro-16a-methyl-hydrocortisone, the 1-dehydro-6a-chloro-9a-fluoro-16a-methyl-hydrocortisone-21- is obtained in the same way. hemisuccinate.