Verfahren zur Herstellung von Peptiden
Durch die Veröffentlichung von J. C. Sheehan und G. P. Hess [J. Amer. chem. Soc. 77, 1067-68 (1955)] hat Dicyclohexylcarbodiimid als mildes Kon
RCOOH + NHzR'+ C6HiiN=C=N-C. Hu
Schon heute gehört diese bequeme Methode der Peptid-Verknüpfung zu den gebräuchlichsten [Th.
Wieland und B. Heinke, Peptid-Synthesen III, Angew.
Chem. 69, 368 (1957)]. Vor kurzem ist sogar die Synthese des Lactam-Ringes mit Hilfe von Dicyclohexylcarbodiimid zu einem vollsynthetischen Penicillin in 10"/aiger Ausbeute gelungen [J. C.
Sheehan und K. R. Hencry-Logan, J. Amer. chem.
Soc. 79, 1262 (1957)].
Der bei der Peptidsynthese durch Hydratisierung entstehende Dicyclohexylharnstoff ist in den gebräuchlichen Lösungsmitteln sehr schwer löslich und kann, wenn die gebildeten Peptide in Lösung bleiben, leicht von diesen abgetrennt werden. Jedoch in vielen Fällen (z. B. bei der Synthese von Peptiden mit grossem Molekulargewicht) besitzen das Peptid und densationsmittel für Peptidsynthesen grosses Interesse erlangt : ? RCONHR'+ C6HllNHCONHCsHll der Dicyclohexylharnstoff ähnliche Löslichkeitseigen- schaften, so dass sich das Peptid nur sehr schwer iso lieren lässt. J C. Sheehan und J. J. Hlavka [J. org.
Chemistry 21, 439-441 (1956)] schlugen deshalb vor, in solchen Fällen Carbodiimide mit einer ter tiären oder quaternären Aminogruppe im Substituen ten zu verwenden. Die daraus durch Hydratisierung entstehenden Harnstoffe sind in verdünnter Säure oder Wasser löslich und lassen sich daher von den in Wasser schwerlöslichen Peptiden leicht abtrennen.
Man kann mit diesen basischen Carbodiimiden
Peptide in einer Ausbeute von 80 bis 950/o der
Theorie herstellen.
Die von J C. Sheehan und J. J. Hiavka vorge schlagenen basischen Carbodiimide, wie z. B.
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[2- (N-Morpholyl)-äthyl]-cyclohexyl-carbociiimid, enthalten sämtlich neben dem Rest mit einer tertiären bzw. quatemären Aminogruppe am Atom (1) einen sekundären Kohlenstoffrest am Atom (3), sind daher nur wenig lagerbeständig und polymerisierten bereits teilweise, wenn man grössere Mengen, das heisst 0, 5 Mol und mehr, unter Olpumpenvakuum destil- liert.
Durch die Arbeiten von E. Schmidt und Mitarbeiter [Chem. Ber. 74, 1285 bis 1296 (1941) und A. 560, 222 bis 231 (1948)] war bekannt, dass man die Lagerbeständigkeit von unstabilen Carbodiimiden stark erhöhen kann, wenn man an einem der Stickstoffatome einen primären oder sekundären Kohlenstoffrest durch einen tertiären Kohlenstoffrest ersetzt ; so ist z. B. N-n-Propyl-N'-tert.-butyl-carbodi- imid bedeutend beständiger als N-n-Propyl-N'-iso- propyl-carbodiimid. Anderseits ist aber auch bekannt, dass die Reaktionsfähigkeit von Carbodiimiden mit steigender Stabilität abnimmt. (F. Moosmüller, Universität München, Dissertation 1953, S. 35).
Daher war anzunehmen, dass N, N'-disubstituierte Carbodiimide mit einer tertiären oder quater nären Aminogruppe in einem Substituenten und einer tert. Alkylgruppe als zweite Substituenten zwar lagerbeständig sind, aber wegen zu geringer Reaktionsfähigkeit für die Knüpfung von Peptidbindungen nicht oder wenig geeignet sind.
¯berraschenderweise wurde nun gefunden, dass Carbodiimide der Formel
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sich sehr gut als Reagenz bei der Herstellung von Peptidbindungen verwenden lassen.
In dieser Formel bedeuten R1, R2, R3 und R4 Alkyl-, Cycloalkyl-, Aralkyl-oder Arylgruppen, wobei mindestens einer dieser vier Reste durch eine oder mehrere tertiäre und/oder quartäre Aminogruppen substituiert ist, so dass R1, R2, R3 und 4 beispielsweise bedeuten können : 2-Dimethylamino-äthyl-,
3-Dimethylamino-propyl-, 3-Diäthylamino-propyl-,
3-DiÏthylamino-pentyl-(4)-,
4-Dimethylamino-cyclohexyl-,
4-Dimethylamino-phenyl-, fl- [(N'-Methyl)-N-piperazinyl]-Ïthyl-, ¯-(N-Morpholyl)-Ïthylbzw. die sich hiervon ableitenden Reste mit quartären Aminogruppen.
Die folgenden Carbodiimide haben sich bei der Knüpfung von Peptidbindungen bewährt :
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Mit Hflfe dieser Carbodiimide lassen sich Peptide in der bekannten Weise darstellen und von den gebildeten Harnstoffen abtrennen.
Beispiel 1
3, 1 g Sarkosinäthylester-hydrochlorid werden in 50 cm3 Methylenchlorid suspendiert, dann bei 0¯C 2 g Triäthylamin zugegeben, 3 Minuten bei 0¯ C geschüttelt, dann abgesaugt, mit Methylenchlorid nachgewaschen, das Filtrat mit der Suspension von 4,2gCBO-Glycinin400cm3Methylenchlorid vereinigt und dann 3, 7 g des basischen Carbodiimids : (3-Dimethylamino-propyl)-tert.-butyl-carbodiimid zugegeben und anschlie13end die Mischung unter gele gentlichem Umschüttetn 24 Stunden tei Raumtempe- ratur stehengelassen. Dann wurde die klare Losung mit In HC1, Bicarbonat-Lösung und Wasser gewaschen, ber Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum völlig eingedampft und getrocknet.
Ausbeute : , 5, 0 g (81% der Theorie), CBO-Glycyl-sarkosinÏthylester, eines schwach gelben Öles, dessen Zusammensetzung durch Papierchromatographie gesichert wurde.
Beispiel 2
26, 0 g L-Leucinmethylester-hydrochlorid wurden -in 550 cm3 Methylenchlorid suspendiert, 14, 1 g Tri athylamin zugegeben, 3 Minuten bei 0 C geschüttelt, abgesaugt, das Filtrat mit der Lösung von 43, 4 g CBO-Glycyl-sarkosin vereinigt, dann 35, 9 g N- [3-Di äthylamino-pentyl-(4)]-N'-tert.-butylcarbodiimid zugegeb, en, 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet.
Ausbeute : 56, 9 g (98e/v der Theorie) CBO- Glycyl-sarkosyl-L-leucinmethylester ; ein schwach gelbes, halbfestes Öl. Die Zusammensetzung wurde papierchromatographisch gesichert.
Beispiel 3
2, 4 g L-Leucinmethylester-hydrochlorid wurden in 50 cm3 Methylenchlorid suspendiert, mit 1, 3 g TriÏthylamin versetzt, 3 Minuten geschüttelt, abgesaugt, das Filtrat mit der Lösung von 4, 0 g CBO Glycyl-sarkosin in 100 cm3 Methylenchlorid vereinigt, dann 2, 4 g (3-Dimethylamino-propyl)-tert.butyl-carbodiimid zugegeben, 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet.
Ausbeute : 3, 8 g CBO-Glycyl-sarkosyl-L-leucin- methylester (718/o der Theorie), ein festes tjl.
Beispiel 4
52 g Sarkosinäthylester-hydrochlorid wurden in 800 cm3 CH2C12 suspendiert, 33, 6 g Triäthylamin zugegeben, 3 Minuten bei 09 C geschüttelt, dann abgesaugt, mit CH2C12 gewaschen, das Filtrat mit der Suspension von 70, 6 g CBO-Glycin in 1680 cm3 CH2C12 vereinigt, dann 71, 5 g 2- [ (N-Morpholyl)- äthyl]-(tert.-butyl)-carbodiimid zugegeben, die Mi- schung 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, dann, wie im Beispiel 1 beschrieben, aufgearbeitet.
Ausbeute : 103 g (99 /a der Theorie) CBO-Glycylsarkosinäthylester als festes O1.
Process for the production of peptides
Through the publication by J. C. Sheehan and G. P. Hess [J. Amer. chem. Soc. 77, 1067-68 (1955)] has dicyclohexylcarbodiimide as a mild con
RCOOH + NHzR '+ C6HiiN = C = N-C. Hu
This convenient method of peptide linking is already one of the most common [Th.
Wieland and B. Heinke, Peptide Syntheses III, Angew.
Chem. 69, 368 (1957)]. Recently, even the synthesis of the lactam ring with the aid of dicyclohexylcarbodiimide to a fully synthetic penicillin in a yield of 10% [J.C.
Sheehan and K. R. Hencry-Logan, J. Amer. chem.
Soc. 79, 1262 (1957)].
The dicyclohexylurea formed by hydration during peptide synthesis is very sparingly soluble in common solvents and can easily be separated from them if the peptides formed remain in solution. However, in many cases (e.g. in the synthesis of peptides with a large molecular weight) the peptide and densifying agent for peptide syntheses have gained great interest:? RCONHR '+ C6HllNHCONHCsHll the dicyclohexylurea similar solubility properties, so that the peptide is very difficult to isolate. J C. Sheehan and J. J. Hlavka [J. org.
Chemistry 21, 439-441 (1956)] therefore suggested using carbodiimides with a tertiary or quaternary amino group in the substituent in such cases. The ureas resulting from hydration are soluble in dilute acid or water and can therefore be easily separated from the peptides which are sparingly soluble in water.
You can use these basic carbodiimides
Peptides in a yield of 80 to 950 / o
Make theory.
The proposed by J C. Sheehan and J. J. Hiavka basic carbodiimides such. B.
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[2- (N-Morpholyl) -äthyl] -cyclohexyl-carbociiimid, all contain in addition to the residue with a tertiary or quaternary amino group on atom (1) a secondary carbon residue on atom (3), are therefore only slightly stable in storage and already polymerized partially, if larger amounts, that is, 0.5 mol and more, are distilled under an oil pump vacuum.
Through the work of E. Schmidt and coworkers [Chem. Ber. 74, 1285 to 1296 (1941) and A. 560, 222 to 231 (1948)] it was known that the shelf life of unstable carbodiimides can be greatly increased if a primary or secondary carbon radical on one of the nitrogen atoms is replaced by a tertiary carbon radical ; so is z. B. N-n-propyl-N'-tert-butyl-carbodiimide is significantly more stable than N-n-propyl-N'-isopropyl-carbodiimide. On the other hand, it is also known that the reactivity of carbodiimides decreases with increasing stability. (F. Moosmüller, University of Munich, dissertation 1953, p. 35).
It was therefore to be assumed that N, N'-disubstituted carbodiimides with a tertiary or quaternary amino group in a substituent and a tert. Although alkyl groups as second substituents are storage-stable, they are not or not very suitable for the formation of peptide bonds due to insufficient reactivity.
Surprisingly, it has now been found that carbodiimides of the formula
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can be used very well as a reagent in the production of peptide bonds.
In this formula, R1, R2, R3 and R4 denote alkyl, cycloalkyl, aralkyl or aryl groups, at least one of these four radicals being substituted by one or more tertiary and / or quaternary amino groups, so that R1, R2, R3 and 4 can mean, for example: 2-dimethylamino-ethyl,
3-dimethylamino-propyl-, 3-diethylamino-propyl-,
3-DiÏthylamino-pentyl- (4) -,
4-dimethylamino-cyclohexyl-,
4-dimethylaminophenyl-, fl- [(N'-methyl) -N-piperazinyl] -Ïthyl-, ¯- (N-morpholyl) -Ïthyl or. the radicals derived therefrom with quaternary amino groups.
The following carbodiimides have proven themselves in the creation of peptide bonds:
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With the aid of these carbodiimides, peptides can be prepared in the known manner and separated from the ureas formed.
example 1
3.1 g of sarcosine ethyl ester hydrochloride are suspended in 50 cm3 of methylene chloride, then 2 g of triethylamine are added at 0¯C, shaken for 3 minutes at 0¯C, then filtered off with suction, washed with methylene chloride, the filtrate with the suspension of 4.2g of CBO-glycinin400cm3 of methylene chloride combined and then 3.7 g of the basic carbodiimide: (3-dimethylamino-propyl) -tert.-butyl-carbodiimide were added and the mixture was then left to stand at room temperature for 24 hours with occasional shaking. The clear solution was then washed with 1N HCl, bicarbonate solution and water, dried over sodium sulphate and completely evaporated and dried in vacuo.
Yield: 0.50 g (81% of theory), CBO-glycyl-sarcosine ethyl ester, a pale yellow oil, the composition of which was confirmed by paper chromatography.
Example 2
26.0 g of L-leucine methyl ester hydrochloride were suspended in 550 cm3 of methylene chloride, 14.1 g of triethylamine were added, shaken at 0 ° C. for 3 minutes, filtered off with suction, and the filtrate was combined with the solution of 43.4 g of CBO-glycylsarcosine , then 35.9 g of N- [3-diethylamino-pentyl- (4)] - N'-tert-butylcarbodiimide added, allowed to stand for 24 hours at room temperature and then, as described in Example 1, worked up.
Yield: 56.9 g (98e / v of theory) CBO-glycyl-sarkosyl-L-leucine methyl ester; a pale yellow, semi-solid oil. The composition was secured by paper chromatography.
Example 3
2.4 g of L-leucine methyl ester hydrochloride were suspended in 50 cm3 of methylene chloride, mixed with 1.3 g of triethylamine, shaken for 3 minutes, filtered off with suction, the filtrate was combined with the solution of 4.0 g of CBO glycyl sarcosine in 100 cm3 of methylene chloride, then 2.4 g of (3-dimethylamino-propyl) -tert.butyl-carbodiimide were added, the mixture was left to stand at room temperature for 24 hours and worked up as described in Example 1.
Yield: 3.8 g of CBO-glycyl-sarkosyl-L-leucine methyl ester (718 / o of theory), a solid part.
Example 4
52 g of sarcosine ethyl ester hydrochloride were suspended in 800 cm3 of CH2C12, 33.6 g of triethylamine were added, shaken for 3 minutes at 09 ° C., then filtered off with suction, washed with CH2C12, the filtrate with the suspension of 70.6 g of CBO-glycine in 1680 cm3 of CH2C12 combined, then 71.5 g of 2- [(N-morpholyl) -ethyl] - (tert-butyl) -carbodiimide were added, the mixture was left to stand for 24 hours at room temperature, then, as described in Example 1, worked up.
Yield: 103 g (99 / a of theory) CBO-glycylsarcosine ethyl ester as solid O1.