Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines neuen: Antibioti- kums, das mit Holomycin bezeichnet wird, das da durch gekennzeichnet ist, dass man Streptomyces griseus A 17474 oder eine Mutation dieses Stammes in einer Nährlösung aerob kultiviert und hierauf das Antibiotikum Holomycin aus der Nährlösung isoliert.
Wie im folgenden gezeigt wird, besitzt das Anti biotikum Holomycin eine durch saure Hydrolyse ab spaltbare Acetylgruppe. Dem Desacetylderivat, das im folgenden Holothin genannt wird, schreiben wir auf Grund der weiter :unten gegebenen Befunde die Formel 1
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zu. Aus ihm lassen sich durch Acylierung Acylderi- vate herstellen, wobei das so gewonnene Acetyl- derivat mit dem Antibiotikum Holomycin identisch ist.
Diese Verbindungen besitzen die Formel II
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worin R für einen Acylrest, insbesondere einen Alka- noylrest, steht.
Das Antibiotikum entsteht bei der Kultur eines neuen Stammes der Art Streptomyces griseus (Krainski) Waksman et Henrici, der im folgenden näher beschrieben wird. Er wurde aus einer in Riccino, Italien, gesammelten Bodenprobe isoliert und wird in unseren Laboratorien und in der Eidg. Technischen Hochschule, Institut für spezielle Bota nik, Zürich, unter der Bezeichnung A17474 auf bewahrt.
Der Stamm A 17474 bildet ein .gelblich-grünlich- graues Luftmycel. Das Substratmycel ist weissgelb oder weissgrau bis saugelb. Die aus glatten Sporen bestehenden Sporenketten sind meist stark gewellt und bilden sympodial verzweigte Büschel mit kurzer Hauptachse. Bei der Kultivierung auf peptonhaltigen Nährböden tritt keine melanoide, schwarzbraune Verfärbung ein.
Das Wachstum ist relativ wenig ab hängig von der Temperatur, sowohl bei 18 als auch bei 400 entwickelt sich der Pilz gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 320.
Zur weiteren Charakterisierung wird im folgen den das Wachstum des Stammes A 17474 auf ver schiedenen Nährmedien beschrieben. Die Nähr medien 1-7 und 10 wurden nach W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (l952) hergestellt.
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5. <SEP> Calciummalat-Agar:
<tb> Wachstum <SEP> dünn, <SEP> schleierartig, <SEP> weissgrau;
<tb> Substrat <SEP> ziegelrot; <SEP> Luftmycel <SEP> spärlich,
<tb> schneeweiss.
<tb> 6. <SEP> Gelatinestich <SEP> (18 ):
<tb> Wachstum <SEP> oberflächlich, <SEP> spärlich, <SEP> runzelig <SEP> bis
<tb> flechtenartig; <SEP> Substrat <SEP> unverfärbt; <SEP> Luftmycel
<tb> gelblich-grünlichgrau; <SEP> Verflüssigung <SEP> langsam,
<tb> nach <SEP> 30 <SEP> Tagen <SEP> 0,3 <SEP> cm.
<tb> 7. <SEP> Stärkeplatte:
<tb> Wachstum <SEP> pustelig, <SEP> weissgelb;
<SEP> Luftmycel
<tb> sammetig, <SEP> gelblich-grünlichgrau, <SEP> Hydrolyse <SEP> nach
<tb> 7 <SEP> Tagen <SEP> 1,3 <SEP> cm.
<tb> B. <SEP> Kartoffeln:
<tb> Wachstum <SEP> dünn, <SEP> schleierartig <SEP> bis <SEP> runzelig;
<tb> Luftmycel <SEP> sammetig, <SEP> weissgelb <SEP> bis <SEP> gelblich grünlichgrau.
<tb> 9. <SEP> Karotten:
<tb> Wachstum <SEP> sehr <SEP> spärlich, <SEP> punktförmig, <SEP> weissgelb.
<tb> 10. <SEP> Lackmusmilch:
<tb> Sehr <SEP> stark <SEP> ausgebildete <SEP> Pellikula, <SEP> hellgelb;
<tb> Luftmycel <SEP> staubig, <SEP> einen <SEP> feinen <SEP> Überzug <SEP> bildend,
<tb> schneeweiss; <SEP> langsame <SEP> Peptonisierung, <SEP> 0,5 <SEP> cm <SEP> in
<tb> 8 <SEP> Tagen; <SEP> keine <SEP> Koagulation; <SEP> Lackmus <SEP> entfärbt
<tb> oder <SEP> blau.
Es ist bekannt, dass verschiedene Stämme von Streptomyces griseus verschiedene Antibiotika bilden (vergl. z. B. Waksman und Lechevalier, Acetino- mycetes and their Antibiotics , Baltimore 1953, Seite 166).
Daraus folg , dass man die Bildung eines bestimmten Antibiotikums nicht als charakteristische Eigenschaft einer bestimmten Streptomyceten-Art, sondern lediglich als Charakteristikum eines be stimmten Streptomyceten-Stammes bezeichnen kann [vgl. Ettlinger et a1., Arch. Mikrobiol., <I>31,</I><B>326-358</B> (1958)].
Die folgenden Antibiotika werden von ver schiedenen Stämmen der Art Streptomyces griseus produziert: Streptomycin, Mannosido-streptomycin, Grisein, Streptocin, Candicidin und Actidion (Cyclo- heximid). Wie weiter unten gezeigt werden soll, unter scheidet sich das neue Antibiotikum Holomycin von allen diesen Substanzen in charakteristischer Weise.
Zur Herstellung des Antibiotikums Holomycin kann man auch Varianten des Stammes A 17474 verwenden, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stick stoff-Senfölen gewonnen werden. Ein derartiger Stamm kann z.
B. in wässriger, anorganische Salze, eine Stickstoff- und Kohlenstoffquelle enthaltender Nährlösung, aerob, also beispielsweise in ruhender Oberflächenkultur oder vorzugsweise submers unter Schütteln oder Rühren mit Luft oder Sauerstoff in Schüttelflaschen oder den bekannten Fermentern ge züchtet werden. Als Temperatur eignet sieh eine solche zwischen 18 und 40 . Eine wesentliche anti- bakterielle Wirkung zeigt die Nährlösung dabei im allgemeinen nach 15-72 Stunden.
Die Nährlösung kann als anorganische Salze bei spielsweise Chloride, Nitrate, Carbonate, Sulfate von Alkalien, Erdalkalien, Magnesium, Eisen, Zink, Mangan enthalten. Als Kohlenstoffquellen kommen vor allem Kohlehydrate, wie Glukose, Saccharose, Laktose und Stärke in Betracht. Als stickstoff haltige Verbindungen und gegebenenfalls zuzusetzende wachstumsfördernde Stoffe seien z.
B. genannt: Aminosäuren und ihre Gemische, Peptide und Pro teine sowie ihre Hydrolysate, wie Pepton oder Trypton, Fleischextrakte, wasserlösliche Anteile von Getreidekörnern, wie Mais und Weizen, von Destilla- tionsrückständen bei der Alkoholherstellung, von Hefe, Bohnen, insbesondere der Sojapflanze, von Samen, beispielsweise der Baumwollpflanze.
Zur Isolierung des Holomycins kann man z. B. wie folgt vorgehen: Man trennt das Mycel vom Kultur filtrat ab, wonach die Hauptmenge des Antibiotikums im Kulturfiltrat gefunden wird. Es bleiben aber trotz dem namhafte Mengen des Antibiotikums am Mycel adsorbiert. Es ist daher vorteilhaft, letzteres gut auszuwaschen. Dazu eignen sich besonders orga nische, mindestens teilweise wasserlösliche Lösungs mittel, wie Alkohole, z. B. Methanol, Athanol und Butanole, oder Ketone, z. B.
Aceton und Methyläthyl- keton. Diese Mycelextrakte werden entweder direkt oder nach vorheriger Konzentration im Vakuum zum Kulturfiltrat gegeben. Man extrahiert das Gemisch mit einem mit Wasser nicht mischbaren, organischen Lösungsmittel, wie Estern niederer Fettsäuren, bei spielsweise Äthylacetat oder Amylacetat, Kohlen wasserstoffen, zum Beispiel Benzol, chlorierten Kohlenwasserstoffen, zum Beispiel Äthylenchlorid, Methylenchlorid oder Chloroform, Ketonen, zum Bei spiel Methylpropylketon,
Methylamylketon oder Di- isobutylketon, Alkoholen, wie Butylalkoholen oder Amylalkoholen, Äthern, z. B. Äthyläther, Diisopro- pyläther, Dibutyläthern oder Glykoläthern und der gleichen.
Anstelle einer Lösungsmittel-Extraktion der Kulturen, oder in Kombination mit einer solchen als weitere Reinigungsoperation, kann man das Anti biotikum auch durch Adsorption gewinnen, beispiels weise an Aktivkohle oder an aktivierten Erden, wie Fullererde oder Floridin, und anschliessende Extrak tion des Adsorbates z. B. mit einem in Wasser wenigstens teilweise löslichen organischen Lösungs mittel, wie Aceton, Butanol oder Methyläthylketon.
Man kann auch die Kulturen direkt, ohne vor gängige Abtrennung des Mycels, in der angegebenen Art und Weise extrahieren.
Eine weitere Anreicherung lässt sich dadurch erzielen, dass man die antibiotikumhaltigen orga nischen Extrakte zuerst mit einer sauren wässrigen Lösung mit einem pH unter 5 und dann mit einer alkalischen wässrigen Lösung mit einem pH über 8 wiederholt auszieht, wobei die Hauptmenge der antibiotischen Aktivität in der organischen Phase bleibt, aus der das Holomycin isoliert wird.
Als saure wässrige Lösungen eignen sich verdünnte Säu ren, wie Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure, oder Pufferlösungen, wie Citrat- oder Phosphat puffer, und als alkalische wässrige Lösungen verdünnte Alkalien, wie Natronlauge oder Kalilauge, oder Pufferlösungen, wie Phosphatpuffer und dergleichen.
Eine gute Reinigungsmethode für das neue Anti biotikum stellt die Chromatographie dar. Als Adsor- bens hat sich Aluminiumoxyd besonders bewährt, doch können auch andere adsorbierende Substanzen verwendet werden, z. B. Silicagel, Magnesiumsilikat und dergleichen.
Auch die Verteilung zwischen einer wässrigen Lösung und einem mit Wasser nicht mischbaren Lö sungsmittel ist zur Anreicherung des neuen Anti biotikums sehr geeignet. Zweckmässig erfolgt dieselbe nach dem Gegenstromverfahren in entsprechenden Apparaten. Die Gewinnung des reinen Antibiotikums in kristalliner Form nimmt man z. B. aus organischen Lösungsmitteln, wie aus Aceton, Methanol, Äthanol, Essigester, Chloroform, Essigester-Methanol-Ge- mischen, Essigester-Äther-Gemischen oder Essigester- Petroläther-Gemischen vor.
Zum Umkristallisieren dienen dieselben Lösungsmittel oder auch wässrig organische Lösungen, wie verdünnte Alkohole, ver dünntes Aceton, usw. Weiter kann das Antibiotikum mittels Sublimation im Hochvakuum gereinigt wer den.
Das Antibiotikum erhält man als orange .ge färbte Kristallblättchen, F. 264-271 . Die Elementar analyse liefert folgende Werte: C = 39,25 0/0, H = 2,79 %, N = 13,07 %, S = 29,77 %, (C)CH3 = 7,
04 %, CH3C0 = 21,38'9/o. Diese Werte weisen auf die Formel C7Ho02N2S2 hin, wobei die Substanz keine O-Methyl- oder N-Methyl- gru.ppen, jedoch je eine C-Methyl- und Ace.tylgruppe enthält.
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt drei Banden bei 245 m,u (log E = 3,78), bei 302 m,a (log c - 3,51) und bei 390 m,ec (log a = 4,05).
Im Infrarot-Spektrum sind Banden u. a. bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,91 /t, 3,10 p., 3,18 ,u, <I>3,27</I> ,lc, 3,31<I>,</I> u., 6,02<I>,u,</I> 6,10 /1., <I>6,25</I> ,u, 6,44 /,t, 6,86 Ll, 7,30 /1., <I>7,42</I> ,u, 7,587,89 ,a., 8,38,u, 9,49 9,68<I>,</I> u., 12,10 7r, 12,65 12,98,u,
13,90 ,u, 14,25 /,c und 15,35 p. Holomycin ist eine neutrale Substanz und besitzt keine leicht acylierbaren Hydroxylgruppen.
Durch saure Hydrolyse kann man unter Ab spaltung von Essigsäure ein basisches Spaltprodukt erhalten, das als Hydrochlorid in kristalliner Form anfällt. Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 29,06 0/0, H = 2,54 %, N = 13,35 0/0, S = 30,56 0/a und Cl = 16,74 0/0, die auf die Summenformel CAON.S.C1 hinweisen.
Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt drei Ban den, nämlich bei 226 mu (log e = 3,70), bei 296 m,u (log a = 3,70) und bei 381 m,a (log e - 4,08). Durch Behandlung mit acylierenden Mitteln, z. B. mittels Carbonsäureanhydridenoder -chloriden, erhält man die entsprechenden acylierten Verbindungen.
Verwendet man Acetanhydrid, so wird das die oben erwähnten Eigenschaften besitzende Holomycin zurückgebildet. Es handelt sich demnach bei dem oben erwähnten basischen Spaltprodukt um das Desacetylderivat des Antibiotikums Holomycin. Bei der Umsetzung des Desacetylderivates mit Propion- säureanhydrid oder mit n-Buttersäureanhydrid kön nen .das
Propionyl- resp. das Butyrylderivat erhalten werden. Ersteres schmilzt bei 250-260 unter Zer setzung und letzteres bei 215-218 . Das Desacetyl- derivat lässt sich in üblicher Weise in seine Salze überführen.
Mit entschwefelnden Mitteln, z. B. mit Raney- Nickelkatalysator, lässt sich das Holomycin in eine farblose, schwefelfreie Verbindung C7H1202N2 der Formel
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welche bei 191-191,5 schmilzt, überführen. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum zeigt nur eine schwache Endabsorption bei 210 mu. Durch saure Hydrolyse dieser Substanz kann die a,
y Diamino- valeriansäure gebildet werden. Die gleichen Reak tionen lassen sich mit dem Desacetylderivat und all gemein mit seinen Acylderivaten durchführen.
Das Holomycin ist gemäss seinen physikalischen und chemischen Eigenschaften sowie gemäss den erhaltenen Abbauprodukten nahe verwandt mit dem Antibiotikum Thiolutin [W. D. Celmer, J. A. Solo- mons, Antibiotic Annual 1953/54, Seite 622; W. D. Celmer, F. W. Tanner, M. Harfenist, T. M. Lees, J. A. Solomons, J. Amer. Chem. Soc. 74, 6304 (1952); W. D. Celmer, J.
A. Solomons, J. Amer. Chem. Soc. 77, 2861 (1955)]. Die Verschiedenheit dieser beiden Antibiotika geht aber aus der beobachteten Schmelz- punkterniedrigung von 20 ihres Gemisches, aus ihren Infrarotspektren sowie aus ihrem Verhalten bei der Papierehromatographie hervor.
Bei Verwendung der beiden Lösungsmittelsysteme A (stationäre Phase: Formamid, mobile Phase: Benzol) und B (stationäre Phase: Natrium-meta-kresotinat, mobile Phase: Ge misch n-Butylacetat-Di-n-butyläther im Verhältnis 3: 1) zeigen Holomycin und seine Homologen die folgenden RT"-Werte. Als Rr1,-Werte wird das Ver hältnis der Laufstrecken zu der Laufstrecke von Thiolutin angegeben:
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System <SEP> A <SEP> System <SEP> B
<tb> Thiolutin <SEP> 1,00 <SEP> 1,00
<tb> Aureothricin <SEP> 1,47 <SEP> 1,62
<tb> Butyryl-pyrrothin <SEP> 1,76 <SEP> 2,10
<tb> Holomyoin <SEP> 0,10 <SEP> 0,78
<tb> Propionyl-Holothin <SEP> 0,28 <SEP> 1,50
<tb> Butyryl-Holothin <SEP> 0,52 <SEP> 1,87 Auf Grund dieser Befunde wird .dem Holomycin die Formel 1I (R - COCH3), dem Desacetylderivat die Formel I und der Propionyl- resp. Butyryl-Ver- bindung die Formel 1I (R = COCH.CH3 bzw.
R = COCH,- CH.,CH3) zugeschrieben.
Das Holomycin ist verschieden von den von ande ren Stämmen der Art Streptomyces griseus produzier ten bekannten Antibiotika. Im Gegensatz zu Holo- mycin lassen sich Streptomycin, Mannosido-strepto- mycin und Grisein nicht mit organischen Lösungs mitteln aus dem Kulturfiltrat extrahieren und besitzen basische Eigenschaften. Das Actidion (Cycloheximid)
und das Candicidin zeigen einen von Holomycin ver schiedenen Schmelzpunkt und ein verschiedenes anti- biotisches Wirkungsspektrum. Das letztere trifft auch für das Streptocin zu. Von allen diesen bekannten Antibiotika unterscheidet sich Holomycin weiter durch sein Absorptionsspektrum in Ultraviolett und Infrarot, mit Ausnahme des Griseins, durch seine Eigenfarbe.
Das Antibiotikum Holomycin, das Desacetylderi- vat sowie ganz allgemein Acylverbindungen des letzteren, besonders die zum Antibiotikum Holo- mycin homologen Propionyl- und n-Butyrylverbin- dungen besitzen eine sehr hohe antibiotische Wirk samkeit :gegenüber verschiedenen Testorganismen.
Verwendet man als Testmethode in vitro Verdün nungsreihen (Zehnerpotenzen) in Glukosebouillon, die während 24 Stunden bei 37 bebrütet werden, so ergeben sich folgende noch hemmende Konzentra tionen:
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Hemmende <SEP> Konzentration <SEP> lig/cm3
<tb> Testorganismen <SEP> Propionyl- <SEP> Butyryl Holomycin <SEP> Holothin <SEP> verbindung <SEP> verbindung
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus
<tb> Penicillin <SEP> resistent <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> <B>100</B> <SEP> > <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1 <SEP> <B>100</B> <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 0,1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> Chloromycetinresistent <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Escherichia <SEP> coli,
<SEP> Streptomycinresistent <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Klebsiella <SEP> Typ <SEP> A <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> > <SEP> 100
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 0,
1 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> e1 <SEP> Tor <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> > <SEP> 100 <SEP> 100 Das neue Antibiotikum Holomycin oder seine Derivate oder entsprechende Gemische davon können als Heilmittel in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden, welche die genannten Verbin dungen in Mischung mit einem für die enterale, parenterale oder lokale Applikation geeigneten phar mazeutischen organischen oder anorganischen Träger materialien enthalten.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempe raturen in Celsiusgraden angegeben.
<I>Beispiel 1</I> Man bereitet eine Nährlösung der Zusammen setzung: 20g Distillers solubles, 20 g Malzextrakt, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid und 1 Liter Leitungswasser und stellt sie auf pH 7,5 ein. Diese bzw. ein Vielfaches derselben wird in 500 cm3-Erlen- meyern (mit je 100 cm3 Nährlösung) oder in 500 Liter- Fermentern (mit je 300 Liter Nährlösung) abgefüllt und 20-30 Minuten bei 1 atü sterilisiert.
Dann impft man mit bis zu 10% einer teilweise sporulierenden, vegetativen Kultur des Streptomyceten-Stammes A 17474 an und inkubiert unter gutem Schütteln bzw. Rühren und in den Fermentern unter Belüftung (mit etwa 1 Vol. steriler Luft pro Vol. Nährlösung pro Minute) bei 27 , wobei sich in den Kulturen eine antibakterielle Wirksamkeit entwickelt.
Nach 18 bis 72 Stunden Wachstum filtriert man die Kulturen unter Zusatz eines Filterhilfsmittels je nach Volumen durch eine Nutsche oder durch eine Filterpresse oder einen rotierenden Filter und befreit so die anti biotisch wirksame wässrige Lösung vom Mycel und anderen festen Bestandteilen.
<I>Beispiel 2</I> Verwendet man anstelle des in Beispiel 1 ange gebenen Mediums die im folgenden beschriebenen Nährlösungen<I>a), b), c), d), e), f)</I> oder g), so erhält man nach analoger Sterilisation, Beimpfung mit dem Streptomyceten-Stamm A 17474, Inkubation bei 27 und Filtration wässrige antibiotisch wirksame Lösun <I>gen.</I>
a) 10 :g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleisch extrakt (Oxo Lab Lemco), 5 g Natriumchlorid, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
b) 10 g Rohglukose, 10 g Distillers solubles, 1 g Natriumnitrat, 5 g Natriumchlorid, 10 g Calcium- carbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
c) 10 g Rohglukose, 10 g Sojamehl, 20 cm3 Maisquellwasser (corn steep liquor), 5 g Natrium chlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
(1) 20 g Glycerin, 10 g Sojamehl, 5 g Natrium chlorid, 1 g Natriumnitrat, 10 g Calciumcarbonat und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisa tion 7,5.
e) 20 g Laktose, 20g Distillers solubles, 5 g Natriumchlorid, 1 g Natriumnitrat und 1 Liter Lei tungswasser; pH vor der Sterilisation 8,0.
f) 3 g Casein, 2 g sek. Kaliumhydrophosphat, 10 g Rohglukose und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,5.
g) 20 g Mannit, 20 g Sojamehl und 1 Liter Leitungswasser; pH vor der Sterilisation 7,8. <I>Beispiel 3</I> Der Filterrückstand eines gemäss Beispiel 1 oder 2 erhaltenen 150 Liter-Ansatzes wird mit 25 Liter Aceton ausgerührt und erneut filtriert. Dies wird zweimal wiederholt, worauf man die antibiotikum- haltigen Acetonlösungen vereinigt, im Vakuum auf 5 Liter einengt und mit dem Kulturfiltrat vereinigt. Diese Lösung wird mit 70 Liter Äthylacetat extra hiert, wobei die gesamte antibakterielle Aktivität in die organische Phase übergeht.
Der Extrakt wird mit Wasser gewaschen, im Vakuum auf 5 Liter einge dampft und dann mehrere Male mit 0,5 n. Essigsäure und mit 2n-Natronlauge ausgeschüttelt. Schliesslich trocknet man die Äthylacetatlösung über Natrium sulfat und dampft sie im Vakuum ein, wobei das rohe Antibiotikum Holomycin in Form eines braunen Öls erhalten wird.
<I>Beispiel 4</I> 100 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibiotikums Holomycin werden an einer Säule aus 2 kg Aluminiumoxyd (Aktivität III) nach der Durch laufmethode chromatographiert, wobei mit Chloro form, Chloroform-Methanol-Gemischen und Metha nol eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 4 Liter) werden im Vakuum .eingedampft und auf ihre anti biotische Aktivität untersucht.
Die Chloroform- und die Chloroform-Methanol-(99: 1)-Fraktionen enthal ten nur unwirksame Begleitsubstanzen, während die mit Chloroform-Methanol-(97:3)-Gemischen eluier- ten Anteile gelb gefärbt und hochwirksam sind. Sie werden vereinigt und aus Essigester kristallisiert. Man erhält das Holomycin .in Form von orangegelben Blättchen, F.264-271 ; Misch-Schmelzpunkt mit Thiolutin 240-245 .
Die Elementaranalyse liefert folgende Werte: C = 39,25 %, H = 2,79 O/0, N = 13,07 0/0, S = 29,77'0/0, C(CH3) = 7,04%, CH3C0 = 21,38'%,
N(CH3) = 0'/o, OCHS = 0 0/a. Das Ultraviolett-Absorptionsspektrum in Feinsprit zeigt drei Banden bei 245 m,u (log e = 3,78), bei, 302 mu (log e = 3,51) und bei 390 m,u (log e = 4,05).
Im Infrarot-Spektrum in Kaliumbromid sind Banden u. a. bei folgenden Wellenlängen sichtbar: 2,91 ,u, 3,10 ,u, 3,18,u, <I>3,27</I> ,u, 3,31,u, 6,02 ,u, 6,10 ,u, 6,25 #c, 6,44,u, 6,86 /c, 7,30 ,u, 7,42 /,c, 7,58 ,cc, 7,89<I>,</I><B>4</B> 8,38 ,u, 9,49,u, 9,68 ,u,
12,10,u, 12,65,u,, 12,98 ic, 13,90,u, 14,25<I>,u</I> und 15,35,u. <I>Beispiel 5</I> 5,7 g des gemäss Beispiel 3 erhaltenen rohen Antibiotikums Holomycin werden einer 82stufigen Gegenstromverteilung unterworfen, wobei man als Lösungsmittelgemisch das System Essigester-Wasser <B>(1:</B> 1) verwendet.
Der Inhalt der Verteilungsgefässe, die am intensiv sten gefärbt sind, wird vereinigt. Die wässrige Phase wird abgetrennt und zweimal mit frischem Essigester extrahiert. Die Essigester-Auszüge werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum stark konzentriert, wobei das Holomycin in orangegelben Kristallen ausfällt, F. 264 bis 271.
Es besitzt die in Beispiel 4 beschriebenen Eigen schaften.
Das gemäss .den obigen Beispielen erhaltene Holo- mycin kann wie folgt in das Desacetylderivat über geführt werden: Eine Lösung von 500 mg Holomycin in 25 cm3 Dioxan wird zum Sieden erhitzt, mit 5 cm3 konzen trierter Salzsäure versetzt und .dann 45 Minuten unter Rückfluss gekocht.
Beim Abkühlen der Reak tionslösung scheidet sich das rohe Hydrochlorid des Holothins in Form von grünschwarzen Kristallen ab. Diese werden aus 90 ml heisser 2n-Salzsäure um kristallisiert. Die olivgrünen, metallisch schimmernden Blättchen verlieren bei 240-260 langsam ihre Dop pelbrechung, schmelzen aber bis 300 nicht.
Die Elementaranalyse liefert die folgenden Werte: C = 29,06 0/0, H = 2,54 %, N = 13,35 0/0, S = 30,56 %, Cl = 16,74 0/0.
Das Ultraviolett-Spektrum in Feinsprit zeigt drei Ban den bei 226 mu (log a = 3,70), bei 296 m,u. (log E = 3,70) und bei 381 my (log E = 4,08).
Die folgenden drei Beispiele .beschreiben eine Acylierung des gemäss obigem Beispiel erhältlichen Desacetylderivates das Holomycins.
a) Eine Lösung von 133 mg des Hydrochlorids von Holothin in 13 cm3 Wasser wird unter Rühren mit 2 cm3 Essigsäureanhydrid versetzt, wobei sich Holomycin in Form von orangegelben Kristallen ab scheidet. Nach halbstündigem Stehen werden diese abfiltriert und aus .einem Methanol-Essigester-Ge- misch umkristallisiert, F.264-271 . Das erhaltene Kristallisat ist in jeder Hinsicht identisch mit dem in Beispiel 5 beschriebenen Holomycin.
b) Zu einer Lösung von 130 mg des Hydro- chlorids von desacetyliertem Holomycin in 14 cm3 Wasser werden unter Rühren 3 cm3 Propionsäure- anhydrid zugegeben.
Es scheidet sich ein orange gelber kristalliner Niederschlag ab, der nach 1/2.stün- digem Stehen abfiltriert und aus einem Methanol- Essigester-Gemisch umkristallisiert wird. Die so erhal tene Propionylverbindung schmilzt bei 250-260 unter Zersetzung.
Elementaranalyse: C = 41,91%, H = 3,45 0/0,N = 12,26 0/a, S = 28,170/a.
Das Ultraviolett-Spektrum in Feinsprit zeigt drei Banden bei 245 mu (log s = 3,78), bei 302 m,y (log E = 3,51) und bei 390 mlt- (log a = 4,05), es ist identisch mit dem des Holomycins. Im Infrarot- Spektrum in Kaliumbromid sind u. a. folgende Ban den sichtbar:
2,88 lt, 3,06 /c, 3,16 /i, 3,25,u, 3,30,u, 6,02 lt, 6,09<I>lt.,</I> 6,25 Y, 6,43 ,u, 6,84 ,u, <I>7,07</I> ,u, 7,26,u, 7,42,u, <I>7,71</I><B>11</B><I>,</I> 8,10,u, 8,45,u, <I>9,27</I> ,u, 9,52 /c, 11,20<B>11</B><I>,</I> 12,15 /., 12,68 /,c, 14,
15 lt und 15,50,u.
c) Eine Lösung von 110 mg des Hydrochlorids von desacetyliertem Holomycin in 18 cm3 Wasser wird unter Rühren mit 2 cm3 Buttersäureanhydrid versetzt, wobei sich die Butyryl-Verbindung in Form von orangegelben Kristallen abscheidet. Es wird aus Methanol umkristallisiert, F.215-218 .
Elementaranalyse: C = 44,57 0/0, H = 4,25 %, N = 11,56 %, S = 26,10%.
Das Ultraviolett-Spektrum in Feinsprit zeigt drei Banden bei 245 mli (log E = 3,78), bei 302 mlt (log @ = 3,51) und bei 390<I>mit</I> (log s = 4,05) und ist identisch mit dem des Holothins. Im Infrarot-Spek- trum in Kaliumbromid sind u.a. folgende Banden sichtbar:
2,89 lt, 3,08 lt, 3,17 /i, 3,30 3,35 6,01 /i, 6,09 p, 6,25 lt, 6,47 /1, <I>6,84</I> lt, 7,41 <I>7,47</I> /i, <I>7,71</I> y., 7,797,95 /r, 8,20 ,u, 8,39 /1, 9,15 ,u, 9,50 /c, l0,50 lt, 11,<B>1</B>8 /i, 11,33 /i, 12,15 /i, <B>1</B>2,
75 /i, 13,05 lt, 14;25 /1., 15,25<I>,</I>11, und 15,55 ct.
Process for the production of a new antibiotic The present invention relates to a process for the production of a new: Antibiotic, which is called holomycin, which is characterized in that Streptomyces griseus A 17474 or a mutation of this strain is cultivated aerobically in a nutrient solution and then isolated the antibiotic holomycin from the nutrient solution.
As will be shown in the following, the antibiotic holomycin has an acetyl group which can be split off by acid hydrolysis. For the deacetyl derivative, which is called holothin in the following, we write formula 1 on the basis of the findings given below
EMI0001.0013
to. Acyl derivatives can be produced from it by acylation, the acetyl derivative thus obtained being identical to the antibiotic holomycin.
These compounds have the formula II
EMI0001.0021
where R is an acyl radical, in particular an alkanoyl radical.
The antibiotic arises from the culture of a new strain of the species Streptomyces griseus (Krainski) Waksman et Henrici, which is described in more detail below. It was isolated from a soil sample collected in Riccino, Italy, and is stored in our laboratories and in the Swiss Federal Institute of Technology, Institute for Special Botany, Zurich, under the designation A17474.
The strain A 17474 forms a yellowish-greenish-gray aerial mycelium. The substrate mycelium is white-yellow or white-gray to suction-yellow. The spore chains, consisting of smooth spores, are mostly strongly wavy and form sympodial branched tufts with a short main axis. When cultivated on peptone-containing nutrient media, no melanoid, black-brown discoloration occurs.
The growth is relatively little dependent on the temperature, both at 18 and at 400 the fungus develops well, but the optimum is between 25 and 320.
For further characterization, the growth of strain A 17474 on various nutrient media is described below. The nutrient media 1-7 and 10 were according to W. Lindenbein, Arch. Mikrobiol. 17, 361 (1952).
EMI0001.0049
EMI0002.0001
5. <SEP> calcium malate agar:
<tb> growth <SEP> thin, <SEP> veil-like, <SEP> white-gray;
<tb> substrate <SEP> brick red; <SEP> aerial mycelium <SEP> sparse,
<tb> snow white.
<tb> 6. <SEP> gelatin stitch <SEP> (18):
<tb> Growth <SEP> superficial, <SEP> sparse, <SEP> wrinkled <SEP> to
<tb> lichen-like; <SEP> substrate <SEP> uncolored; <SEP> aerial mycelium
<tb> yellowish-greenish-gray; <SEP> liquefaction <SEP> slowly,
<tb> after <SEP> 30 <SEP> days <SEP> 0.3 <SEP> cm.
<tb> 7. <SEP> thickness plate:
<tb> growth <SEP> pustular, <SEP> white-yellow;
<SEP> aerial mycelium
<tb> velvety, <SEP> yellowish-greenish gray, <SEP> hydrolysis <SEP> after
<tb> 7 <SEP> days <SEP> 1.3 <SEP> cm.
<tb> B. <SEP> Potatoes:
<tb> growth <SEP> thin, <SEP> veil-like <SEP> to <SEP> wrinkled;
<tb> aerial mycelium <SEP> velvety, <SEP> white yellow <SEP> to <SEP> yellowish greenish gray.
<tb> 9. <SEP> carrots:
<tb> Growth <SEP> very <SEP> sparse, <SEP> punctiform, <SEP> white-yellow.
<tb> 10. <SEP> litmus milk:
<tb> Very <SEP> strongly <SEP> developed <SEP> pellicle, <SEP> light yellow;
<tb> aerial mycelium <SEP> dusty, <SEP> forming a <SEP> fine <SEP> coating <SEP>,
<tb> snow white; <SEP> slow <SEP> peptonization, <SEP> 0.5 <SEP> cm <SEP> in
<tb> 8 <SEP> days; <SEP> no <SEP> coagulation; <SEP> litmus <SEP> discolored
<tb> or <SEP> blue.
It is known that different strains of Streptomyces griseus produce different antibiotics (cf., for example, Waksman and Lechevalier, Acetinomycetes and their Antibiotics, Baltimore 1953, page 166).
It follows that the formation of a certain antibiotic cannot be described as a characteristic property of a certain Streptomycete species, but only as a characteristic of a certain Streptomycete strain [cf. Ettlinger et al., Arch. Mikrobiol., <I>31,/I> <B> 326-358 </B> (1958)].
The following antibiotics are produced by different strains of the species Streptomyces griseus: Streptomycin, Mannosido-streptomycin, Grisein, Streptocin, Candicidin and Actidion (cycloheximide). As will be shown below, the new antibiotic holomycin differs from all these substances in characteristic ways.
For the production of the antibiotic holomycin, variants of the strain A 17474 can also be used, as z. B. by selection or mutation, especially under the action of ultraviolet or X-rays or stick material mustard oils are obtained. Such a strain can e.g.
B. in aqueous, inorganic salts, a nitrogen and carbon source containing nutrient solution, aerobically, so for example in resting surface culture or preferably submerged with shaking or stirring with air or oxygen in shaker bottles or the known fermenters ge. A suitable temperature is between 18 and 40. The nutrient solution generally shows a significant antibacterial effect after 15-72 hours.
The nutrient solution can contain, for example, chlorides, nitrates, carbonates, sulfates of alkalis, alkaline earths, magnesium, iron, zinc, manganese as inorganic salts. Carbohydrates such as glucose, sucrose, lactose and starch come into consideration as carbon sources. As nitrogen-containing compounds and possibly to be added growth-promoting substances such.
B. named: Amino acids and their mixtures, peptides and proteins and their hydrolysates, such as peptone or tryptone, meat extracts, water-soluble parts of cereal grains such as maize and wheat, of distillation residues from alcohol production, of yeast, beans, especially the soy plant , of seeds, for example the cotton plant.
To isolate the holomycin you can, for. B. proceed as follows: The mycelium is separated from the culture filtrate, after which the main amount of the antibiotic is found in the culture filtrate. However, despite the significant amounts of the antibiotic, they remain adsorbed on the mycelium. It is therefore advantageous to wash out the latter well. These are particularly organic, at least partially water-soluble solvents such as alcohols such. B. methanol, ethanol and butanols, or ketones, e.g. B.
Acetone and methyl ethyl ketone. These mycelium extracts are added to the culture filtrate either directly or after prior concentration in vacuo. The mixture is extracted with a water-immiscible organic solvent, such as esters of lower fatty acids, for example ethyl acetate or amyl acetate, hydrocarbons, for example benzene, chlorinated hydrocarbons, for example ethylene chloride, methylene chloride or chloroform, ketones, for example methyl propyl ketone,
Methyl amyl ketone or di-isobutyl ketone, alcohols such as butyl alcohols or amyl alcohols, ethers, e.g. B. ethyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ethers or glycol ethers and the like.
Instead of a solvent extraction of the cultures, or in combination with such as a further cleaning operation, you can win the anti biotic by adsorption, for example, on activated carbon or on activated earth, such as fuller's earth or floridine, and subsequent extraction of the adsorbate z. B. with an at least partially soluble organic solvent in water, such as acetone, butanol or methyl ethyl ketone.
You can also extract the cultures directly, without prior separation of the mycelium, in the manner indicated.
A further enrichment can be achieved by repeatedly extracting the antibiotic-containing organic extracts first with an acidic aqueous solution with a pH below 5 and then with an alkaline aqueous solution with a pH above 8, the majority of the antibiotic activity in the organic Phase remains from which the holomycin is isolated.
Suitable acidic aqueous solutions are dilute acids such as acetic acid, hydrochloric acid or sulfuric acid, or buffer solutions such as citrate or phosphate buffer, and as alkaline aqueous solutions dilute alkalis such as sodium hydroxide solution or potassium hydroxide solution or buffer solutions such as phosphate buffer and the like.
Chromatography is a good cleaning method for the new antibiotic. Aluminum oxide has proven particularly effective as an adsorbent, but other adsorbing substances can also be used, e.g. Silica gel, magnesium silicate and the like.
The distribution between an aqueous solution and a water-immiscible solvent is also very suitable for the enrichment of the new antibiotic. The same is expediently carried out using the countercurrent method in appropriate apparatus. The extraction of the pure antibiotic in crystalline form takes z. B. from organic solvents such as acetone, methanol, ethanol, ethyl acetate, chloroform, ethyl acetate-methanol mixtures, ethyl acetate-ether mixtures or ethyl acetate-petroleum ether mixtures.
The same solvents or aqueous organic solutions such as dilute alcohols, ver dilute acetone, etc. are used for recrystallization. The antibiotic can also be purified by sublimation in a high vacuum.
The antibiotic is obtained as orange .ge colored crystal flakes, F. 264-271. The elementary analysis provides the following values: C = 39.25 0/0, H = 2.79%, N = 13.07%, S = 29.77%, (C) CH3 = 7,
04%, CH3C0 = 21.38.9 / o. These values refer to the formula C7Ho02N2S2, whereby the substance does not contain any O-methyl or N-methyl groups, but one C-methyl and one acetyl group.
The ultraviolet absorption spectrum shows three bands at 245 m, u (log E = 3.78), at 302 m, a (log c - 3.51) and at 390 m, ec (log a = 4.05).
In the infrared spectrum there are bands u. a. visible at the following wavelengths: 2.91 / t, 3.10 p., 3.18, u, <I> 3.27 </I>, lc, 3.31 <I>, </I> u., 6.02 <I>, u, </I> 6.10 / 1., <I> 6.25 </I>, u, 6.44 /, t, 6.86 Ll, 7.30 / 1 ., <I> 7.42 </I>, u, 7.587.89, a., 8.38, u, 9.49 9.68 <I>, </I> u., 12.10 7r, 12.65 12.98, u,
13.90, u, 14.25 /, c and 15.35 p. Holomycin is a neutral substance and has no easily acylatable hydroxyl groups.
By acid hydrolysis, acetic acid can be split off to obtain a basic cleavage product which is obtained as the hydrochloride in crystalline form. The elemental analysis gives the following values: C = 29.06 0/0, H = 2.54%, N = 13.35 0/0, S = 30.56 0 / a and Cl = 16.74 0/0, the refer to the empirical formula CAON.S.C1.
The ultraviolet absorption spectrum shows three bands, namely at 226 mu (log e = 3.70), at 296 m, u (log a = 3.70) and at 381 m, a (log e - 4.08). By treatment with acylating agents, e.g. B. by means of carboxylic anhydrides or chlorides, the corresponding acylated compounds are obtained.
If acetic anhydride is used, the holomycin, which has the properties mentioned above, is reduced. The basic cleavage product mentioned above is therefore the deacetyl derivative of the antibiotic holomycin. When reacting the deacetyl derivative with propionic anhydride or with n-butyric anhydride, the
Propionyl resp. the butyryl derivative can be obtained. The former melts at 250-260 with decomposition and the latter at 215-218. The deacetyl derivative can be converted into its salts in the usual way.
With desulfurizing agents, e.g. B. with Raney nickel catalyst, the holomycin can be converted into a colorless, sulfur-free compound C7H1202N2 of the formula
EMI0003.0139
which melts at 191-191.5. The ultraviolet absorption spectrum shows only a weak final absorption at 210 mu. By acid hydrolysis of this substance the a,
y diamino valeric acid are formed. The same reactions can be carried out with the deacetyl derivative and generally with its acyl derivatives.
According to its physical and chemical properties and according to the degradation products obtained, holomycin is closely related to the antibiotic thiolutin [W. D. Celmer, J. A. Solomons, Antibiotic Annual 1953/54, page 622; W.D. Celmer, F. W. Tanner, M. Harfenist, T. M. Lees, J. A. Solomons, J. Amer. Chem. Soc. 74: 6304 (1952); W. D. Celmer, J.
A. Solomons, J. Amer. Chem. Soc. 77, 2861 (1955)]. The difference between these two antibiotics is evident from the observed decrease in the melting point of their mixture, from their infrared spectra, and from their behavior in paper chromatography.
When using the two solvent systems A (stationary phase: formamide, mobile phase: benzene) and B (stationary phase: sodium meta-cresotinate, mobile phase: mixture of n-butyl acetate-di-n-butyl ether in a ratio of 3: 1) show Holomycin and its homologues have the following RT "values. The ratio of the running distance to the running distance of thiolutin is given as Rr1, values:
EMI0003.0182
System <SEP> A <SEP> System <SEP> B
<tb> Thiolutin <SEP> 1.00 <SEP> 1.00
<tb> Aureothricin <SEP> 1.47 <SEP> 1.62
<tb> Butyryl-pyrrothin <SEP> 1.76 <SEP> 2.10
<tb> Holomyoin <SEP> 0.10 <SEP> 0.78
<tb> Propionyl-Holothin <SEP> 0.28 <SEP> 1.50
<tb> Butyryl-Holothin <SEP> 0.52 <SEP> 1.87 On the basis of these findings, the holomycin is given the formula 1I (R - COCH3), the deacetyl derivative the formula I and the propionyl or. Butyryl compound has the formula 1I (R = COCH.CH3 or
R = COCH, - CH., CH3).
Holomycin is different from the known antibiotics produced by other strains of the species Streptomyces griseus. In contrast to holomycin, streptomycin, mannosido-streptomycin and grisein cannot be extracted from the culture filtrate with organic solvents and have basic properties. The Actidion (cycloheximide)
and the candicidin show a different melting point from holomycin and a different spectrum of antibiotics. The latter also applies to streptocin. Holomycin differs from all these known antibiotics further through its absorption spectrum in ultraviolet and infrared, with the exception of being gris, through its own color.
The antibiotic holomycin, the deacetyl derivative and, more generally, acyl compounds of the latter, especially the propionyl and n-butyryl compounds homologous to the antibiotic holomycin, have a very high antibiotic activity: against various test organisms.
If one uses as a test method in vitro dilution series (powers of ten) in glucose broth, which are incubated for 24 hours at 37, the following still inhibiting concentrations result:
EMI0004.0043
Inhibiting <SEP> concentration <SEP> lig / cm3
<tb> test organisms <SEP> propionyl <SEP> butyryl holomycin <SEP> holothin <SEP> compound <SEP> compound
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Micrococcus <SEP> pyogenes, <SEP> var.
<SEP> aureus
<tb> Penicillin <SEP> resistant <SEP> 10 <SEP>> <SEP> 100 <SEP>> <SEP> <B> 100 </B> <SEP>> <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> pyogenes <SEP> 1 <SEP> <B> 100 </B> <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Streptococcus <SEP> viridans <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Streptococcus <SEP> faecalis <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Corynebacterium <SEP> diphtheriae <SEP> 1 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 0.1
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 10 <SEP>> <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Escherichia <SEP> coli, <SEP> chloromycetin-resistant <SEP> 10 <SEP>> <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Escherichia <SEP> coli,
<SEP> Streptomycin resistant <SEP> 10 <SEP>> <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Salmonella <SEP> typhosa <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Salmonella <SEP> schottmuelleri <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Shigella <SEP> sonnei <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> Pseudomonas <SEP> aeruginosa <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Klebsiella <SEP> Type <SEP> A <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP>> <SEP> 100
<tb> Pasteurella <SEP> pestis <SEP> 0,
1 <SEP> 10 <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Vibrio <SEP> cholerae <SEP> e1 <SEP> Tor <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Bacillus <SEP> megatherium <SEP> 10 <SEP> 100 <SEP> 10 <SEP> 10
<tb> Endomyces <SEP> albicans <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100 <SEP>> <SEP> 100 <SEP> 100 The new antibiotic holomycin or its derivatives or corresponding mixtures thereof can be used as remedies in the form of pharmaceutical preparations Find use which contain the compounds mentioned in a mixture with a pharmaceutical, organic or inorganic carrier materials suitable for enteral, parenteral or local application.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius.
<I> Example 1 </I> A nutrient solution is prepared with the composition: 20 g of distillers solubles, 20 g of malt extract, 1 g of sodium nitrate, 5 g of sodium chloride and 1 liter of tap water and adjusts it to pH 7.5. This or a multiple thereof is filled into 500 cm3 Erlenmeyer (with 100 cm3 nutrient solution each) or in 500 liter fermenter (with 300 liter nutrient solution each) and sterilized for 20-30 minutes at 1 atm.
Then up to 10% of a partially sporulating, vegetative culture of the Streptomycete strain A 17474 is inoculated and incubated with good shaking or stirring and in the fermenters with aeration (with about 1 volume of sterile air per volume of nutrient solution per minute) at 27, with antibacterial activity developing in the cultures.
After 18 to 72 hours of growth, the cultures are filtered with the addition of a filter aid, depending on the volume, through a suction filter or through a filter press or a rotating filter, thus removing the mycelium and other solid components from the anti-biotically effective aqueous solution.
<I> Example 2 </I> If instead of the medium given in Example 1, the nutrient solutions <I> a), b), c), d), e), f) </I> or g described below are used ), then after similar sterilization, inoculation with the Streptomycete strain A 17474, incubation at 27 and filtration, aqueous antibiotic solutions are obtained. </I>
a) 10: g raw glucose, 5 g peptone, 3 g meat extract (Oxo Lab Lemco), 5 g sodium chloride, 10 g calcium carbonate and 1 liter tap water; pH 7.5 before sterilization.
b) 10 g of raw glucose, 10 g of distillers solubles, 1 g of sodium nitrate, 5 g of sodium chloride, 10 g of calcium carbonate and 1 liter of tap water; pH 7.5 before sterilization.
c) 10 g raw glucose, 10 g soy flour, 20 cm3 corn steep liquor, 5 g sodium chloride, 1 g sodium nitrate, 10 g calcium carbonate and 1 liter tap water; pH 7.5 before sterilization.
(1) 20 g glycerin, 10 g soy flour, 5 g sodium chloride, 1 g sodium nitrate, 10 g calcium carbonate and 1 liter of tap water; pH before sterilization 7.5.
e) 20 g of lactose, 20 g of distillers solubles, 5 g of sodium chloride, 1 g of sodium nitrate and 1 liter of tap water; pH before sterilization 8.0.
f) 3 g casein, 2 g sec. Potassium hydrophosphate, 10 g of raw glucose and 1 liter of tap water; pH 7.5 before sterilization.
g) 20 g mannitol, 20 g soy flour and 1 liter of tap water; pH before sterilization 7.8. <I> Example 3 </I> The filter residue of a 150 liter batch obtained according to Example 1 or 2 is stirred with 25 liters of acetone and filtered again. This is repeated twice, whereupon the antibiotic-containing acetone solutions are combined, concentrated in vacuo to 5 liters and combined with the culture filtrate. This solution is extracted with 70 liters of ethyl acetate, the entire antibacterial activity being transferred to the organic phase.
The extract is washed with water, evaporated to 5 liters in vacuo and then extracted several times with 0.5N acetic acid and with 2N sodium hydroxide solution. Finally, the ethyl acetate solution is dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo, the crude antibiotic holomycin being obtained in the form of a brown oil.
<I> Example 4 </I> 100 g of the crude antibiotic holomycin obtained according to Example 3 are chromatographed on a column of 2 kg of aluminum oxide (activity III) using the continuous flow method, using chloroform, chloroform-methanol mixtures and methanol is eluted. The individual fractions (4 liters each) are .evaporated in vacuo and examined for their anti-biotic activity.
The chloroform and chloroform-methanol (99: 1) fractions contain only ineffective accompanying substances, while the fractions eluted with chloroform-methanol (97: 3) mixtures are yellow in color and highly effective. They are combined and crystallized from ethyl acetate. The holomycin is obtained in the form of orange-yellow leaflets, F.264-271; Mixed melting point with thiolutin 240-245.
The elemental analysis gives the following values: C = 39.25%, H = 2.79 O / 0, N = 13.07 0/0, S = 29.77'0 / 0, C (CH3) = 7.04% , CH3C0 = 21.38%,
N (CH3) = 0 '/ o, OCHS = 0 0 / a. The ultraviolet absorption spectrum in fine spirits shows three bands at 245 m, u (log e = 3.78), at .302 mu (log e = 3.51) and at 390 m, u (log e = 4.05).
In the infrared spectrum in potassium bromide, bands u. a. visible at the following wavelengths: 2.91, u, 3.10, u, 3.18, u, <I> 3.27 </I>, u, 3.31, u, 6.02, u, 6, 10, u, 6.25 #c, 6.44, u, 6.86 / c, 7.30, u, 7.42 /, c, 7.58, cc, 7.89 <I>, </ I> <B> 4 </B> 8.38, u, 9.49, u, 9.68, u,
12.10, u, 12.65, u ,, 12.98 ic, 13.90, u, 14.25 <I>, u </I> and 15.35, u. <I> Example 5 </I> 5.7 g of the crude antibiotic holomycin obtained according to Example 3 are subjected to 82-stage countercurrent distribution, the ethyl acetate-water system (1: 1) being used as the solvent mixture.
The contents of the distribution vessels, which are most intensely colored, are combined. The aqueous phase is separated off and extracted twice with fresh ethyl acetate. The ethyl acetate extracts are combined, dried over sodium sulfate and strongly concentrated in vacuo, the holomycin precipitating out in orange-yellow crystals, mp 264-271.
It has the properties described in Example 4.
The holomycin obtained according to the above examples can be converted into the deacetyl derivative as follows: A solution of 500 mg holomycin in 25 cm3 of dioxane is heated to boiling, 5 cm3 of concentrated hydrochloric acid are added and then refluxed for 45 minutes .
When the reaction solution cools, the crude holothin hydrochloride separates out in the form of greenish-black crystals. These are crystallized from 90 ml of hot 2N hydrochloric acid. The olive green, metallic shimmering leaves slowly lose their birefringence at 240-260, but do not melt until 300.
The elemental analysis gives the following values: C = 29.06 0/0, H = 2.54%, N = 13.35 0/0, S = 30.56%, Cl = 16.74 0/0.
The ultraviolet spectrum in fine spirits shows three bands at 226 mu (log a = 3.70), at 296 m, u. (log E = 3.70) and at 381 my (log E = 4.08).
The following three examples describe an acylation of the deacetyl derivative holomycin obtainable according to the above example.
a) A solution of 133 mg of the hydrochloride of holothin in 13 cm3 of water is mixed with 2 cm3 of acetic anhydride while stirring, with holomycin separating out in the form of orange-yellow crystals. After standing for half an hour, these are filtered off and recrystallized from a methanol-ethyl acetate mixture, F.264-271. The crystals obtained are identical in every respect with the holomycin described in Example 5.
b) To a solution of 130 mg of the hydrochloride of deacetylated holomycin in 14 cm3 of water, 3 cm3 of propionic anhydride are added with stirring.
An orange-yellow crystalline precipitate separates out, which is filtered off after standing for 1/2 hour and recrystallized from a methanol-ethyl acetate mixture. The propionyl compound obtained in this way melts at 250-260 with decomposition.
Elemental analysis: C = 41.91%, H = 3.45 0/0, N = 12.26 0 / a, S = 28.170 / a.
The ultraviolet spectrum in fine spirits shows three bands at 245 mu (log s = 3.78), at 302 m, y (log E = 3.51) and at 390 mlt- (log a = 4.05), it is identical to that of holomycin. In the infrared spectrum in potassium bromide are u. a. the following bands are visible:
2.88 lt, 3.06 / c, 3.16 / i, 3.25, u, 3.30, u, 6.02 lt, 6.09 <I> lt., </I> 6.25 Y, 6.43, u, 6.84, u, <I> 7.07 </I>, u, 7.26, u, 7.42, u, <I> 7.71 </I> < B> 11 </B> <I>, </I> 8.10, u, 8.45, u, <I> 9.27 </I>, u, 9.52 / c, 11.20 < B> 11 </B> <I>, </I> 12.15 /., 12.68 /, c, 14,
15 lt and 15.50, u.
c) A solution of 110 mg of the hydrochloride of deacetylated holomycin in 18 cm3 of water is mixed with 2 cm3 of butyric anhydride while stirring, the butyryl compound separating out in the form of orange-yellow crystals. It is recrystallized from methanol, F.215-218.
Elemental analysis: C = 44.57 0/0, H = 4.25%, N = 11.56%, S = 26.10%.
The ultraviolet spectrum in fine spirits shows three bands at 245 mli (log E = 3.78), at 302 mlt (log @ = 3.51) and at 390 <I> with </I> (log s = 4.05 ) and is identical to that of the holothin. In the infrared spectrum in potassium bromide are i.a. the following bands visible:
2.89 lt, 3.08 lt, 3.17 / i, 3.30 3.35 6.01 / i, 6.09 p, 6.25 lt, 6.47 / 1, <I> 6.84 </I> lt, 7.41 <I> 7.47 </I> / i, <I> 7.71 </I> y., 7.797.95 / r, 8.20, u, 8.39 / 1, 9.15, u, 9.50 / c, l0.50 lt, 11, <B> 1 </B> 8 / i, 11.33 / i, 12.15 / i, <B> 1 </B> 2,
75 / i, 13.05 lt, 14; 25/1., 15.25 <I>, </I> 11, and 15.55 ct.