Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Glutaminsäureloristalle
Optisch aktive Glutaminsäurekristalle können in zwei Arten klassifiziert werden. Eine umfasst Kristalle von korniger und prismatischer Form und die andere besitzt Nadel-, Tafel-oder Schuppenform. Die erstere setzt sich ausgezeichnet ab und hat ausgezeichnete Filtrier-und freifliessende Eigenschaften sowie ein geringes spezifisches Volumen, während die letztgenannte die umgekehrten Eigenschaften und ein grosses spezifisches Volumen besitzt. Vom industriellen Standpunkt aus gesehen ist die erstgenannte Modifikation erwünschter als die letztgenannte, beispielsweise beim Abtrennen von Glutaminsäurekristallen und beim Transport derselben.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Glutaminsäurekristalle, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man zu einer wässrigen Lösung optisch aktiver Glutaminsäure mindestens eine der Aminosäuren Phenylalanin, Leucin, Tyrosin, Cystin, Asparaginsäure, Lysin, Histidin, Arginin und Alanin hinzufügt und anschliessend kristallisieren lässt.
Es wurde gefunden, dass die oben erwähnten körnigen und prismatischen Kristalle optisch aktiver Glutaminsäure zu dem sog. a-Typ des Rhombischen Systems [die Gitterkonstanten a = 7, 06, b = 10, 3, c = 8, 75, Bernal, Z. Kryst., 78 363 (1931)] und die nadel-, tafel-oder schuppenförmigen Kristalle zu dem / ?-Typ des Rhombischen Systems [die Gitterkonstanten : a = 5, 17, b = 17, 34, c = 6, 95, Acta Cryst., 8, 637 (1955)] gehören. (Weidman erwähnt im USA Patent Nr. 2 683 739, dass zum monoklinen System gehörende L-Glutaminsäurekristalle existenzfähig sind und erklärt die Gewinnung derselben und ihre Gitterkonstanten.
Nach den durchgeführten Versuchen ergab sich jedoch, dass die nach dem im USA-Patent mitgeteilten Verfahren hergestellten Kristalle zur a-Form des Rhombischen Systems gehören.) Die Kristalle mit körniger oder prismatischer Form werden nachstehend der Einfachheit halber mit a-Form bezeichnet und die nadelförmigen, tafelförmigen oder schuppenartigen Kristalle mit ss-Form .
Die a-Form besitzt zahlreiche technische Vorteile, wie schon vorstehend erwähnt (vgl. Tafel 1), während die -Form ziemlich stabil ist. Unter gewöhnlichen Bedingungen kristallisiert immer die ?-Form aus.
Selbst nach Kristallisation der a-Form geht diese all mählich in die -Form über, wenn man sie eine längere Zeit hindurch stillstehen lässt. Beispielsweise bilden sich beim Abkühlen einer heissen wässrigen Lösung optisch aktiver Glutaminsäure Kristalle zu 95-100 / (, Kristalle der -Form.
Tabelle
Vergleich der Eigenschaften der beiden Formen optisch aktiver Glutaminsäurekristalle a-Form des rhombischen Systems @-Form des rhombischen Systems Form körnig oder prismatisch nadel-, tafel-oder schuppenförmig Absitzvermögen der Kristalle in sehr gut schlecht einer diese enthaltenden Aufschlämmung
Tabelle (Fortsetzung) a-Form des rhombischen Systems 5-Form des rhombischen Systems Form körnig oder prismatisch nadel-, tafel-oder schuppenförmig Filtrationsvermögen der Kristalle gut (schnelle Filtration, schlecht (langsame Filtration, aus einer diese enthaltenden hoher Entwässerungsgrad ; der geringer Entwässerungsgrad ; Aufschlämmung Wassergehalt nach Abnutschen bei normalem Abnutschen beträgt beträgt 5-10 /o) der Wassergehalt 15-40 O/o) Spez.
Volumen der trockenen 1, 3-1, 4 Kristalle 2-3 Freies Fliessvermögen der gut schlecht trockenen Kristalle
In dem genannten USA-Patent ist beschrieben, dass Kristallgemische mit einem geringen Gehalt an ¯-Kristallen bei schneller Zufügung, einer Säure oder eines Alkalis zu einer wässrigen Lösung von L-Mononatriumglutamat oder L-Glutaminsäurehydrochlorid von vergleichsweise niedriger Konzentration (niedriger als 20 o/o Glutaminsäure) zur Einstellung des pH von 2, 5 bis 4, 0 anfallen können. Jedoch geht während der Reifezeit für eine ausrechende Kristallisation die ur sprünglich auskristallisierte Form nach und nach in die ¯-Form über, schliesslich 100 /aig.
Die Umwandlungsgeschwindigkeit variiert stark in Abhängigkeit von der Temperatur und wächst mit steigender Temperatur. Beispielsweise benötigt die vollständige Umwandlung in die ss-Form bei 20 C 20-30 Stunden, während sie bei einer Temperatur von 50 C nur 10-20 Minuten dauert.
Aus den vorstehend erwähnten Tatsachen ergibt sich, dass es schwierig ist, optisch aktive Glutaminsäurekristalle mit wenig ss-Kristallen zu erhalten, da letztere stabiler sind. Es wurde durch Versuche festgestellt, dal3 die Kristallisation in ¯-Form bzw. der Übergang der Kristalle in die ¯-Form verzögert werden kann durch einen Zusatz von mehr als 0, 02 Gew. /a (auf Wassergehalt der Lösung berechnet) von Phenylalanin, Leucin, Tyrosin, Cystin, AsparaginsÏure, Lysin, Histidin, Arginin und Alanin, einzeln oder in beliebigem Gemisch, vor der Kristallisation.
Auf Grund dieser Feststellung konnte das Verfahren zur Herstellung optisch aktiver Glutaminsäurekristalle in a-Form verbessert werden, welch letztere gutes Absitz-und Filtrationsvermögen sowie freie Fliessbeschaffenheit und geringes Packvolumen auf Grund des äusserst geringen Gehaltes an ¯-Form besitzen.
Die Kristallisation von optisch aktiver Glutaminsäure kann entweder durch Kühlen einer heissen ge sättigten Lösung (Kühlmethode) oder durch Konzentrierung einer Lösung unter vermindertem Druck (Konzentrationsmethode) oder auch durch Neutralisieren einer Lösung von Mononatriumglutamat oder Glutaminsäurehydrochlorid auf den isoelektrischen Punkt der Glutaminsäure (Neutralisationsverfahren) erfolgen.
Bei Anwendung der letzteren Methode liegt die Konzentration an Glutaminsäure in der Lösung vorzugsweise unter 204)/o. Wenn beispielsweise vier wässrige L-Glutaminsäurehydrochlorid in Konzentrationen von 10, 15, 20 und 25 ouzo (berechnet als Glut aminsäure) enthaltende Lösungen nach Zusatz von 0, 02% Tyrosin und Einstellung des pH auf 3, 2 mit 15"/aiger wässrigen NaOH-Lösung versetzt werden, erhält man die L-Glutaminsäurekristalle in ¯-Form in den nachstehend in Prozenten angegebenen Mengen :
Glutaminsäurekonzentration Gehalt an ¯-Form
10% 15% 1511/o 150/o
20% 24%
25% 100%
Beispielsweise wurden zu einer 85 C heissen ge sättigten wässrigen Lösung von L-Glutaminsäure 150 mg Phenylalanin auf 100 cm3 Wasser zugefügt und auf 20 C abgekühlt und 24 Stunden bei dieser Temperatur gereift und die Kristalle abgetrennt. In gleicher Weise wurde, jedoch ohne Zufügung von Phenylalanin, eine Kristallisation vorgenommen.
Die Ergebnisse an ss-Form-Gehalt in beiden Beispielen in den so gewonnenen L-Glutaminsäure-Kristallen nach der Röntgenpulveruntersuchung waren folgende :
Bei Abwesenheit von
Phenylalanin ¯-Gehalt 1000/o
Bei Anwesenheit von Phenylalanin 3-Gehalt 10 //a
Die Verzögerung der Kristallumwandlung in die ss-Form zeigt folgenden Versuch : 5 g L-Glutaminsäurekristalle mit einem Gehalt von 9, 5 O/o der ¯-Form wurden mit 30 cm3 einer wässrigen, 100 mg Tyrosin auf 100 cm3 Wasser enthaltenden Lösung bei 50 C gerührt. Die Experimente wurden hinsichtlich der anderen Aminosäuren in gleicher Weise durchgeführt.
In jedem Fall ergab sich nach 60 Min. die Menge des Oberganges in die ¯-Form als sehr gering. Ein Gegenversuch wurde in gleicher Weise durchgeführt, jedoch ohne Zusatz einer Aminosäure. In diesem Fall waren alle Kristalle schon nach 20 Min. in die ¯-Form übergegangen.
Die Untersuchung des Pulvers nach der Röntgenmethode ergab den nachstehend aufgeführten Gehalt an ss-Kristallen : Zugesetzte Gehalt an Versuchsdauer AminosÏure ¯-Kristallen Gegenversuch 20 Min. 100 lo Asparaginsäure 60 52 /o Phenylalanin 60 43 /o Tyrosin 60 28 /o Leucin 60 48 /o Cystin 60 54 /o Lysin 60 53 /o Histidin60 75"A Arginin 60 78 /o Alanin 60 59 /0
Es ergab sich, dass die Gesamtmenge einer einzelnen oder mehrerer der beigefügten genannten Aminosäuren vorteilhaft mindestens 0, 02 /o beträgt.
Mit geringen Mengen von Aminosäure ist die Verzöge- rungswirkung auf die Umwandlungsgeschwindigkeit der Kristallkerne bzw. der Kristalle in die ¯-Form für praktische Zwecke zu gering.
Beispielsweise wurden 0, 00, 0, 01, 0, 02, 0, 05 und 0, 1"/a Lysin zu vier heissen, mit L-Glutaminsäure bei 850C gesättigten wässrigen Lösungen zugefügt und dann auf 20 C abgekühlt. Die hierbei abgeschiedenen Kristalle von L-Glutaminsäure ergaben bei den einzelnen Versuchen die nachstehend aufgeführten Mengen an lS-Kristallen :
Zugefügte Gehalt an
Lysinmenge S-Kristallen
0, 00 /o 100 19
0, 01% 53%
0, 02% 25%
0, 05 /0 21 lo
0, 10% 17%
Die Gegenwart einer die Löslichkeit der genannten Aminosäuren übersteigenden Menge an Aminosäuren in einer sauren Glutaminsäurelösung bei Zimmertemperatur verringert den Reinheitsgrad an auszukristallisierender optisch aktiver Glutaminsäure und ist daher unerwünscht. Obgleich reine Aminosäure vorzuziehen ist, können doch Hydrolysate von Wolle, Seidenfibroin und dergleichen Protein verwendet werden, welche mehr oder weniger der erwähnten Aminosäuren enthalten.
Mutterlaugen, aus welchen optisch aktive Glutaminsäurekristalle abgetrennt worden sind, können aus Sparsamkeitsgründen wiederholt für denselben Zweck verwendet werden, solange sich nicht zu viele Verunreinigungen darin angesammelt haben.
Beispiel 1
Zu 200 g einer 12, 7% wϯrigen L¯sung von L-Mononatriumglutamatmonohydrat wurden 70 mg L-Asparaginsäure zugefügt. Dann wurden 13, 5 cm3 einer 10n-Salzsäure zur Lösung zugefügt, um das pH auf 3, 2 einzustellen, und 2 Stunden lang ger hrt.
Nach 20 Stunden langem Stehen bei 20 kristallisierte L-Glutaminsäure aus. Die Kristalle wurden abfiltriert und mit dem gleichen Volumen Wasser gewaschen und getrocknet. Die so erhaltenen 16, 8 g L-Glutaminsäurekristalle enthielten 7, 8% ¯-Form.
Unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Zu fügung von Aminosäure, wurden L-Glutaminsäurekristalle mit einem Gehalt von 80 /o ss-Form gewonnen.
Beispiel 2
400 mg L-Tyrosin wurden in einem Liter Wasser gelöst. Der Lösung wurden 80 g nadelförmige L Glutaminsäurekristalle (100 /o ?-Form) zugefügt und auf 90 zwecks Lösung der Kristalle erhitzt, und dann auf 20¯ unter einstündigem fortgesetztem Rühren abgek hlt. Die gebildeten Kristalle wurden abgetrennt und getrocknet. Die trockenen Kristalle hatten ein Gewicht von 58 g, wobei 970 cm3 Mutterlauge abgetrennt waren. Zu dieser Mutterlauge wurden 65 g nadelförmige L-Glutaminsäurekristalle zugefügt und das Gemisch auf 90 erhitzt. Die erhaltene Lösung wurde auf 20 zur Auskristallisation der L-Glutaminsäure abgek hlt.
Diese Arbeit wurde dreimal durchgeführt und insgesamt 320 g L-Glutaminsäurekristalle mit einem Gehalt von 4, 0 /o ¯-Form aus 340 g nadelförmigen Kristallen gewonnen.
Unter denselben Versuchsbedingungen, jedoch ohne Zusatz von Tyrosin, wurden 97%, ¯-Kristalle erhalten.
Beispiel 3
300 g nadelförmige D-Glutaminsäurekristalle mit einem Zusatz von 10 g DL-Leucin wurden in 10 Liter Wasser gelöst und das Gemisch zur Lösung auf 70 erhitzt. Die Lösung wurde unter verringertem Druck bei 50-55 ungefähr auf 1/4 des Volumens konzentriert und 10 Stunden bei 20 gerührt, und die dann gebildeten Kristalle abfiltriert. 255 g getrocknete D Glutaminsäurekristalle mit einem Gehalt von 3, 5% ¯-Form wurden hierbei erhalten. Die unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Zusatz von DL-Leucin erhaltenen D-Glutaminsäurekristalle fielen zu 100 /o in der ¯-Form an.
Beispiel 4
Zu 200 g einer 12, 5 /o wässrigen L-Glutaminsäurehydrochloridlösung wurden 5 g entfärbte Salzsäurehydrolysate von Wolle mit einem Gehalt von 1, 5 /e Cystin und 2 /o Leucin hinzugefügt und das pH auf 3, 2 durch Zusatz von 14 cm ? einer lOn-Atz- natronlösung eingestellt. Das Rühren wurde etwa 2 Stunden lang fortgesetzt und die L¯sung 20 Stunden lang bei 20 auskristallisiert. Die erhaltenen Kristalle wurden mit dem gleichen Volumen Wasser ausgewaschen.
Es ergaben sich 16, 2 g getrocknete L-Glutaminsäurekristalle mit einem Gehalt von 6, 3 O/o in ss-Form. Unter denselben Bedingungen, jedoch ohne Zusatz von Hydrolysat erhaltene L-Glutaminsäure- kristalle enthielten 87 /o ss-Form.
Process for the production of optically active glutamic acid crystals
Optically active glutamic acid crystals can be classified into two types. One includes crystals of granular and prismatic shapes and the other has needle, tabular or scale shape. The former settles excellently and has excellent filtering and free-flowing properties and a low specific volume, while the latter has the opposite properties and a large specific volume. From the industrial point of view, the former modification is more desirable than the latter, for example in the separation of glutamic acid crystals and the transportation thereof.
The present invention relates to a method for producing optically active glutamic acid crystals, which is characterized in that at least one of the amino acids phenylalanine, leucine, tyrosine, cystine, aspartic acid, lysine, histidine, arginine and alanine is added to an aqueous solution of optically active glutamic acid and then lets crystallize.
It was found that the above-mentioned granular and prismatic crystals of optically active glutamic acid belong to the so-called a-type of the rhombic system [the lattice constants a = 7.0, b = 10, 3, c = 8, 75, Bernal, Z. Kryst., 78 363 (1931)] and the needle-, tab- or scale-shaped crystals of the /? -Type of the rhombic system [the lattice constants: a = 5, 17, b = 17, 34, c = 6, 95, Acta Cryst., 8, 637 (1955)]. (Weidman mentions in US Pat. No. 2,683,739 that L-glutamic acid crystals belonging to the monoclinic system are capable of existence and explains how they are obtained and their lattice constants.
After the tests carried out, however, it was found that the crystals produced according to the process reported in the USA patent belong to the a-shape of the rhombic system.) The crystals with granular or prismatic shape are referred to below for simplicity with a-shape and the needle-shaped , tabular or scale-like crystals with ss-shape.
The a-form has numerous technical advantages, as already mentioned above (see Table 1), while the -form is quite stable. Under normal conditions the? Form always crystallizes out.
Even after the a-form has crystallized, it gradually changes to the -form if it is left to stand still for a long time. For example, when a hot aqueous solution of optically active glutamic acid is cooled, crystals of 95-100 / (, crystals of the form.
table
Comparison of the properties of the two forms of optically active glutamic acid crystals a-form of the rhombic system @ -form of the rhombic system Shape granular or prismatic needle, tabular or flaky Settling ability of the crystals in very good bad a slurry containing them
Table (continued) a-shape of the rhombic system 5-shape of the rhombic system shape granular or prismatic needle-, tabular or flaky filtration capacity of the crystals good (fast filtration, poor (slow filtration, from a high degree of drainage containing them; the low degree of drainage ; Slurry water content after suction extraction with normal suction extraction is 5-10 / o) the water content 15-40 O / o) spec.
Volume of the dry 1, 3-1, 4 crystals 2-3 Free flow of the good, poorly dry crystals
In the above-mentioned USA patent it is described that crystal mixtures with a low content of ¯ crystals can be added quickly, an acid or an alkali to an aqueous solution of L-monosodium glutamate or L-glutamic acid hydrochloride of a comparatively low concentration (lower than 20 o / o Glutamic acid) to adjust the pH from 2.5 to 4.0. However, during the ripening period for adequate crystallization, the originally crystallized form gradually changes into the ¯ form, finally 100 / aig.
The rate of conversion varies greatly depending on the temperature and increases with increasing temperature. For example, complete conversion to the ss-form takes 20-30 hours at 20 ° C, while it takes only 10-20 minutes at a temperature of 50 ° C.
From the above-mentioned facts, it is difficult to obtain optically active glutamic acid crystals with few β-crystals because the latter are more stable. Experiments have shown that crystallization in ¯ form or the transition of the crystals to ¯ form can be delayed by adding more than 0.02 wt. / A (calculated on the water content of the solution) of phenylalanine, Leucine, tyrosine, cystine, aspartic acid, lysine, histidine, arginine and alanine, individually or in any mixture, before crystallization.
On the basis of this finding, the process for the production of optically active glutamic acid crystals in a-form could be improved, the latter having good settling and filtration properties as well as free flow properties and low packing volume due to the extremely low content of ¯-form.
The crystallization of optically active glutamic acid can be done either by cooling a hot saturated solution (cooling method) or by concentrating a solution under reduced pressure (concentration method) or by neutralizing a solution of monosodium glutamate or glutamic acid hydrochloride to the isoelectric point of glutamic acid (neutralization method).
When using the latter method, the concentration of glutamic acid in the solution is preferably below 204%. For example, if four aqueous L-glutamic acid hydrochloride in concentrations of 10, 15, 20 and 25 ouzo (calculated as glutamic acid) containing solutions after adding 0.02% tyrosine and adjusting the pH to 3.2 with 15 "/ aiger aqueous NaOH If the solution is added, the L-glutamic acid crystals are obtained in ¯-form in the following percentages:
Glutamic acid concentration ¯-form content
10% 15% 1511 / o 150 / o
20% 24%
25% 100%
For example, 150 mg phenylalanine per 100 cm3 of water were added to a saturated aqueous solution of L-glutamic acid at a temperature of 85 ° C. and the mixture was cooled to 20 ° C. and matured at this temperature for 24 hours and the crystals were separated off. Crystallization was carried out in the same way, but without the addition of phenylalanine.
The results of the ss-form content in both examples in the L-glutamic acid crystals obtained in this way after the X-ray powder examination were as follows:
In the absence of
Phenylalanine ¯ content 1000 / o
In the presence of phenylalanine 3 content 10 // a
The following experiment shows the delay in the crystal transformation into the ss-form: 5 g of L-glutamic acid crystals with a content of 9.5% of the ¯-form were mixed with 30 cm3 of an aqueous solution containing 100 mg of tyrosine per 100 cm3 of water at 50 C stirred. The experiments were carried out in the same way with respect to the other amino acids.
In any case, the amount of transition into the ¯-form was found to be very small after 60 minutes. A counter-experiment was carried out in the same way, but without the addition of an amino acid. In this case, all of the crystals had changed to the ¯ shape after just 20 minutes.
Examination of the powder by the X-ray method gave the following content of SS crystals: Added content of test duration Amino acid ¯ crystals Counter-experiment 20 min. 100 lo Aspartic acid 60 52 / o Phenylalanine 60 43 / o Tyrosine 60 28 / o Leucine 60 48 / o Cystine 60 54 / o Lysine 60 53 / o Histidine 60 75 "A Arginine 60 78 / o Alanine 60 59/0
It was found that the total amount of a single or more of the attached amino acids mentioned is advantageously at least 0.02 / o.
With small amounts of amino acid, the retarding effect on the rate of conversion of the crystal nuclei or the crystals into the ¯ form is too small for practical purposes.
For example, 0, 00, 0, 01, 0, 02, 0, 05 and 0, 1 "/ a lysine were added to four hot aqueous solutions saturated with L-glutamic acid at 850 ° C. and then cooled to 20 ° C. The crystals separated out of L-glutamic acid resulted in the following amounts of IS crystals in the individual experiments:
Added salary to
Amount of lysine in S crystals
0.00 / o 100 19
0.01% 53%
0.02% 25%
0, 05/0 21 lo
0, 10% 17%
The presence of an amount of amino acids in an acidic glutamic acid solution at room temperature that exceeds the solubility of the amino acids mentioned reduces the degree of purity of the optically active glutamic acid to be crystallized and is therefore undesirable. Although pure amino acid is preferred, hydrolysates of wool, silk fibroin and the like protein which contain more or less of the amino acids mentioned can be used.
Mother liquors from which optically active glutamic acid crystals have been separated can, for reasons of economy, be used repeatedly for the same purpose, as long as too many impurities have not accumulated therein.
example 1
70 mg of L-aspartic acid were added to 200 g of a 12.7% aqueous solution of L-monosodium glutamate monohydrate. Then 13.5 cm3 of 10N hydrochloric acid were added to the solution in order to adjust the pH to 3.2, and the mixture was stirred for 2 hours.
After standing at 20 for 20 hours, L-glutamic acid crystallized out. The crystals were filtered off and washed with an equal volume of water and dried. The 16.8 g of L-glutamic acid crystals thus obtained contained 7.8% ¯ form.
L-glutamic acid crystals with a content of 80 / o ss-form were obtained under the same conditions, but without adding amino acid.
Example 2
400 mg of L-tyrosine were dissolved in one liter of water. 80 g of acicular L-glutamic acid crystals (100 / o? Form) were added to the solution and heated to 90 ° to dissolve the crystals, and then cooled to 20 ° with continued stirring for one hour. The crystals formed were separated and dried. The dry crystals had a weight of 58 g, with 970 cm3 of mother liquor having separated off. To this mother liquor, 65 g of acicular L-glutamic acid crystals were added and the mixture was heated to 90 °. The solution obtained was cooled to 20 to allow the L-glutamic acid to crystallize out.
This work was carried out three times and a total of 320 g of L-glutamic acid crystals with a content of 4.0 / o ¯ -form were obtained from 340 g of needle-shaped crystals.
Under the same experimental conditions, but without the addition of tyrosine, 97% ¯ crystals were obtained.
Example 3
300 g of needle-shaped D-glutamic acid crystals with an addition of 10 g of DL-leucine were dissolved in 10 liters of water and the mixture was heated to 70 ° to dissolve. The solution was concentrated to about 1/4 volume under reduced pressure at 50-55 and stirred at 20 for 10 hours, and the crystals then formed were filtered off. 255 g of dried D glutamic acid crystals with a content of 3.5% ¯ -form were obtained here. 100% of the D-glutamic acid crystals obtained under the same conditions, but without the addition of DL-leucine, were obtained in the ¯ form.
Example 4
To 200 g of a 12.5 / o aqueous L-glutamic acid hydrochloride solution, 5 g of decolored hydrochloric acid hydrolysates of wool with a content of 1.5 / e cystine and 2 / o leucine were added and the pH was increased to 3.2 by adding 14 cm? a lOn caustic soda solution. Stirring was continued for about 2 hours and the solution crystallized at 20 for 20 hours. The crystals obtained were washed out with an equal volume of water.
There were 16.2 g of dried L-glutamic acid crystals with a content of 6.3% in ss form. L-glutamic acid crystals obtained under the same conditions, but without the addition of hydrolyzate, contained 87 / o ss-form.