Verfahren zur Spaltung von Racematen von bicyclisch-alicyclischen Verbindungen Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Spaltung von Raeematen von bicy- clisch-alicyclischen Verbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man auf Racemate von bi- eyclisch-alicyclischen Verbindungen, die mindestens eine Oxogruppe aufweisen, Kulturen von Mikro organismen,
welche eine Oxogruppe unter Ausbil dung eines neuen Asymmetriezentrums zu reduzieren vermögen, oder entsprechende Enzyme einwirken lässt, wobei mindestens in einem der optisch aktiven Antipoden die Oxogruppe zur Oxygruppe reduziert wird, und dass man mindestens eine der optisch akti ven Verbindungen isoliert und gegebenenfalls auf eines der entstandenen Hydrierungsprodukte dehy drierende Mittel einwirken lässt.
Als Ausgangsstoffe für das neue Verfahren kom men allgemein Oxoverbindungen der Hydronaphtha- lin- oder der Hydroindenreihe in Betracht, beispiels weise der Dihydro-, Tetrahydro-, Hexahydro-, Octa- hydro- oder Dekahydronaphthalinreihe oder der Di- hydro-, Tetrahydro-,
Hexa- oder Octahydroinden- reihe. Sie können weiter beliebig substituiert sein. Als Substituenten kommen - neben mindestens einer Oxogruppe - besonders in Frage freie bzw.
funk tionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxyl- gruppen, wie Ester-, Amido-, Nitril-, Äther-, Thio- ester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen,
an beliebiger Stelle des Naphthalin- resp. des Inden-Gerüstes, ferner Halogenatome oder Epoxygruppen. Weiter können die Ausgangsstoffe aliphatische Seitenketten besitzen, z. B. substituierte oder unsubstituierte Alkylreste, wie Methyl-, Äthyl-, Propyl-, Isopropylreste, ferner z.
B. durch freie oder funktionell abgewandelte Oxy-, Oxo- oder Carboxyl- gruppen substituierte Methyl-, Äthyl- oder Propyl- Reste. Solche Ausgangsstoffe sind u. a. das
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d,1-8-Oxo-dekalin,
<tb> d,1-3,8-Dioxo-dekalin,
<tb> d,1-8-Oxo-9-methyl-dekalin,
<tb> d,1-3,8-Dioxo-9-methyl-dekalin,
<tb> d,1-3-Oxy-8-oxo-9-methyl-dekalin,
<tb> d,1-44.1o-3-Oxo-octalin,
<tb> d,1-44.10-3,8-Dioxo-octalin,
<tb> d,1-44#10-3,8-Dioxo-9-methyl-octalin <SEP> und <SEP> seine
<tb> Enolderivate, <SEP> wie <SEP> z. <SEP> B.
<tb> d,1-43.4;
10,5-3-Alkoxy- <SEP> oder <SEP> -Acyloxy-8-oxo-9 methyl-hexahydronaphthaline,
<tb> d,1-44,10-3 <SEP> ,8-Dioxo-9-methyl-4-carboxymethyl-,
<tb> -carboxyäthyl-, <SEP> -carboxypropyl-octaline <SEP> und
<tb> ihre <SEP> funktionellen <SEP> Derivate,
<tb> d,1-41,2-3-Oxo-4,7-dioxy-9-methyl-octalin,
<tb> <B>d,1-,d1,2-3</B> <SEP> - <SEP> Oxo-6,7-isopropyliden-dioxy-9-methyl octalin,
<tb> d,1-d1.2 <SEP> ;
<SEP> 0.7-3-Oxo-9-methyl-hexahydro-naphthalin,
<tb> d,1-1-Oxo-octahydro-inden,
<tb> d,1-1-Oxo-8-methyl-octahydro-inden,
<tb> d,1-1-Oxo-5-oxy-8-methyl-octahydro-inden,
<tb> d,1-1,5-Dioxo-8-methyl-octahydro-inden,
<tb> d,1-44>9-1,5-Dioxo-8-methyl-hexahydro-inden
<tb> und <SEP> seine <SEP> Enolderivate, <SEP> wie <SEP> z. <SEP> B.
<tb> d,1-44,5;3,9_1-Oxo-5-alkoxy- <SEP> oder <SEP> -acyloxy-3 methyl-tetrahydro-indene,
<tb> d,1-44>9-1,5-Dioxo-8-methyl-4-carboxymethyl-,
<tb> -carboxyäthyl-, <SEP> -earboxypropyl-hexahydro indene <SEP> oder <SEP> deren <SEP> funktionelle <SEP> Derivate.
Es wurde die überraschende Beobachtung ge macht, dass bei der verfahrensgemässen Reduktion die enantiomorphen Formen der genannten Racemate je nach der Konstitution des Ausgangsstoffes mit glei cher oder verschiedener Geschwindigkeit umgewan delt werden. So werden z.
B. Racemate der d4.io- 3,8-Dioxo-9-methyl-octalinreihe bei der Einwirkung der genannten Enzyme in zwei diastereoisomere Hy- drierungsprodukte übergeführt, das heisst, die Um setzung der beiden enanthiomorphen Formen erfolgt mit praktisch gleicher Geschwindigkeit.
Die erhaltenen Diastereoisomeren unterscheiden sich in ihren physikalischen Eigenschaften und kön nen infolgedessen leicht voneinander getrennt und in reiner Form isoliert werden.
Unterschiede in der Reaktionsgeschwindigkeit der beiden enantiomorphen Formen werden beispielsweise bei der erfindungsgemässen Reduktion von Race- maten der 44,9-1,5-Dioxo-8-methyl-hexahydro-inden- reihe beobachtet. In diesen Fällen wird praktisch nur eine enantiomorphe Form des Ausgangsstoffes redu ziert, die andere bleibt unverändert.
Man kann die erhaltenen optisch aktiven Hydrie- rungsprodukte dehydrieren und so zu den enantio- morphen Formen der Ausgangsstoffe gelangen.
Die nachstehenden beiden Beispiele dienen zur Illustration der oben erwähnten Beobachtung.
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Racemat
EMI0002.0026
EMI0002.0027
Racemat
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Das Verfahren wird vorteilhaft in der Weise durchgeführt, dass man auf den Ausgangsstoff die Kultur eines einzigen Mikroorganismus einwirken lässt. Es kann aber auch so vorgegangen werden, dass man in einem Arbeitsgang mehrere Kulturen auf den Ausgangsstoff einwirken lässt, wobei es sich als vorteilhaft erwiesen hat, die Einwirkung der einzel nen Kulturen zeitlich nacheinander vorzunehmen. Alle diejenigen Mikroorganismen sind für das Verfahren geeignet, die die Ausgangsstoffe zu redu zieren vermögen.
Nachstehend sind einige Beispiele angeführt:
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Saccharomyces <SEP> cerevisiae,
<tb> Bacterium <SEP> putrificus,
<tb> Streptomyces <SEP> coelicolor,
<tb> Streptomyces <SEP> lavendulae,
<tb> Curvularia <SEP> falcata,
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans,
<tb> Rhizopus <SEP> arrhizus,
<tb> Ophiobolus <SEP> herpotrichus. Die in dieser Zusammenstellung figurierenden Mikroorganismen sind Pilze oder Bakterien, z. B. von der Klasse der Actinomyceten.
Zur Durchführung des Verfahrens kann man die Ausgangsstoffe mit Kulturen der genannten Mi kroorganismen unter an sich bekannten anaeroben, ferner auch aeroben Bedingungen inkubieren. Das Wachstum erfolgt in Oberflächenkultur oder, tech nisch vorteilhafter, submers, wobei man schüttelt oder rührt. Die Kulturen enthalten assimilierbaren Kohlen stoff, insbesondere Kohlehydrate, sowie gegebenen falls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind so- mit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar.
Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sog. Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Ent wicklung der Kulturen gibt man die genannten Aus gangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, bei spielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter.
Schliesslich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und;'oder die Mycel- masse und isoliert aus dem Extrakt die d-Formen und/oder die 1-Formen der Hydrierungsprodukte und(oder enantiomorphe Formen der Ausgangsmate rialien in an sich bekannter Weise, z.
B. durch Ent- mischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen und dergleichen. Man kann auch die wirksamen Enzyme von den Kulturen der genannten Organismen abtrennen und unter Aus schluss der wachsenden Kulturen verwenden. So kann man z. B. das Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die genannten Aus gangsstoffe diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren. Es ist auch möglich, die Enzyme aus den Kulturen zu extrahieren, und die so erhaltenen Extrakte für die Umsetzungen zu verwenden.
Sollen in einem Arbeitsgang mehrere Mikro organismen zur Entwicklung gelangen, so kann man beispielsweise wie folgt vorgehen: Nach Entwicklung der Kulturen des ersten Organismus gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter, bis die maxi male Reaktion erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Umsetzungsprodukt zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Organismus und nötigenfalls ent sprechende Nährsubstanzen und Wuchsstoffe zu und fährt mit der Inkubation fort. Der Verlauf der ein zelnen Reduktionen kann papierchromatographisch verfolgt werden.
Allgemein ist die Racematspaltung nach dem neuen Verfahren besonders einfach, weil sich die er haltenen optisch aktiven Hydrierungsprodukte infolge ihrer verschiedenen Polarität leicht trennen lassen.
Bereits seit den klassischen Untersuchungen von Pasteur hat man zwar gelegentlich mikrobiologische Methoden zur Gewinnung des einen Antipoden aus Racematen angewandt. Dabei wurden gewöhnlich Pilze oder Bakterien verwendet, die die Ausgangs stoffe assimilierten, und zwar den natürlichen (d) Antipoden rascher als den unnatürlichen (1). Nach diesem Verfahren musste man also, um ein optisch reines Präparat zu erhalten, so lange mikrobiologisch behandeln, bis mindestens die eine Form, und zwar meist die biologisch interessantere, völlig zerstört war. Demgegenüber liefert das neue Verfahren auch bei nur teilweiser Umsetzung die Hydrierungspro- dukte in optisch reiner Form.
In den nachfolgenden Beispielen sind die Tempe raturen in Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel 1</I> In einem Schüttelgefäss werden 40 g Rohrzucker, 40 g Difco Trypton (Markenprodukt, 8 g Natrium nitrat, 4 g Dikahumphosphat, 2 g Magnesiumsulfat, 2 g Kaliumchlorid und 40 mg Ferrosulfat in 4 Liter Wasser gelöst, auf pH 7 eingestellt, mit 10 g CaCO3 versetzt, sterilisiert und mit einer Kultur von Cürvu- laria falcata beimpft.
Nach 3tägigem Schütteln bei 27 gibt man eine Lösung von 1 g d,l-d4.lo-3,8- Dioxo-9-methyl-octalin in 15 cm3 Aceton zu und lässt weiter schütteln. Nach 3 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man schüttelt die vereinigten Filtrate mit Essigester aus und wäscht die Extrakte mit verdünnter Salz säure, Kaliumhydrogencarbonatlösung und Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein.
Die pa- pierchromatographische Untersuchung des Rück standes (1,6 g) zeigt die Anwesenheit von d4,1o-3- Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin und von wenig Aus gangsmaterial. Der Rückstand wird an 80 g Alumi niumoxyd nach der Durchlaufmethode chromatogra- phiert, wobei mit Benzol, Benzol-Äther-Gemischen, Äther und mit Äther-Essigester-Gemischen eluiert wird.
Die papierchromatographische Untersuchung der einzelnen Fraktionen (je 80 cm3) zeigt, dass die ersten Benzolfraktionen Ausgangsmaterial enthalten, welches optisch inaktiv ist. In den Benzolfraktionen 5 und 6 findet sich ein negativ drehendes Öl, das mit p-Nitrobenzoylchlorid in Pyridin in sein p-Nitro- benzoyl-Derivat (F. 106,5-107,5 , [a]D = -26 ) übergeführt wird.
Es enthält kein a,ss-ungesättigtes Keton, und die Elementaranalyse passt auf die Sum menformel C18H2105N. Die mit Benzol eluierten Fraktionen 7-23 bestehen aus einem Öl, welches eine positive optische Drehung besitzt und das (+)-d4,1o- 3-Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin darstellt.
Mit Äther und mit Äther-Essigester-Gemischen wird eine stark negativ drehende, kristalline Substanz eluiert, die aus Äther - Petroläther - Gemischen umkristallisiert wird (F. 94-95 , [a]D = -129 ) und das (-)-d4.10-3-Oxo- 8 - oxy - 9 - methyl - octalin darstellt.
Analyse: Gef. C = 73,00,1/0, H = 9,0611/o; UV-Absorptionsspek- trum in Feinsprit: d."x 240 m,a (log. ± = 4,15); p-Nitro-benzoat: F. 122,5 , [a]D =<B>+87>.</B>
Das ölige (+)-d4.1o-3-Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin bildet ein kristallines p-Nitrobenzoat: F. 195 , lab = + 159 . Durch Verseifung mittels methanolischer Kalilauge wird der freie Alkohol zurückerhalten. Er wird im Hochvakuum destilliert: [a]D = + 203 , UV Absorptionsspektrum in Feinsprit: A",", 240 mu (log. s = 4,15).
<I>Beispiel 2</I> In einem Schüttelgefäss werden 4 Liter einer Nährlösung, die auf 1 Liter Leitungswasser 20 g Pepton, 5 cm3 Maisquellwasser (Comsteepliquor) und 50g Rohglukose enthält, auf pH 6,3 gestellt, sterili siert und mit einer Kultur von Ophiobolus herpo- trichus beimpft. Man lässt 3 Tage lang bei 27 schüt teln, gibt dann unter sterilen Bedingungen eine Lö sung von 1 g d,1-d4,10-3,8-Dioxo-9-methyl-octalin in 15 cm?- Aceton zu und lässt weiter bei der gleichen Temperatur schütteln.
Nach 3 Tagen wird das Mycel abgetrennt und mit Wasser und Essigester gewaschen. Man schüttelt die vereinigten Filtrate mit Essigester aus und wäscht die Extrakte mit verdünnter Salz säure, Kaliumhydrogencarbonatlösung und Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein. Die papierchromatographische Untersuchung des Rück standes (l,01 g) zeigt die Anwesenheit von 44.10-3- Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin und von Ausgangsmate rial. Der Rückstand wird wie in Beispiel 1 beschrie ben aufgearbeitet.
Man erhält neben wenig, optisch inaktivem Ausgangsmaterial das kristalline (-)-d4.10- 3-Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin (F. 94-95 , [a]D = -129 ) und das ölige (+)-44.10-3-Oxo-8-oxy-9- methyloctalin ([a]D = + 203 ).
<I>Beispiel 3</I> Beimpft man die in Beispiel 2 beschriebene Nähr lösung mit einer Kultur von Rhizopus nigricans an stelle von Ophiobolus herpotrichus, und inkubiert man auf gleiche Weise d,1-44.10-3,8-Diketo-9-methyl- octalin, so erhält man nach analoger Extraktion und Aufarbeitung neben wenig Ausgangsmaterial das kristalline () - d4.10 - 3 - Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin vom F.
94-95 , [a]D =-129 und das ölige (+)-J4.10- 3-Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin ([a]D = + 203 ).
<I>Beispiel 4</I> In einem Schüttelgefäss wird eine Lösung von 40 g Rohglucose, 20 g Pepton, 15g Fleischextrakt (Oxo, Lab. Lemco) und 20 g Natriumchlorid in 4 Liter Wasser mit 40 g Calciumcarbonat versetzt, auf pH 7,5 gebracht, sterilisiert und dann mit einer Kultur von Streptomyces coelicolor beimpft.
Nach 4tägigem Schütteln bei 27 gibt man, wie in Beispiel 1 beschrieben, eine Lösung von 1 g d,1-44.10-3,8- Dioxo-9-methyl-octalin in 15 cm3 Aceton zu und lässt weiter bei 27 schütteln. Nach 10 Tagen wird gemäss den Angaben in Beispiel 1 aufgearbeitet und chromatographiert. Man erhält neben wenig Aus gangsmaterial das kristalline (-)-d4.10-3-Oxo-8-oxy- 9-methyl-octalin vom F.
94-95 , [a]D = -126 und das ölige (+) - 44>i0 - 3 - Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin [a]D = + 203 ).
Die gemäss obigen Beispielen erhaltenen optisch aktiven Hydrierungsprodukte können wie in den fol genden zwei Beispielen beschrieben in die entspre chenden Oxoverbindungen übergeführt werden.
<I>Beispiel 5</I> Eine Lösung von 250 mg (-)-d4,1o-3-Oxo-8-oxy- 9-methyl-octalin in 4 cm3 Pyridin wird mit 4 em3 einer Pyridin-Chrom-(V1)-oxyd-Komplex-Suspension, entsprechend 340 mg Cr03, versetzt. Man lässt das Gemisch bei Zimmertemperatur stehen und gibt nach 2 Tagen 20 cm3 Wasser zu. Dann wird die Lösung im Vakuum bei 35 konzentriert und mit einem Benzol-Äther-Gemisch ausgeschüttelt. Die Extrakte werden neutral gewaschen, getrocknet und eingedampft.
Man chromatographiert den Rückstand an 8 g Aluminiumoxyd nach der Durchlaufmethode, wobei mit Benzol-Petroläther-Gemischen, Benzol, Benzol-Äther-Gemischen und mit Äther eluiert wird. Die Benzol-Petroläther- und die Benzol-Eluate ent halten ()-44.10-3,8-Dioxo-9-methyl-octalin, das aus einem Äther-Petroläther-Gemisch kristallisiert wird.
F. 50,5 , [a]D = -100 , UV-Absorptionsspektrum in Feinsprit: 2",", 244 mir (log. E = 4,10). Die mit Benzol-Äther-Gemischen und mit Äther eluierten Fraktionen enthalten noch etwas Ausgangsmaterial. <I>Beispiel 6</I> 250 mg (+)-44.10-3-Oxo-8-oxy-9-methyl-octalin werden wie in Beispiel 5 beschrieben mit Pyridin- Chromoxyd-Komplex oxydiert, aufgearbeitet und chromatographisch gereinigt.
Man erhält neben etwas Ausgangsmaterial das (+)-d4,10-3,8-Dioxo-9-methyl- octalin, das aus einem Äther-Petroläther-Gemisch umkristallisiert wird. F. 50 , [a]D = + 100 , UV Absorptionsspektrum in Feinsprit: i:"," <I>244</I> my, (log. E = 4,10).
<I>Beispiel 7</I> In einem Schüttelgefäss werden 40 g Rohrzucker, 40 g Difco Trypton, 8 g Natriumnitrat, 4 g sek. Ka- liumphosphat, 2 g Magnesiumsulfat und 40 mg Ferrosulfat in 4 Liter Wasser gelöst, auf pH 7 ein gestellt, mit 10 g Calciumcarbonat versetzt, sterilisiert und mit einer Kultur von Curvularia falcata beimpft.
Man lässt die Kultur 36 Stunden bei 27 schütteln und gibt dann unter sterilen Bedingungen eine Lö sung von 430 mg d,1-A4,0-1,5-Dioxo-8-methyl-hexa- hydro-inden in 10 cm3 Aceton zu, worauf weiter bei 27 geschüttelt wird. Nach 3 Tagen trennt man das Mycel ab, wäscht es mit Aceton und Essigester. Die vereinigten Filtrate werden erschöpfend mit Essig ester extrahiert. Man wäscht die Extrakte mit ver dünnter Salzsäure, Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser, trocknet sie und dampft sie im Vakuum ein.
Der Rückstand wird an 100 g Aluminiumoxyd nach der Durchlaufmethode chromatographiert, wo bei mit Benzol, Benzol-Äther-Gemischen, Äther, Äther-Essigester-Gemischen, Essigester und Methanol eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 200 cm3) werden im Vakuum eingedampft und papierchromato- graphisch (System Propylenglykol-Toluol) untersucht.
In den ersten beiden Benzol-Fraktionen befinden sich nur ölige Verunreinigungen, während die weiteren mit Benzol eluierten Fraktionen eine Substanz enthal ten, die sich im Papierchromatogramm wie Ausgangs material verhält (Rr = 0,68). Diese Fraktionen wer den vereinigt und im Hochvakuum destilliert. Aus einem Ätller-Petroläther-Gemisch erhält man Kri stalle, die bei 58-60 schmelzen, [a]D = -3l2 (in Benzol). Das UV- und IR-Absorptionsspektrum ist identisch mit demjenigen des Ausgangsmaterials.
Die Substanz stellt somit das 1-A4.0-1,5-Dioxo-8-methyl- hexahydro-inden dar. Die mit Benzol-Äther-Gemischen <B>(19:</B> 1 und 9 : 1) eluierten Anteile bestehen aus d-44.9-5-Oxo-l-oxy-8- methyl-hexahydro-inden, das einen RF-Wert von 0,12 besitzt und in Form eines rechtsdrehenden und UV-absorbierenden Öls gewonnen wird.
Mit Benzol- Äther-Gemischen (4 : 1) werd-,n kleine Mengen eines linksdrehenden und UV-absorbierenden Öls eluiert, das sich papierchromatographisch gleich verhält und das 1-J4.9-5-Oxo -1- oxy- 8 -methyl-hexahydro-inden darstellt. Die mit Äther, Äther-Essigester-Gemischen, Essigester und Methanol eluierten Fraktionen zeigen keine optische Aktivität.
<I>Beispiel 8</I> In einem Erlenmeyerkolben werden 100 cms Bierwürze sterilisiert und mit einer Kultur von Rhizopus nigricans beimpft. Nach 24stündigem Schütteln bei 25 gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,1-44,9-1,5-Dioxo-8-methyl- hexahydro-inden in 1,5 cm3 Aceton zu. Man lässt weitere 5 Tage bei<B>25-1</B> schütteln und extrahiert dann die Kultur mit Essigester.
Die Prüfung des Extrak tionsrückstandes im Papierchromatogramm zeigt die Anwesenheit von 1-a4.9-1,5 - Dioxo - 8 - methyl-hexa- hydro-inden (R1,. = 0,68), von d-44,9-5-Oxo-l-oxy-8- methyl-hexahydro-inden (RF = 0,12) und von einer weiteren UV-absorbierenden Substanz vom RF - 0,05.
<I>Beispiel 9</I> In einem Erlenmeyerkolben werden 100 em3 einer sterilen Nährlösung, die auf 1 Liter Leitungs wasser 20 g Pepton, 5 cm3 Maisquellwasser und 50 g Glukose enthält, mit einer Kultur von Ophiobolus herpotrichus beimpft. Nach 24stündigem Schütteln bei 25 gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 30 mg d,1-44,9-1,5-Dioxo-8-methyl-hexa- hydro-inden in 1,5 cm3 Aceton zu. Man lässt weitere 5 Tage bei 25 schütteln und extrahiert dann die Kultur mit Essigester.
Die Prüfung des Extraktions rückstandes im Papierchromatogramm zeigt die An wesenheit von 1-44.9-1,5-Dioxo-8-methyl-hexahydro- inden (RF = 0,68), von d-44.9-5-Oxo-l-oxy-8-me- thyl-hexahydro-inden (RF - 0,12) und von einer weiteren UV-absorbierenden Substanz vom RF = 0,05.
<I>Beispiel 10</I> In einem Erlenmeyerkolben werden 100 em3 einer sterilen Nährlösung, die auf 1 Liter Leitungs- wasser, 10 g Glukose, 5 g Pepton, 3 g Fleisch extrakt (Oxo, Lab. Lemco), 5 g Natriumchlorid und 10 g Calciumcarbonat enthält, mit einer Kultur von streptomyces coelicolor beimpft.
Nach 24stündigem Schütteln bei 25 gibt man unter sterilen Bedingun gen eine Lösung von 30 mg d,l- 4,9-1,5-Dioxo-8-me- thyl-hexahydro-inden in 1,5 cm3 Aceton zu. Man lässt weitere 5 Tage bei 25 schütteln und extrahiert dann die Kultur mit Essigester.
Die Prüfung -=des Extraktionsrückstandes im Papierchromatogramm zeigt die Anwesenheit von 1-d4,9-1,5-Dioxo-8-methyl- hexahydro-inden (RF = 0,68) und von d-44,9-5-Oxo- 1-oxy-8-methyl-hexahydro-inden (RF = 0,68).
Process for the resolution of racemates of bicyclic-alicyclic compounds The present invention relates to a process for the resolution of racemates of bicyclic-alicyclic compounds, which is characterized in that racemates of bicyclic-alicyclic compounds which contain at least one oxo group are used have cultures of microorganisms,
which are able to reduce an oxo group with the formation of a new center of asymmetry, or allow corresponding enzymes to act, the oxo group being reduced to the oxy group in at least one of the optically active antipodes, and that at least one of the optically active compounds is isolated and, if necessary, on one of the resulting hydrogenation products allows dehydrating agents to act.
The starting materials for the new process are generally oxo compounds of the hydronaphthalene or hydroindene series, for example the dihydro, tetrahydro, hexahydro, octahydro or decahydronaphthalene series or the dihydro, tetrahydro,
Hexa- or octahydroindene series. They can also be substituted as desired. In addition to at least one oxo group, particularly suitable substituents are free or
functionally modified hydroxyl, oxo or carboxyl groups, such as ester, amido, nitrile, ether, thioester, thioether, thiol and thionester, acetal, mercaptal, ketal, hydrazone -, semicarbazone and enol groups,
at any point of the naphthalene resp. of the indene skeleton, halogen atoms or epoxy groups. Next, the starting materials can have aliphatic side chains, e.g. B. substituted or unsubstituted alkyl radicals, such as methyl, ethyl, propyl, isopropyl radicals, also z.
B. by free or functionally modified oxy, oxo or carboxyl groups substituted methyl, ethyl or propyl radicals. Such starting materials are u. a. the
EMI0001.0070
d, 1-8-oxo-decaline,
<tb> d, 1-3,8-dioxo-decaline,
<tb> d, 1-8-Oxo-9-methyl-decaline,
<tb> d, 1-3,8-Dioxo-9-methyl-decaline,
<tb> d, 1-3-Oxy-8-oxo-9-methyl-decaline,
<tb> d, 1-44.10-3-oxo-octalin,
<tb> d, 1-44.10-3,8-dioxo-octalin,
<tb> d, 1-44 # 10-3,8-Dioxo-9-methyl-octalin <SEP> and <SEP> seine
<tb> enol derivatives, <SEP> like <SEP> e.g. <SEP> B.
<tb> d, 1-43.4;
10,5-3-alkoxy- <SEP> or <SEP> -acyloxy-8-oxo-9 methyl-hexahydronaphthalenes,
<tb> d, 1-44,10-3 <SEP>, 8-Dioxo-9-methyl-4-carboxymethyl-,
<tb> -carboxyäthyl-, <SEP> -carboxypropyl-octaline <SEP> and
<tb> their <SEP> functional <SEP> derivatives,
<tb> d, 1-41,2-3-oxo-4,7-dioxy-9-methyl-octalin,
<tb> <B> d, 1-, d1,2-3 </B> <SEP> - <SEP> Oxo-6,7-isopropylidene-dioxy-9-methyl octalin,
<tb> d, 1-d1.2 <SEP>;
<SEP> 0.7-3-Oxo-9-methyl-hexahydro-naphthalene,
<tb> d, 1-1-oxo-octahydro-indene,
<tb> d, 1-1-oxo-8-methyl-octahydro-indene,
<tb> d, 1-1-Oxo-5-oxy-8-methyl-octahydro-indene,
<tb> d, 1-1,5-dioxo-8-methyl-octahydro-indene,
<tb> d, 1-44> 9-1,5-dioxo-8-methyl-hexahydro-indene
<tb> and <SEP> its <SEP> enol derivatives, <SEP> like <SEP> e.g. <SEP> B.
<tb> d, 1-44,5; 3,9_1-Oxo-5-alkoxy- <SEP> or <SEP> -acyloxy-3 methyl-tetrahydro-indene,
<tb> d, 1-44> 9-1,5-Dioxo-8-methyl-4-carboxymethyl-,
<tb> -carboxyäthyl-, <SEP> -earboxypropyl-hexahydro indene <SEP> or <SEP> their <SEP> functional <SEP> derivatives.
The surprising observation was made that, in the reduction according to the method, the enantiomorphic forms of the racemates mentioned are converted at the same or different rates depending on the constitution of the starting material. So z.
B. Racemates of the d4.io- 3,8-dioxo-9-methyl-octalin series are converted into two diastereoisomeric hydrogenation products when the enzymes mentioned act, that is, the conversion of the two enanthiomorphic forms takes place at practically the same rate.
The diastereoisomers obtained differ in their physical properties and as a result can be easily separated from one another and isolated in pure form.
Differences in the reaction rate of the two enantiomorphic forms are observed, for example, in the reduction according to the invention of racemates of the 44,9-1,5-dioxo-8-methyl-hexahydro-indene series. In these cases, practically only one enantiomorphic form of the starting material is reduced, the other remains unchanged.
The optically active hydrogenation products obtained can be dehydrogenated and the enantiomorphous forms of the starting materials can thus be obtained.
The following two examples serve to illustrate the above observation.
EMI0002.0024
Racemate
EMI0002.0026
EMI0002.0027
Racemate
EMI0002.0029
The method is advantageously carried out in such a way that the culture of a single microorganism is allowed to act on the starting material. It is also possible, however, to proceed in such a way that several cultures are allowed to act on the starting material in one operation, whereby it has proven to be advantageous to effect the individual cultures one after the other. All those microorganisms are suitable for the process that are able to reduce the starting materials.
Some examples are given below:
EMI0002.0033
Saccharomyces <SEP> cerevisiae,
<tb> Bacterium <SEP> putrificus,
<tb> Streptomyces <SEP> coelicolor,
<tb> Streptomyces <SEP> lavendulae,
<tb> Curvularia <SEP> falcata,
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans,
<tb> Rhizopus <SEP> arrhizus,
<tb> Ophiobolus <SEP> herpotrichus. The microorganisms figuring in this compilation are fungi or bacteria, e.g. B. from the class of the actinomycetes.
To carry out the process, the starting materials can be incubated with cultures of the said microorganisms under known anaerobic and also aerobic conditions. The growth takes place in surface culture or, technically more advantageous, submerged, with shaking or stirring. The cultures contain assimilable carbon, in particular carbohydrates, and, if appropriate, growth substances, for example corn steep water or wort, and inorganic salts. Natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions can therefore be used.
The simplest method in practice is described below: The organisms are grown in equipment and under conditions similar to those known in the production of antibiotics as so-called deep-tank processes. After the cultures have developed, the starting materials mentioned are added in a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and incubated further.
Finally, one separates from the mycelium, extracts the filtrate and; 'or the mycelium mass and isolates from the extract the d-forms and / or the 1-forms of the hydrogenation products and (or enantiomorphic forms of the starting materials in a manner known per se, z.
B. by demixing processes, adsorption, chromatography, crystallization, conversion into functional derivatives such as Girard compounds and the like. You can also separate the active enzymes from the cultures of the organisms mentioned and use them to the exclusion of the growing cultures. So you can z. B. separate the mycelium, suspend it in water or buffer solutions, add the starting materials mentioned to these slurries and incubate. It is also possible to extract the enzymes from the cultures and use the extracts thus obtained for the reactions.
If several microorganisms are to develop in one operation, one can proceed as follows, for example: After the cultures of the first organism have developed, the starting materials mentioned are added in a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol, and the incubation continues until the maximum response has been reached. Then, without first filtering or isolating the reaction product, a full-grown culture of the second organism and, if necessary, appropriate nutrients and growth substances are added to the reaction mixture and the incubation is continued. The course of the individual reductions can be followed by paper chromatography.
In general, the resolution of the racemate according to the new process is particularly simple because the optically active hydrogenation products obtained can be easily separated due to their different polarity.
Even since the classical investigations by Pasteur, microbiological methods have occasionally been used to obtain one antipode from racemates. Fungi or bacteria were usually used to assimilate the starting materials, namely the natural (d) antipodes more quickly than the unnatural (1). According to this procedure, in order to obtain an optically pure preparation, one had to treat microbiologically until at least one form, and usually the more biologically interesting one, was completely destroyed. In contrast, the new process delivers the hydrogenation products in optically pure form, even if only partially converted.
In the following examples, the temperatures are given in degrees Celsius. <I> Example 1 </I> 40 g of cane sugar, 40 g of Difco Tryptone (branded product, 8 g of sodium nitrate, 4 g of calcium phosphate, 2 g of magnesium sulfate, 2 g of potassium chloride and 40 mg of ferrous sulfate are dissolved in 4 liters of water) in a shaking vessel, adjusted to pH 7, mixed with 10 g CaCO3, sterilized and inoculated with a culture of Curvularia falcata.
After 3 days of shaking at 27, a solution of 1 g of d, l-d4.lo-3,8-dioxo-9-methyl-octalin in 15 cm3 of acetone is added and the mixture is shaken again. After 3 days, the mycelium is separated off and washed with water and ethyl acetate. The combined filtrates are shaken out with ethyl acetate and the extracts are washed with dilute hydrochloric acid, potassium hydrogen carbonate solution and water, dried and evaporated in vacuo.
The paper chromatographic analysis of the residue (1.6 g) shows the presence of d4,1o-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin and of little starting material. The residue is chromatographed on 80 g of aluminum oxide using the continuous flow method, eluting with benzene, benzene-ether mixtures, ether and ether-ethyl acetate mixtures.
The paper chromatographic analysis of the individual fractions (80 cm3 each) shows that the first benzene fractions contain starting material which is optically inactive. In the benzene fractions 5 and 6 there is a negatively rotating oil which is converted into its p-nitrobenzoyl derivative (M.p. 106.5-107.5, [a] D = -26) with p-nitrobenzoyl chloride in pyridine .
It does not contain any a, ß-unsaturated ketone, and the elemental analysis fits the empirical formula C18H2105N. The fractions 7-23 eluted with benzene consist of an oil which has a positive optical rotation and which is (+) - d4,1o-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin.
With ether and with ether-ethyl acetate mixtures a strongly negative rotating, crystalline substance is eluted, which is recrystallized from ether-petroleum-ether-mixtures (F. 94-95, [a] D = -129) and the (-) - d4 Is 10-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin.
Analysis: Found C = 73.00.1 / 0, H = 9.0611 / 0; UV absorption spectrum in fine spirits: d. "X 240 m, a (log. ± = 4.15); p-nitro-benzoate: F. 122.5, [a] D = <B> +87>. </B>
The oily (+) - d4.1o-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin forms a crystalline p-nitrobenzoate: F. 195, lab = + 159. The free alcohol is recovered by saponification using methanolic potassium hydroxide solution. It is distilled in a high vacuum: [a] D = + 203, UV absorption spectrum in fine spirits: A ",", 240 mu (log. S = 4.15).
<I> Example 2 </I> In a shaking vessel, 4 liters of a nutrient solution which contains 20 g of peptone, 5 cm3 of corn steep liquor (Comsteepliquor) and 50 g of raw glucose for 1 liter of tap water, adjusted to pH 6.3, sterilized and with a Inoculated culture of Ophiobolus herpotrichus. It is left to shake for 3 days at 27, then a solution of 1 gd, 1-d4,10-3,8-dioxo-9-methyl-octalin in 15 cm? -Acetone is added under sterile conditions and further added shake at the same temperature.
After 3 days, the mycelium is separated off and washed with water and ethyl acetate. The combined filtrates are shaken out with ethyl acetate and the extracts are washed with dilute hydrochloric acid, potassium hydrogen carbonate solution and water, dried and evaporated in vacuo. The paper chromatographic analysis of the residue (1.01 g) shows the presence of 44.10-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin and of the starting material. The residue is worked up as described in Example 1 ben.
In addition to a small amount of optically inactive starting material, the crystalline (-) - d4.10- 3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin (F. 94-95, [a] D = -129) and the oily ( +) - 44.10-3-oxo-8-oxy-9-methyloctaline ([a] D = + 203).
<I> Example 3 </I> The nutrient solution described in Example 2 is inoculated with a culture of Rhizopus nigricans instead of Ophiobolus herpotrichus, and incubated in the same way d, 1-44.10-3,8-Diketo-9- methyl-octalin, after an analogous extraction and work-up, in addition to a little starting material, the crystalline () - d4.10-3 - oxo-8-oxy-9-methyl-octalin from F.
94-95, [a] D = -129 and the oily (+) - J4.10-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin ([a] D = + 203).
<I> Example 4 </I> In a shaking vessel, 40 g of calcium carbonate are added to a solution of 40 g of raw glucose, 20 g of peptone, 15 g of meat extract (Oxo, Lab. Lemco) and 20 g of sodium chloride in 4 liters of water, to pH 7 , 5 brought, sterilized and then inoculated with a culture of Streptomyces coelicolor.
After 4 days of shaking at 27, a solution of 1 g of d, 1-44.10-3,8-dioxo-9-methyl-octalin in 15 cm3 of acetone is added as described in Example 1 and the mixture is shaken again at 27. After 10 days, it is worked up and chromatographed according to the information in Example 1. In addition to a little starting material, the crystalline (-) - d4.10-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin from F.
94-95, [a] D = -126 and the oily (+) - 44> 10-3 - oxo-8-oxy-9-methyl-octalin [a] D = + 203).
The optically active hydrogenation products obtained in accordance with the above examples can be converted into the corresponding oxo compounds as described in the following two examples.
<I> Example 5 </I> A solution of 250 mg (-) - d4,1o-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin in 4 cm3 pyridine is mixed with 4 cm3 of a pyridine-chromium (V1 ) oxide complex suspension, corresponding to 340 mg Cr03, added. The mixture is left to stand at room temperature and 20 cm3 of water are added after 2 days. Then the solution is concentrated in vacuo at 35 and extracted with a benzene-ether mixture. The extracts are washed neutral, dried and evaporated.
The residue is chromatographed on 8 g of aluminum oxide using the continuous flow method, eluting with benzene-petroleum ether mixtures, benzene, benzene-ether mixtures and ether. The benzene petroleum ether and the benzene eluates contain () -44.10-3,8-Dioxo-9-methyl-octalin, which is crystallized from an ether-petroleum ether mixture.
F. 50.5, [a] D = -100, UV absorption spectrum in fine spirit: 2 ",", 244 microns (log. E = 4.10). The fractions eluted with benzene-ether mixtures and with ether still contain some starting material. <I> Example 6 </I> 250 mg (+) - 44.10-3-oxo-8-oxy-9-methyl-octalin are oxidized as described in Example 5 with a pyridine-chromium oxide complex, worked up and purified by chromatography.
In addition to some starting material, (+) - d4,10-3,8-dioxo-9-methyl-octalin, which is recrystallized from an ether-petroleum ether mixture, is obtained. F. 50, [a] D = + 100, UV absorption spectrum in fine spirits: i: "," <I> 244 </I> my, (log. E = 4.10).
<I> Example 7 </I> In a shaking vessel, 40 g of cane sugar, 40 g of Difco tryptone, 8 g of sodium nitrate, 4 g of sec. Potassium phosphate, 2 g magnesium sulfate and 40 mg ferrous sulfate dissolved in 4 liters of water, adjusted to pH 7, mixed with 10 g calcium carbonate, sterilized and inoculated with a culture of Curvularia falcata.
The culture is allowed to shake for 36 hours at 27 and then a solution of 430 mg of d, 1-A4,0-1,5-dioxo-8-methyl-hexahydro-indene in 10 cm3 of acetone is added under sterile conditions. followed by shaking at 27. After 3 days, the mycelium is separated off and washed with acetone and ethyl acetate. The combined filtrates are exhaustively extracted with ethyl acetate. The extracts are washed with dilute hydrochloric acid, sodium hydrogen carbonate solution and water, dried and evaporated in vacuo.
The residue is chromatographed on 100 g of aluminum oxide by the continuous flow method, eluting with benzene, benzene-ether mixtures, ether, ether-ethyl acetate mixtures, ethyl acetate and methanol. The individual fractions (200 cm3 each) are evaporated in vacuo and examined by paper chromatography (propylene glycol-toluene system).
The first two benzene fractions contain only oily impurities, while the other fractions eluted with benzene contain a substance that behaves like the starting material in the paper chromatogram (Rr = 0.68). These fractions who combined and distilled in a high vacuum. Crystals are obtained from a mixture of ether and petroleum ether which melt at 58-60, [a] D = -3l2 (in benzene). The UV and IR absorption spectrum is identical to that of the starting material.
The substance thus represents the 1-A4.0-1,5-dioxo-8-methylhexahydro-indene. The eluted with benzene-ether mixtures (19: 1 and 9: 1) Components consist of d-44.9-5-oxo-l-oxy-8-methyl-hexahydro-indene, which has an RF value of 0.12 and is obtained in the form of a clockwise and UV-absorbing oil.
With benzene-ether mixtures (4: 1), n small amounts of a levorotatory and UV-absorbing oil are eluted, which behaves the same in paper chromatography, and 1-J4.9-5-oxo-1-oxy-8-methyl -hexahydro-indene represents. The fractions eluted with ether, ether-ethyl acetate mixtures, ethyl acetate and methanol show no optical activity.
<I> Example 8 </I> 100 cms of wort are sterilized in an Erlenmeyer flask and inoculated with a culture of Rhizopus nigricans. After shaking at 25 for 24 hours, a solution of 30 mg of d, 1-44,9-1,5-dioxo-8-methylhexahydro-indene in 1.5 cm 3 of acetone is added under sterile conditions. The mixture is shaken for a further 5 days at <B> 25-1 </B> and the culture is then extracted with ethyl acetate.
The examination of the extraction residue in the paper chromatogram shows the presence of 1-a4.9-1.5 - Dioxo - 8 - methyl-hexahydro-indene (R1, = 0.68), of d-44.9-5 -Oxo-l-oxy-8- methyl-hexahydro-inden (RF = 0.12) and another UV-absorbing substance from RF - 0.05.
<I> Example 9 </I> In an Erlenmeyer flask, 100 em3 of a sterile nutrient solution which contains 20 g of peptone, 5 cm3 of corn steep liquor and 50 g of glucose for 1 liter of tap water is inoculated with a culture of Ophiobolus herpotrichus. After shaking at 25 for 24 hours, a solution of 30 mg d, 1-44,9-1,5-dioxo-8-methyl-hexahydro-indene in 1.5 cm 3 of acetone is added under sterile conditions. The mixture is shaken at 25 for a further 5 days and the culture is then extracted with ethyl acetate.
The examination of the extraction residue in the paper chromatogram shows the presence of 1-44.9-1,5-Dioxo-8-methyl-hexahydro-indene (RF = 0.68), of d-44.9-5-Oxo-l-oxy- 8-methyl-hexahydro-indene (RF - 0.12) and another UV-absorbing substance with an RF = 0.05.
<I> Example 10 </I> In an Erlenmeyer flask, 100 em3 of a sterile nutrient solution, which is based on 1 liter of tap water, 10 g glucose, 5 g peptone, 3 g meat extract (Oxo, Lab. Lemco), 5 g sodium chloride and containing 10 g calcium carbonate, inoculated with a culture of Streptomyces coelicolor.
After shaking at 25 for 24 hours, a solution of 30 mg of d, l-4,9-1,5-dioxo-8-methylhexahydro-indene in 1.5 cm3 of acetone is added under sterile conditions. The mixture is shaken at 25 for a further 5 days and the culture is then extracted with ethyl acetate.
The test - = of the extraction residue in the paper chromatogram shows the presence of 1-d4,9-1,5-dioxo-8-methyl-hexahydro-indene (RF = 0.68) and of d-44,9-5-oxo 1-oxy-8-methyl-hexahydro-indene (RF = 0.68).