DE1036254B

DE1036254B - Process for resolution

Info

Publication number: DE1036254B
Application number: DEC13552A
Authority: DE
Inventors: Dr Albert Wettstein; Dr Ernst Vischer
Original assignee: Ciba Geigy AG; Ciba AG
Current assignee: Novartis AG; BASF Schweiz AG
Priority date: 1955-08-25
Filing date: 1956-08-20
Publication date: 1958-08-14

Description

Verfahren zur Racematspaltung Es ist bekannt, mit Hilfe von Mikroorganismen Steroidverbindungen mit der natürlichen Konfiguration zu reduzieren. Es wurde nun die überraschende Beobachtung gemacht, daB d,l-Steroidverbindungen sich diesen Mikroorganismen gegenüber verschieden verhalten, indem im wesentlichen nur die d-Form, d. h. die den natürlichen Steroiden entsprechende enantiomorphe Form reduziert wird, und die 1-Form unverändert bleibt. Diese Beobachtung hat nun zu einem neuen Verfahren zur Racematspaltung geführt, wobei neben den reduzierten d-Steroiden die bisher nur in den einzelnen Fällen bekanntgewordenen 1-Steroide erhalten werden.Process for the resolution of racemates It is known with the aid of microorganisms Reduce steroid compounds with the natural configuration. It was now made the surprising observation that d, l-steroid compounds are associated with these microorganisms behave differently towards each other, in that essentially only the d-form, i.e. H. the the enantiomorphic form corresponding to the natural steroids is reduced, and the 1 form remains unchanged. This observation has now led to a new method for Racemate led, with the previously only reduced d-steroids 1-steroids which have become known in the individual cases can be obtained.

Das neue Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daB man auf Oxo-Gruppen aufweisende d,l-Steroide durch Kulturen von Mikroorganismen produzierte reduzierende Enzyme, welche eine Oxogruppe zu einer Oxygruppe zu reduzieren vermögen, in bekannter Weise einwirken läBt und mindestens eine der enantiomorphen Formen isoliert.The new process is characterized in that it is based on oxo groups containing d, l-steroids produced by cultures of microorganisms Enzymes which are able to reduce an oxo group to an oxy group are known Way and at least one of the enantiomorphic forms is isolated.

Ausgangsstoffe für das neue Verfahren sind beliebig substituierte, Kohlenstoff-Sauerstoff-Doppelbindungen aufweisende d,l-Steroide der Pregnan-, Allopregnan-, Testan-, Androstan- oder Oestranreihe sowie ihre höheren und niederen Homologen, beispielsweise entsprechende A-Nor-, D-Homo- und 19-Nor-verbindungen. Doppelbindungen befinden sich z. B. in 1- und/oder 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- und/oder 16-Stellung. Als Substituenten kommen besonders in Frage freie bzw. funktionell abgewandelte Hydroxyl-, Oxo- oder Carboxylgruppen, wie Ester-, Äther-, Thioester-, Thioäther-, Thiol- und Thionester-, Acetal-, Mercaptal-, Ketal-, Hydrazon-, Semicarbazon- und Enolgruppen, z. B. in 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-,1.6-,17-,18-,19-, 20- und 21-Stellung, ferner Halogenatome, insbesondere Chlor oder Fluor, z. B. in 9- und 17-Stellung, oder Epoxygruppen, z. B. in 9,11- oder 16,17-Stellung.The starting materials for the new process are arbitrarily substituted, D, l-steroids of the pregnan, allopregnan, carbon-oxygen double bonds Testan, Androstan or Oestran series as well as their higher and lower homologues, for example corresponding A-Nor, D-homo- and 19-Nor compounds. Double bonds are z. B. in the 1- and / or 4-, 5-, 6-, 7-, 9-, 11-, 14-, 15- and / or 16-position. Particularly suitable substituents are free or functionally modified ones Hydroxyl, oxo or carboxyl groups, such as ester, ether, thioester, thioether, Thiol and thionester, acetal, mercaptal, ketal, hydrazone, semicarbazone and Enol groups, e.g. B. in 2-, 3-, 6-, 7-, 11-, 12-, 1.6-, 17-, 18-, 19-, 20- and 21-positions, also halogen atoms, especially chlorine or fluorine, e.g. B. in 9- and 17-position, or epoxy groups, e.g. B. in the 9.11 or 16.17 position.

Spezifische Ausgangsstoffe sind unter anderem d,l-Progesteron, d,1-17a-Oxy-progesteron, d,l-Cortexon, d,l-18-Oxy- und 18-Oxocortexon, d,l-Cortison, d,l-Hydrocortison,d,l-17a-Oxycortexon, d,l-Aldosteron,d,1-Pregnenolon, die entsprechenden 1-Dehydroverbindungen, z. B. d,1-1-Dehydroprogesteron, d,l-1-Dehydro-17a-oxy-progesteron, Dehydroisoandrosteron, Androstendion, Oestron, oder ihre funktionellen Derivate. Besonders wichtige Ausgangsstoffe für die Aldosteronsynthese sind z. B. das d,1 - d 4 - 3,20 - Dioxo -11 ß - oxy-pregnen-18-säure-lakton (18 -@ 11), das d,1-d4-3,18,20-Trioxo-llß-oxy-pregnen bzw. sein 18,11-Cyclo-halbacetal und das d,l-d4-3,20-Dioxo-I l ß,18-dioxy-pregnen. Zu nennen sind auch die entsprechenden in 17a-Stellung hydroxylierten Verbindungen, ferner das Lakton des d,1-d4-3,16-Dioxo-Ilß-oxy-18-carboxy-androstens, das d,1-44,1$-3,16-Dioxo-Ilß,18a-oxido-18a-methyl-18-homo-androstadien und entsprechende in 14,15-Stellung ungesättigte Verbindungen. Das Verfahren wird vorteilhaft in der Weise durchgeführt, daß man auf den Ausgangsstoff die Kultur eines einzigen Mikroorganismus einwirken läBt. Es kann aber auch so vorgegangen werden; daB man in einem :Arbeitsgang mehrere Kulturen auf den Ausgangsstoff einwirken läBt, wobei es sich als vorteilhaft erwiesen hat; die Einwirkung der einzelnen Kulturen zeitlich nacheinander vorzunehmen.Specific starting materials include d, l-progesterone, d, 1-17a-oxy-progesterone, d, l-cortexone, d, l-18-oxy- and 18-oxocortexone, d, l-cortisone, d, l-hydrocortisone, d, l-17a-oxycortexone, d, l-aldosterone, d, 1-pregnenolone, the corresponding 1-dehydro compounds, e.g. B. d, 1-1-dehydroprogesterone, d, l-1-dehydro-17a-oxy-progesterone, dehydroisoandrosterone, Androstenedione, Oestron, or their functional derivatives. Particularly important raw materials for aldosterone synthesis are z. B. das d, 1 - d 4 - 3.20 - Dioxo -11 ß - oxy-pregnen-18-acid-lactone (18 - @ 11), the d, 1-d4-3,18,20-trioxo-11ß-oxy-pregnen or its 18,11-cyclo-hemiacetal and the d, l-d4-3,20-dioxo-I l ß, 18-dioxy-pregnen. The corresponding ones should also be mentioned compounds hydroxylated in the 17a position, also the lactone of d, 1-d4-3,16-dioxo-Ilß-oxy-18-carboxy-androstene, das d, 1-44,1 $ -3,16-Dioxo-Ilß, 18a-oxido-18a-methyl-18-homo-androstadiene and corresponding compounds unsaturated in the 14,15-position. The method is advantageous in the Way carried out that the starting material is the culture of a single microorganism can act. But this can also be done; that one in one: work process several cultures can act on the starting material, which is advantageous has proven; to effect the influence of the individual cultures one after the other.

Alle diejenigen Kulturen von Mikroorganismen sind für das Verfahren geeignet, die in den Ausgangsstoffen enthaltenen Oxogruppen zu reduzieren vermögen, wie z. B. für die Reduktion der 20-Oxogruppe Streptomyces coelicolor, Streptomyces lavendulae, Epicoccum oryzae, Curvularia lunata, Alcaligenes, Gibberella baccata, Mycobacterium lacticola, Fusarium solani und für die Reduktion einer 3- oder 17ständigen Oxogruppe, z. B. Pseudomonas testosteronis oder Saccharomyces cerevisiae.All those cultures of microorganisms are eligible for the procedure suitable to reduce the oxo groups contained in the starting materials, such as B. for the reduction of the 20-oxo group Streptomyces coelicolor, Streptomyces lavendulae, Epicoccum oryzae, Curvularia lunata, Alcaligenes, Gibberella baccata, Mycobacterium lacticola, Fusarium solani and for the reduction of a 3- or 17-position Oxo group, e.g. B. Pseudomonas testosteronis or Saccharomyces cerevisiae.

Zur Durchführung des Verfahrens kann man die Ausgangsstoffe mit Kulturen der genannten Mikroorganismen unter an sich bekannten anaeroben, ferner auch aeroben Bedingungen inkubieren. Das Wachstum erfolgt in Oberflächenkultur oder, technisch vorteilhaft, submers, wobei man schüttelt oder rührt. Die Kulturen enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze, und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daB die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotika-Fabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Nach Entwicklung der Kulturen gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter. Schließlich trennt man vom Mycel ab, extrahiert das Filtrat und/oder die Mycelmasse und isoliert aus dem Extrakt die d-Formen und/oder die 1-Formen in an sich bekannter Weise, z. B. durch Entmischungsverfahren, Adsorption, Chromatographie, Kristallisation, Überführung in funktionelle Derivate, wie Girard-Verbindungen u. dgl. Dieselben Umsetzungen lassen sich auch durchführen, indem man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden Kulturen der genannten Organismen zuerst abtrennt und unter Ausschluß der wachsenden Kulturen verwendet. So kann man z. B. das von entsprechenden Kulturen der genannten Organismen gebildete Mycel abtrennen, in Wasser oder Pufferlösungen suspendieren, die genannten Ausgangsstoffe diesen Aufschlämmungen zugeben und inkubieren.To carry out the process, the starting materials can be mixed with cultures of the microorganisms mentioned, including anaerobic ones known per se, and also aerobic ones Incubate conditions. The growth takes place in surface culture or, technically advantageous, submerged, shaking or stirring. The cultures contain assimilable Carbon, in particular carbohydrates, and possibly growth substances, for example Corn steep liquor or wort, and inorganic salts. They are therefore natural synthetic or semi-synthetic nutrient solutions can be used. Practically the easiest The process is described below without the invention being depicted by these details should be limited: you breed the organisms in Apparatus and under conditions similar to those used in the manufacture of antibiotics as so-called Deep tank processes are known. After the cultures have developed, these are given Starting materials in fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol and continue to incubate. Finally, one separates from the mycelium, extracts the filtrate and / or the mycelial mass and isolates the from the extract d-forms and / or the 1-forms in a manner known per se, e.g. B. by segregation processes, Adsorption, chromatography, crystallization, conversion into functional derivatives, like Girard connections and the like. The same conversions can also be carried out, by getting the effective enzymes from appropriate cultures of the said organisms first separated and used to the exclusion of the growing cultures. So you can z. B. Separate the mycelium formed by corresponding cultures of the organisms mentioned, Suspend the starting materials mentioned in water or buffer solutions Add slurries and incubate.

Sollen in einem Arbeitsgang mehrere Mikroorganismen zur Einwirkung gelangen, so kann man beispielsweise wie folgt vorgehen: Nach Entwicklung der Kulturen des ersten Organismus gibt man die genannten Ausgangsstoffe in feiner Dispersion oder Lösung, beispielsweise in Methanol, Aceton oder Äthylenglykol zu und inkubiert weiter, bis die maximale Reaktion erreicht ist. Dann gibt man, ohne vorher zu filtrieren oder das Umsetzungsprodukt zu isolieren, zum Reaktionsgemisch eine ausgewachsene Kultur des zweiten Organismus und nötigenfalls entsprechende Nährsubstanzen und Wuchsstoffe zu und fährt mit der Inkubation fort. Der Verlauf der einzelnen Reduktionen kann papierchromatographisch verfolgt werden.Should several microorganisms act in one operation one can proceed, for example, as follows: After the cultures have developed of the first organism are given the starting materials mentioned in a fine dispersion or solution, for example in methanol, acetone or ethylene glycol and incubated continue until the maximum response is achieved. Then you add without filtering beforehand or to isolate the reaction product, a full-blown reaction mixture Culture of the second organism and, if necessary, appropriate nutrient substances and Growth substances and continues with the incubation. The course of the individual reductions can be followed by paper chromatography.

Allgemein ist die Racematspaltung nach dem neuen Verfahren besonders einfach, weil die reduzierten Derivate des einen Antipoden sich vom unveränderten anderen Antipoden infolge ihrer verschiedenen Polarität leicht abtrennen lassen.In general, the resolution according to the new process is special simply because the reduced derivatives of one antipode differ from the unchanged other antipodes can easily be separated due to their different polarity.

Bereits seit den klassischen Untersuchungen von Pasteur hat man zwar gelegentlich eine mikrobiologische Methode zur Gewinnung des einen Antipoden aus Racematen angewandt. Dabei wurden gewöhnlich Pilze oder Bakterien verwendet, die die Ausgangsstoffe assimilierten, und zwar den natürlichen (d) Antipoden rascher als den unnatürlichen (1). Nach diesem Verfahren mußte also, um ein optisch reines Präparat zu erhalten, so lange mikrobiologisch behandelt werden, bis mindestens die eine Form, und zwar meist die biologisch interessantere, völlig zerstört war. Demgegenüber liefert das neue Verfahren auch bei nur teilweiser Umsetzung den umgewandelten Antipoden, der meist den biologisch interessanteren darstellt, in optisch reiner Form. Wird beim neuen Verfahren der eine Antipode völlig umgesetzt, so fällt auch der andere in optisch reiner Form an.Since the classic investigations by Pasteur, one has indeed occasionally a microbiological method for the extraction of one antipode Racemates applied. Usually fungi or bacteria were used the starting materials assimilated, namely the natural (d) antipodes more quickly than the unnatural (1). After this process, one had to get an optically pure To receive the preparation as long as it is microbiologically treated until at least one form, usually the biologically more interesting one, was completely destroyed. In contrast, the new method delivers the converted one even if only partially implemented Antipode, which is usually the biologically more interesting one, in optically pure Shape. If one antipode is fully implemented in the new process, then it also falls the other in optically pure form.

Die Erfindung wird in den nachfolgenden Beispielen beschrieben. Beispiel 1 2 g Hohglucose, 1 g Pepton, 0,6 g Fleischextrakt (bekan-:t unter der Handelsbezeichnung Oxo Lab. Lemco), 1 g Natriumchlorid und 2 g Calciumcarbonat werden in 200 cm3 Wasser gelöst bzw. suspendiert, auf pH 7,5 gebracht und sterilisiert. Dann wird mit einer Kultur von Streptomyces coelicolor beimpft und 3 Tage bei 27'C geschüttelt. Man gibt nun unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 50 mg d,1-17a-Oxy-cortexon in 4 cm 3 Methanol zu und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 2 Tagen wird das Mycel abgetrennt und das Kulturfiltrat dreimalmit Essigester ausgeschüttelt. Die Extrakte werden mit Wasser gewaschen, getrocknet und eingedampft. Man chromatographiert den Rückstand an 2 g Kieselsäuregel nach der Durchlaufmethode, wobei mit Äther, Äther-Essigester-Gemischen und mit Essigester eluiert wird. Die einzelnen Fraktionen (je 10 cm3) werden papierchromatographisch untersucht. Die Äther-Fraktionen enthalten 17a-oxy-cortexon, während mit den Äther-Essigester-Gemischen (90: 10, 80: 20 und 50: 50) d 4-3-Keto-1 7a,20ß,21-trioxy-pregnen eluiert wird. Man vereinigt die Äther-Fraktionen bzw. die Äther-Essigester-Fraktionen und dampft sie getrennt ein. Durch Kristallisation aus Aceton erhält man 1-17a-Oxycortexon, F. = 209 bis 212°C; [a] ö =-140° (Äthanol) und d-d4-3-Keto-17a,20ß,21-trioxy-pregnen, F.= 193 bis 194°C, [a] ö = -;- 74° (Äthanol).The invention is described in the following examples. Example 1 2 g of high glucose, 1 g of peptone, 0.6 g of meat extract (known under the trade name Oxo Lab. Lemco), 1 g of sodium chloride and 2 g of calcium carbonate are dissolved or suspended in 200 cm3 of water, to pH 7, 5 brought and sterilized. A culture of Streptomyces coelicolor is then inoculated and shaken at 27 ° C. for 3 days. A solution of 50 mg of d, 1-17a-oxycortexon in 4 cm 3 of methanol is then added under sterile conditions and the mixture is shaken again at the same temperature. After 2 days the mycelium is separated off and the culture filtrate is extracted three times with ethyl acetate. The extracts are washed with water, dried and evaporated. The residue is chromatographed on 2 g of silica gel by the continuous flow method, eluting with ether, ether-ethyl acetate mixtures and with ethyl acetate. The individual fractions (10 cm3 each) are examined by paper chromatography. The ether fractions containing 17a-oxy-Cortexon, while the ether-Essigester mixtures (90: 10, 80: 20 and 50: 50) d 4-3-keto-1 7a, 20SS, 21-trioxy-pregnene eluted will. The ether fractions or the ether-ethyl acetate fractions are combined and evaporated separately. Crystallization from acetone gives 1-17a-oxycortexone, mp = 209 to 212 ° C; [a] ö = -140 ° (ethanol) and d-d4-3-keto-17a, 20β, 21-trioxy-pregnen, m.p. = 193 to 194 ° C, [a] ö = -; - 74 ° ( Ethanol).

Beispiel 2 Beimpft man die im Beispiel l beschriebene Nährlösung mit Streptomy ces lavendulae, so erhält man nach analoger Zugabe von d,1-17a-Oxy-cortexon und nach analoger Inkubation und Aufarbeitung ebenfalls 1-17a-Oxy-cortexon und d-d4-3-Keto-17a,20ß,21-trioxy-pregnen. Beispiel 3 Eine Lösung von 20 g Glucose in 100 cm3 Leitungswasser wird in einem Erlenmeyerkolben sterilisiert und dann mit 10g frischer Preßhefe (Saccharomyces cerevisiae) versetzt. Man läßt den Kolben 4 Stunden bei 28°C schütteln, gibt dann eine Lösung von 100 mg d,1-Oestronin 5 cm3 Dioxan zu und schüttelt weiter bei der gleichen Temperatur. Nach 1, 2, 3, 4 und 5 Tagen gibt man jeweils 10 g Hefe, 20 g Glucose in 30 cm3 Wasser zu, worauf nach 7 Tagen das Reaktionsgemisch erschöpfend ausgeäthert wird. Man wäscht die Ätherextrakte mit gesättigter Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser, trocknet sie und dampft sie ein. Der Rückstand, der aus 1-Oestron und d-Oestradiol-(17ß) besteht, wird papierchromatographisch aufgetrennt. Durch Umkristallisation aus wäßrigem Methanol erhält man 1-Oestron, F. = 257 bis 259°C; [a]D = -163°C, und d-Oestradiol-(17ß); F. = 177 bis 178°C, [a]D = + 82°C (Äthanol).Example 2 The nutrient solution described in Example 1 is inoculated with Streptomy ces lavendulae is obtained after the analogous addition of d, 1-17a-oxycortexon and after an analogous incubation and work-up also 1-17a-oxy-cortexon and d-d4-3-keto-17a, 20β, 21-trioxy-pregnen. Example 3 A solution of 20 g of glucose in 100 cm3 of tap water is in a Sterilized Erlenmeyer flasks and then sprinkled with 10g fresh pressed yeast (Saccharomyces cerevisiae). The flask is left to shake for 4 hours at 28 ° C. and then added add a solution of 100 mg of d, 1-oestronine to 5 cm3 of dioxane and continue shaking with the same temperature. After 1, 2, 3, 4 and 5 days, add 10 g of yeast each, 20 g glucose in 30 cm3 water, whereupon the reaction mixture exhausts after 7 days is etherified. The ether extracts are washed with saturated sodium hydrogen carbonate solution and water, dries them and steams them. The residue obtained from 1-oestron and d-Oestradiol- (17β) is separated by paper chromatography. By recrystallization 1-oestrone is obtained from aqueous methanol, mp = 257 to 259 ° C .; [a] D = -163 ° C, and d-estradiol- (17 [beta]); M.p. = 177 to 178 ° C, [a] D = + 82 ° C (ethanol).

Claims

PATENT CLAIMS: 1. Process for the splitting of racemates from 1-S @ eroids, characterized in that reducing enzymes produced by cultures of microorganisms and containing an oxo group are used on d, 1-steroids of the pregnan, allopregnan, testan, androstan or oestran series which are produced by cultures of microorganisms able to reduce to an oxy group, allows it to act and isolates at least one of the enantiomorphic forms.

2. The method according to claim 1, characterized in that one in one operation allows several microorganisms to act.

3. The method according to claims 1 and 2, characterized in that the starting materials used are d, l-oestrone or d, 1-17a-oxy-cortexon used.

4. Process according to claims 1 to 3, characterized in that one cultures of Saccharomyces cerevisiae, Streptomyces lavendulae or Streptomyces coelicolor used.