Verfahren zur Herstellung von Kanamycin Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums Kanamycin durch Fermentation.
Das erfindungsgemäss hergestellte neue Anti biotikum ist wachstumshemmend auf gram-positive, gram-negative und säurefeste Bakterien, wie Myco- bacterium tuberculosis.
Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch ge kennzeichnet, dass ein Stamm von Streptomyces kanamycetiaus nov. spec. in einer wässrigen Kohle- hydratlösurng, welche stickstoffhaltige Nährsubstanzen enthält, aerob kultiviert wird, worauf das Antibiotikum abgetrennt und gegebenenfalls gereinigt wird.
Die das neue Antibiotikum produzierenden Mikroor-,anismen wurden aus einer Bodenprobe ab getrennt, welche auf dar Nagano-Präfektur in Japan gewonnen wurde.. Sie stellen eine neue Species der Gattung Streptomyces dar, welche Streptomyces kanamyceticu,s genannt wird.
Eine Kultur von Streptomyces kanamyceticus wurde in der Ame-rican Type Culture Collection in Washington D. C. deponiert, wo sie der permanenten Sammlung von Mikroorganismen unter der Bezeich nung A. T. T. C.<B>12853</B> einverleibt wurde.
Streptomyces kanamyceticus weist folgende cha rakteristischen Eigenschaften auf: Die mikroskopische Beobachtung zeigt, dass das Substrat Mycelium ungefähr 1 ,cc dick und verzweigt ist. Das Luft Mycelium entwickelte sich aus sub- mersen Myceliumzweigen und trägt die Sporenträger am Ende.
Spiralen und Wirtel werden normalerweise nicht beobachtet.
Auf Glycerin-Czapek-Agar (27 C) gezüchtet ergab sich ein Gewächs, das zunächst farblos, später citronengelb war. Die Unterseite Ist heufarbig, das Luft-Mycelium ist weiss bis gelb, gelegentlich mit einem grünlichen oder leicht rosafarbigen Stich. Gelegentlich wird ein schwach braunes, lösliches Pigment beobachtet.
Auf Krainsky-Glucose As.p,aragin-Agar (27 C) gezüchtet, ergab sich: Das Gewächs ist farblos bis gelb und die Rückseite weiss, schwach rosa weiss, gelb oder Neufarben. Das spärlich ausgebildete Luft Mycel:ium entsteht gewöhnlich aus dem Zentrum der Kolbnie und ist weiss, schwach rosaweiss, schwach grünlichgelb oder gelb. üblicherweise wird kein lösliches Pigment gebildet.
Auf Calciummalat Agar (27 C) gezüchtet, ergab sich: Das Gewächs ist kleiner, sonst im wesentlichen gleich wie auf Krainsky-Glucose-Asparagin-Agar. Bisweilen tritt überhaupt kein Wachstum auf.
Auf der Stärkeplatte (27 C) gezüchtet, tritt im wesentlichen dieselbe Erscheinung auf wie auf Krainsky-Glucosa,Asparagin-Agar, jedoch ist der Wuchs eingeschränkt und es entsteht kein Luft- Mycelium. Die Stärke wird hydrolysiert.
Auf einem Kartoffelpfropf (27 ) entsteht ein runzeliges Gewächs mit körniger Oberfläche von schwach gelbbraunem bis gelbem Farbton. Ein Luft Mycelium bildet sich keines oder höchstens nur knapp. Es ist weiss. Es, entsteht kein lösliches Pigment. Der unterhalb dem Gewächs befindliche Pfropf ist normaleTweise dunkel verfärbt.
Auf einem Karottenpfropf (27 C) entsteht nor- malerweise nur ein sparsam ausgebildetes Gewächs, das gegebenenfalls dieselben Ausbildungsformen auf weist wie auf dem Kartoffelpfropf. Auf Pepton- Wasser mit 2% Natriumnitrat (27 C)
entsteht ein m'ngförmiges Oberflächengewächs,, das farblos bis weisslichgellb ist und am Grunde weiss. Das gelegent lich ausgebildete Luft,Mycelium ist ebenfalls, weiss. Aus dem Nitrat entsteht Nitrit.
Es bildet sich. kein lösliches Pigment. Gezüchtet auf Pepton Fleischex rakt Agar (37 C) bildet sich ein runzeliges, weiss bis gelbes Gewächs aus, das kein Luft-Mycelium oder lösliches Pigment entwickelt.
Die Form auf Blut Agar (37 C) ist runzelig, Farbe rötlichbraun mit grauem Stich. Luft-Myceiium oder lösliches Pigment werden nicht ausgebildet.
Auf Milch bei 37 C ergibt sich normalerweise keine Änderung und auf der Oberfläche bildet sich keinerlei Gewächs.
Auf koaguliertem Loeffler-Serum (37 C) ist das Wachstum beschränkt, das Gebilde von weisser bis gelber Farbe. Es bildet sich kein Luft Mycelium oder lösliches Pigment aus. Auf Ei-Substanz (37 C) ent steht runzeliger Wuchs, ohne ein Luft Mycelium.
Auf Gelatine tritt Verflüssigung ohne Bildung eines löslichem Pigments ein.
Als Kohlenstofflieferanten, verwendbar auf einem Czapek-Salz Basis-Medium, kommen folgende Sub stanzen in Frage: Arabinose, Dextrin, Fructose, Galactose, Glucose, Glycerin, Maltose, Mannit, Mannose, Raffinose, Stärke, Saccharose, Succinate. Als Kohlenstofflieferanten nicht geeignet sind:
Inosit, Inulin, Lactose, Rhamnose, Sorbose, Xylose, Acetat. Nur schlecht aufgenommene, kohlenstoffhaltige Sub- stanzen: sind: Aesculin, Salicin, Sorbit und Citrate.
Die vorstehend erwähnten Charakteristiken sind hinreichend, um den Mikroorganismus: von bisher bekannten StreptomyceS Arten zu unterscheiden und zu zeigen, dass der Stamm K<B>2-J</B> zu einer neuen Species gehört. Variation oder Mutation der oben beschriebenen Organismen kann normalerweise er wartet werden, da :dieses Verhalten eine albgemeine Eigenschaft der Organismen der Streptomycearten ist.
Es können somit auch alle natürlichen oder künstlichen Varianten oder Mutanten von Strepto- myces kanamyceticus verwendet werden.
Die Charakteristiken dieser Species können fol gendermassen zusammengefasst werden: Das Gewächs der Kolonie ist farblos bis gelb, mit oder ohne grünlichem oder rosafarbenem Stich. Die Rückseite der Kolonie auf synthetischem Agar ist farblos, weiss, schwach rosaweiss, weisslichgelb 'oder heufarben. Das Luft-Mycelium ist weiss bis gelb und\ Spiralen oder Wirtel werden daran nicht ausgebildet. Gelegentlich entsteht ein schwach braunes, lösliches Pigment auf synthetischen Nährmedien.
Gelatine wird verflüssigt und Stärke hydrolysiert.
Streptomyces kanamyceticus (K24) kann z. B. in Schüttelflaschen in folgender Weise gezüchtet werden: Als Nährmedium diente folgende Zusammenstellung: 0,75 0/0 Fleischextrakt, a,750/0 Pepton, 0,3 % NaCI, mit 1% Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose,
Lactose, Saecharose oder Glycerin, ferner ein zweites Nähr- medium, bestehend aus 2 % Sojabohnenmehl, 0,05 0/a KCl, 0,05119 MgS04 ' 7H20, 0,51/o NaCl, 0,20/9 NaN0-, mit 1,
0 0/0 Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose, Lactose, Saccharose oder Glycerin. Der Ausgangs- pH-Wert aller Medien wurde auf 7,0 eingestellt. Nach 24-48 Stunden Schütteldauer war der pH-Wert in einigen Fällen auf ungefähr 6,0-6,8 abgefallen, stieg jedoch nach 72-l20 Stunden wieder an und erreichte schliesslich den Wert 7,5-8,6.
Im zweiten., vorstehend erwähnten Nährmedium, dem 2 % Stärke zugesetzt wurden, stieg der pH-Wert nach 3 Tagein Schütteldauer auf 8,2 an und es ent- stunden 250 mog Kanamycin pro ml.
In einer Tank kultur mit einem Medium, welches 2 0i0 Stärke, 0,5 % Glucose, 1,2 % Sojabohnenmehl, 0,05 % KCl, 0,051)/o MgS04 - 7H20, 0,1% Kafumphosphat (K2HP04), 0,3 % Kochsalz, 0,
3 % Pepton und 0,3 0/0 Calciumcarbonat enthielt, wurde der pH-Wert zu Beginn leicht erniedrigt (6,6) und stieg hierauf wie der, nach 43 Stunden, bis auf 8,0 an. Hierbei wurden 273 mcg Kanamycin pro ml im Verlauf von 78 Stun den gebildet.
Als Nährmedium können die oben beschriebenen Fermentationsibrühen sowie Rohprodukte, welche aus denselben gewonnen wurden, verwendet werden.
Geeignete Stickstofflieferanten sind Sojabohnen mehl, Baumwollsamenmehl, Erdnussmehl, Fleisch extrakt, Pepton, Kornpresssaft oder Hefeextrakt. Als Kohlenstofflieferanten kommen Stärke, Dextrin, Maltose, Glucose, Saccharose, Lactose und Glycerin in Frage.
Als eine der besten Kombinationen hat sich eine Zusammenstellung von Stärke und Sojabohnen mehl erwiesen, wobei sich die Zugabe von Korn- presssaft, Pepton, Hefeextrakt oder Nitraten zu dieser Kombination als fördernd auf die Bildung von Kana- mycin erwies. Fördernd wirkte ferner die Zugabe von Magnesiumsulfat, Man!ganchlorid oder Zinksulfat.
Optimale Ausbeuten wurden erhalten, wenn der pH- Wert :der Kulturbrühe während der Züchtung schwach alkalisch wurde. Die kann in weiten Grenzen, z. B. zwischen 25 und 35 , variiert werden, jedoch ist es vorzuziehen, im Temperatur bereich von 27-32 C zu arbeiten. Es ist vorteilhaft, die Züchtung so lange fortzusetzen, bis sich eine wesentliche Menge von Kanamycin im Medium ge bildet hat. In einer tiefen, belüfteten., submersen Kul tur sind im allgemeinen 2-7 Tage notwendig, bis eine optimale Bildung des Antibiotikums erfolgt ist. Die günstigste Züchtungsdauer liegt bei 3-5 Tagen.
Das Kanamycin findet sich in flüssigem Anteil der Fermentationsbrühen vor.
Für die experimentelle Durchführung des erfin dungsgemässen Verfahrens haben sich folgende Ar beitsweisen als geeignet erwiesen: Schüttelkultur: 150 ml des wässerigen Mediums werden in einer Flasche von 500 ml Volumen unter gebracht und sterilisiert. Das Medium wurde hierauf mit den Mycelium und Sporen der Kanamycin pro duzierenden Organismen auf dem Agar Medium oder mit Mycelium, erhalten aus einer 48stündigen Schüttelkultur, geimpft und hierauf auf einer Schüttelmaschine (l20 Hübe pro Minute von 8 cm Amplitude)
unter Luftzutritt bei 27-29 geschüttelt.
Tankkultur: Ein rostfreier Stahlfermentator von 400 Liter Volumen wird verwendet. In demselben werden 180 oder 200 Liter des wässrigen Nähr- mediums untergebracht und bei 120^ C während 20 bis 30 Minuten sterilisiert. Die Belüftungsrate betrug 200 Liter pro Minute und die Umdrehungszahl des Rührers war 200 pro Minute. Als Antischaummittel wurden Silicone, Sojabohn,enäl oder Paraffinöl ver wendet.
Zur Gewinnung des in der flüssigen Phase der Fermentationsbrühe enthaltenen Kanamycins kann man diese vorzugsweise mit Butanol in Gegenwart einer Trägersubstanz, wie Laurinsäure oder Stearin- säure, extrahieren. Hierbei geht das Antibiotikum bei einem pH-Wert von 7-8 in das Butanol über und wird anderseits bei einem pH-Wert von 2-4 aus dem organischen Lösungsmittel in die wässrige Phase übergedrängt.
In Abwesenheit einer Trägersubstanz lässt sich Kanamycin nicht in wesentlichem Ausmass in Butanal, Äthylacetat, Butylacetat, Benzol usw. aufnehmen. Bei Extraktion ohne einen derartigen Träger lässt sich deshalb mit den genannten Lösungs mitteln eine Reinigung der Fermentationsibrühe von anderen coexistierenden Substanzen und Verunreini gungen erzielen.
Zur Abtrennung des Kanamycins aus der Fer- mentationsibrühe kann man auch so vorgehen, dass man die Brühe im Vakuum durch Verdampfen kon zentriert, oder zerstäubt. Aus dem Rückstand kann das Kanamycin mit Wasser, Methanol, Äthanol oder Aceton ausgezogen werden, wobei Ans.äuren mit Salz säure die Auflösung fördert.
Das Antibiotikum kann mit Aktivkohle aus neutraler oder alkalischer wäss- riger Lösung adsorbiert werden und lässt sich in der Folge von der Kohle d@esorbieren, unter Verwendung von wässri:gem oder absolutem Alkohol oder wäss- rigem Aceton, dessen pH-Wert auf 2,0 mit Salzsäure eingestellt ist.
Bei einem pH-Wert von 6-9 lässt sich Kanamycin auch von Kationenaustauscherharzen adsorbieren, wie z. B. einem Copolymeren der Meth@ acrylsäure und des Divinylbenzols. Nach Adsorption an einem Kationenaustauscher lässt sich das Anti biotikum mit wässriger Salzsäure eluieren. Desglei chen kann es mit wässriger Schwefelsäure oder wäss- rigen organischen Lösungsmitteln, z.
B. normaler Salzsäure in 10%i,ge:m, wässrigem Aceton, eluiert werden. Ferner lässt es sich auch mit Ammonium- hydroxyd eluieren.
Das derart erhaltene Eluat kann durch Vakuum verdampfung oder durch Gefriertrocknung konzen triert werden. Aus der konzentrierten Lösung lässt sich das Kanamycin in der Folge durch Zugabe eines Lösungsmittels, in welchem Kanamycin selber oder seine Salze praktisch unlöslich sind, ausfällen.
Zur Reinigung des Kanamycins können auch Chromatograph:iekolonnen mit Tonerde oder Aktiv kohle verwendet werden. Hierbei kann beispielsweise so gearbeitet werden, dass eine wässrige Lösung des Kanamycins vom pH-Wert 8,0, welche aus wieder holter Anwendung eines Kationaustauscherprozesses erhalten wurde, durch eine Kolonne, welche Aktiv kohle enthält, durchsaufen gelassen wird.
Hierauf wird die Kolonne mit destilliertem Wasser ausge- waschen und schliesslich mit 0,5nornnaler Schwefel säure eluiert. Die am meisten aktive Fraktion des Elurates wird; zu Methanol .zugegeben, worauf kristal lines Kanamycinsulfat ausfällt.
Aus den Salzen des Kanamycins, beispielsweise aus dem Hydrochlorid oder dem Sulfat, lässt sich die Kanamycinbase gewinnen, indem man beispielsweise die Lösung des Kanamycinsul@fats mit Baritlawge be handelt.
Kanamycinhydrochlorid ist in Wasser und Metha nol löslich, wenig löslich in Äthianol und unlöslich in Aceton, Äthylacetat, Butylacetat, Benzol, Äther oder Petroläther.
Kanamycins.ulfat ist wasserlöslich, dagegen un löslich in Methanol, Äthanol, Aceton, Äthylacetat und Benzol.
In Pyridin gelöstes Kanamycin ergibt eine posi tive Ninhydrinreaktion. Die Testreaktionen nach Tollens, Sakaguchi, Fehling, Molisch und Elson- Margan (Gl.ucoseamintest) verlaufen negativ, wobei der Glucoscamintest ebenfalls nach Hydrolyse negativ ausfällt.
Der Rf-Wert des Kanamycins, ausgeführt mit Papiers:treifenchromaatographie (mit Toyo -Fütrier- papier Nr. 50 und 0,20/a p-Toluolsulfonsäure-Butanol gesättigt mit Wasser), ergab 0:
,.21-0,26. Kanamycin ist optisch aktiv, wobei eine 1%%ge, wässrige Lö- sung gereinigten Kanamycinhydrochlorids. den Wert [a]D = + 103 aufweist, während eine 1% ige,
wäss- rige Lösung von der freien Kanamycinbase den Wert [a117 = + 112 . und eine 1%,ige, wässrige Lösung kristallinen Kanamycinsulfats den Wert [a]23 = + 121 ergibt.
Die Analysendaten der freien Base sind fol gende: berechnet für C14H"N3011: C = 40,48,H = 7,04,N =<B>10,</B> 12,<B>0</B> = 42,370/0 gefunden: C = 43,17,H = 6,95,N = 9,82% Die Analysenwerte des Hydrochlorids sind folgende: berechnet für C14H"N3011. 3 HCl: C = 32,04, H = 6;15, N = 8,01, Cl = 20,27, O = 33,54% gefunden:
C =<B>3,1,3 1,</B> H = 6,07, N =<B>8,2 1,</B> Cl = 18,03 0/0 Analytische Daten für das Kanamycinsulfat (amorph): berechnet für C14H"N3011 "/2 H@S04: C = 29,89, H = 5,73, N = 7,47, s = 8,57, O = 48,35% gefunden:
C = 3 0,20, H = 5,88,N = 7,43% Analysenwerte für N-Acetyl-Kanamycin: berechnet für C14H20N3011 ' 3<B>CH</B> 3C0:
C = 44,36,H = 6,51,N = 7,76,O = 41,36% gefunden: C = 44,39, H = 6,01,N = 7,49% Analysendaten für das Kanamycin-Reineckesalz:
berechnet für C14Hz9N30" - 3.(C4H.N.S4Cr): C = 22,68, H = 3,88, N = 21,37,S = 27,95, Cr = 11,33,O =l2,78 e/o gefunden: C = 21,44,H = 4,31,N = 19,93, Cr = 11,400/0 (aus dem Aschegehalt).
Analysenwerte für kristallines Kanamycinsulfat: berechnet für C14H29N3011 " i/2 HZSO4: C = 3 6,21, H = 6,51,N = 9,05,S = 3,44, O = 44,799o gefunden: C = 35,97, H = 6,51,N = 9,13,S = 3,47 /o. Kanamycinbase zeigt im ultravioletten Spektral- bereich zwischen 220 und 400 m,y keine Absorption.
Aus dem lnfrarotabsorptionsspektrum des kristalli nen Kanamycin-hemisulfats, welches mit Kalium- bro@mid tablettiert wurde, ergibt sich, dass das neue Antibiotikum offensichtlich eine neue und charakte ristische Konfiguration aufweist.
Die charakteristi schen Absorptionsbanden im Infrarot haben folgende Wellenlängen in Micron: 2,85, 3,03, 3,20, 3,30, 3,43, 3,63, 3,70 3,83, 4,70 (breit), 6,05, 6,17, 6,27, 6,60, 6,90,<B>7,15,</B> 7,35, 7,52, 7,60, 7,95, 8,18, 8,76, 8,95, 9,08, 9,40, 9,70, 10,20, 10,48, 10,75, 11,13, 11,50, 11,90,<B>12,35,</B> 12,80 und<B>13,15.</B> Unter den bekannten Antibiotika weisen Neomycin B und C, Neamin und Catenulin gewisse gemein same Charakteristiken mit dem Kanamycin auf, jedoch unterscheidet sich das Kanamycin eindeutig von den genannten Antibiotika.
Der für Neomycin ausgewiesene Glucosamintest, welcher im Buch Assay Methods of Antibiotics von D. C. Grove und W. A. Randall (Medical Encyclopedia Inc. New York) beschrieben wurde, verläuft mit Kanamycin negativ.
Diese Reaktion ist für die Neomycine und das Cate- nulin positiv. Papierchromatographie mit 2 % p- To@luols.ulfosäure-Butanol, gesättigt mit Wasser, unter scheidet das Kanamycin vom Neamin. Mit Toyo. - Filterpapier Nr.
50 betrug der Rf-Wert des Kana- mycins 0,21-0,26 und derjenige des Neamins 0,75 bis 0,85. Im Testversuch mit verdünnten Fermenta- tionsbrühen inhibierte Kanamycin das Wachstum von Klebsiena pneumoniae bei 3 meg/ml, Neamin bei 25 mcg/ml, Neomycin B bei 3 mcg/ml und Catenulin bei 1,
5 mcg/ml. In der Zylinderplattenmethode mit B. subtilis waren für die Ausübung einer Inhibition von 20 mm Durchmesser 30 mcg pro ml Kanamycin 25 meg/ml Neamin, 170 mcg/ml Neomycin B, 250 mcg/ml Neomycin C oder 18 mcg/ml Catenulin erforderlich.
Sowohl diese genannten Charakteristiken als auch die Eigenschaft geringer Toxizität und die empirischen Formeln bestätigen die Tatsache, d'ass Kanamycin sich von den Neomycinen, dem Neamin und dem Catenulin .unterscheidet und ein neues Anti biotikum ist.
Getestet nach der Agar-Verdünnungsmethode zeigte das Kanamycin folgendes antibakterielles Spektrum:
EMI0004.0097
Minimale
<tb> Konzentration
<tb> Mikroor;anismen <SEP> zur <SEP> vollständigen
<tb> Inhibition
<tb> meg/ml
<tb> S. <SEP> lutea <SEP> PCI-1001 <SEP> 1,8
<tb> M. <SEP> Pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 2,2
<tb> M. <SEP> Pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 0,4
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 9,0
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> PCI-219 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> NRRL-558 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> su,btilis <SEP> Tracy <SEP> 9,0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 2,2
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 3,1
<tb> S.
<SEP> dysenteriae <SEP> 1,6
<tb> Proteus <SEP> vulgans <SEP> 6,2
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 3,1
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 2,2
<tb> Saecharomyces <SEP> Bake <SEP> 300
<tb> Sacch <SEP> aromyces <SEP> 300
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 300
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 300 In Kirchners Medium verhinderte es den Durch bruch des Mycobacteriums tuberculosis. H., bei 2 mcg/ml. Das stre:
ptomycinresistente E. coli und streptomycinfeste Mycobacterium tuberculosis homi- nis waren auf Kanamycin empfindlich.
Mäuse ertrugen intravenöse Injektion von 150 mg/kg. Die LD,DO-Dosen betrugen bei Mäusen, Ratten und Kaninchen<B>150-250</B> mg/kg. Mäuse ertrugen, tägliche, subcutane Injektionen in der Dosis von 200 mg/k- während 30 Tagen.
An Hunden wurden keine Nebenerscheinungen beobachtet, wenn ihnen tägliche Injektionen von 100-200 mg/kg an Kanamycin verabfolgt wurden während einer Dauer von 30 Tagen.
Intraperitoneale Injektion von mehr als 50 mcg pro Maus alle 4 Stunden schützten die Mäuse, welche mit 10000 MLD von Diplococcus pneumoniae oder 1000 MLD von Salmonella typhosa infisziert worden waren.
Tägliche subkutane Injektion von 100 mg/ kg Kanamycin ergab einen Inhibitor- effekt an mit Mycobacterium tuberculosis (Ravenel- Stamm) infizierten Mäusen. <I>Beispiele</I> 1.
Zu einem wässrigen Basismedium, das 0,750/ö Fleischextrakt, 0,75 e/e Pepton und 0,3 % Natrium- chlorid enthielt, wurden Glucose, Glycerin, Lactose, Maltose, Saccharose, Stärke oder Dextrin im Anteil von 2% zugesetzt,
das Gemenge hierauf sterilisiert und der pH-Wert nach der Sterilisation auf 7,0 einge stellt. Das Gemenge wurde hierauf inokuliert mit einer auf Glycerin CzapekAgar befindlichen Kultur von Streptomyces Kanamyceticus und bei 27-29 C unter Luftzutritt geschüttelt.
Die Bildung des Kana-
EMI0005.0005
maximale <SEP> Produktion <SEP> End-pH-Wert <SEP> und <SEP> Anzahl <SEP> Tage
<tb> Kohlenstofflieferant <SEP> von <SEP> Kanamycin <SEP> zur <SEP> Ausbildung <SEP> maximaler
<tb> mcg/ml <SEP> Produktion
<tb> Stärke <SEP> 250 <SEP> 7,8 <SEP> 5 <SEP> Tage
<tb> Dextrin <SEP> 200 <SEP> 8,0 <SEP> 5 <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 200 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8,6 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 100 <SEP> 8,4 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 100 <SEP> 8,0 <SEP> 4 <SEP> Wenn eines der angegebenen Kohlehydrate zu einem Basismedium,
enthaltend 1% Sojabohnenmehl-, 0,05 /o KCI, 0,05 % MgS04 - 7 H20 und 0,3 % NaCI,
EMI0005.0023
maximale <SEP> Produktion <SEP> End-pH-Wert <SEP> und <SEP> Anzahl <SEP> Tage
<tb> Kohlenstofflieferant <SEP> von <SEP> Kanamycin <SEP> zur <SEP> Ausbildung <SEP> maximaler
<tb> mcg/ml <SEP> Produktion
<tb> Stärke <SEP> 250 <SEP> 7,
6 <SEP> 4 <SEP> Tage
<tb> Dextrin <SEP> 250 <SEP> 8,0 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 100 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8,4 <SEP> 3 <SEP>
<tb> Saccharose <SEP> 150 <SEP> 8,4 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 70 <SEP> 8,2 <SEP> 4 <SEP> 2. Ein wässriges Medium, enthaltend 2 % Stärke, 1,2% Sojabohnenmehl, 0,051119 KCl, 0,
0511/o Ma S04 * 7H0, 0,1% K2HP04, 0,3 % NaCI, 0,3 % Pepton und 0,5 % CaCO3, dessen Anfangs-pH-Wert 7,0 betrug, wurde mit einer ausgewählten Kultur von S.
kanamyceticus (Stramm K24) auf Glycerin; Czapek- Agar geimpft und unter Luftzutritt gezüchtet.
Nach 4 Tagen Schütteldauer betrug der pH-Wert 8,2 und der Zylinderplattenversuch mit B. subtilis und Myco- bakterium 607 ergab die Produktion von 550 mcg/mI Kanamycin.
3. 180 Liter eines wässrigen Mediums, enthal- tend 2,0% Stärke, 1,0% Glukose, 1,2% Soja-
EMI0005.0082
Stunden <SEP> PH <SEP> Kanamycin <SEP> Reduzierender <SEP> Zucker <SEP> 0 <SEP> Ammoniak-N,
<tb> mcg/ml <SEP> /o <SEP> in <SEP> der <SEP> Flüssigkeit <SEP> mg <SEP> /0 <SEP> in <SEP> der <SEP> Flüssigkeit
<tb> 0 <SEP> 6,6 <SEP> - <SEP> 2,20 <SEP> 2,5
<tb> 24 <SEP> 6,9 <SEP> - <SEP> 1,50 <SEP> 10,7
<tb> 36 <SEP> 7,6 <SEP> 150 <SEP> 0,4 <SEP> 1,2
<tb> 48 <SEP> 7,6 <SEP> 200 <SEP> 0,3 <SEP> 1,2
<tb> 60 <SEP> 8,0 <SEP> 220 <SEP> 0,3 <SEP> 6,
0
<tb> 72 <SEP> 8,2 <SEP> 210 <SEP> 0,25 <SEP> 12,0 mycins wurde nach der Zylinderplattenmethode mit Mycobakterium 607 kontrolliert, wobei sich folgende Resultate ergaben: zugageben wurde, ergaben sich die folgenden Resul tate:
bohnenmehl, 0,3 % NaCI, 0,05 % KCI, 0,05 0/0 MgS04 ' 7H20, 0,1% K2HP04, 0,21% CaC03, 0,3 % NaN03, 0,
002 % MnS04 * 7 H20 und 0,002 % ZnS04 * 7 1120 wurde in einem: Fermentator von 400 Liter untergebracht, sein pH-Wert auf 7,4 einge stellt und schliesslich 30 Minuten lang bei 120 sterilisiert.
Es wurde geimpft mit 1000 Liter einer 40 Stunden lang geschüttelten Brühe von S. kanamyce- ticus (eine ausgewählte Unterkultur des Stammes K24) und unter Belüftung im Tank bei 27-29 C gezüchtet.
Als Antischaummittel wurde Sojabohnenöl (0,04 %) und Silicon (0,04 %) zugefügt. Es ergaben sich folgende Resultate:
4. 200 Liter eines wässrigen Mediums, enthaltend 2,0 % Stärke, 1,011/o Sojabohnenmehl, 0,0511/o KCl, 0,0511/o MgS04 * 7 H20, 0,311/o NaC1, 0,2 % NaN03, wurden in:
einem 400-Liter Fermentator unterge bracht, der pH-Wert auf 7,5 eingestellt, das Medium sterilisiert, worauf der pH-Wert 7,0 betrug und im übrigen gemäss Beispiel 3 weiterbehandelt. Nach 48 Stunden enthielt die Brühe 250 mcg/ml Kana- mycin. In der Folge veränderte sich die Konzen tration des Kanamycins in der Brühe nicht mehr wesentlich. Nach 65 Stunden Fermentation wurde die Brühe filtriert. Hierbei wurden 160 Liter filtrierte Brühe erhalten.
Die letztere enthielt 150 mcg/ml Kanamycin und ihr pH-Wert betrug 8,2. Das Filtrat wurde durch einen Kationenaustauscher durchlaufen gelassen. Die Kolonne des letzteren wies 15 cm Durchmesser auf und enthielt 6 Liter IRC-50 in der Natriumform (das heisst regeneriert mit Natrium hydroxyd) bei pH = 8,0.
Amberlit ICR-50 (Mar kenprodukt) ist ein Kationenaustaucher vom Carboxyl- säuretyp. Es ist ein Copolymeres der Methacrylsäure und des Divinylbenzols.. Das Filtrat wurde mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 16 Liter pro Stunde durch die Kolonne duschgeschickt. Im Durchlauf er gab sich bei Prüfung nach der Zylinderplatten me;thod''e keinerlei antibakterielle Aktivität gegen Mycobacterium 607.
Die Kolonne wurde hierauf mit ungefähr 10 Liter .destilliertem Wasser gewaschen, wobei dieselbe Durchlaufgeschwindigkeit zur Anwen dung kam wie bei der Brühe. Hierauf wurde normale Salzsäure mit einer Durchsatzgeschwind'igkeit von 0,8 Liter pro Stunde durch die Kolonne d'urchge- schickit. Das Eluat wurde in 2-Liter-Portionen ab schnittweise gesammelt. Nach der 7. Portion wurde das Eluat sauer und das Kanamycin wurde in der 7.-10. Portion wieder gefunden.
Die Kanamycin enthaltenden Portionen wurden vereinigt und die erhaltenen, gesamthaft 8 Liter mit 1011/oiger Natron lauge auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, hierauf durch Vakuumdestillation bei ungefähr 50 C auf 300 ml eingeengt.
Die konzentrierte Lösung wurde einer Gefriertrocknung unterworfen. Das auf diese Art erhaltene braunweisse Pulver im Gewicht von 500 g enthielt 8 g Kanamycin. Dieses Produkt wurde in 2 Liter Methanol gelöst und, nachdem der un lösliche Anteil abgetrennt wurde, wurden 20 Liter Aceton zugegeben, worauf sich 80 g des braunweissen Pulvers erneut abschieden. Dieses Pulver enthielt immer noch 8 g Kanamycin. 20 g des Pulvers wur den in 40 ml destilliertem Wasser gelöst und wässrige Reineckesalzlösung zugefügt.
Die schwach .rosafarbige Fällung, welche zuerst sich bildete und 50 g wog, wurde abgetrennt, hierauf mehr Reineckesalzlösung zugegeben, bis sich keine weitere Fällung mehr bil dete. Die rosafarbene Fällung wurde abgetrennt und aus destilliertem Wasser umkristallisiert, worauf kristallines, rosafarbenes Kanamycin-Reineckesalz (300 mg) erhalten wurde. Im Schmelzversuch färbte es sich bei 191-193 C dunkel und zersetzte sich bei 211-213 C. Das zuerst ausgefallene, schwach rosafarbene Produkt enthielt ebenfalls Kanamycin.
5. Ein in einem 400-Liter-Fermentator aus rost freiem Stahl befindliches wässriges Medium von 200 Liter Volumen wurde mit S. kanamyceticus (einer ausgewählten Subkultur des K2-J-Stammes) geimpft und fermentiert.
Das Medium enthielt 2,011/o Stärke, 1,011/o Glucose, 1,211/o Sojabohnenmehl, 0,311/o Kochsalz, 0,0511/o KCl, 0,05 0/0; MgS04 ' 7 H20, 0,111/o KZHP04, 0,211/o CaC03 und 0,311/o Pepton. Der pH-Wert des Mediums betrug nach Sterilisation 7,0.
Als Antischaummittel wurde 0,111/o Sojabohnenöl zugegeben. Nach 65 Stunden Kultivation unter Be lüftung enthielt die Brühe 220 mcg/ml Kanamycin. Ihr pH-Wert betrug 8,0. Sie wurde filtriert, wobei 170 Liter Filtrat mit einem Gehalt von 210 mcg/ml Kanamycin erhalten wurden. Das Filtrat wurde durch eine Kationenaustauscherkolon.ne geschickt.
Der Aus- tauscher bestund aus 6 Litern Amberlit IRC-50 in der Natriumform bei einem pH-Wert von 8,0 und befand sich in einer Kolonne von 15 cm Durchmesser. Die Durchflussmenge betrug 30 Liter pro Stunde, das heisst 1/1Z Liter des Harzvolumens pro Minute. Im weiteren wurden 30 ml Wasser durch die Kolonne geschickt, wobei die Durchsatzgeschwindigkeit 30 Liter pro Stunde betrug.
Das vom Harz absorbierte Kanamycin wurde hierauf mit normaler Salzsäure eluiert, wobei die Durchsatzgeschwind'igkeit 3 Liter pro Stunde betrug. Das erste Eluat (6,5 Liter) ent hielt keinerlei Aktivität. Die folgenden Eluate ent hielten Kanamycin: 90 /o des adsorbierten Kanamy- cins erschienen im Eluat wieder, wobei dessen pH- Wert höher als 2,0 war.
Das die Aktivität enthal tende Eluat (16 Liter) wurde auf einen pH-Wert von 7,5 mit 10 %iger Natronlauge eingestellt. Es wurde hierauf auf 80 Liter verdünnt. Die. Ausbeute des Brühefiltrates betrug 8311/0. Die verdünnte Lösung wurde wiederum durch eine Harzkolonne durchlaufen gelassen.
Diese Kolonne enthielt 2 Liter IRC-50 - Harz in der Natriumform mit einem pH-Wert von 7,5. Der Durchmesser der Kolonne betrug 5 cm. Die Durchsatzgeschwindigkeit lag bei 10 Litern pro Stunde. Die Kolonne wurde mit 20 Litern Wasser mit einer Durchsatzgeschwindigkeit von 10 Litern pro Stunde ausgewaschen, hierauf wurde das ad'sor- bierte Kanamycin mit normaler Salzsäure eluiert. Die Durchsatzrate betrug hierbei 3,0 Liter pro Stunde.
Wie in der vorgängigen Eluierung, .erschien das Kanamycin im Elüat, dessen pH-Wert höher als 2,0 lag. Das aktive Eluat (4,5 Liter), wurde auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt, indem diesem ein Anionaustauscherharz Amberl.it -IR-4B (Marken produkt) in der Hydroxy1form zugegeben wurde.
Amberlit IR-4B ist ein schwach basischer Anion- austauscher des Typs, wie er in der amerikanischen Patentschrift Nr. 2591573beschrieben ist. Das der art behandelte Eluat wurde im Vakuum bei unge fähr 40 C auf 500 ml eingeengt. Zu dem derart erhaltenen Konzentrat wurden 5 ml Methanol zuge geben und die unlöslichen Teile abgetrennt.
Das Filtrat wurde im Vakuum bei ungefähr 40 C auf 250 ml weiter eingeengt und zur konzentrierten Lö sung 2,5 Liter Aceton zugegeben, wobei 65 g Kanamycin in Form eines leicht braunen Pulvers erhalten wurden. Der Wirkungswert dieses Pulvers betrug 350 nie g/rng.
6. Das bräunlich-weisse Kanamycin (5 g) erhalten nach Beispiel 5, wurde in 50 ml 60%igem, wässrigem Methanol gelöst, der unlösliche Anteil abgetrennt und zum Filtrat 40 tn1 60 /oiges, wässriges Methanol, enthaltend 2000 mg Ammoniumsulfat zugefügt,
worauf das ausgefallene Kanamycinsulfat abfiltriert und mit 50 ml 80 /oigem, wässrigem Methanol ge waschen und getrocknet wurde. Auf diese Weise wurden 4,5g Kanamycinsulfat in Form eines hell braunen Pulvers erhalten. Sein Wirkungswert betrug 370 mcg/mg.
7. Werden die nach der Arbeitsweise des vor stehenden Beispiels 4 erhaltenen salzsauren, kana- mycinhaltigen Eluate des Kationenau,stausch-Pro- zesses im Vakuum eingedampft und -das erhaltene feste Material einer Gefriertrocknung unterworfen, so erhält man rohes Kanamycin-Hydrochlorid.
10 g derart hergestelltes KanamycinrHydro- chlorid, dessen Wirkungswert 535 mcg/rng betrug, wurden in 100 ml 900/uigem, wässrigem Methanol gelöst und durch eine Tonerdekolonne hindurch laufen gelassen. Die Kolonne von 1,5 cm Durch messer enthielt 140 g Tonerde, welche mit Schwefel säure behandelt worden war. Sie wurde mit Methanol entwickelt.
Das erste Eluat von 200 m1 enthielt kein Kanamycin. Das zweite Eluat (128 ml) erwies sich antibakteriell wirksam und wurde im Vakuum ein gedampft, worauf 4,681g Kanamycin-Hydrochlorid in Form eines weissen Pulvers erhalten wurden. Der Wirkungswert dieses Pulvers betrug 560 mcg/mg. Nach demselben Verfahren wurden aus dem dritten Eluat (115 ml) 2,205g festen weissen Kanamycin- Hyd@rochlorids erhalten.
Der Wirkungswert des letzte ren betrug 615 mcg/mg. Danach wurde das gelbe Pigment von der Kolonne ad'sorbiert und das Kana- mycin,-Hydrochlorid in Form eines farblosen Pulvers erhalten.
Das von der Kolonne adsorbierte gelbe Pigment wurde mittels weiterer Eluierung mit 50 % igem, wässrigem Methanol und destilliertem Wasser herausgelösit.
B. 4 g festes Kanamycin@-Hydrochlorid, herge stellt wie in den Beispielen 4 und 7 beschrieben, dessen Wirkungswert 500 mcg/mg betrug, wurden in 200 ml Methanol gelöst und nach Eindampfen auf 80 ml durch eine Kolonne geschickt, welche 5 g Aktivkohle und 25 g pulverförmige Cellulose ent hielt. Die Kolonne wurde mit Methanol entwickelt. Das erste Eluat (50 ml) enthielt kein Kanamycin. Das zweite Eluat (60 ml) wurde eingedampft, wobei 364 mg Kanamycin-Hydrochlorid anfielen.
Der Wir kungswert des letzteren betrug 720 mcg/mg. Das diritt.e Eluat (46 ml) ergab 381 mag Kanamycin- Hydrochlorid in Form von Pulver. Der Wirkungs wert des letzteren lag bei 616 mcg/mg. Aus dem vierten Eluat (55 ml) wurden 1,873 mg weissen Kanamycin-Hydrochlorids erhalten, dessen Wir- kungswert 483 mcg/mg betrug.
Das fünfte Eluat (55 md) ergab 956,6 mg in Form eines weissen Pul vers mit einem Wirkungswert von 410 meg/mg. Alle hierbei erhaltenen festen Substanzen waren farblos.
9. S. kanamyceticus wurde in einer Schüttel kultur unter Luftzutritt 4 Tage lang bei 28 C ge- züchtet, wobei das wässrige Nährmedium 1,0% Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehl und 0,3 % Kochsalz bei einem anfänglichen pH-Wert von 7,0 enthielt.
Die Kulturbrühen von 25 Flaschen wurden vereinigt und filtriert. Der pH-Wert des Filtrates betrug 8,2 und das Filtrat enthielt 400 mcg/ml Kanamycin. Das Filtrat (3,100 ml) wurde durch eine Harzkolonne, enthaltend IRC-5,0 durchgeschickt. Die Kolonne enthielt 100 ml des Harzes in dessen Natriumform aus dem pH-Wert 8,0.
Nach der Absorption wurde die Kolonne: mit 500 ml Wasser ausgewaschen und das adsorbierte Kanamycin mit normaler Salzsäure eluiert, wobei das E1uat in Abschnitte von je 20 ml unterteilt wurde. Die antibakterielle Aktivität war im vierten bis zum neunten Abschnitt enthalten. Diese Abschnitte wurden vereinigt und ihr pH-Wert auf 6,0 eingestellt.
Die Lösung wurde im Vakuum auf 12 ml eingeengt und die unlöslichen Verunreinigungen abfiltriert. Zum Filtrat wurde Reineckesalz zugegeben. Die zuerst entstandene Fällung war leicht rosafarben, wog 50 mg, enthielt Kanamycin und wurde abge trennt.
Zum Filtrat wurde weitere Reineckesalz- lösung zugegeben, bis keine Fällung mehr entstund. Die rosafarbenen Fällungen wurden abgetrennt und getrocknet, wobei sich 544 mg Kanamycin-Reinecka- salz ergaben und ungefähr 30 % der antibakteriellen Aktivität in der Lösung verblieben. Die vereinigten Fällungen wurden zu 12 ml destilliertem Wasser zuge geben, auf 60 C erwärmt und filtriert.
Das derart erhaltene Filtrat wurde abgekühlt und die Kanamycin- Reineckesalzkristalle auf diese Art gewonnen. Zur Mutterlauge wurde Kanamycin-Reineckesalz zugesetzt und nach erneutem Heizen auf 60 C und Abkühlen der zweite Anteil kristallinen Kanamycin-R.einecke- salzes abgetrennt. Dieses Verfahren wurde weitere drei Male wiederholt.
Auf diese Weise wurden 300 mg kristallinen Kanamycin-Reineckesalzes isoliert. 140 mg dieses Salzes wurden zu 105 m1 destilliertem Wasser zugegeben und zur Lösung 2,5 normale Salzsäure in Pyridin tropfenweise zugefügt, bis sich keine Fällung mehr bildete. Die Fällung wurde abzentrifugiert, der Gefriertrocknung unterworfen und mit Aceton gewaschen. Hierbei wurden 60 mg Kanamycin- Hydrochlorid in, Form einer hygroskopischen, weissen, festen Substanz erhalten.
10. 10 g Kanamycin-Hydrochlorid vom Wir kungswert 450 mcg/mg, erhalten gemäss Beispiel 5, wurden in einem Liter destilliertem Wasser gelöst und der pH-Wert auf 6,4 eingestellt. Die Lösung wurde mit einer Durchsatzrate von 10 ml pro Minute durch eine Kolonne von 75 ml IRC-50 Harz in Natriumform bei einem pH-Wert von 6,4 durch laufen gelassen.
Nachdem die Kolonne mit 50 ml Wasser nachgewaschen worden war, wurde das ad sorbierte Kanamycin mit 5 o/oigem Ammonium hyd!roxyd eluiert. Das erste Eluat (80 ml) zeigte keine antibakterielle Aktivität, während das weitere Eluat (130 ml) das Kanamycin enthielt. Der pH-Wert dieses Eluates lag höher als 10,0. Es wurde im Vakuum bei ungefähr 40 C auf 22 ml eingeengt.
Die Ausbeute in dieser konzentrierten Lösung war <B>97,80/a.</B> Die konzentrierte Lösung wurde durch eine Kolonne, enthaltend 20g Aktivkohle der Maschen zahl 100-250 durchlaufen gelassen. Der Kolonnen durchmesser betrug 2 cm. Die Kolonne wurde hierauf mit 160 ml destilliertem Wasser ausgewaschen und chromatographisch mit 0,5 normaler Schwefelsäure entwickelt. Die durchlaufende Lösung wurde in un gefähr 20 ml umfassende Portionen unterteilt. Das Kanamycin-Sulfat erschien von der fünften Fraktion an.
Die erste bis vierte Fraktion, deren pH-Werte bei 6,2 bis 6,4 lagen, enthielt kein Kanamycin,. Beinahe die gesamte Kanamycinmenge wurde in der fünften bis und mit der achten Fraktion gefunden, wobei sich folgende Werte ergaben:
Fünfte Fraktion pH = 8,2, 22,0 ml, 16,9 mg/ml; sechste Fraktion pH = 8,6, 23,0 rnl, 65,3 mg/ml; siebente Fraktion pH = 8,6, 20,0 ml, 55,0 mg/ml; achte Fraktion pH = 4,6, 22,0 ml, 47,5 mg/ml;
neunte Fraktion pH = 1,0, 22,0 ml, 4,2 mg/ml. Zur sechsten Fraktion wurden 23,0 ml Methanol zugefügt und hierbei kristallines Kanamycin-Sulfat ausgefällt, welches abfiltriert und getrocknet wurde. Es ergaben sich hierbei 1,39 g kristallines Kanamycin- Sulfat. 1,2 g dieses kristallinen Sulfates wurden in 8 ml Wasser gelöst, auf 45 C erwärmt und 6,5 ml Methanol unter Rühren und Kühlung zugefügt.
Hier bei fiel Kanamycin-Sulfat (1;07 g) aus in kristalliner Form. Mikroskopisch betrachtet, erwies es sich als farblose, plattenförmige Kristalle. Es schmolz nicht bis 250 C. Analyse: C = 35,97, 35,89; H = 6,51, 6,56; N = 9,13, 8,92; S = 3,47'%. [a]D = -f- 121 .
Gewünschtenfalls, und wenn die pharmazeutische Verträglichkeit gewährleistet ist, können zu dem erfindungsgemäss hergestellten Antibiotikum andere Medikamente zugemischt werden, wie z.
B. Anti- histaminverbindungen, Sulfadrogen, Stimulantien, Lokalanästhetica, Analgetika, Laxiermittel, Sedativa, Penicillinsalze und andere antibiotische Agentien, wie Streptomycin oder Tetracyclin, ferner Vitamine, Hormone oder antifungal wirkende Agentien.
Process for the Production of Kanamycin The present invention relates to a process for the production of the new antibiotic kanamycin by fermentation.
The new antibiotic produced according to the invention inhibits the growth of gram-positive, gram-negative and acid-fast bacteria, such as Mycobacterium tuberculosis.
The method according to the invention is characterized in that a strain of Streptomyces kanamycetiaus nov. spec. is cultivated aerobically in an aqueous carbohydrate solution which contains nitrogenous nutrient substances, whereupon the antibiotic is separated off and, if necessary, purified.
The microorganisms producing the new antibiotic were separated from a soil sample obtained on Nagano Prefecture in Japan. They represent a new species of the genus Streptomyces, which is called Streptomyces kanamyceticu, s.
A culture of Streptomyces kanamyceticus was deposited in the American Type Culture Collection in Washington D. C., where it was incorporated into the permanent collection of microorganisms under the designation A. T. T. C. <B> 12853 </B>.
Streptomyces kanamyceticus has the following characteristic properties: Microscopic observation shows that the substrate Mycelium is approximately 1. cc thick and branched. The air mycelium developed from submerged mycelium branches and carries the spore carriers at the end.
Spirals and whorls are usually not observed.
Grown on glycerine Czapek agar (27 C) resulted in a plant that was initially colorless and later lemon yellow. The underside is hay-colored, the aerial mycelium is white to yellow, occasionally with a greenish or slightly pinkish tinge. Occasionally a pale brown, soluble pigment is observed.
Cultivated on Krainsky-Glucose As.p, aragin agar (27 C), the result was: The plant is colorless to yellow and the reverse side is white, pale pink-white, yellow or new colors. The sparsely developed air mycelium usually arises from the center of the Kolbnie and is white, pale pinkish-white, pale greenish-yellow, or yellow. usually no soluble pigment is formed.
Cultivated on calcium malate agar (27 C), the result was: the plant is smaller, otherwise essentially the same as on Krainsky glucose asparagine agar. Sometimes there is no growth at all.
Grown on the starch plate (27 C), the appearance is essentially the same as on Krainsky glucosa, asparagine agar, but the growth is restricted and no aerial mycelium is formed. The starch is hydrolyzed.
On a potato plug (27) a wrinkled plant with a grainy surface of a slightly yellow-brown to yellow hue arises. An air mycelium does not form or at most only barely. It is white. There is no soluble pigment. The plug below the plant is normally dark in color.
On a carrot stopper (27 C) usually only a sparingly developed plant emerges, which may have the same shape as on the potato stopper. On peptone water with 2% sodium nitrate (27 C)
The result is a m'ng-shaped surface growth which is colorless to whitish-yellow and white at the base. The occasionally formed air, mycelium, is also white. Nitrite is created from the nitrate.
It forms. no soluble pigment. Cultivated on Pepton Fleischex rakt agar (37 C), a wrinkled, white to yellow growth develops that does not develop any aerial mycelium or soluble pigment.
The shape on blood agar (37 C) is wrinkled, reddish brown in color with a gray tinge. Air mycelium or soluble pigment are not formed.
On milk at 37 C there is normally no change and no growth of any kind on the surface.
Growth is limited on coagulated Loeffler serum (37 C), the structure is white to yellow in color. No air mycelium or soluble pigment forms. Wrinkled growth develops on egg substance (37 C), without an air mycelium.
Liquefaction occurs on gelatin without the formation of a soluble pigment.
As carbon suppliers, usable on a Czapek salt base medium, the following substances come into question: arabinose, dextrin, fructose, galactose, glucose, glycerol, maltose, mannitol, mannose, raffinose, starch, sucrose, succinates. The following are not suitable as carbon suppliers:
Inositol, inulin, lactose, rhamnose, sorbose, xylose, acetate. Only poorly absorbed, carbonaceous substances: are: esculin, salicin, sorbitol and citrate.
The above-mentioned characteristics are sufficient to distinguish the microorganism from previously known Streptomyces species and to show that the strain K 2-J belongs to a new species. Variation or mutation of the organisms described above can normally be expected because: This behavior is a common property of the organisms of the Streptomyces species.
It is thus also possible to use all natural or artificial variants or mutants of Streptomyces kanamyceticus.
The characteristics of this species can be summarized as follows: The growth of the colony is colorless to yellow, with or without a greenish or pinkish tinge. The reverse side of the colony on synthetic agar is colorless, white, pale pink-white, whitish-yellow or hay-colored. The aerial mycelium is white to yellow and there are no spirals or whorls on it. Occasionally a pale brown, soluble pigment develops on synthetic nutrient media.
Gelatine is liquefied and starch is hydrolyzed.
Streptomyces kanamyceticus (K24) can e.g. B. cultured in shake flasks in the following way: The nutrient medium was the following composition: 0.75 0/0 meat extract, a, 750/0 peptone, 0.3% NaCl, with 1% starch, dextrin, maltose, glucose,
Lactose, saecharose or glycerine, as well as a second nutrient medium, consisting of 2% soybean meal, 0.05% KCl, 0.05119 MgS04 '7H20, 0.51 / o NaCl, 0.20 / 9 NaN0-, with 1,
0 0/0 starch, dextrin, maltose, glucose, lactose, sucrose or glycerine. The starting pH of all media was adjusted to 7.0. After 24-48 hours of shaking, the pH had dropped to around 6.0-6.8 in some cases, but rose again after 72-120 hours and finally reached 7.5-8.6.
In the second, above-mentioned nutrient medium, to which 2% starch was added, the pH value rose to 8.2 after 3 days of shaking and 250 mg kanamycin per ml were formed.
In a tank culture with a medium containing 2 0i0 starch, 0.5% glucose, 1.2% soybean meal, 0.05% KCl, 0.051) / o MgS04 - 7H20, 0.1% kafumphosphat (K2HP04), 0, 3% table salt, 0,
Containing 3% peptone and 0.3% calcium carbonate, the pH was lowered slightly at the beginning (6.6) and then rose again after 43 hours to 8.0. Here, 273 mcg of kanamycin per ml were formed in the course of 78 hours.
The fermentation broths described above and raw products obtained from them can be used as the nutrient medium.
Suitable nitrogen suppliers are soybean flour, cottonseed flour, peanut flour, meat extract, peptone, pressed corn juice or yeast extract. As carbon suppliers, starch, dextrin, maltose, glucose, sucrose, lactose and glycerin come into question.
A combination of starch and soybean flour has proven to be one of the best combinations, with the addition of corn juice, peptone, yeast extract or nitrates to this combination being shown to promote the formation of canomycin. The addition of magnesium sulfate, manganese chloride or zinc sulfate also had a beneficial effect.
Optimal yields were obtained when the pH of the culture broth became weakly alkaline during the cultivation. The can within wide limits, z. B. between 25 and 35, but it is preferable to work in the temperature range of 27-32 C. It is advantageous to continue culturing until a substantial amount of kanamycin has formed in the medium. In a deep, ventilated, submerged culture, 2-7 days are generally necessary for optimal formation of the antibiotic. The most favorable cultivation period is 3-5 days.
The kanamycin is found in the liquid portion of the fermentation broths.
The following procedures have proven to be suitable for the experimental implementation of the method according to the invention: Shaking culture: 150 ml of the aqueous medium are placed in a bottle of 500 ml volume and sterilized. The medium was then inoculated with the mycelium and spores of the kanamycin-producing organisms on the agar medium or with mycelium obtained from a 48-hour shaking culture and then inoculated on a shaking machine (120 strokes per minute of 8 cm amplitude)
shaken with access to air at 27-29.
Tank culture: A stainless steel fermenter with a volume of 400 liters is used. 180 or 200 liters of the aqueous nutrient medium are accommodated in the same and sterilized at 120 ° C. for 20 to 30 minutes. The aeration rate was 200 liters per minute and the number of revolutions of the stirrer was 200 per minute. Silicones, soybean, enel or paraffin oil have been used as antifoam agents.
To obtain the kanamycin contained in the liquid phase of the fermentation broth, this can preferably be extracted with butanol in the presence of a carrier substance such as lauric acid or stearic acid. Here, the antibiotic passes into the butanol at a pH of 7-8 and, on the other hand, is forced out of the organic solvent into the aqueous phase at a pH of 2-4.
In the absence of a carrier substance, kanamycin cannot be absorbed to any significant extent in butanal, ethyl acetate, butyl acetate, benzene, etc. In the case of extraction without such a carrier, the solvents mentioned can therefore be used to purify the fermentation broth from other coexisting substances and impurities.
To separate the kanamycin from the fermentation broth, one can also proceed in such a way that the broth is concentrated or atomized in vacuo by evaporation. The kanamycin can be extracted from the residue with water, methanol, ethanol or acetone, with ans.acids with hydrochloric acid promoting dissolution.
The antibiotic can be adsorbed with activated charcoal from a neutral or alkaline aqueous solution and can subsequently be absorbed by the charcoal using aqueous or absolute alcohol or aqueous acetone, whose pH value is 2, 0 is set with hydrochloric acid.
At a pH of 6-9, kanamycin can also be adsorbed by cation exchange resins, such as B. a copolymer of meth @ acrylic acid and divinylbenzene. After adsorption on a cation exchanger, the antibiotic can be eluted with aqueous hydrochloric acid. It can also be done with aqueous sulfuric acid or aqueous organic solvents, e.g.
B. normal hydrochloric acid in 10% i, ge: m, aqueous acetone, eluted. It can also be eluted with ammonium hydroxide.
The eluate obtained in this way can be concentrated by vacuum evaporation or by freeze-drying. The kanamycin can then be precipitated from the concentrated solution by adding a solvent in which the kanamycin itself or its salts are practically insoluble.
Chromatograph columns with alumina or activated charcoal can also be used to purify the kanamycin. In this case, it is possible, for example, to work in such a way that an aqueous solution of kanamycin with a pH of 8.0, which was obtained from repeated use of a cation exchange process, is allowed to flow through a column which contains activated carbon.
The column is then washed out with distilled water and finally eluted with 0.5 normal sulfuric acid. The most active fraction of the Elurates becomes; to methanol. Added, whereupon crystalline kanamycin sulfate precipitates.
The kanamycin base can be obtained from the salts of the kanamycin, for example from the hydrochloride or the sulfate, by treating, for example, the solution of the kanamycin sulfate with baritol.
Kanamycin hydrochloride is soluble in water and methanol, slightly soluble in ethianol and insoluble in acetone, ethyl acetate, butyl acetate, benzene, ether or petroleum ether.
Kanamycin sulfate is soluble in water, but insoluble in methanol, ethanol, acetone, ethyl acetate and benzene.
Kanamycin dissolved in pyridine gives a positive ninhydrin reaction. The test reactions according to Tollens, Sakaguchi, Fehling, Molisch and Elson-Margan (Gl.ucoseamine test) are negative, whereas the Glucoscamine test also turns out negative after hydrolysis.
The Rf value of the kanamycin, carried out with paper: strip chromatography (with Toyo filter paper No. 50 and 0.20 / a p-toluenesulfonic acid-butanol saturated with water), gave 0:
, .21-0.26. Kanamycin is optically active, with a 1%% aqueous solution of purified kanamycin hydrochloride. has the value [a] D = + 103, while a 1%,
aqueous solution of the free kanamycin base has the value [a117 = + 112. and a 1%, aqueous solution of crystalline kanamycin sulfate gives the value [a] 23 = + 121.
The analysis data of the free base are as follows: Calculated for C14H "N3011: C = 40.48, H = 7.04, N = 10, 12, 0 = 42.370 / 0 found: C = 43.17, H = 6.95, N = 9.82% The analytical values for the hydrochloride are as follows: calculated for C14H "N3011. 3 HCl: C = 32.04, H = 6; 15, N = 8.01, Cl = 20.27, O = 33.54% found:
C = <B> 3,1,3 1, </B> H = 6.07, N = <B> 8.2 1, </B> Cl = 18.03 0/0 Analytical data for the kanamycin sulfate ( amorphous): calculated for C14H "N3011" / 2 H @ S04: C = 29.89, H = 5.73, N = 7.47, s = 8.57, O = 48.35% found:
C = 3 0.20, H = 5.88, N = 7.43% Analysis values for N-acetyl-kanamycin: calculated for C14H20N3011 '3 <B> CH </B> 3C0:
C = 44.36, H = 6.51, N = 7.76, O = 41.36% found: C = 44.39, H = 6.01, N = 7.49% analytical data for the kanamycin pure corner salt :
calculated for C14Hz9N30 "-3. (C4H.N.S4Cr): C = 22.68, H = 3.88, N = 21.37, S = 27.95, Cr = 11.33, O = 12.78 e / o found: C = 21.44, H = 4.31, N = 19.93, Cr = 11.400 / 0 (from the ash content).
Analysis values for crystalline kanamycin sulfate: calculated for C14H29N3011 "i / 2 HZSO4: C = 3 6.21, H = 6.51, N = 9.05, S = 3.44, O = 44.799o found: C = 35.97 , H = 6.51, N = 9.13, S = 3.47 / o. Kanamycin base shows no absorption in the ultraviolet spectral range between 220 and 400 m, y.
The infrared absorption spectrum of the crystalline kanamycin hemisulphate, which was tabletted with potassium bromide, shows that the new antibiotic obviously has a new and characteristic configuration.
The characteristic absorption bands in the infrared have the following wavelengths in microns: 2.85, 3.03, 3.20, 3.30, 3.43, 3.63, 3.70 3.83, 4.70 (broad), 6.05, 6.17, 6.27, 6.60, 6.90, <B> 7.15, </B> 7.35, 7.52, 7.60, 7.95, 8.18 , 8.76, 8.95, 9.08, 9.40, 9.70, 10.20, 10.48, 10.75, 11.13, 11.50, 11.90, <B> 12, 35, 12.80 and 13.15. Among the known antibiotics, neomycin B and C, neamin and catenulin have certain characteristics in common with kanamycin, but kanamycin is clearly different from the antibiotics mentioned.
The glucosamine test identified for neomycin, which was described in the book Assay Methods of Antibiotics by D. C. Grove and W. A. Randall (Medical Encyclopedia Inc. New York), is negative with kanamycin.
This reaction is positive for neomycins and catenulin. Paper chromatography with 2% p- To@luols.ulfosäure- butanol, saturated with water, distinguishes the kanamycin from the neamine. With Toyo. - filter paper no.
50, the Rf value of canamycine was 0.21-0.26 and that of neamine was 0.75 to 0.85. In the test with diluted fermentation broths, kanamycin inhibited the growth of Klebsiena pneumoniae at 3 meg / ml, neamine at 25 mcg / ml, neomycin B at 3 mcg / ml and catenulin at 1,
5 mcg / ml. In the cylinder plate method with B. subtilis, inhibition of 20 mm diameter required 30 mcg / ml kanamycin, 25 mcg / ml neamine, 170 mcg / ml neomycin B, 250 mcg / ml neomycin C, or 18 mcg / ml catenulin.
These characteristics as well as the low toxicity property and the empirical formulas confirm the fact that kanamycin differs from neomycins, neamine and catenulin and is a new antibiotic.
When tested using the agar dilution method, the kanamycin showed the following antibacterial spectrum:
EMI0004.0097
Minimal
<tb> concentration
<tb> microorganisms <SEP> for <SEP> complete
<tb> inhibition
<tb> meg / ml
<tb> S. <SEP> lutea <SEP> PCI-1001 <SEP> 1,8
<tb> M. <SEP> Pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> 209-P <SEP> 2.2
<tb> M. <SEP> Pyogenes <SEP> var. <SEP> aureus <SEP> Terajima <SEP> 0.4
<tb> Micrococcus <SEP> flavus <SEP> 9.0
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> PCI-219 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> subtilis <SEP> NRRL-558 <SEP> 4,5
<tb> B. <SEP> su, btilis <SEP> Tracy <SEP> 9.0
<tb> E. <SEP> coli <SEP> 2.2
<tb> S. <SEP> paratyphi <SEP> A <SEP> 3.1
<tb> S.
<SEP> dysenteriae <SEP> 1.6
<tb> Proteus <SEP> vulgans <SEP> 6.2
<tb> Mycobacterium <SEP> 607 <SEP> 3.1
<tb> Mycobacterium <SEP> phlei <SEP> 2.2
<tb> Saecharomyces <SEP> Bake <SEP> 300
<tb> Sacch <SEP> aromyces <SEP> 300
<tb> Candida <SEP> albicans <SEP> 300
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> 300 In Kirchner's medium it prevented the breakthrough of Mycobacterium tuberculosis. H., at 2 mcg / ml. The stre:
Ptomycin-resistant E. coli and streptomycin-resistant Mycobacterium tuberculosis hominis were sensitive to kanamycin.
Mice endured intravenous injection of 150 mg / kg. The LD, DO doses in mice, rats and rabbits were <B> 150-250 </B> mg / kg. Mice endured daily, subcutaneous injections at the dose of 200 mg / k- for 30 days.
No side effects were observed in dogs when they were given daily injections of 100-200 mg / kg of kanamycin for a period of 30 days.
Intraperitoneal injection of more than 50 mcg per mouse every 4 hours protected the mice infected with 10,000 MLD of Diplococcus pneumoniae or 1,000 MLD of Salmonella typhosa.
Daily subcutaneous injection of 100 mg / kg kanamycin showed an inhibitory effect in mice infected with Mycobacterium tuberculosis (Ravenel strain). <I> Examples </I> 1.
Glucose, glycerine, lactose, maltose, sucrose, starch or dextrin in a proportion of 2% were added to an aqueous base medium containing 0.750 / o meat extract, 0.75 e / e peptone and 0.3% sodium chloride,
the mixture is then sterilized and the pH is adjusted to 7.0 after the sterilization. The mixture was then inoculated with a culture of Streptomyces Kanamyceticus located on glycerol CzapekAgar and shaken at 27-29 ° C. with access to air.
The formation of the canal
EMI0005.0005
maximum <SEP> production <SEP> final pH value <SEP> and <SEP> number of <SEP> days
<tb> Carbon supplier <SEP> of <SEP> Kanamycin <SEP> for <SEP> training <SEP> maximal
<tb> mcg / ml <SEP> production
<tb> Strength <SEP> 250 <SEP> 7.8 <SEP> 5 <SEP> days
<tb> Dextrin <SEP> 200 <SEP> 8.0 <SEP> 5 <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 200 <SEP> 8.2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8.6 <SEP> 4 <SEP>
<tb> sucrose <SEP> 100 <SEP> 8.4 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 100 <SEP> 8.0 <SEP> 4 <SEP> If one of the specified carbohydrates is added to a base medium,
Contains 1% soybean meal, 0.05 / o KCI, 0.05% MgS04 - 7 H20 and 0.3% NaCI,
EMI0005.0023
maximum <SEP> production <SEP> final pH value <SEP> and <SEP> number of <SEP> days
<tb> Carbon supplier <SEP> of <SEP> Kanamycin <SEP> for <SEP> training <SEP> maximal
<tb> mcg / ml <SEP> production
<tb> strength <SEP> 250 <SEP> 7,
6 <SEP> 4 <SEP> days
<tb> Dextrin <SEP> 250 <SEP> 8.0 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Maltose <SEP> 130 <SEP> 7,8 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 100 <SEP> 8.2 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Lactose <SEP> 100 <SEP> 8.4 <SEP> 3 <SEP>
<tb> sucrose <SEP> 150 <SEP> 8.4 <SEP> 4 <SEP>
<tb> Glycerin <SEP> 70 <SEP> 8.2 <SEP> 4 <SEP> 2. An aqueous medium containing 2% starch, 1.2% soybean meal, 0.051119 KCl, 0,
0511 / o Ma S04 * 7H0, 0.1% K2HP04, 0.3% NaCl, 0.3% peptone and 0.5% CaCO3, the initial pH of which was 7.0, was mixed with a selected culture of S. .
kanamyceticus (Stramm K24) on glycerine; Czapek agar inoculated and grown with access to air.
After 4 days of shaking, the pH was 8.2 and the cylinder plate test with B. subtilis and Mycobacterium 607 resulted in the production of 550 mcg / ml kanamycin.
3. 180 liters of an aqueous medium containing 2.0% starch, 1.0% glucose, 1.2% soy
EMI0005.0082
Hours <SEP> PH <SEP> Kanamycin <SEP> Reducing <SEP> Sugar <SEP> 0 <SEP> Ammonia-N,
<tb> mcg / ml <SEP> / o <SEP> in <SEP> of the <SEP> liquid <SEP> mg <SEP> / 0 <SEP> in <SEP> of the <SEP> liquid
<tb> 0 <SEP> 6.6 <SEP> - <SEP> 2.20 <SEP> 2.5
<tb> 24 <SEP> 6.9 <SEP> - <SEP> 1.50 <SEP> 10.7
<tb> 36 <SEP> 7.6 <SEP> 150 <SEP> 0.4 <SEP> 1.2
<tb> 48 <SEP> 7.6 <SEP> 200 <SEP> 0.3 <SEP> 1.2
<tb> 60 <SEP> 8.0 <SEP> 220 <SEP> 0.3 <SEP> 6,
0
<tb> 72 <SEP> 8.2 <SEP> 210 <SEP> 0.25 <SEP> 12.0 mycins was checked by the cylinder plate method with mycobacterium 607, the following results being obtained: was added, the following results were obtained tate:
Bean meal, 0.3% NaCI, 0.05% KCI, 0.05 0/0 MgS04 '7H20, 0.1% K2HP04, 0.21% CaC03, 0.3% NaN03, 0,
002% MnS04 * 7 H20 and 0.002% ZnS04 * 7 1120 was placed in a fermenter of 400 liters, its pH was adjusted to 7.4 and finally sterilized at 120 for 30 minutes.
It was inoculated with 1000 liters of a broth of S. kanamyceticus shaken for 40 hours (a selected subculture of the K24 strain) and cultivated in a tank at 27-29 ° C. with aeration.
Soybean oil (0.04%) and silicone (0.04%) were added as antifoam agents. The following results were obtained:
4. 200 liters of an aqueous medium containing 2.0% starch, 1.011 / o soybean meal, 0.0511 / o KCl, 0.0511 / o MgSO 4 * 7 H 2 O, 0.311 / o NaCl, 0.2% NaNO 3, were in :
placed in a 400-liter fermenter, the pH was adjusted to 7.5, the medium was sterilized, whereupon the pH was 7.0 and otherwise treated according to Example 3. After 48 hours the broth contained 250 mcg / ml kanamycin. As a result, the concentration of kanamycin in the broth no longer changed significantly. After 65 hours of fermentation, the broth was filtered. 160 liters of filtered broth were obtained.
The latter contained 150 mcg / ml kanamycin and its pH was 8.2. The filtrate was passed through a cation exchanger. The column of the latter had a diameter of 15 cm and contained 6 liters of IRC-50 in the sodium form (that is, regenerated with sodium hydroxide) at pH = 8.0.
Amberlit ICR-50 (branded product) is a cation exchanger of the carboxylic acid type. It is a copolymer of methacrylic acid and divinylbenzene. The filtrate was passed through the column as a shower at a throughput rate of 16 liters per hour. In the run, there was no antibacterial activity against Mycobacterium 607 when tested using the cylinder plate method.
The column was then washed with about 10 liters of distilled water using the same flow rate as the broth. Normal hydrochloric acid was then sent through the column at a throughput rate of 0.8 liters per hour. The eluate was collected in 2 liter portions from sections. After the 7th serving, the eluate became acidic and the kanamycin was in the 7th-10th Portion found again.
The portions containing kanamycin were combined and the total of 8 liters obtained were adjusted to a pH of 6.0 with 1011% sodium hydroxide solution and then concentrated to 300 ml by vacuum distillation at about 50.degree.
The concentrated solution was subjected to freeze-drying. The brown-white powder obtained in this way, weighing 500 g, contained 8 g of kanamycin. This product was dissolved in 2 liters of methanol and, after the insoluble fraction had been separated off, 20 liters of acetone were added, whereupon 80 g of the brown-white powder separated out again. This powder still contained 8 g of kanamycin. 20 g of the powder were dissolved in 40 ml of distilled water and aqueous pure salt solution was added.
The slightly pink-colored precipitate which formed first and weighed 50 g was separated off, then more pure salt solution was added until no further precipitate formed. The pink precipitate was separated and recrystallized from distilled water, whereupon crystalline pink kanamycin pure corner salt (300 mg) was obtained. In the melting test it turned dark in color at 191-193 ° C. and decomposed at 211-213 ° C. The pale pink product which precipitated first also contained kanamycin.
5. An aqueous medium of 200 liter volume in a 400 liter stainless steel fermenter was inoculated with S. kanamyceticus (a selected subculture of the K2-J strain) and fermented.
The medium contained 2.011 / o starch, 1.011 / o glucose, 1.211 / o soybean meal, 0.311 / o table salt, 0.0511 / o KCl, 0.05%; MgS04 '7 H2O, 0.111 / o KZHP04, 0.211 / o CaCO3 and 0.311 / o peptone. The pH of the medium after sterilization was 7.0.
0.111 / o soybean oil was added as an antifoam agent. After 65 hours of cultivation with aeration, the broth contained 220 mcg / ml kanamycin. Its pH was 8.0. It was filtered to obtain 170 liters of filtrate containing 210 mcg / ml of kanamycin. The filtrate was passed through a cation exchange column.
The exchanger consisted of 6 liters of Amberlite IRC-50 in the sodium form at a pH of 8.0 and was located in a column with a diameter of 15 cm. The flow rate was 30 liters per hour, that is to say 1 / 1Z liter of the resin volume per minute. In addition, 30 ml of water were passed through the column, the throughput rate being 30 liters per hour.
The kanamycin absorbed by the resin was then eluted with normal hydrochloric acid, the throughput rate being 3 liters per hour. The first eluate (6.5 liters) did not contain any activity. The following eluates contained kanamycin: 90% of the adsorbed kanamycin reappeared in the eluate, the pH of which was higher than 2.0.
The eluate containing the activity (16 liters) was adjusted to a pH of 7.5 with 10% sodium hydroxide solution. It was then diluted to 80 liters. The. The yield of the broth filtrate was 8311/0. The diluted solution was again passed through a resin column.
This column contained 2 liters of IRC-50 resin in the sodium form with a pH of 7.5. The diameter of the column was 5 cm. The throughput rate was 10 liters per hour. The column was washed out with 20 liters of water at a throughput rate of 10 liters per hour, then the adsorbed kanamycin was eluted with normal hydrochloric acid. The throughput rate was 3.0 liters per hour.
As in the previous elution, the kanamycin appeared in the eluate, the pH of which was higher than 2.0. The active eluate (4.5 liters) was adjusted to a pH of 6.0 by adding an anion exchange resin Amberl.it -IR-4B (branded product) in the hydroxyl form.
Amberlit IR-4B is a weakly basic anion exchanger of the type described in US Pat. No. 2591573. The eluate treated in this way was concentrated to 500 ml in vacuo at approximately 40.degree. 5 ml of methanol were added to the concentrate obtained in this way and the insoluble parts were separated off.
The filtrate was further concentrated to 250 ml in vacuo at approximately 40 ° C. and 2.5 liters of acetone were added to the concentrated solution, 65 g of kanamycin being obtained in the form of a light brown powder. The action value of this powder was never 350 g / mng.
6. The brownish-white kanamycin (5 g) obtained according to Example 5, was dissolved in 50 ml of 60% strength aqueous methanol, the insoluble fraction was separated off and 40 tn1 60% aqueous methanol containing 2000 mg of ammonium sulfate was added to the filtrate,
whereupon the precipitated kanamycin sulfate was filtered off and washed with 50 ml of 80% aqueous methanol and dried. In this way, 4.5 g of kanamycin sulfate was obtained in the form of a light brown powder. Its potency was 370 mcg / mg.
7. If the hydrochloric acid, kanamycin-containing eluates of the cation exchange process obtained by the procedure of Example 4 above are evaporated in vacuo and the solid material obtained is subjected to freeze-drying, crude kanamycin hydrochloride is obtained.
10 g of kanamycin hydrochloride prepared in this way, the action value of which was 535 mcg / mng, were dissolved in 100 ml of 900% aqueous methanol and allowed to run through an alumina column. The column, 1.5 cm in diameter, contained 140 g of clay which had been treated with sulfuric acid. It was developed with methanol.
The first eluate of 200 ml did not contain any kanamycin. The second eluate (128 ml) proved to be antibacterial and was evaporated in vacuo, whereupon 4.681 g of kanamycin hydrochloride were obtained in the form of a white powder. The activity value of this powder was 560 mcg / mg. By the same procedure, 2.205 g of solid white kanamycin hyd @ rochlorids were obtained from the third eluate (115 ml).
The effect value of the latter was 615 mcg / mg. The yellow pigment was then adsorbed by the column and the kana mycin, hydrochloride was obtained in the form of a colorless powder.
The yellow pigment adsorbed by the column was dissolved out by further elution with 50% strength aqueous methanol and distilled water.
B. 4 g of solid Kanamycin @ hydrochloride, Herge provides as described in Examples 4 and 7, whose action value was 500 mcg / mg, were dissolved in 200 ml of methanol and, after evaporation to 80 ml, sent through a column containing 5 g of activated carbon and 25 g of powdered cellulose contained. The column was designed with methanol. The first eluate (50 ml) did not contain any kanamycin. The second eluate (60 ml) was evaporated to give 364 mg of kanamycin hydrochloride.
The effect value of the latter was 720 mcg / mg. The direct eluate (46 ml) gave 381 mag kanamycin hydrochloride in the form of powder. The effect value of the latter was 616 mcg / mg. From the fourth eluate (55 ml), 1.873 mg of white kanamycin hydrochloride were obtained, the activity value of which was 483 mcg / mg.
The fifth eluate (55 md) gave 956.6 mg in the form of a white powder with an activity value of 410 meg / mg. All of the solid substances obtained were colorless.
9. S. kanamyceticus was grown in a shaking culture with access to air for 4 days at 28 ° C., the aqueous nutrient medium being 1.0% starch, 1.5% soybean meal and 0.3% common salt at an initial pH of 7.0 contained.
The culture broths from 25 bottles were combined and filtered. The pH of the filtrate was 8.2 and the filtrate contained 400 mcg / ml kanamycin. The filtrate (3.100 ml) was passed through a resin column containing IRC-5.0. The column contained 100 ml of the resin in its sodium form from pH 8.0.
After absorption, the column was washed out with 500 ml of water and the adsorbed kanamycin was eluted with normal hydrochloric acid, the eluate being divided into sections of 20 ml each. The antibacterial activity was included in the fourth through the ninth sections. These sections were combined and their pH adjusted to 6.0.
The solution was concentrated to 12 ml in vacuo and the insoluble impurities were filtered off. Reinecke salt was added to the filtrate. The precipitate formed first was light pink, weighed 50 mg, contained kanamycin and was separated off.
Further Reinecke salt solution was added to the filtrate until no more precipitation occurred. The pink precipitates were separated and dried, yielding 544 mg of kanamycin purecka salt and approximately 30% of the antibacterial activity remaining in the solution. The combined precipitates were added to 12 ml of distilled water, heated to 60 ° C. and filtered.
The filtrate thus obtained was cooled and the kanamycin pure corner salt crystals were recovered in this way. Kanamycin pure corner salt was added to the mother liquor and, after heating to 60 ° C. and cooling, the second portion of crystalline kanamycin pure corner salt was separated off. This procedure was repeated three more times.
In this way 300 mg of crystalline kanamycin Reinecke's salt were isolated. 140 mg of this salt were added to 105 ml of distilled water and 2.5 normal hydrochloric acid in pyridine was added dropwise to the solution until no more precipitates formed. The precipitate was centrifuged off, subjected to freeze-drying and washed with acetone. This gave 60 mg of kanamycin hydrochloride in the form of a hygroscopic, white, solid substance.
10. 10 g of kanamycin hydrochloride with an action value of 450 mcg / mg, obtained according to Example 5, were dissolved in one liter of distilled water and the pH was adjusted to 6.4. The solution was passed through a column of 75 ml of IRC-50 resin in sodium form at a pH of 6.4 at a rate of 10 ml per minute.
After the column had been washed with 50 ml of water, the adsorbed kanamycin was eluted with 5% ammonium hydroxide. The first eluate (80 ml) showed no antibacterial activity, while the further eluate (130 ml) contained the kanamycin. The pH of this eluate was higher than 10.0. It was concentrated to 22 ml in vacuo at approximately 40 ° C.
The yield in this concentrated solution was 97.80 / a. The concentrated solution was passed through a column containing 20 g of activated carbon with a mesh number of 100-250. The column diameter was 2 cm. The column was then washed out with 160 ml of distilled water and developed chromatographically with 0.5 normal sulfuric acid. The running solution was divided into approximately 20 ml portions. The kanamycin sulfate appeared from the fifth fraction.
The first to fourth fractions, the pH of which were 6.2 to 6.4, contained no kanamycin. Almost the entire amount of kanamycin was found in the fifth up to and including the eighth fraction, with the following values:
Fifth fraction pH = 8.2, 22.0 ml, 16.9 mg / ml; sixth fraction pH = 8.6, 23.0 ml, 65.3 mg / ml; seventh fraction pH = 8.6, 20.0 ml, 55.0 mg / ml; eighth fraction pH = 4.6, 22.0 ml, 47.5 mg / ml;
ninth fraction pH = 1.0, 22.0 ml, 4.2 mg / ml. 23.0 ml of methanol were added to the sixth fraction, and crystalline kanamycin sulfate was precipitated, which was filtered off and dried. This resulted in 1.39 g of crystalline kanamycin sulfate. 1.2 g of this crystalline sulfate were dissolved in 8 ml of water, heated to 45 ° C. and 6.5 ml of methanol were added with stirring and cooling.
Here at Kanamycin sulfate (1; 07 g) fell out in crystalline form. When viewed microscopically, it turned out to be colorless, plate-shaped crystals. It did not melt until 250 C. Analysis: C = 35.97, 35.89; H = 6.51, 6.56; N = 9.13, 8.92; S = 3.47%. [a] D = -f- 121.
If desired, and if the pharmaceutical compatibility is guaranteed, other drugs can be added to the antibiotic prepared according to the invention, such as.
B. antihistamine compounds, sulfa drugs, stimulants, local anesthetics, analgesics, laxatives, sedatives, penicillin salts and other antibiotic agents, such as streptomycin or tetracycline, and also vitamins, hormones or agents with an antifungal effect.