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Verfahren zur Herstellung von Dihydronovobiocin Novobiocin [dies ist die allgemeine Bezeichnung für ein Antibioticum, das unter anderem auch unter der Bezeichnung Cathomycin (eingetragene Marke) bekannt ist], wird erzeugt durch Züchten einer bisher unbekannten Art von Mikroorganismen, die als Streptomyces sphaeroides bezeichnet wurde, unter kontrollierten Bedingungen. Diese Streptomyces-Art, welche aus einer Bodenprobe von einem alten Weiderasen in Vermont isoliert wurde, wurde in der Kulturensammlung von Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey, als Streptomyces sphaeroides MA-319 bezeichnet. Eine lebensfähige Kultur davon wurde hinterlegt bei der Fermentation section des Northern Utilization Research Bureau, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois, und in dessen ständige Kulturensammlung aufgenommen als NRRL 2449.
Wässerige Medien, die sich eignen zum aeroben Züchten von Stämmen von Streptomyces sphaeroides zur Bildung von Novobiocin sind im allgemeinen jene, die sich auch eignen für die Herstellung von andern Antibiotica durch Züchten von andern Streptomyces-Mikroorganismen. Solche Medien enthalten Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, wie z. B. ein Kohlehydrat, assimilierbaren Stickstoff, z. B. Getreideweiche, Caseinhydrolysat, Auszüge aus Destillationsrückständen usw., sowie anorganische Salze, inbegriffen solche von Spurenmetallen, die für den eigenen Stoffwechsel der Mikroorganismen nötig sind.
Vorzugsweise wird während der Zeit, in welcher die Mikroorganismen gezüchtet werden, die gewöhnlich etwa 1-7 Tage ausmacht, eine Temperatur von 24 bis 28 C eingehalten, und es wird eine Belüftung durchgeführt, um ein optimales Wachstum der Organismen und eine optimale Produktion von Novo- biocin zu erzielen. Die in dieser Weise hergestellten Fermentierungsbrühen besitzen eine Aktivität von etwa 150-2000 Novobiocin-Einheiten, wie sie hiernach definiert werden, pro cm3, und die Festanteile der Fermentierungsbrühe haben eine Aktivität in der Grössenordnung von etwa 2,25 Novobiocin-Einheiten pro mg Feststoffe. Der antibiotische Wirkstoff kann gereinigt und mit Hilfe verschiedener Verfahren in reinerer Form gewonnen werden.
Zum Beispiel kann man die gesamte Brühe bei einer Wasserstoffionenkonzentration, welche gewöhnlich etwa einem pH 7,0-8,0 entspricht, filtrieren. Das Filtrat kann man im sauren Bereich unterhalb etwa pH 7,0 extrahieren mit einem neutralen, eher schwach polaren, mit Wasser nicht mischbaren flüssigen organischen Lösungsmittel, das in kalter konzentrierter Schwefelsäure und in kalter sirupartiger Orthophosphorsäure löslich ist.
Der organische Auszug kann extrahiert werden mit einer wässerigen alkalischen Pufferlösung bei einem pH von mindestens 8,0, wobei man eine Lösung erhält, welche Novobiocin-Salz in beträchtlicher Konzentration enthält.
Die beiden Extraktionsschritte können nachfolgend wiederholt werden, wobei man eine noch konzentriertere Lösung erhält, aus welcher durch saures Ausfällen Novobiocin-aktives Material gewonnen werden kann. Das so gewonnene Produkt kann gereinigt werden durch Umkristallisieren aus einer wässerigen sauren Alkohollösung.
Es versteht sich, dass ausser Streptomyces sphae- roides NRRL 2449 auch andere Novobiocin erzeugende Stämme von Streptomyces sphaeroides zur Herstellung von Novobiocin verwendet werden können, beispielsweise Mutationsformen der beschriebenen Organismen, wie sie erhalten werden durch natürliche Auswahl oder durch Einwirkung von Mutations- mitteln, z. B.
Bestrahlung mit Röntgen- oder Ultraviolettstrahlen, Behandeln mit Stickstoff-Lost usw.
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Das neue Antibioticum Novobiocin besteht aus einer Substanz mit der ungefähren Bruttoformel C31H36N2O11. Diese reagiert gegenüber alkalischen Reagenzien als saure organische Verbindung und ist in solchen leicht löslich, beispielsweise in wässerigen Lösungen von Alkalihydroxyden, -carbonaten und -bicarbonaten; sie besitzt zwei besenbindende Gruppen und kann aus alkalischer Lösung ausgefällt werden durch Ansäuern.
Sie ist löslich in niedrigen Alka- nolen, niedrigen aliphatischen Ketonen, Essigsäure, Äthylacetat und Dioxan, und sie ist unlöslich oder nur schwer löslich in Äther, Benzol, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Äthylendichlor, Wasser und Salzsäure.
Reines Novobiocin wurde in zwei kristallinen Modifikationen erhalten; die eine Form kristallisiert rosettenförmig und schmilzt bei etwa 152-l54 C, während eine zweite Form das Aussehen von flachen Nadeln hat und bei etwa 170-172 C schmilzt. Jede dieser kristallinen Formen des Antibioticums kann in eine sogenannte Normalform übergeführt werden, bei welcher es sich vermutlich um eine amorphe oder submikrokristalline Form handelt, indem man die Kristalle in Aceton löst, zu dieser Lösung rasch ein relativ grosses Volumen Petroläther zugibt und das ausgefällte normalisierte Material abfiltriert.
Alkalische wässerige Lösungen von Novobiocin und Mineralölsuspensionen der Normalform des Anti- bioticums zeigen eine charakteristische Absorption, die ersteren im Ultravioletteil und die letzteren im Infrarotteil des Strahlungsspektrums. Eine Lösung von reinem Novobiocin in 0,1n wässerigem Natriumhydroxyd zeigt eine charakteristische Ultraviolett- Absorptionsspitze bei 3070 A. Diese Absorptionsspitze zeigt ein im wesentlichen reines Material an, mit einer spezifischen Absorption von 600, gemessen bei dieser Wellenlänge unter Verwendung einer Lösung von 1 g reinem Novobiocin auf 100 cm3 Lösung, die enthalten ist in einer Zelle mit einer Absorptionsschichtdicke von 1 cm.
Eine Lösung von reinem Novobiocin in 0,1n wässerig-methanolischer Salzsäure zeigt eine charakteristische Ultraviolett-Absorptionsspitze bei 3240 A mit E #m = 390. Eine Mineralöl Suspension von reinem normalisiertem Novobiocin zeigt charakteristische Infrarot-Absorptionsspitzen bei den folgenden Wellenlängen, ausgedrückt in Mikron: 5,8-6,0 (breit), 6,10, 6,21, 6,30, 6,49, 6,63, 7,4 bis 7,6 (breite Schulter), 7,78, 7,96, 8,27 (schwach), 8,60 (Schulter), 8,7 (Schulter), 9,13, 9,40, 10,0-10,1 (breit), 10,28, 10,60 (breit), 12,0-12,30 (breit), 12,60-12,75 (breit), 13,07 und 13,39.
Die Novobiocin-Einheiten beziehen sich auf die mikrobiologische Aktivität von reinem kristallinem Novobiocin. Die mikrobiologische Aktivität von reinem kristallinem Novobiocin wurde willkürlich festgesetzt auf 5000 Einheiten/mg, und sie wird bestimmt nach der Standard-Schalenplatten-Diffusionsmethode unter Verwendung von Bacillus subtilis ATTC 12,432 als Testorganismus. Nach diesem Verfahren wird eine Kultur von Bacillus subtilis ATTC 12,432 während 24 Stunden bei 37 C auf Hirnmarkinfusionsagar (Difco Manual, 9. Ausgabe, Seiten 90, 91) gezüchtet und dann für eine Dauer von nicht mehr als einem Monat gelagert. Zur Herstellung von Sporen wird ein Inoculum zubereitet durch Zugeben von 5 cm3 sterilem destilliertem Wasser zu einer frischen Zucht von Bacillus subtilis.
Die Zellen werden aseptisch vom Nährboden abgekratzt, gut vermischt und in einen Erlenmeyer- Kolben gegeben, welcher 50 cm3 steriles destilliertes Wasser enthält. Zwei cm3 der Bakteriensuspension werden als Inoculum in einen Roux-Kolben gegeben, weicher ein Medium enthält, das aus 3 % Sojabohnenmehl, 0,2 %o NaCl, 0,4% löslichen Anteilen aus Destillationsrückständen, 0,8%c, Dextrose und 2,00% Agar besteht. Nach Bebrüten während 7 Tagen bei 37 C wird die erhaltene Bakterienzucht suspendiert in 50 cm3 sterilem destilliertem Wasser und während 30 Minuten bei 65 C pasteurisiert. 4 cm3 einer Verdünnung 1 : 50 dieser Sporensuspension werden verwendet pro Liter Versuchsmedium, das bei einem pH von 5,9-6,10,5 % Pepton, 0,3 % Rindfleischextrakt, 0,3 % Hefeextrakt und 1,5 %lo Agar enthält.
Portionen von je 50 cm3, besäten Mediums werden in tiefe Petri-Schalen mit flachem Boden gegeben. Auf das besäte Agar stellt man 6 Zylinder aus rostfreiem Stahl. Abwechselnd werden 3 Zylinder gefüllt mit einer Standard-Lösung von 4 r Novobiocin/cm3 (entsprechend 20 Novobiocin-Einheiten/ cm3) und 3 Zylinder mit der zu bestimmenden Lösung, welche ungefähr auf die gleiche Stärke verdünnt wird mit m/20 Phosphatpuffer bei pH 6,0. Es wird eine tägliche Standard-Kurve hergestellt mit reinem Novobiocin, das auf verschiedene Konzentrationen von 2-16 /tcm3 verdünnt ist.
Nach 18stündigem Bebrüten bei 28 C werden die Durchmesser der Hemmungszonen der unbekannten Lösungen und der Standard-Lösungen auf jeder Schale gemessen. Die Stärke der unbekannten. Lösung wird bestimmt aus einem Nomogramm, basierend auf :dem Empfänglichk.eit.sgrad bei verschiedenen Konzentrationen, der sich aus der täglichen Standard- Kurve ,ergibt.
Novobiocin ist optisch aktiv, [a] D = -270 (C = 1 in 1 n Natriumhydroxyd) und [a] D = -44, (C = 1 in Pyridin).
Novobiocin ist wirksam zur Hemmung des Wachstums in erster Linie von grampositiven Mikroorganismen, zeigt jedoch auch eine gewisse Wirkung gegenüber gramnegativen Mikroorganismen. Es hemmt u. a. das Wachstum der folgenden Orga- nismen:
M. pyogenes vor. albus M. pyogenes vor. aureus Diplococcus pneumoniae Corynebacterium .diphtheriae Typus gravis Corynebacterium diphtheriae Typus intermedius Corynebacterium diphtheriae Typus mitis Corynebacterium xerose
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Corynebacterium renale Neisseria meningitidis Sarcina lutea (VD) M. pyogenes var. aureus (resistent gegenüber Aureomycin) M. pyogenes var. aureus (resistent gegenüber Streptomycin-Streptothricin) M. pyogenes var.
aureus (resistent gegenüber Penicillin). Novobiocin-Salze haben ebenfalls antibiotische Wirkung. Beispielsweise zeigte sich. beim Agarstreifen- lösungsversuch, dass das Natriumsalz von Novobiocin das Wachstum verschiedener Stämme von M. pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria menin- gitidis (Nr. 274) und Sarcina lutea (VD) bei Konzentrationen von weniger als 0,5 /cm3 hemmt. Auch andere Mikroorganismen werden durch Novobiocin oder dessen Salze in unterschiedlichem Masse geschädigt.
Es wurde nun gefunden, dass beim Zusammenbringen von Novobiocin mit Wasserstoff in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators im Verhältnis von 1 Mol Wasserstoff pro Mal Novobiocin bzw. Novo- biocin-Salz in sozusagen quantitativer Ausbeute ein Dihydro-Derivat entsteht als neues synthetisches Produkt. Bei diesem Produkt handelt es sich um Di- hydronovobiocin bzw. einem Salz davon, je nach dem verwendeten Ausgangsmaterial oder nach den Bedingungen, unter welchen das Produkt erhalten wurde. Dieses Dihydronovobiocin-Produkt ist ungefähr antibiotisch so aktiv wie das Novobiocin selbst, indem es in reinem Zustand eine Aktivität von etwa 5000 Novobiocin-Einheiten pro mg aufweist, und ist ebenfalls zur klinischen Verwendung geeignet.
Zur Durchführung des erfindungsgemässen Verfahrens wird beispielsweise so vorgegangen, dass man Novo- biocin oder ein Salz von Novobiocin in einem geeigneten Lösungsmittel löst, z. B. in einem niedrigen Alkanol, einer niedrigen Fettsäure oder einer wässerigen alkalischen Lösung, in welchem ein Hydrie- rungskatalysator suspendiert ist, setzt das Gemisch bei Atmosphärendruck oder höherem Druck einer Wasserstoffatmosphäre aus und schüttelt oder rührt so lange, bis ungefähr ein Mol Wasserstoff pro Mol Novobiocin bzw. Novobiocin-Salz aufgenommen ist.
Geeignete Hydrierungskatalysatoren sind katalytische Massen aus Platin, Palladium, Ruthenium und Rhodium sowie Oxyde dieser Edelmetalle, ferner feinzerteiltes Nickel oder Cobalt, z. B. Raney Nickel oder Raney-Cobalt. Die Katalysatoren können mit oder ohne Träger und mit oder ohne Beschleuniger verwendet werden. Im allgemeinen verläuft die Hydrierung rascher mit Platin als mit den andern genannten Edelmetall- oder Edelmetalloxyd-Katalysatoren, wenn die verwendeten Katalysatormengen gleich sind. Genügende Reaktionsgeschwindigkeiten werden bei Verwendung von Edelmetall- oder Edelmetalloxyd-Katalysatoren bei niedrigeren Drucken und Temperaturen erreicht als bei Verwendung von Nichtedelmetall- Katalysatoren, wie Raney-Nickel oder Raney-Cobalt.
Bei Verwendung eines Edelmetalls oder eines Edelmetalloxyds als Hydrierungskatalysator verläuft die Reaktion mit befriedigender Geschwindigkeit bei gewöhnlicher Zimmertemperatur und geringem Druck, das heisst einem solchen von wenig über Atmosphärendruck. Bei Verwendung anderer Hydrierungskatalysatoren, wie Raney-Nickel oder Raney Cobalt können mit Vorteil etwas höhere Temperaturen von etwa l00 C oder mehr, jedoch nicht über etwa 150 C, und etwas höhere Drucke von etwa 70-154 kg/cm2 angewendet werden. Die zur vollständigen Durchführung der Reaktion nötige Zeit kann verkürzt werden, wenn man die Reaktion bei erhöhten Drücken durchführt. Die Reaktion verläuft befriedigend bei Zimmertemperatur, doch können, wenn erwünscht, auch höhere Temperaturen angewendet werden, die im allgemeinen jedoch etwa 150 C nicht überschreiten sollen.
Im allgemeinen ist der Typus des verwendeten Katalysators nicht ausschlaggebend, indessen wird die Reduktionsgeschwindigkeit erhöht oder herabgesetzt bei Vergrösserung oder Erniedrigung der Katalysatormenge.
Als Ausgangsmaterialien können unreine Konzentrate von Novobiocin oder Novobiocin-Salzen verwendet werden, doch geht man gewöhnlich vorzugsweise von reinen Ausgangsmaterialien aus, wenn solche zur Verfügung stehen. Geeignet sind Alkalisalze, z. B. das Mononatriumsalz von Novobiocin.
Man kann die Reaktion in einem Lösungsmittel vornehmen, in dem das als Ausgangsmaterial verwendete Novobiocin oder Novobiocin-Salz löslich ist und welches die Hydrierung des Novobiocins nicht stört. Beispielsweise können alkalische wässerige Lösungen, wie wässerige Natrsumhydroxydlösung oder wässerige Kaliumhydroxydlösung, niedrige Alkanole, wie Methanol oder Äthanol, sowie niedrige Fettsäuren, wie Eisessig, verwendet werden.
Nach Beendigung der Reduktion, das heisst nachdem eine äquimolekulare Menge Wasserstoff mit Bezug auf das Novobiocin oder Novobiocin-Salz, das als Ausgangsmaterial dient, aufgenommen wurde, wird der Katalysator am besten durch Filtrieren aus dem Reaktionsgemisch entfernt und das Dihydro- novobiocin isoliert, vorzugsweise durch Abdampfen des Lösungsmittels aus .dem Filtrat unter Vakuum.
Das Dihydronovobiocin kann als solches aus dem Reaktionsgemisch gewonnen werden; falls man von einem Salz von Novobiocin ausgeht, kann so vorgegangen werden, dass man eine Lösung des erhaltenen Dihydronovobiocin-Salzes mit einer Säure, beispiels- weise einer der gebräuchlichen Mineralsäuren, wie Schwefelsäure, versetzt und das ausgefällte Dihydro- novobiocin abfiltriert.
Gleicherweise lassen sich Salze von Dihydronovo- biocin als .solche erhalten, indem man die Hydrierung in einem geeignet ,gewählten basischen wässerigen Medium durchführt.
Man kann Dihydronovobiocin in einfacher Weise durch Umsetzung mit geeignet ausgewählten Basen in ihre einbasischen oder zwei- basischen Salze Überführen. In dieser Weise können
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Alkalisalze von Dihydronovobiocin, wie das Natrium- oder das Kaliumsalz, Erdalkalisalze, wie das Calciumsalz, sowie die Salze quaternärer Stickstoffbasen, wie Ammoniumsalze und Salze organischer Amine gewonnen werden.
Beispiele von organischen Aminen, welche mit Dihydronovobiocin Salze bilden, sind Chinin, Procain, Guanidin, Noformicin, N-Benzyl-ss- phenyl-äthylamin, N,N Dibenzyl-äthylendiamin, Cyclo- hexylamin, N Äthyl-piperidin, Triäthylamin, Dicyclo- hexylamin, Arginin, Histidin und Lysin.
Die Salze von Dihydronovobiocin können, wenn erwünscht, gereinigt werden durch Umkristallisieren nach den üblichen Methoden. Beispielsweise kann man sie in einer minimalen Menge eines niedrigen Alkanols, wie Methanol oder Äthanol, lösen und die Lösung teilweise eindampfen, um ein Ausfallen des gereinigten kristallinen Materials hervorzurufen, oder man kann der alkoholischen Lösung ein Lösungsmittel wie Aceton zusetzen, um eine Trübung einzuleiten, wonach, nachdem man einige Zeit stehengelassen hat, das ausgefallene gereinigte kristalline Produkt gewonnen werden kann.
Wie oben erwähnt, scheint dem Novobiocin auf Grund der zur Zeit vorliegenden Daten die Bruttoformel C31H36N2O11 zuzukommen, woraus folgt, dass das Dihydronovobiocin, welches zwei Wasserstoffatome pro Novobiocin-Molekül mehr besitzt, die Formel C31H38N2O11 aufweisen dürfte. Obschon die genaue chemische Struktur des Novobiocin- und des Dihydronovobiocin-Moleküls zur Zeit noch nicht vollständig geklärt ist, nimmt man auf Grund experimentalchemischer Untersuchungen an, dass das Novobiocin-Molekül unter anderem einen Benzolring enthält, an welchen eine Dimethylallyl-Kette mit der Gruppierung
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geknüpft ist, welche bei der Hydrierung in eine Dimethylpropyl Kette der Gruppierung
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übergeht als Substituent des genannten Benzolrings im Dihydronovobiocin.
Die Tatsache, dass Novobiocin in Gegenwart eines geeigneten Hydrierungskatalysators mit Wasserstoff reagiert unter Bildung einer neuen Verbindung und die Tatsache, dass diese Reaktion mit äquimolaren Mengen Wasserstoff und Novobiocin verläuft, können bewiesen werden, indem man die Reaktion durchführt unter Verwendung des Wasserstoffisotops Deuterium anstelle von gewöhnlichem Wasserstoff, und dann das Reaktionsprodukt analysiert zur Bestimmung von dessen Deuteriumgehalt.
Dies kann wie folgt geschehen: In einen geeigneten Hydrierungsapparat gibt man etwa 515 mg Novobiocin und 71 mg Natriumhydroxyd zu einem Gemisch von 50 mg Platinoxyd und 10 cm3 Deuteriumoxyd unter einer Atmosphäre von Deuterium und rührt das Gemisch unter einem Deuteriumdruck von etwas, mehr als 1 Atmosphäre während etwa 2 Stunden. Dann setzt man etwa 35 mg weiteres Natriumhydroxyd zu, um eine vollständige Auflösung des Novobiocins zu gewährleisten, und gibt nochmals 50 mg Platinoxyd zum Gemisch. Um die Wasserstoffionenkonzentration der Lösung zu erniedrigen und dadurch eine Hydrolyse zu verzögern, gibt man etwa 0,5 cms Äthylacetat zu und rührt dann das Gemisch unter der Deuterium-Atmosphäre während etwa weiteren 9 Stunden.
Dann filtriert man das Gemisch zur Entfernung des Katalysators und säuert das Filtrat an durch Zugabe von Salzsäure, wobei das Deuterium-Isologe von Dihydronovobiocin ausfällt, welches abgetrennt, mit Wasser gewaschen und getrocknet wird. Bei der Analyse findet man, dass das Produkt 5,0 Gew.%a Deuterium enthält (berechnet: 5,6 %).
Die Anwesenheit von Deuterium im Produkt dient dazu, dasselbe als neue chemische Verbindung zu unterscheiden von dem als Ausgangsmaterial verwendeten Novobiocin, und sie beweist, dass eine Wasserstoffaddition stattfindet, wenn man Novobiocin in Gegenwart eines Hydrierungskatalysators wie oben beschrieben einer Hydrierung unterwirft. Der bei der Reaktion aufgenommene und im Reaktionsprodukt anwesende Deuterium-Anteil beweist, dass die Reaktionsteilnehmer in äquimolarer Menge an der Reaktion teilgenommen haben.
Eine biologische Untersuchung dieses Deuterium-Isologen von Dihydro- novobiocin ergibt, dass dieses genau denselben Grad von antimikrobiologischer Aktivität besitzt wie Novo- biocin und Dihydronovobiocin., und d'ass sich seine Wirksamkeit auf das gleiche bakterielle Spektrum erstreckt wie diejenige von Novobiocin und Dihydro- novobiocin.
Während sich die beiden Gruppen von antibiotischen Substanzen, nämlich Novobiocin und .seine Salze einerseits und Dihydronovobiocin und seine Salze anderseits, durch gewöhnliche chemische Analyse kaum unterscheiden lassen,- und während auch die gewöhnlichen physikalischen :Messungen, wie diejenigen der Absorption im Infrarot- oder Ultraviolett- Bereich des Strahlungsspektrums, eine derartige Unterscheidung nicht ohne weiteres zulassen, können die Glieder der beiden Gruppen leicht unterschieden werden durch Papierchromatographie, sowie auf Grund ihres Verhaltens gegenüber gewissen chemischen Reagenzien, insbesondere Perjodsäure.
Was die erste Unterscheidungsmethode betrifft, wird gewöhnlich das mit umgekehrter Phase arbeitende Chromatographieverfahren angewendet, wobei man Capryl:alkohol als stationäre Phase und eine wässerige Lösung als bewegliche Phase verwendet.
Ein Blatt Filterpapier (Whatman Nr. 1) wird behandelt zur Entfernung von Wasser aus dem Papier.
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Die Behandlung besteht darin, dass man das Papier bei 110 C unter Hochvakuum (1 mm Hg) über Nacht trocknet. Hierauf wird das Papier behandelt zum Schutz gegen Wiederabsorption von Wasser. Diese Behandlung besteht darin, dass man das Papier in ein Gemisch aus einer Siliconflüssigkeit (z. B. Dow Cor- ning 200 Fluid) mit einer Viskosität von 12500 und Äthyläther mit einem Verhältnis von 5 g Silicon- flüssigkeit auf 100 cm3 Äthyläther eintaucht und dann während 10 Minuten an der Luft trocknet. In diesem Zustand können die Papiere bis zu ihrer Verwendung in einem Exsikkator gelagert werden.
Bei der Verwendung des Papiers wird das Novobiocin oder Dihydronovobiocin nahe dem einen Ende des Streifens aufgetupft, wonach man das Papier in ein Gemisch von Caprylalkohol und Methanol (Volumenverhältnis 1:5) eintaucht. Nach dem Eintauchen wird das Papier abgelöscht zur Entfernung von überschüssiger Flüssigkeit und dann in einem geschlossenen Zylinder aufgehängt, wobei jenes Ende, an welchem die Verbindungen aufgetragen wurden, oben ist. Dieses Ende des Papierstreifens wird in eine wässerige Lösung von Natriumphosphat (0,1-molar) mit einem pH von 8,4 eingetaucht. Eine zusätzliche Menge der gleichen Lösung wird am Boden des geschlossenen Zylinders aufgestellt, so dass das Ab- dunsten der Lösung vom Papier beim Hinunterwandern durch dasselbe möglichst Gering gehalten wird.
Beim Hinunterwandern der beweglichen (wässerigen) Phase durch das Papier bewegt sich das Novo- biocin rascher als das Dihydronovobiocin. Innert 6 Stunden bewegt sich die Lösungsmittelfront etwa 18 cm vorwärts und führt zu einer befriedigenden Auftrennung der beiden Verbindungen. Die getrennten Lagen der beiden Flecke sind auf dem Papier sichtbar, wenn man es in einem Ultraviolettgerät betrachtet. Lässt man das Chromatogramm über Nacht laufen (etwa 17 Stunden), so bewegt sich die Lösungs- mittelfront um etwa 45 cm, und es erfolgt eine entsprechend grössere Trennung zwischen den beiden Flecken.
Quantitativ ausgedrückt, bewegt sich Novobiocin mit einer Wanderungsgeschwindigkeit entsprechend einem Rf-Wert von 0,30. Unter Bezugnahme auf die Beweglichkeit von Novobiocin als Standard von 1,0 besitzt das Dihydronovobiocin eine Wanderungsgeschwindigkeit von 0,68.
Bei der andern Methode zur Unterscheidung von Novobiocin und seinen Salzen und Dihydronovobiocin und seinen Salzen, bei welcher Novobiocin oder ein Novobiocin-Salz mit Perjodsäure zur Reaktion gebracht wird, wird ein zusätzliches Mol dieses Reagens pro Mol Novobiocin aufgenommen im Vergleich zur Menge des Reagens, die aufgenommen wird bei der Reaktion mit einer äquimolaren Menge Dihydro- novobiocin. Dies kann leicht wie folgt gezeigt werden: Man behandelt Lösungen von gemessenen Mengen Novobiocin und Dihydronovobiocin in Dioxan mit einem bekannten Überschuss an Perjodsäure in Wasser. Die Lösungen werden über Nacht stehen gelassen.
Der Überschuss an Perjodsäure wird in jedem Fall bestimmt durch Titrieren mit Natriumarsenit- Normallösung. Die Differenz des Titrationswertes dieses Überschusses und der zu Beginn des Versuches anwesenden Perjodsäuremenge ergibt in beiden Fällen die Perjodsäuremenge, welche von den Verbindungen aufgenommen wurde. Es wird gefunden, dass Novobiocin pro Mol verwendeter antibiotischer Verbindung etwa 1 Mol Perjodsäure mehr aufnimmt als Dihydronovobiocin.
Novobiocin und seine Salze einerseits und Di- hydronovobiocin und seine Salze anderseits unterscheiden sich auch in ihrer Aktivität gegenüber gewissen Mikroorganismen, wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, welche auf in vitro-Versuchen mit Standard-Verdünnungsreihen beruht.
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<tb> Tabelle <SEP> 1
<tb> Vergleich <SEP> von <SEP> Novobiocin <SEP> und <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> Kultur <SEP> Hemmungs-Konzentration <SEP> /cm3
<tb> Novobiocin <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (gravis) <SEP> ATCC <SEP> 9674 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <SEP> <
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (intermediate) <SEP> ATCC <SEP> 9675 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (mitis) <SEP> ATCC <SEP> 9673 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> C.
<SEP> pseudotuberculosis <SEP> 545 <SEP> 25 <SEP> 6,25
<tb> C. <SEP> renalis <SEP> 506 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> C. <SEP> xeroxis <SEP> C. <SEP> U. <SEP> 1,56 <SEP> 0,78
<tb> C. <SEP> pseudodiphtheriticum <SEP> 259 <SEP> 50 <SEP> 12,5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> V.D. <SEP> 0,19 <SEP> 0,19
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<tb> Kultur <SEP> Hemmungs-Konzentration <SEP> /cm3
<tb> Novobiocin <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> vor. <SEP> albus <SEP> 0,19 <SEP> 0,19
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> vor. <SEP> aureus <SEP> Sm <SEP> 0,19 <SEP> oder <SEP> < <SEP> 0,19 <SEP> oder <
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I-37 <SEP> 0,39 <SEP> 0,19
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> II-807 <SEP> 3,12 <SEP> 1,56
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I1-6302 <SEP> 1,56 <SEP> 0,78
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> 1,56 <SEP> 1,56
<tb> Strep.
<SEP> pyogenes <SEP> S-23 <SEP> 1,56 <SEP> 0,78
<tb> Strep. <SEP> fecalis <SEP> 12,5 <SEP> 12,5
<tb> N. <SEP> catarrhalis <SEP> 7900 <SEP> 12,5 <SEP> 6,25
<tb> N. <SEP> intracellularis <SEP> 274 <SEP> 0,39 <SEP> 0,78
<tb> N. <SEP> intracellularis <SEP> 2333 <SEP> 0,39 <SEP> 0,39
Es ist zu beachten, dass Dihydronovobiocin gegen- über den Testmikroorganismen mindestens so aktiv und in den meisten Fällen aktiver ist als Novo- biocin, insbesondere gegenüber wichtigen Krankheitserregern, und dass eine mehr als zweifache Verbesserung der Aktivität festzustellen ist gegenüber zweien von diesen, nämlich C. pseudotuberculosis 545 und C. pseudodiphtherificum 259.
Man findet auch, dass Dihydronovobiocin im Vergleich zu Novobiocin bedeutend aktiver ist in vivo gegenüber Infektionen durch Proteus sp., Micro- coccus pyogenes vor. aureus Smith, Streptococcus pyogenes und Diplococcus pneumoniae (Erythro- mycin-resistent), wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht:
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<tb> Tabelle <SEP> 2
<tb> Dosis, <SEP> die <SEP> nötig <SEP> ist <SEP> für <SEP> das <SEP> Überleben <SEP> von <SEP> 50 <SEP> %d <SEP> der <SEP> Testtiere, <SEP> die <SEP> geimpft <SEP> wurden <SEP> mit <SEP> einer <SEP> Kultur
<tb> der <SEP> folgenden <SEP> Mikroorganismen-Stämme
<tb> Oral <SEP> durch <SEP> subcutane <SEP> Injektion
<tb> Dihydro- <SEP> DihydroNovobiocin <SEP> novobiocin <SEP> Novobiocin <SEP> novobiocin
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I-37 <SEP> (erythromycin-resistent) <SEP> 4,01 <SEP> 3,44 <SEP> - <SEP> M. <SEP> pyogenes <SEP> vor. <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0,434 <SEP> 0,463 <SEP> - <SEP> Proteus <SEP> sp. <SEP> UM <SEP> Nr. <SEP> 2 <SEP> 3,36 <SEP> 1,97 <SEP> - <SEP> S.
<SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> 5,42 <SEP> 5,79 <SEP> 3,47 <SEP> 4,91
Geeignete Novobiocin-Salze, aus denen man entsprechende Dihydronovobiocin-Salze erhält, sind solche mit einem oder höchstens zwei Kationen aus der Gruppe der Alkalimetalle, der nichttoxischen Erdalkalimetalle, des Ammoniums oder der quaternären organischen Stickstoffbasen und Amine.
Beispiel 1 In einem geeigneten Hydrierungsapparat und unter Wasserstoffatmosphäre wird eine Lösung von etwa 15,8 mg Novobiocin in 25 cm3 Methanol mit 50 mg Platinoxyd-Katalysator :gerührt. Das das Ge- misch enthaltende Hydrierungsgefäss wird während etwa 3 Stunden kontinuierlich geschüttelt, wobei ein Wasserstoffdruck von 2,80 kg/cm- und eine Temperatur von etwa 25 C aufrechterhalten wird.
Die Wasserstoffaufnahme wird gemessen, und nachdem eine äquimolare Menge Wasserstoff in bezu,g auf das Novobiocin absorbiert worden ist, öffnet man den Apparat, filtriert die im Gefäss befindliche Lösung zur Entfernung des Katalysators und dampft das Filtrat unter Vakuum zur Trockne ein. Der Rückstand zeigt beim mikrobiologischen Versuch eine im wesentlichen gleiche Aktivität wie das als Ausgangsmaterial ver-
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wendete Novobiocin. Bei diesem Produkt handelt es sich um das neue synthetische Antibioticum Dihydro- novobiocin, welches die oben beschriebenen Eigenschaften und antibiotische Aktivität besitzt.
Beispiel 2 Man gibt eine Lösung von etwa 28,4 mg Novo- biocin in 10 cm3 gereinigtem Eisessig in ein geeignetes Hydrierungsgefäss und rührt die Lösung während etwa 3 Stunden mit 27,5 mg Platinoxyd-Katalysator unter einer Wasserstoffatmosphäre von einem Druck von etwas über 1 Atmosphäre und bei einer Temperatur von etwa 25 C. Durch Messen der Wasserstoffaufnahme wird festgestellt, dass eine ziemlich genau äquimolare Menge Wasserstoff mit Bezug auf das als Ausgangsmaterial verwendete Novobiocin absorbiert wird. Der Katalysator wird entfernt und die Lösung wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft.
Bei der Prüfung einer methanolischen Lösung dieses Rückstandes beobachtet man Maxima bei Wellenlängen von 2450 A und 3250 A; beim Ansäuern der methano- lischen Lösung auf eine Wasserstoffionenkonzentration von etwa pH 2,0 ist eine Spitze bei 3250 A zu beobachten, und in basischer methanolischer Lösung mit einer Wasserstoffionenkonzentration von etwa pH 10,0-11,0 werden Maxima beobachtet bei 3050-3100 A. Beim Produkt handelt es sich um das oben beschriebene Dihydronovobiocin.
Beispiel 3 Man suspendiert etwa 25,0 mg Platinoxyd in 20 cm3 Methanol und reduziert mit Wasserstoff in einem geeigneten Hydrierungsapparat. Zur methano- lischen Suspension des Platin-Katalysators gibt man eine Lösung von etwa 66,0 mg Novobiocin in 4 cm3 Methanol und rührt das Gemisch während etwa 44 Minuten unter einer Wasserstoffatmosphäre bei etwas höherem als Atmosphärendruck und bei einer Temperatur von etwa 25 C. Die Wasserstoffaufnahme wird sorgfältig gemessen, und es ergibt sich, dass pro Mol des als Ausgangsmaterial verwendeten Novobiocins 1 Mol Wasserstoff aufgenommen wird.
Nach dem Abtrennen des Katalysators wird die Lösung unter Vakuum eingedampft, wobei man Di- hydronovobiocin als hellgelbes Pulver erhält. Dieses Produkt hat die oben beschriebene mikrobiologische Aktivität.
Beispiel 4 Eine Lösung von etwa 15,0 g des Mononatriumsalzes von Novobiocin in 400 cm3 Methanol wird in ein geeignetes Hydrierungsgefäss gegeben; zu dieser Lösung gibt man 100 mg Platinoxyd. Das Gemisch wird während etwa 50 Minuten unter einer Wasserstoffatmosphäre und bei einer Temperatur von etwa 25 C geschüttelt, worauf man das Gefäss öffnet, die Lösung entnimmt und den Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Beim erhaltenen Produkt handelt es sich um das Mononatriumsalz von Dihydronovobiocin, dessen Aktivität im wesentlichen gleich ist wie diejenige des Dihydronovobiocins, das man in den vorstehenden Beispielen als Produkt erhielt.
Beispiel S Eine Lösung von etwa 1,12g Novobiocin in 20 cm3 Methanol wird mit 25 mg Platinoxyd unter Wasserstoffatmosphäre bei einer Temperatur von 25 C während etwa 36 Minuten gerührt. Die Wasserstoffaufnahme ergibt sich zu einem Mol Wasserstoff pro Mol des als Ausgangsmaterial verwendeten Novo- biocins. Das Gemisch wird filtriert zur Entfernung des Katalysators und das Filtrat wird zur Trockne eingedampft. Der aus Dihydronovobiocin bestehende Rückstand wird in einer minimalen Menge Aceton gelöst, zu welcher acetonischen Lösung man Petrol- äther (30-60 C) zugibt, wobei das Dihydronovo- biocin aus der Lösung in Form eines Niederschlages ausfällt, welcher abfiltriert, mit Petroläther gewaschen und getrocknet wird.
Dieses Produkt ist optisch aktiv: [a] D = -27 (C = 1,68 in 2,5n Natriumhydroxydlösung). Aus Titrationskurven findet man, dass dieses Produkt wie Novobiocin zwei basenbindende Gruppen aufweist, und das Infrarot-Absorptionsspektrum dieses synthetischen Antibioticums gleicht ebenfalls den entsprechenden Daten, die man bei der Prüfung von Novobiocin erhält.
Beispiel 6 Etwa 12,5 g (0,019 Mol) des Mononatriumsalzes von Novobiocin werden in 200 cm3 Methanol gelöst, wobei eine wolkige Lösung entsteht, welche mit etwa 3 g Raney-Nickel während 5 Minuten gerührt wird, worauf man die Lösung filtriert, den Rückstand mit 50 cm3 Methanol wäscht, die Waschflüssigkeit mit dem Filtrat vereinigt und die entstehende klare Lösung über einem Platin-Katalysator hydriert, bis die Wasserstoffaufnahme aufhört. Man findet, dass 0,019 Mol Wasserstoff absorbiert werden.
Man filtriert den Katalysator ab, dampft das Filtrat unter Vakuum zur Trockne ein und löst den Rückstand in etwa 15 cm3 Äthanol. Zu dieser Lösung gibt man so viel Aceton, dass eine beginnende Trübung auftritt, worauf man die Lösung über Nacht bei Zimmertemperatur stehen lässt. Der kristalline Niederschlag des Mononatriumsalzes von Dihydro- novobiocin, welcher sich dabei bildet, wird abfiltriert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Er zeigt die Eigenschaften des oben beschriebenen Mononatriumsalzes von Dihydronovobiocin.
Wenn man eine wässerige Lösung dieses Mononatriumsalzes mit einem geringen überschuss von in Wasser gelöstem Procainhydrochlorid vermischt, so fällt das wasserunlösliche Procainsalz von Dihydro- novobiocin aus.
Beispiel 7 Zu .einer Lösung von 2,0 g Novobiocin in 50 cm3 Methanol gibt man ungefähr einen halben Teelöffel Raney-Nickel-Hydrierungskatalysator (entsprechend etwa 3-4 -g Trockengewicht). Diese Lösung wird
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während etwa 2 Stunden in einer Hydrierungsbombe geschüttelt bei einem Wasserstoffdruck von 154 kg/cm2 und einer Temperatur von 100 C. Die Bombe wird dann gekühlt und der Wasserstoffdruck wird entspannt. Die methanolische Lösung wird filtriert zur Entfernung des Katalysators und das methanolische Filtrat wird im Vakuum konzentriert, wobei man 1,8 g Dihydronovobiocin als festen Rückstand erhält.
Dieses Material hat die Eigenschaften des oben beschriebenen Dihydronovobiocins.
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Process for the production of dihydronovobiocin Novobiocin [this is the general name for an antibiotic which is also known, among other things, under the name Cathomycin (registered trademark)], is produced by growing a previously unknown type of microorganism which was called Streptomyces sphaeroides, under controlled conditions. This Streptomyces species, isolated from a soil sample from an old grass pasture in Vermont, was designated Streptomyces sphaeroides MA-319 in the culture library of Merck & Co., Inc., Rahway, New Jersey. A viable culture thereof has been deposited with the Fermentation section of the Northern Utilization Research Bureau, United States Department of Agriculture in Peoria, Illinois and is included in its permanent culture collection as NRRL 2449.
Aqueous media that are suitable for aerobically growing strains of Streptomyces sphaeroides to produce novobiocin are generally those that are also suitable for the production of other antibiotics by growing other Streptomyces microorganisms. Such media contain sources of assimilable carbon such as e.g. A carbohydrate, assimilable nitrogen, e.g. B. Grain softening, casein hydrolyzate, extracts from distillation residues, etc., as well as inorganic salts, including those of trace metals, which are necessary for the metabolism of the microorganisms.
Preferably, during the time in which the microorganisms are cultured, which is usually about 1-7 days, a temperature of 24 to 28 C is maintained and ventilation is carried out to ensure optimal growth of the organisms and optimal production of Novo - to achieve biocin. The fermentation broths prepared in this way have an activity of about 150-2000 novobiocin units, as defined below, per cm3, and the solids of the fermentation broth have an activity of the order of magnitude of about 2.25 novobiocin units per mg of solids. The antibiotic agent can be purified and obtained in a purer form using various methods.
For example, one can filter the entire broth at a hydrogen ion concentration which usually corresponds to about pH 7.0-8.0. The filtrate can be extracted in the acidic range below about pH 7.0 with a neutral, rather weakly polar, water-immiscible liquid organic solvent that is soluble in cold concentrated sulfuric acid and in cold syrupy orthophosphoric acid.
The organic extract can be extracted with an aqueous alkaline buffer solution at a pH of at least 8.0 to obtain a solution containing novobiocin salt in considerable concentration.
The two extraction steps can then be repeated, obtaining an even more concentrated solution from which novobiocin-active material can be obtained by acidic precipitation. The product thus obtained can be purified by recrystallization from an aqueous acidic alcohol solution.
It goes without saying that, in addition to Streptomyces sphaeroides NRRL 2449, other novobiocin-producing strains of Streptomyces sphaeroides can also be used for the production of novobiocin, for example mutation forms of the organisms described, as obtained by natural selection or by the action of mutation agents, e.g. . B.
X-ray or ultraviolet radiation, treatment with nitrogen mustard, etc.
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The new antibiotic Novobiocin consists of a substance with the approximate gross formula C31H36N2O11. This reacts to alkaline reagents as an acidic organic compound and is easily soluble in such, for example in aqueous solutions of alkali hydroxides, carbonates and bicarbonates; it has two broom-binding groups and can be precipitated from alkaline solution by acidification.
It is soluble in lower alkanols, lower aliphatic ketones, acetic acid, ethyl acetate and dioxane, and it is insoluble or only sparingly soluble in ether, benzene, chloroform, carbon tetrachloride, ethylene dichloro, water and hydrochloric acid.
Pure novobiocin was obtained in two crystalline modifications; One shape crystallizes in a rosette shape and melts at about 152-154 C, while a second shape has the appearance of flat needles and melts at about 170-172 C. Each of these crystalline forms of the antibiotic can be converted into a so-called normal form, which is probably an amorphous or sub-microcrystalline form, by dissolving the crystals in acetone, quickly adding a relatively large volume of petroleum ether to this solution and the precipitated normalized material filtered off.
Alkaline aqueous solutions of novobiocin and mineral oil suspensions of the normal form of the antibiotic show a characteristic absorption, the former in the ultraviolet part and the latter in the infrared part of the radiation spectrum. A solution of pure novobiocin in 0.1N aqueous sodium hydroxide shows a characteristic ultraviolet absorption peak at 3070 A. This absorption peak indicates an essentially pure material, with a specific absorption of 600, measured at this wavelength using a solution of 1 g pure Novobiocin per 100 cm3 solution contained in a cell with an absorption layer thickness of 1 cm.
A solution of pure Novobiocin in 0.1N aqueous-methanolic hydrochloric acid shows a characteristic ultraviolet absorption peak at 3240 A with E #m = 390. A mineral oil suspension of pure normalized Novobiocin shows characteristic infrared absorption peaks at the following wavelengths, expressed in microns: 5.8-6.0 (wide), 6.10, 6.21, 6.30, 6.49, 6.63, 7.4 to 7.6 (wide shoulder), 7.78, 7.96 , 8.27 (weak), 8.60 (shoulder), 8.7 (shoulder), 9.13, 9.40, 10.0-10.1 (broad), 10.28, 10.60 (broad ), 12.0-12.30 (wide), 12.60-12.75 (wide), 13.07 and 13.39.
The novobiocin units refer to the microbiological activity of pure crystalline novobiocin. The microbiological activity of pure crystalline novobiocin was arbitrarily set at 5000 units / mg and determined by the standard dish plate diffusion method using Bacillus subtilis ATTC 12,432 as a test organism. According to this method, a culture of Bacillus subtilis ATTC 12,432 is grown on brain marrow infusion agar (Difco Manual, 9th edition, pages 90, 91) for 24 hours at 37 ° C. and then stored for a period of no more than one month. To produce spores, an inoculum is prepared by adding 5 cm3 of sterile distilled water to a fresh cultivation of Bacillus subtilis.
The cells are aseptically scraped off the nutrient medium, mixed well and placed in an Erlenmeyer flask containing 50 cm3 of sterile distilled water. Two cm3 of the bacterial suspension are placed as an inoculum in a Roux flask containing a medium consisting of 3% soybean meal, 0.2% NaCl, 0.4% soluble components from distillation residues, 0.8% c, dextrose and 2 , 00% agar. After incubation for 7 days at 37 ° C., the bacterial culture obtained is suspended in 50 cm3 of sterile distilled water and pasteurized at 65 ° C. for 30 minutes. 4 cm3 of a 1:50 dilution of this spore suspension are used per liter of test medium, which has a pH of 5.9-6.10.5% peptone, 0.3% beef extract, 0.3% yeast extract and 1.5% agar contains.
Portions of 50 cm3 each of the seeded medium are placed in deep Petri dishes with a flat bottom. Six stainless steel cylinders are placed on the seeded agar. Alternately, 3 cylinders are filled with a standard solution of 4 r Novobiocin / cm3 (corresponding to 20 Novobiocin units / cm3) and 3 cylinders are filled with the solution to be determined, which is diluted to approximately the same strength with m / 20 phosphate buffer at pH 6 , 0. A daily standard curve is produced with pure Novobiocin diluted to various concentrations of 2-16 / tcm3.
After incubation at 28 ° C. for 18 hours, the diameter of the zones of inhibition of the unknown solutions and the standard solutions on each dish are measured. The strength of the unknown. The solution is determined from a nomogram, based on: the degree of susceptibility at different concentrations, which results from the daily standard curve.
Novobiocin is optically active, [a] D = -270 (C = 1 in 1 n sodium hydroxide) and [a] D = -44, (C = 1 in pyridine).
Novobiocin is effective in inhibiting the growth of primarily gram-positive microorganisms, but also has some effect on gram-negative microorganisms. It inhibits u. a. the growth of the following organisms:
M. pyogenes before. albus M. pyogenes. aureus Diplococcus pneumoniae Corynebacterium .diphtheriae Typus gravis Corynebacterium diphtheriae Typus intermedius Corynebacterium diphtheriae Typus mitis Corynebacterium xerose
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Corynebacterium renale Neisseria meningitidis Sarcina lutea (VD) M. pyogenes var.aureus (resistant to aureomycin) M. pyogenes var.aureus (resistant to streptomycin-streptothricin) M. pyogenes var.
aureus (resistant to penicillin). Novobiocin salts also have antibiotic effects. For example, it showed. in the agar strip solution test that the sodium salt of novobiocin inhibited the growth of various strains of M. pyogenes var. aureus, M. pyogenes var. albus, Neisseria meningitidis (No. 274) and Sarcina lutea (VD) at concentrations of less than 0 , 5 / cm3 inhibits. Other microorganisms are also damaged to varying degrees by Novobiocin or its salts.
It has now been found that when novobiocin is combined with hydrogen in the presence of a hydrogenation catalyst in a ratio of 1 mol of hydrogen per time of novobiocin or novobiocin salt, a dihydro derivative is formed as a new synthetic product in quantitative yield, so to speak. This product is dihydronovobiocin or a salt thereof, depending on the starting material used or on the conditions under which the product was obtained. This dihydronovobiocin product is approximately as antibiotic as the novobiocin itself, having an activity of about 5000 novobiocin units per mg in the pure state, and is also suitable for clinical use.
To carry out the process according to the invention, the procedure is, for example, that novobiocin or a salt of novobiocin is dissolved in a suitable solvent, e.g. B. in a lower alkanol, a lower fatty acid or an aqueous alkaline solution in which a hydrogenation catalyst is suspended, the mixture is exposed to a hydrogen atmosphere at atmospheric pressure or higher pressure and shakes or stirs until about one mole of hydrogen per mole Novobiocin or Novobiocin salt is added.
Suitable hydrogenation catalysts are catalytic masses of platinum, palladium, ruthenium and rhodium and oxides of these noble metals, also finely divided nickel or cobalt, e.g. B. Raney nickel or Raney cobalt. The catalysts can be used with or without a carrier and with or without an accelerator. In general, the hydrogenation proceeds more rapidly with platinum than with the other noble metal or noble metal oxide catalysts mentioned if the amounts of catalyst used are the same. Sufficient reaction rates are achieved when using noble metal or noble metal oxide catalysts at lower pressures and temperatures than when using non-noble metal catalysts such as Raney nickel or Raney cobalt.
If a noble metal or a noble metal oxide is used as the hydrogenation catalyst, the reaction proceeds at a satisfactory rate at normal room temperature and low pressure, that is to say at a pressure slightly above atmospheric pressure. When using other hydrogenation catalysts, such as Raney nickel or Raney cobalt, somewhat higher temperatures of about 100 ° C. or more, but not above about 150 ° C., and somewhat higher pressures of about 70-154 kg / cm 2 can be used with advantage. The time required to complete the reaction can be shortened if the reaction is carried out at elevated pressures. The reaction proceeds satisfactorily at room temperature, but higher temperatures can, if desired, also be used, but these should generally not exceed about 150.degree.
In general, the type of catalyst used is not decisive, but the rate of reduction is increased or decreased when the amount of catalyst is increased or decreased.
Impure concentrates of novobiocin or novobiocin salts may be used as starting materials, but it is usually preferred to start from pure starting materials when available. Alkali salts are suitable, e.g. B. the monosodium salt of novobiocin.
The reaction can be carried out in a solvent in which the novobiocin or novobiocin salt used as starting material is soluble and which does not interfere with the hydrogenation of the novobiocin. For example, alkaline aqueous solutions such as aqueous sodium hydroxide solution or aqueous potassium hydroxide solution, lower alkanols such as methanol or ethanol, and lower fatty acids such as glacial acetic acid can be used.
After the end of the reduction, that is, after an equimolecular amount of hydrogen with respect to the novobiocin or novobiocin salt, which serves as the starting material, has been absorbed, the catalyst is best removed from the reaction mixture by filtration and the dihydro-novobiocin isolated, preferably by Evaporation of the solvent from the filtrate under vacuum.
The dihydronovobiocin can be obtained as such from the reaction mixture; If a salt of novobiocin is used as a starting point, a solution of the dihydronovobiocin salt obtained is mixed with an acid, for example one of the common mineral acids such as sulfuric acid, and the precipitated dihydronovobiocin is filtered off.
Likewise, salts of dihydronovobiocin can be obtained as such by carrying out the hydrogenation in a suitably selected basic aqueous medium.
Dihydronovobiocin can be converted into its monobasic or dibasic salts in a simple manner by reaction with suitably selected bases. In this way you can
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Alkali salts of dihydronovobiocin, such as the sodium or potassium salt, alkaline earth salts such as the calcium salt, and the salts of quaternary nitrogen bases, such as ammonium salts and salts of organic amines, can be obtained.
Examples of organic amines which form salts with dihydronovobiocin are quinine, procaine, guanidine, noformicin, N-benzyl-ss-phenyl-ethylamine, N, N dibenzyl-ethylenediamine, cyclohexylamine, N ethyl-piperidine, triethylamine, dicyclo- hexylamine, arginine, histidine and lysine.
The salts of dihydronovobiocin can, if desired, be purified by recrystallization according to the usual methods. For example, it can be dissolved in a minimal amount of a lower alkanol such as methanol or ethanol and the solution partially evaporated to cause the purified crystalline material to precipitate, or a solvent such as acetone can be added to the alcoholic solution to induce turbidity, after which, after standing for some time, the precipitated purified crystalline product can be recovered.
As mentioned above, based on the data currently available, the novobiocin seems to have the gross formula C31H36N2O11, from which it follows that the dihydronovobiocin, which has two more hydrogen atoms per novobiocin molecule, should have the formula C31H38N2O11. Although the exact chemical structure of the novobiocin and dihydronovobiocin molecules has not yet been fully clarified, it is assumed on the basis of experimental chemical investigations that the novobiocin molecule contains, among other things, a benzene ring on which a dimethylallyl chain with the grouping
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is linked, which in the hydrogenation in a dimethylpropyl chain of the group
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passes over as a substituent of the benzene ring mentioned in the dihydronovobiocin.
The fact that novobiocin reacts with hydrogen in the presence of a suitable hydrogenation catalyst to form a new compound, and the fact that this reaction proceeds with equimolar amounts of hydrogen and novobiocin, can be proven by performing the reaction using the hydrogen isotope, deuterium, instead of ordinary Hydrogen, and then the reaction product is analyzed to determine its deuterium content.
This can be done as follows: In a suitable hydrogenation apparatus, about 515 mg novobiocin and 71 mg sodium hydroxide are added to a mixture of 50 mg platinum oxide and 10 cm3 deuterium oxide under an atmosphere of deuterium and the mixture is stirred under a deuterium pressure of a little more than 1 atmosphere for about 2 hours. Then about 35 mg more sodium hydroxide is added to ensure complete dissolution of the novobiocin, and another 50 mg platinum oxide is added to the mixture. In order to lower the hydrogen ion concentration of the solution and thereby delay hydrolysis, about 0.5 cms of ethyl acetate are added and the mixture is then stirred under the deuterium atmosphere for about a further 9 hours.
The mixture is then filtered to remove the catalyst and the filtrate is acidified by adding hydrochloric acid, the deuterium isologue of dihydronovobiocin precipitating, which is separated off, washed with water and dried. The analysis shows that the product contains 5.0% by weight of a deuterium (calculated: 5.6%).
The presence of deuterium in the product serves to distinguish it as a new chemical compound from the novobiocin used as starting material, and it proves that hydrogen addition occurs when novobiocin is subjected to hydrogenation in the presence of a hydrogenation catalyst as described above. The amount of deuterium absorbed during the reaction and present in the reaction product proves that the reactants took part in the reaction in an equimolar amount.
A biological examination of this deuterium isologue of dihydronovobiocin reveals that it has exactly the same degree of antimicrobial activity as novobiocin and dihydronovobiocin, and that its effectiveness extends to the same bacterial spectrum as that of novobiocin and dihydro- biocin. novobiocin.
While the two groups of antibiotic substances, namely novobiocin and its salts on the one hand and dihydronovobiocin and its salts on the other, can hardly be distinguished by ordinary chemical analysis - and while ordinary physical measurements, such as those of absorption in the infrared or ultraviolet, can also be used In the range of the radiation spectrum, such a distinction does not readily permit, the members of the two groups can easily be distinguished by paper chromatography, as well as on the basis of their behavior towards certain chemical reagents, especially periodic acid.
As for the first method of discrimination, the reverse phase chromatography method is commonly used, using caprylic: alcohol as the stationary phase and an aqueous solution as the mobile phase.
A sheet of filter paper (Whatman # 1) is treated to remove water from the paper.
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The treatment consists in drying the paper at 110 ° C. under high vacuum (1 mm Hg) overnight. The paper is then treated to protect it against the reabsorption of water. This treatment consists in immersing the paper in a mixture of a silicone liquid (e.g. Dow Corning 200 Fluid) with a viscosity of 12500 and ethyl ether with a ratio of 5 g silicone liquid to 100 cm3 ethyl ether and then dipping air dry for 10 minutes. In this state the papers can be stored in a desiccator until they are used.
When using the paper, the novobiocin or dihydronovobiocin is dabbed near one end of the strip, after which the paper is immersed in a mixture of caprylic alcohol and methanol (volume ratio 1: 5). After immersion, the paper is blotted to remove excess liquid and then hung in a closed cylinder with the end to which the compounds were applied facing up. This end of the paper strip is immersed in an aqueous solution of sodium phosphate (0.1 molar) with a pH of 8.4. An additional amount of the same solution is placed at the bottom of the closed cylinder, so that the evaporation of the solution from the paper as it moves down through it is kept as low as possible.
When the mobile (aqueous) phase migrates down through the paper, the novobiocin moves faster than the dihydronovobiocin. Within 6 hours the solvent front moves forward about 18 cm and leads to a satisfactory separation of the two compounds. The separate locations of the two spots are visible on the paper when viewed in an ultraviolet device. If the chromatogram is allowed to run overnight (approx. 17 hours), the solvent front moves by approx. 45 cm and there is a correspondingly greater separation between the two spots.
In quantitative terms, Novobiocin moves at a migration speed corresponding to an Rf value of 0.30. Referring to novobiocin mobility as a standard of 1.0, the dihydronovobiocin has a migration speed of 0.68.
In the other method of differentiating between novobiocin and its salts and dihydronovobiocin and its salts, in which novobiocin or a novobiocin salt is reacted with periodic acid, an additional mole of this reagent is taken up per mole of novobiocin compared to the amount of the reagent which is absorbed in the reaction with an equimolar amount of dihydro-novobiocin. This can easily be shown as follows: One treats solutions of measured amounts of novobiocin and dihydronovobiocin in dioxane with a known excess of periodic acid in water. The solutions are left to stand overnight.
The excess of periodic acid is determined in each case by titration with sodium arsenite standard solution. The difference between the titration value of this excess and the amount of periodic acid present at the beginning of the experiment gives in both cases the amount of periodic acid which was taken up by the compounds. It is found that novobiocin absorbs about 1 mole more periodic acid than dihydronovobiocin per mole of antibiotic compound used.
Novobiocin and its salts, on the one hand, and dihydronovobiocin and its salts, on the other hand, also differ in their activity against certain microorganisms, as can be seen from the following table, which is based on in vitro tests with standard dilution series.
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<tb> Table <SEP> 1
<tb> Comparison <SEP> of <SEP> Novobiocin <SEP> and <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> culture <SEP> inhibition concentration <SEP> / cm3
<tb> Novobiocin <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (gravis) <SEP> ATCC <SEP> 9674 <SEP> 0.39 <SEP> 0.19 <SEP> or <SEP> <
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (intermediate) <SEP> ATCC <SEP> 9675 <SEP> 0.39 <SEP> 0.19 <SEP> or <
<tb> C. <SEP> diphtheriae <SEP> (mitis) <SEP> ATCC <SEP> 9673 <SEP> 0.39 <SEP> 0.19 <SEP> or <
<tb> C.
<SEP> pseudotuberculosis <SEP> 545 <SEP> 25 <SEP> 6.25
<tb> C. <SEP> renalis <SEP> 506 <SEP> 0.39 <SEP> 0.19 <SEP> or <
<tb> C. <SEP> xeroxis <SEP> C. <SEP> U. <SEP> 1.56 <SEP> 0.78
<tb> C. <SEP> pseudodiphtheriticum <SEP> 259 <SEP> 50 <SEP> 12.5
<tb> Sarcina <SEP> lutea <SEP> V.D. <SEP> 0.19 <SEP> 0.19
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<tb> culture <SEP> inhibition concentration <SEP> / cm3
<tb> Novobiocin <SEP> Dihydronovobiocin
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> before. <SEP> albus <SEP> 0.19 <SEP> 0.19
<tb> M. <SEP> pyogenes <SEP> before. <SEP> aureus <SEP> Sm <SEP> 0.19 <SEP> or <SEP> <<SEP> 0.19 <SEP> or <
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I-37 <SEP> 0.39 <SEP> 0.19
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> II-807 <SEP> 3.12 <SEP> 1.56
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I1-6302 <SEP> 1.56 <SEP> 0.78
<tb> Strep. <SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> 1.56 <SEP> 1.56
<tb> Strep.
<SEP> pyogenes <SEP> S-23 <SEP> 1.56 <SEP> 0.78
<tb> Strep. <SEP> fecalis <SEP> 12.5 <SEP> 12.5
<tb> N. <SEP> catarrhalis <SEP> 7900 <SEP> 12.5 <SEP> 6.25
<tb> N. <SEP> intracellularis <SEP> 274 <SEP> 0.39 <SEP> 0.78
<tb> N. <SEP> intracellularis <SEP> 2333 <SEP> 0.39 <SEP> 0.39
It should be noted that dihydronovobiocin is at least as active towards the test microorganisms and in most cases more active than novobiocin, especially towards important pathogens, and that there is more than a twofold improvement in activity compared to two of these, namely C. pseudotuberculosis 545 and C. pseudodiphtherificum 259.
It is also found that, compared to novobiocin, dihydronovobiocin is significantly more active in vivo against infections by Proteus sp., Micrococcus pyogenes. aureus Smith, Streptococcus pyogenes and Diplococcus pneumoniae (erythro- mycin-resistant), as shown in the following table:
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<tb> Table <SEP> 2
<tb> dose, <SEP> the <SEP> necessary <SEP> is <SEP> for <SEP> the <SEP> survival <SEP> of <SEP> 50 <SEP>% d <SEP> of the <SEP> test animals , <SEP> the <SEP> vaccinated <SEP> were <SEP> with <SEP> a <SEP> culture
<tb> of the <SEP> following <SEP> microorganism strains
<tb> Oral <SEP> by <SEP> subcutaneous <SEP> injection
<tb> Dihydro- <SEP> DihydroNovobiocin <SEP> novobiocin <SEP> Novobiocin <SEP> novobiocin
<tb> D. <SEP> pneumoniae <SEP> I-37 <SEP> (erythromycin-resistant) <SEP> 4.01 <SEP> 3.44 <SEP> - <SEP> M. <SEP> pyogenes <SEP > before. <SEP> aureus <SEP> Smith <SEP> 0.434 <SEP> 0.463 <SEP> - <SEP> Proteus <SEP> sp. <SEP> UM <SEP> No. <SEP> 2 <SEP> 3.36 <SEP> 1.97 <SEP> - <SEP> S.
<SEP> pyogenes <SEP> C-203 <SEP> 5.42 <SEP> 5.79 <SEP> 3.47 <SEP> 4.91
Suitable novobiocin salts from which corresponding dihydronovobiocin salts are obtained are those with one or at most two cations from the group of the alkali metals, the non-toxic alkaline earth metals, ammonium or the quaternary organic nitrogen bases and amines.
EXAMPLE 1 A solution of about 15.8 mg novobiocin in 25 cm3 of methanol with 50 mg of platinum oxide catalyst is stirred in a suitable hydrogenation apparatus and under a hydrogen atmosphere. The hydrogenation vessel containing the mixture is shaken continuously for about 3 hours, a hydrogen pressure of 2.80 kg / cm 2 and a temperature of about 25 ° C. being maintained.
The hydrogen uptake is measured, and after an equimolar amount of hydrogen has been absorbed in relative g onto the novobiocin, the apparatus is opened, the solution in the vessel is filtered to remove the catalyst and the filtrate is evaporated to dryness under vacuum. In the microbiological test, the residue shows essentially the same activity as that used as the starting material
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turned novobiocin. This product is the new synthetic antibiotic dihydro-novobiocin, which has the properties and antibiotic activity described above.
Example 2 A solution of about 28.4 mg novobiocin in 10 cm3 of purified glacial acetic acid is placed in a suitable hydrogenation vessel and the solution is stirred for about 3 hours with 27.5 mg of platinum oxide catalyst under a hydrogen atmosphere at a pressure of slightly above 1 Atmosphere and at a temperature of about 25 C. By measuring the hydrogen uptake, it is found that a fairly exactly equimolar amount of hydrogen is absorbed with respect to the novobiocin used as the starting material. The catalyst is removed and the solution is evaporated to dryness in vacuo.
When testing a methanolic solution of this residue, maxima are observed at wavelengths of 2450 A and 3250 A; when acidifying the methanolic solution to a hydrogen ion concentration of about pH 2.0, a peak at 3250 A can be observed, and in basic methanolic solution with a hydrogen ion concentration of about pH 10.0-11.0 maxima are observed at 3050-3100 A. The product is the dihydronovobiocin described above.
Example 3 About 25.0 mg of platinum oxide are suspended in 20 cm3 of methanol and reduced with hydrogen in a suitable hydrogenation apparatus. A solution of about 66.0 mg novobiocin in 4 cm3 of methanol is added to the methanolic suspension of the platinum catalyst and the mixture is stirred for about 44 minutes under a hydrogen atmosphere at slightly higher than atmospheric pressure and at a temperature of about 25 ° C Hydrogen uptake is carefully measured, and it is found that 1 mole of hydrogen is taken up per mole of novobiocin used as starting material.
After the catalyst has been separated off, the solution is evaporated in vacuo, whereby dihydronovobiocin is obtained as a pale yellow powder. This product has the microbiological activity described above.
Example 4 A solution of about 15.0 g of the monosodium salt of Novobiocin in 400 cm3 of methanol is placed in a suitable hydrogenation vessel; 100 mg of platinum oxide are added to this solution. The mixture is shaken for about 50 minutes under a hydrogen atmosphere and at a temperature of about 25 ° C., after which the vessel is opened, the solution is removed and the catalyst is filtered off. The filtrate is evaporated to dryness under vacuum. The product obtained is the monosodium salt of dihydronovobiocin, the activity of which is essentially the same as that of the dihydronovobiocin obtained as the product in the preceding examples.
Example S A solution of about 1.12 g of novobiocin in 20 cm3 of methanol is stirred with 25 mg of platinum oxide under a hydrogen atmosphere at a temperature of 25 ° C. for about 36 minutes. The hydrogen uptake results in one mole of hydrogen per mole of the novobiocin used as the starting material. The mixture is filtered to remove the catalyst and the filtrate is evaporated to dryness. The residue consisting of dihydronovobiocin is dissolved in a minimal amount of acetone, to which acetone solution is added petroleum ether (30-60 C), the dihydronovobiocin precipitating out of the solution in the form of a precipitate, which is filtered off, washed with petroleum ether and is dried.
This product is optically active: [a] D = -27 (C = 1.68 in 2.5N sodium hydroxide solution). From titration curves it is found that this product, like Novobiocin, has two base-binding groups, and the infrared absorption spectrum of this synthetic antibiotic also resembles the corresponding data obtained when testing Novobiocin.
Example 6 About 12.5 g (0.019 mol) of the monosodium salt of novobiocin are dissolved in 200 cm3 of methanol, a cloudy solution being formed which is stirred with about 3 g of Raney nickel for 5 minutes, whereupon the solution is filtered and the residue Washed with 50 cm3 of methanol, the washing liquid combined with the filtrate and the resulting clear solution hydrogenated over a platinum catalyst until the hydrogen uptake ceases. It is found that 0.019 moles of hydrogen are absorbed.
The catalyst is filtered off, the filtrate is evaporated to dryness under vacuum and the residue is dissolved in about 15 cm3 of ethanol. So much acetone is added to this solution that cloudiness begins to appear, whereupon the solution is left to stand overnight at room temperature. The crystalline precipitate of the monosodium salt of dihydro-novobiocin, which is formed in the process, is filtered off, washed with acetone and dried. It shows the properties of the monosodium salt of dihydronovobiocin described above.
If an aqueous solution of this monosodium salt is mixed with a small excess of procaine hydrochloride dissolved in water, the water-insoluble procaine salt of dihydronovobiocin precipitates.
Example 7 About half a teaspoon of Raney nickel hydrogenation catalyst (corresponding to about 3-4 g dry weight) is added to a solution of 2.0 g of novobiocin in 50 cm 3 of methanol. This solution will
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shaken for about 2 hours in a hydrogenation bomb at a hydrogen pressure of 154 kg / cm2 and a temperature of 100 C. The bomb is then cooled and the hydrogen pressure is released. The methanolic solution is filtered to remove the catalyst and the methanolic filtrate is concentrated in vacuo to give 1.8 g of dihydronovobiocin as a solid residue.
This material has the properties of the dihydronovobiocin described above.