Verfahren zur Dehydrierung von Steroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Einführung einer Doppelbindung zwischen den Koh- lenstoffatomen Cl und C2 von Steroiden mittels Mikroorganismen der Gattung Bacillus oder entspre chenden Enzymen.
Das Verfahren eignet sich beson ders zur Überführung von ,d4-3-Keto-steroiden, wie J4-Pregnen-3,11,20-trion-17a,21-diol und A4-Pregnen- 3,20-dion-11ss,17a,21-triol, in die entsprechenden J1.4-3-Keto-steroide, z.
B. 4l,4-Pregnadien-3,11,20- trion-17a,21-diol bzw. d1.4-Pregnadien-3,20-dion- 11/3,17a,21-triol. Diese letzteren Verbindungen be sitzen Cortison-Aktivität, unterscheiden sich aber von Cortison dadurch, dass sie im wesentlichen frei von unerwünschten Nebenwirkungen, wie Ödembildung sind, da sie keine merkliche Natrium- oder Wasser retention bewirken.
Die Herstellung von 41,4-3-Keto-steroiden auf chemischem Wege war bisher unbefriedigend, weil die stattfindenden chemischen Reaktionen zu Ge mischen verschiedener Verbindungen führen. Eine Abtrennung der Zwischen- und Endprodukte aus derartigen Gemischen ist kostspielig und führt zu niedrigen Ausbeuten an den gewünschten 41,4-3-Keto- steroiden.
Bei dem vorliegenden Verfahren wird die Bildung von unerwünschten Nebenprodukten weitgehend ver mieden, und man erhält z. B. :dl#4-3-Keto-pregnadiene direkt und mit hoher Ausbeute aus den entsprechen den J- 4-3-Keto-pregnenen.
Die Dehydrierung gelingt besonders gut mit der Art Bacillus sphaericus. Die Art Bacillus sphaericus, wie sie in Bergey's Manual for Determinative Bacte- riology, 6. Auflage definiert ist, umfasst mehrere Ab arten, wie die Abart rotans, die Abart fusiformus usw.;
in einigen Zusammenstellungen werden diese Abarten unter den Artbezeichnungen Bacillus rotans und Bacillus fusiformis erwähnt. Diese Mikroorga- nismen können beispielsweise von der American Type Culture Collection, Washington, D. C. bezogen wer den oder sie können aus natürlichen Vorkommen, z. B. aus dem Erdreich nach bekannten Verfahren isoliert werden.
Die Dehydrierung kann wie gesagt sowohl mit Mikroorganismen-Kulturen als auch mit den betref fenden isolierten Enzymsystemen erfolgen.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann allgemein auf 3-Keto-steroid'e angewendet werden, ohne Rück sicht auf die Substituenten oder den Grad der Unge- sättigtheit der Ringe<I>B,</I> C und<I>D.</I>
Besonders kommen jedoch als Ausgangsstoffe 3-Keto- und auch 3-Oxy-steroide mit einer vom C-Atom 5 ausgehenden Doppelbindung in Betracht, beispielsweise 44-3-Keto-pregnen-Verbindungen und entsprechende 9-Halogenderivate, wie 9-Halogen-44- Pregnen-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-d4-pregnen- 3,20-dion-17a,
21-diol und ähnliche. Anstelle von d4-3-Ketopregnenverbindungen kann man als Aus gangsstoffe andere C5 ungesättigte 3-sauerstoffhaltige Steroide benutzen, beispielsweise 45-3-Oxy-pregnen- verbindungen, wie 45-Pregnen-20-on-3-ol und mit niedrigen Alkanearbonsäuren veresterte d5-3-Oxy- pregnene, z.
B. 45-Pregnen-20-on-3-ol. Diese d5-3 Oxy- und Acyloxy-pregnene werden durch die De hydrierung in die entsprechenden 41.4 - 3 - Keto- pregnadiene umgewandelt, wobei angenommen wird, dass primär die 44-3-Keto-pregnene gebildet werden.
Bei den oben genannten Ausgangsstoffen ist die Oxy- gruppe in 3- und/oder 21-Stellung gewöhnlich mit Essigsäure verestert; es kommen aber auch Ester anderer niederer Carbonsäuren, wie die Propionate, Butyrate, tert. Butylacetate, Benzoate und derglei chen, in Frage.
Es können ferner auch 3-Keto- pregnane oder 3-Hydroxy-pregnane, wie Pregnan- 3,20-dion, Pregnan-3,20-dion-17a-01, Pregnan-3,20- dion-21-ol, Pregnan-3,20-dion-17a,21-diol und ähn liche verwendet werden, wobei die Hydroxylgruppe in 3- und/oder 21-Stellung ebenfalls in der angege benen Weise verestert sein können.
Die Dehydrierung kann so erfolgen, dass das Steroid als fester Stoff oder in einem Lösungsmittel, z. B. einem Dialkylketon, wie Aceton, einem Dialkyl- formamid, wie Dimethylformamid und dergleichen, gelöst, unter sterilen Bedingungen zu einer Kultur der Mikroorganismen in einer Nährlösung zugesetzt wird und indem das gebildete Gemisch geschüttelt wird. Das Steroid kann gleichzeitig mit der Impfung der Nährlösung zugegeben werden, oder es kann anderseits einer bereits .entwickelten Kultur zugesetzt werden.
Man kann auch die Mikroorganismen von der Nährlösung abfiltrieren, mit destilliertem Wasser waschen, dann in einer gepufferten wässrigen, das Steroid enthaltenden Lösung suspendieren und das erhaltene Gemisch schütteln bzw. rühren. Das de hydrierte Steroid lässt sich in diesem Fall leichter isolieren, als wenn die Dehydrierung direkt in der Mikroorganismenkultur erfolgt.
Für die Kultivierung der Mikroorganismen kann man dieselben Nährlösungen verwenden, wie sie ge wöhnlich bei der Züchtung von Bazillen gebraucht werden. Normalerweise enthalten diese Nährlösungen Stickstoff und Kohlenstoff liefernde Stoffe, anorga nische Salze und allenfalls Wuchsstoffe. Der Kohlen stoff kann von Verbindungen, wie Acetaten, Laktaten und dergleichen geliefert werden.
Kohlehydrate wer den von Bacilius sphaericus nur schlecht ausgenutzt, und sie können in der Lösung vorhanden sein oder fehlen, ohne dass dadurch die Steroiddehydrierung ernstlich beeinflusst wird.
Als Stickstofflieferanten können dienen: Ammoniumsalze und Aminosäuren oder Proteine .enthaltende Produkte, wie Sojabohnen, Hafer, Hefe, Hefeextrakte, Abbauprodukte von Casein, Fleischextrakt, Blutmehl, Protein-, Fleisch- und Knochenabfälle, Lachsmehle, lösliche Fisch abfälle, lösliche Destillationsrückstände und derglei chen.
Die Bazillen können unter Umständen allein mit Proteinen (oder Aminosäuren) ohne Kohlehydrate kultiviert werden; in diesem Falle liefern die Proteine oder Aminosäuren sowohl den von den Mikroorga nismen benötigten Kohlenstoff als auch den Stick stoff. Gewöhnlich wird vorgezogen, die zu dehydrieren den Steroide zu einer 24 Stunden alten Kultur von Bacillus sphaericus zuzugeben. Die günstigste Menge des Steroides hängt u. a. von der Art desselben ab; immerhin verwendet man das Steroid vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 0,005111a bis 0,204.
Die das Steroid enthaltende Kultur wird dann vorzugsweise etwa 10 und 50 Stunden geschüttelt oder gerührt. Im Hinblick auf die Tatsache, dass eine verlängerte Gärung zur Zersetzung eines Teiles des dehydrierten Steroids führen kann, wird gewöhn lich die Gärung nicht länger als höchstens 24 Stunden durchgeführt. Nach Beendigung der Dehydrierung wird das Pro dukt aus der Gärflüssigkeit zweckmässig durch Extrak tion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungs mittel, wie z.
B. einem chlorierten Kohlenwasserstoff, beispielsweise Chloroform, einem Keton, beispiels weise Methylisobutylketon, einem Alkylalkanoat, bei spielsweise Äthylacetat und dergleichen, isoliert. Der Extrakt, der unter Umständen noch nicht umgesetztes Ausgangsmaterial enthält, wird zweckmässig durch Chromatographie unter Verwendung von Silicagel, aktiviertem Aluminiumoxyd und dergleichen, oder auch mittels absteigender Papierchromatogramme ge reinigt. Nach Abtrennung des nicht umgesetzten Ausgangsmaterials kann das Produkt weiter gereinigt werden, z.
B. durch Umkristallisation aus einem Lö sungsmittel, wie z. B. Äthylacetat, Äthylacetat-Petrol- äther und dergleichen.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren lassen sich aus d4-3-Keto-, A5-3-Oxy- und 45-3-Acyloxy- pregnenen u. a. folgende 41.4-Pregnadiene herstellen:
dl.4-3-Keto-pregnadiene, wie 41,4-Pregnadien-3,20-dion, dl#4-Pregnadien-3,20-dion-17a-ol, dl.4-Pregnadien-3,20-dion-21-ol, d1.4-Pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, A1,4_pregnadien-3,20-dion-17a-ol-2l-al, 41.4-Pregnadien-3,11,20-trion, d1,4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol, dl#4-Pregnadien-3,11,20-trion-21-ol, 41.4-Pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, Al,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a-ol-21-al, dl >4-Pregnadien-3,
20-dion-11 ss-ol, 41.4-Pregnadien-3,20-dion-1 l ss-ol-21-al, 41.4-Pregnad'ien-3,20-dion-1 l ss,21-diol, d1,4-Pregnad'ien-3,20-d'ion-1 lss,17a-diol, dl,4-Pregnadien-3,20-d'ion-1 lss,17a,21-triol, 9-Halogen-d1,4-3-keto-pregnadiene, wie 9-Halogen-41.4-pregnadien-3,20-dion-17,21-diol, 9-Fluor-41.4-pregnadien-3,20-dion-17a,21-diol, 9-Halogen-d1,4-pregnadien-3,20-dion- 17,11,21-triol,
9-Halogen-41,4-pregnadien-3,11,20-trion- 17,21-diol, 9-Fluör-41,4-pregnadien-3,11,20-trion-17a,21-diol, 9-Fluor-41,4-pregnadien-3,20-dion- Ilss,17a,21-triol und dergleichen.
<I>Beispiel l</I> 50 cm3 einer Nährlösung folgender Zusammen setzung werden hergestellt:
EMI0002.0107
Cerelose <SEP> (handelsübliche <SEP> Dextrose) <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> (handelsüblicher <SEP> Laktalbu minauszug <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25 <SEP> cm3
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 50 <SEP> cm3 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 cm3 einer Kultur, die durch Bebrüten von Bacillus sphaericus (MB 431) in derselben Lösung während 24 Stunden bei 28 erhalten wurde, geimpft; die geimpfte Lösung wird dann. bei einer Temperatur von 28 unter Schütteln 24 Stunden lang bebrütet.
Zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung, die 10 mg Hydrocortison (J4-Pregnen-11ss,17a,21-triol-3,20- dion) in 0,1 cm3 Dimethylformamid gelöst enthält, zugesetzt. Die die Steroid'-Verbindung enthaltende Kultur wird dann unter Schütteln während einer Zeit dauer von etwa 10 Stunden bei 28 bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 em3 Äthyiacetat extrahiert, und die Äthyl,acetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 em3 :eingedampft. Die konzentrierte Lö sung wird dann zur Herstellung von Papierstreifen- chromatogrammen verwendet, die unter Verwendung von Formamid als stationärer flüssiger Phase und Chloroform als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden.
Zwei Zonen lassen sich feststellen, von denen die eine (entsprechend der beweglicheren Kom ponente) das für Hydrocortison charakteristische Ab sorptionsmaximum im Ultraviolett zeigt und die andere (die weniger bewegliche Komponente) ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei etwa <I>242</I> mu. zeigt. Das Paperchromatogramm wird ge trocknet, und die der 242 mp-Absorption entspre chende Zone wird abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unter worfen, wobei Papier, das 48 Stunden mit Methanol extrahiert worden ist, und das vorher benutzte Chloro- form-Formamid-System verwendet werden. Das er haltene Chromatogramm zeigt nur eine Spur einer dem Ausgangsmaterial Hydrocortison entsprechende Zone, während die grössere Zone ein Absorptions maximum im Ultraviolett von<I>242</I> m,y hat. Das Papierchromatögramm wird gründlich getrocknet und die dem 242 my-Absorptionsmaximum entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert.
Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne einge dampft und gibt A1.4-Pregnadien-11ss,17a,21-triol- 3,20-dion.
<I>Beispiel 2</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt: Cerelose . . . . . . . . 400 g Edamin . . . . . . . . 400 g Getreideaufschlämmung . . . . 100 ml Hefeextrakt . . . . . . . . 20 g mit destilliertem Wasser aufgefüllt auf 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g Hydrocortison in 40 ml Diinethylformamid zugegeben. Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer zusätzlichen Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt .und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Eine Probe des Rückstandes wird in Aceton gelöst und auf ein Papierchromatogramm getüpfelt, das unter Verwendung von Formamid als, stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase ent wickelt wird.
Es werden zwei getrennte Zonen erhal ten; die untere, dem nicht umgesetzten Hydrocortison entsprechende Zone wird abgeschnitten, die andere, dem A'-Dehydro-Derivat entsprechende wird gleich- falls abgeschnitten und mit Methanol eluiert. Die Ultraviolett-Absorptionsanalys.e dieses Methanol eluates zeigt, dass die obere Zone 1 g 41,4-Pregnadien- 11,17,21=triol-3;20-dion enthält.
Der Hauptteil des nach Eindampfen des Äthyl- acetatextrakts erhaltenen Rückstands wird einer Zwei phasentrennung mit 70 /aigem wässrigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige Ver unreinigungen in die Petrolätherphase gehen. Das Methanol wird im Vakuum von der wässrigen Methanolphase abgedampft, und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung wird mit Äthylacetat extra hiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton ge löst und der Papierstreifenchromatogr.aphie unter Ver wendung von Formamid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase unterworfen. Die obere, dem A'-Dehydroderivat entsprechende Zone wird abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papier streifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Va kuum zur Trockne eingedampft.
Das zurückbleibende Material wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristalli siert; es werden annähernd 200 mg im wesentlichen reines d1.4-Pregnadien-11ss,17a,21-triol-3,20-dion er halten; Smp. 222-228 C.
<I>Beispiel 3</I> 20 Liter einer Nährlösung der folgenden Zusam mensetzung werden hergestellt:
EMI0003.0082
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400.g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 20 <SEP> 1 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 43l) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet und die erhaltene Kultur zu einer 4 g Cortison, in 40 ml Dimethylformamid gelöst, enthaltenden Lö sung hinzugegeben.
Die die Steroid-Verbindung ent- haltende Kultur wird unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetabextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Die Analyse einer Probe des zurückbleibenden Mate rials durch Papierchromatographie und anschliessende Messung der Ultraviolett-Absorption des in den bei den getrennten Zonen, die in dem Chromatogramm entwickelt wurden, enthaltenen Materials zeigt,
dass das zurückbleibende Material annähernd 3 g nicht umgesetztes Cortison und etwa ein Gramm d1,4- Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion enthält.
Der Hauptteil des nach Eindampfen des Äthyl- acetatextrakts erhaltenen Rückstands wird einer Zwei phasentrennung mit 70d/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige Ver unreinigungen in die Petrolätherphase gehen. Das Methanol wird im Vakuum aus der wässerigen Methanolphase abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand der Papierstreifen chromatographie unterworfen (wobei Aceton als Lö sungsmittel verwendet wird, um dieses Material in der Form von Streifen auf die Papierchromatogramme zu übertragen) unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase für die Entwicklung des Chromatogramms. Die obere, dem Jl-Dehydroderivat entsprechende Zone wird ab geschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papier streifenchromatographie unterworfen.
Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und es werden annähernd 250 mg im wesentlichen reines Al.4-Pregnadien-17a,21-diol-3,11,20-trion erhalten; Smp. 232-236 C.
<I>Beispiel 4</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0004.0035
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g A4-Pregnen-17a,21-diol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben.
Die das Steroid enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stun den bei einer Temperatur von 28 C bebrütet. Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert, und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70 o/cigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden.
Das Methanol wird im Vakuum von der wässerigen Methanolphase abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand wird in Aceton ge löst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als beweglicher Phase entwickelt werden.
Von jedem Chromatogramm werden die oberen, dem 41-Dehydroderivat entsprechenden Zo nen abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen.
Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrock net, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines Al.4-Pregnadien-17a,21-diol- 3,20-dion erhalten; Smp. 230-236 C.
<I>Beispiel 5</I> 20 Liter einer Nährlösung mit folgender Zusam mensetzung werden hergestellt:
EMI0004.0071
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 20 <SEP> 1 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter einer 24 Stunden alten Impfkultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden be brütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g 9ad-Fluoro-d4-pregnen-11j3,17a,21-triol- 3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben.
Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Scbüttein etwa 10 Stunden lang bei einer Tem peratur von 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte wer den vereinigt und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentren- nung mit 70-o/aigem wässerigem Methanol und Petrol- äther unterworfen, wodurch ölige, in der Petroläther- phase lösliche Verunreinigungen entfernt werden.
Das Methanol wird von der wässerigen Methanolphase im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert. Der Äthyl'acetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Chloroform als beweglicher Phase entwickelt werden. Die oberen, dem dl-Dehydroderivat entspre chenden Zonen werden abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unter worfen.
Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne einge dampft. Der Rückstand wird aus Athylacetat-Petrol- äther umkristallisiert, wobei im wesentlichen reines 9 a-Fluoro-dl ,4-pregnadien-11 ss,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird.
Die Acetylierung dieses Materials mit Essigsäureanhydrid in Pyridin ergibt im wesentlichen reines 9a-Fluoro-dl>4-pregnadien-llss,17a,21-triol- 3,20-dion-21-acetat vom Smp. 236 C.
<I>Beispiel 6</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0005.0017
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>100M1</B>
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikro organismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-1lss,21- diol-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid hinzuge geben.
Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kul tur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden lang bei einer Temperatur von etwa 28 C bebrütet.
Das durch die Dehydrierungsaktivität von Bacillus sphaericus-Mikroorganismen gebildete 41A-Steroid wird mit Äthylacetat aus der Gärflüssigkeit extrahiert und gereinigt im wesentlichen unter Anwendung des selben Reinigungsverfahrens wie das oben in Beispiel 4 angegebene, einschliesslich (1) Zweiphasentrennung mit Petroläther und Methanol, um petrolätherlösliche ölige Verunreinigungen zu entfernen, (2) Papier streifenchromatographie unter Verwendung von Formamid als stationärer Phase und Benzol als be weglicher Phase und (3)
Umkristallisieren aus Äthyl- acetat-Petroläther, um im wesentlichen reines Al,4- Pregnadien-llss,21-diol-3,20-dion zu erhalten; Smp. 231-234 C.<I>Beispiel 7</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0005.0043
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter eines 24 Stunden alten Wachstums. des Mikro organismus Baeillus sphaericus (MB 431) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kul tur wird .eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-21-ol-3,20- dion in 40 n41 Dimethylformamid hinzugegeben. Die die Steroid'-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 10 Stun den bei einer Temperatur von annähernd 28 C be brütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl- acetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol wird im Vakuum von der wässerigen Methanolphase abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft, der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Verwen- dung von 50 %. Methanol'-Formamid als stationärer Phase und 50 /o Benzol-Cyclohexan als beweglicher Phase entwickelt werden.
Die oberen, dem dl-De- hydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromato- gramms werden abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines 41.4-Pregnadien-21-ol-3,20- dion erhalten; Smp. 191-193 C.
<I>Beispiel 8</I> 50 ml einer Nährlösung mit der folgenden Zu sammensetzung werden hergestellt:
EMI0005.0094
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,25 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 0,05 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 50 <SEP> ml Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa 2,5 bis 5 ml einer Kultur, die durch Bebrüten von Bacillus sphaericus-Mikroorganismen in derselben Lösung während 24 Stunden bei 28 C erhalten wurde, ge impft; die geimpfte Kultur wird dann bei einer Tem peratur von 28 C unter Schütteln während einer Zeit dauer von 24 Stunden bebrütet.
Zu der erhaltenen Kultur wird eine 10 mg 44-Pregnen-11ss-ol-3,20-dion in 0,1 ml Dimethylformamid enthaltende Lösung ge geben. Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Schütteln während einer Zeitdauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum auf ein Volumen von etwa 5 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird dann zur Herstellung von Papierstreifenchro- matogrammen benutzt, die unter Verwendung von 50 /c. Methanol-Formamid als stationärer flüssiger Phase und 501/u Benzol-Cyclohexan als beweglicher flüssiger Phase entwickelt werden.
Zwei Zonen wer den festgehalten, von denen eine (entsprechend der beweglicheren Komponente) das für llss-Hydroxy- progesteron charakteristische Absorptionsmaximum im Utraviolett zeigt und die andere (weniger beweg liche Komponente) ein Absorptionsmaximum im Ultraviolett bei etwa 241 mAc. Das Papierchromato- gramm wird getrocknet und die der weniger beweg lichen Komponente entsprechende Zone abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifen chromatographie unterworfen, wobei das vorher ver wendete Lösungsmittelsystem benutzt wird.
Das erhal tene Chromatogramm zeigt nur eine Spur der dem llss-Hydroxy-progesteron (Ausgangsmaterial) ent sprechenden Zone. Das Papierchromatogramm wird gründlich getrocknet, die grössere Zone, die ein Ab sorptionsmaximum im Ultraviolett bei 241 m/,c hat, wird abgeschnitten und mit Methanol extrahiert. Der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne einge dampft und di.4-Pregnadien-llss-ol-3,20-dion er halten.
<I>Beispiel 9</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zu sammensetzung werden hergestellt:
EMI0006.0029
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>1001111</B>
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Litereines 24 Stunden asten Wachstums des Mikro organismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g 44-Pregnen-3,20-dion in 40 ml Dimethylformamid gegeben.
Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von annähernd 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthyl acetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70 /oigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen :entfernt werden.
Das Methanol wird von der wässerigen Methanolphase im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässerige Aufschlämmung mit Athylacetat extrahiert. Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Ver wendung von 50 1/o Methanol-Formamid als stationä rer Phase und 50,119 Benzol-Cyclohexan als beweg licher Phase entwickelt werden.
Die oberen, dem 41-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten, mit Methanol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Material wieder der Papierstreifenchromatographie unterwor fen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanolextrakt im Vakuum zur Trockne ein gedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat- Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines 41.4-Pregnadien-3,20-dion erhalten; Smp. 148 bis 150 C.
<I>Beispiel 10</I> 20 Liter einer Nährlösung mit der folgenden Zusammensetzung werden hergestellt:
EMI0006.0070
Cerelose <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Getreideaufschlämmung <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> Hefeextrakt <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> mit <SEP> destilliertem <SEP> Wasser <SEP> aufgefüllt <SEP> auf <SEP> 201 Diese Lösung wird mit KOH auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt, sterilisiert und mit etwa einem Liter eines 24 Stunden alten Wachstums des Mikro organismus Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und zu der erhaltenen Kultur wird eine Lösung von 4 g d3-Pregnen-3-ol-20-on in 40 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die die Steroid-Verbindungen enthal tende Kultur wird unter Schütteln etwa 10 Stunden bei einer Temperatur von annähernd 28 C bebrütet.
Die Gärflüssigkeit wird wiederholt mit Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatextrakte werden ver einigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird einer Zweiphasentrennung mit 70o/aigem wässerigem Methanol und Petroläther unterworfen, wodurch ölige, in der Petrolätherphase lösliche Verunreinigungen entfernt werden. Das Methanol wird von der wässerigen Methanolphase im Vakuum abgedampft und die zurückbleibende wässe rige Aufschlämmung mit Äthylacetat extrahiert.
Der Äthylacetatextrakt wird im Vakuum zur Trockne ein gedampft und der Rückstand in Aceton gelöst und auf Papierchromatogramme gebracht, die unter Ver- wendung von 50%, Methanol-Formamid als statio- närer Phase und 50 /a Benzol-Cyclohexan als beweg licher Phase entwickelt werden.
Die oberen, dem dl-Dehydroderivat entsprechenden Zonen jedes Chromatogramms werden abgeschnitten, mit Metha nol extrahiert und das mit Methanol extrahierte Mate rial wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterworfen. Die obere Zone wird wieder abge schnitten, gründlich getrocknet, mit Methanol extra hiert und der Methanolextrakt wird im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat - Petroläther umkristallisiert und im wesentlichen reines Jl,\\-Pregnadien-3,20-dion erhal ten; Smp. 148-150,C.
<I>Beispiel 11</I> 50 cm3, jeder der sieben verschiedenen Nährlösun gen mit Zusammensetzungen, wie sie in der nach stehenden Tabelle angegeben sind, werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven steri lisiert, und jede Lösung wird mit einer Kultur von Bacillus sphaericus (MB 431) geimpft. Die geimpften Kulturen werden bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu jeder der erhaltenen Kulturen wird eine Lösung von.
10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltenden Kulturen werden dann unter Schütteln für eine wei tere Dauer von etwa 24 Stunden bei 28 C bebrütet.
Jede einzelne so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Athylacetat extrahiert und die jeweils einer Flüssigkeit entsprechenden, aus einer besonderen Lösung stammenden Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne einge dampft. Jede der sieben so erhaltenen Rückstände wird polarographisch auf seinen Gehalt an 41,4-Pre- gnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird.
In der folgenden Tabelle sind die Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen und die Menge an 41,4- Pregnadien-11ss,17a,21-triol - 3,20 - dion (dl-Hydro- cortison), die mit jeder derartigen Lösung erhalten wurde, in Prozenten der theoretischen Ausbeute ange geben.
EMI0007.0032
Ausbeute <SEP> an
<tb> Nr. <SEP> Zusammensetzung <SEP> der <SEP> Lösung <SEP> dl-Hydrocortison
<tb> der <SEP> Theorie
<tb> 1 <SEP> wie <SEP> Beispiel <SEP> 1 <SEP> 3711/o2 <SEP> 2'0l0 <SEP> lösliche <SEP> Destillationsrückstände <SEP> 37114,
<tb> 3 <SEP> 2% <SEP> HCl-Kaseinhydrolysat <SEP> 440/a
<tb> 4 <SEP> 1%
<tb> 31%
<tb> l <SEP> % <SEP> Sojamehl
<tb> 5 <SEP> 2%.
<SEP> Fischmehl <SEP> 30%
<tb> 6 <SEP> 2% <SEP> Getreideaufschlämmung <SEP> 34%
<tb> 7 <SEP> 2%- <SEP> Tankrückstände <SEP> 26% <I>Beispiel 12</I> 10 mg f4-Pregnen-llss,17a,21-triol-3,20-dion werden der Einwirkung einer Bacillus-sphaericus- Kultur (MB 431) ausgesetzt und das dehydrierte Produkt gemäss dem bei der Dehydrierung von d4- Pregnen-llss-ol-3,20-dion oben in Beispiel 8 be schriebenen Verfahren isoliert, wodurch 41,4-Pre- gnadien-11/3,17a,21-triol-3,20-dion erhalten wird.
<I>Beispiel 13</I> 10 mg A4-Androsten-3,20-dion werden der Ein wirkung von Bacillus sphaericus (MB 431) Mikro- oganis@men ausgesetzt und das dehydrierte Produkt gemäss dem bei der Dehydrierung von 44-Pregnen- llss-ol-3,20-dion oben in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren isoliert, wodurch 41,4-And'rostadien-3,20- dion erhalten wird.
<I>Beispiel 14</I> 50 ml der in Beispiel 8 beschriebenen Edamin- lösung werden auf einen pH-Wert von 7 .eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven sterilisiert und die sterilisierte Lösung mit Bacillus sphaericus (A. T. C. C.-245) geimpft. Die geimpfte Kultur wird bei einer Tempe ratur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und die erhaltene Kultur zu einer Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylform- amid hinzugegeben.
Die das Hydrocortison enthal tenden Kulturen werden dann unter Schütteln für eine weitere Dauer von .etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetat- extrakte vereinigt und im Vakuum zur Trockne ein gedampft. Der .so erhaltene Rückstand wird polaro- graphisch analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird, und enthält eine Menge an 41,4-Pregnadien-llss,17a,21-triol-3,20-dion, die einer Ausbeute von mehr als 50'a/9 der theoretischen entspricht.
<I>Beispiel 15</I> 50 ml der oben in Beispiel 8 beschriebenen Edaminlösung werden auf einen pH-Wert von 7 ein gestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120" C in einem Autoklaven sterilisiert und die sterili- sierte Lösung wird mit Bacillus sphaericus (A.T.C.C.- 7054) (Abart fusiformis, manchmal auch Bacillus fusiformis bezeichnet) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und dann eine Lösung von 10 mg Hydrocortison in 0,1 ml Dimethylformamid hinzugegeben. Die das Hydrocortison enthaltende Kultur wird dann unter Schütteln für eine weitere Dauer von etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetat- extrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird, und es wird ein Gehalt an dl.4-Pregnadien-Ilss,17a,21-triol-3,20-dion gefunden, der einer Ausbeute von über<B>5001a</B> der theoretisch aus 10 mg Hydrocortison als Ausgangs material erhältlichen entspricht.
<I>Beispiel 16</I> 50 ml der in Beispiel 8 beschriebenen Edamin- lösung werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt, durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven sterilisiert, die sterilisierte Lö sung mit Baeillus sphaericus (A. T. C. C.-7055) geimpft.
Die geimpfte Kultur wird bei einer Tempe ratur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet und zu der erhaltenen Kultur eine Lösung von 10 mg 9a-Fluoro-d4-pregnen-llss,17a,21-triol- 3,20-dion in 0,1 ml Dimethyl-formamid _ hinzuge geben. Die die Steroid-Verbindung enthaltende Kul tur wird unter Schütteln ;etwa 10 Stunden bei 28 C bebrütet.
Die so erhaltene Gärflüssigkeit wird dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, die Äthylacetat- extrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft.
Der so erhaltene Rückstand wird polarographisch analysiert, indem die halbe Welle bei 1,52 Volt gemessen wird, und es. wird ein Gehalt an 9a-Fluoro-d1#4-pregnadien-llss,17a,21- triol-3,20-dion gefunden, der einer Ausbeute von über 50% der theoretischen entspricht. <I>Beispiel 17</I> 13 Teile der in Beispiel 8 beschriebenen Edamin- lösung zu je 50 ml werden auf einen pH-Wert von 7 eingestellt,
durch 15 Minuten langes Erhitzen auf etwa 120 C in einem Autoklaven sterilisiert und jede der sterilisierten Lösungen wird mit einer Kultur von Bacillus sphaericus (MB 834) geimpft. Die geimpften Kulturen werden bei einer Temperatur von 28 C unter Schütteln etwa 24 Stunden bebrütet, und jede der dreizehn erhaltenen Kulturen wird mit einer Lö sung von 10 mg eines der in der nachstehenden Tabelle angeführten 3-Hydroxy- oder 3-Keto-steroide in 0,1 ml Dimethylformamid versetzt.
Die die 3-Keto- steroide enthaltenden Kulturen werden dann unter Schütteln für eine weitere Dauer von etwa 10 Stun den bebrütet.
Jede der so erhaltenen Gärflüssigkeiten wird für sich dreimal mit je 50 ml Äthylacetat extrahiert, und die drei Äthylacetatextrakte werden vereinigt und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Jeder der so erhaltenen dreizehn Rückstände wird in Aceton ge löst und auf Papierchromatogramme gebracht, von denen jedes unter Verwendung der in der hier fol genden Tabelle angegebenen Lösungsmittelsysteme entwickelt wird.
Die oberen, den d1-Dehydroderivaten entspre chenden Zonen jedes Chromatogramms werden ab geschnitten, jede für sich mit Methanol extrahiert, und das mit Methanol extrahierte Material wird wieder der Papierstreifenchromatographie unterwor fen. Die obere Zone wird wieder abgeschnitten, dann- getrocknet, mit Methanol extrahiert und der Methanol extrakt im Vakuum zur Trockne eingedampft. In der folgenden Tabelle sind ebenfalls die erhaltenen dl.4- 3-Keto-steroide angeführt.
EMI0008.0061
EMI0009.0001
Method for Dehydrating Steroids The invention relates to a method for introducing a double bond between the carbon atoms C1 and C2 of steroids by means of microorganisms of the genus Bacillus or corresponding enzymes.
The method is particularly suitable for the transfer of d4-3-keto-steroids, such as J4-pregnen-3,11,20-trione-17a, 21-diol and A4-pregnen-3,20-dione-11ss, 17a , 21-triol, into the corresponding J1.4-3-keto-steroids, e.g.
B. 4l, 4-pregnadiene-3,11,20-trione-17a, 21-diol or d1.4-pregnadiene-3,20-dione-11 / 3,17a, 21-triol. These latter compounds have cortisone activity, but differ from cortisone in that they are essentially free from undesirable side effects, such as edema formation, since they do not cause any noticeable retention of sodium or water.
The chemical preparation of 41,4-3-keto steroids has so far been unsatisfactory because the chemical reactions that take place lead to mixtures of different compounds. Separation of the intermediate and end products from such mixtures is costly and leads to low yields of the desired 41,4-3-keto steroids.
In the present process, the formation of undesirable by-products is largely avoided, and z. B.: dl # 4-3-keto-pregnadienes directly and with high yield from the corresponding J-4-3-keto-pregnenes.
Dehydration works particularly well with the species Bacillus sphaericus. The species Bacillus sphaericus, as defined in Bergey's Manual for Determinative Bacteriology, 6th Edition, comprises several species, such as the rotans, the fusiformus, etc .;
in some compilations these varieties are mentioned under the species names Bacillus rotans and Bacillus fusiformis. These microorganisms can, for example, from the American Type Culture Collection, Washington, D.C. B. isolated from the ground by known methods.
As mentioned, dehydration can be carried out both with microorganism cultures and with the relevant isolated enzyme systems.
The method according to the invention can generally be applied to 3-keto-steroids, regardless of the substituents or the degree of unsaturation of the rings B, C and D >
Particularly suitable starting materials, however, are 3-keto-steroids and also 3-oxy-steroids with a double bond starting from the carbon atom 5, for example 44-3-keto-pregnen compounds and corresponding 9-halogen derivatives, such as 9-halogen-44 - Pregnen-3,20-dione-17,21-diol, 9-fluoro-d4-pregnen-3,20-dione-17a,
21-diol and the like. Instead of d4-3-ketopregnene compounds, other C5-unsaturated 3-oxygen-containing steroids can be used as starting materials, for example 45-3-oxy-pregnene compounds such as 45-pregnen-20-one-3-ol and d5 esterified with lower alkanearboxylic acids -3-oxy pregnene, e.g.
B. 45-pregnen-20-on-3-ol. These d5-3 oxy- and acyloxy-pregnenes are converted into the corresponding 41.4-3-keto-pregnadienes by the dehydrogenation, it being assumed that the 44-3-keto-pregnenes are primarily formed.
In the abovementioned starting materials, the oxy group in the 3- and / or 21-position is usually esterified with acetic acid; But there are also esters of other lower carboxylic acids, such as propionates, butyrates, tert. Butyl acetates, benzoates and the like, in question.
Furthermore, 3-keto-pregnanes or 3-hydroxy-pregnanes, such as pregnan-3,20-dione, pregnan-3,20-dione-17a-01, pregnan-3,20-dione-21-ol, pregnan -3,20-dione-17a, 21-diol and similar Liche can be used, the hydroxyl group in the 3- and / or 21-position can also be esterified in the specified manner.
The dehydration can be done so that the steroid as a solid or in a solvent, e.g. B. a dialkyl ketone such as acetone, a dialkyl formamide such as dimethylformamide and the like, dissolved, added under sterile conditions to a culture of the microorganisms in a nutrient solution and by shaking the mixture formed. The steroid can be added to the nutrient solution at the same time as inoculation, or it can be added to an already developed culture.
The microorganisms can also be filtered off from the nutrient solution, washed with distilled water, then suspended in a buffered aqueous solution containing the steroid and the resulting mixture shaken or stirred. In this case, the de-hydrogenated steroid can be isolated more easily than if the dehydration takes place directly in the microorganism culture.
The same nutrient solutions can be used for the cultivation of the microorganisms as they are usually used for the cultivation of bacilli. Normally, these nutrient solutions contain nitrogen and carbon supplying substances, inorganic salts and possibly growth substances. The carbon can be provided by compounds such as acetates, lactates and the like.
Carbohydrates are poorly exploited by Bacilius sphaericus and they may be present or absent from the solution without seriously affecting steroid dehydration.
The following can serve as nitrogen suppliers: ammonium salts and amino acids or proteins containing products such as soybeans, oats, yeast, yeast extracts, breakdown products of casein, meat extract, blood meal, protein, meat and bone waste, salmon meal, soluble fish waste, soluble distillation residues and the like .
The bacilli can possibly be cultivated with proteins (or amino acids) alone without carbohydrates; in this case, the proteins or amino acids supply both the carbon and the nitrogen required by the microorganisms. It is usually preferred to add the steroids to be dehydrated to a 24 hour old culture of Bacillus sphaericus. The cheapest amount of the steroid depends u. a. on the nature of the same; after all, the steroid is preferably used in a concentration of about 0.005111a to 0.204.
The culture containing the steroid is then preferably shaken or stirred for about 10 and 50 hours. In view of the fact that prolonged fermentation can lead to the decomposition of part of the dehydrated steroid, fermentation is usually not carried out for more than 24 hours at the most. After the end of the dehydration, the product from the fermentation liquid is expediently medium by extraction with a water-immiscible solvent, such as.
B. a chlorinated hydrocarbon, such as chloroform, a ketone, example, methyl isobutyl ketone, an alkyl alkanoate, for example ethyl acetate and the like isolated. The extract, which may contain unreacted starting material, is expediently purified by chromatography using silica gel, activated aluminum oxide and the like, or by means of descending paper chromatograms. After the unreacted starting material has been separated off, the product can be purified further, e.g.
B. by recrystallization from a Lö solvent such. B. ethyl acetate, ethyl acetate-petroleum ether and the like.
According to the process according to the invention, d4-3-keto-, A5-3-oxy- and 45-3-acyloxy- pregnenen u. a. make the following 41.4-pregnadienes:
dl.4-3-keto-pregnadienes, such as 41,4-pregnadiene-3,20-dione, dl # 4-pregnadien-3,20-dione-17a-ol, dl.4-pregnadiene-3,20-dione -21-ol, d1.4-Pregnadien-3,20-dione-17a, 21-diol, A1,4_pregnadien-3,20-dione-17a-ol-2l-al, 41.4-Pregnadiene-3,11,20 -trione, d1,4-pregnadien-3,11,20-trione-17a-ol, dl # 4-pregnadien-3,11,20-trione-21-ol, 41.4-pregnadien-3,11,20-trione -17a, 21-diol, Al, 4-pregnadien-3,11,20-trione-17a-ol-21-al, dl> 4-pregnadien-3,
20-dione-11 ss-ol, 41.4-Pregnadien-3,20-dione-1 l ss-ol-21-al, 41.4-Pregnad'ien-3,20-dione-1 l ss, 21-diol, d1 , 4-Pregnadien-3,20-d'ion-1 lss, 17a-diol, dl, 4-pregnadiene-3,20-d'ion-1 lss, 17a, 21-triol, 9-halo-d1 , 4-3-keto-pregnadienes, such as 9-halo-41.4-pregnadiene-3,20-dione-17,21-diol, 9-fluoro-41.4-pregnadiene-3,20-dione-17a, 21-diol, 9-halo-d1,4-pregnadiene-3,20-dione-17,11,21-triol,
9-halo-41,4-pregnadiene-3,11,20-trione-17,21-diol, 9-fluoro-41,4-pregnadiene-3,11,20-trione-17a, 21-diol, 9- Fluoro-41,4-pregnadiene-3,20-dione-Ilss, 17a, 21-triol and the like.
<I> Example 1 </I> 50 cm3 of a nutrient solution of the following composition are produced:
EMI0002.0107
Cerelose <SEP> (commercially available <SEP> dextrose) <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP> (commercially available <SEP> Laktalbu min excerpt <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.25 <SEP> cm3
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> filled up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 50 <SEP> cm3 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with approx. 5 to 5 cm3 of a culture obtained by incubating Bacillus sphaericus (MB 431) in the same solution for 24 hours at 28, inoculated; the inoculated solution is then. incubated at a temperature of 28 with shaking for 24 hours.
A solution containing 10 mg of hydrocortisone (J4-Pregnen-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione) dissolved in 0.1 cm3 of dimethylformamide is added to the culture obtained. The culture containing the steroid 'compound is then incubated at 28 with shaking for a period of about 10 hours.
The fermentation liquid is extracted three times with 50 em3 ethyl acetate each time, and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to a volume of about 5 em3: in a vacuum. The concentrated solution is then used to produce paper strip chromatograms, which are developed using formamide as the stationary liquid phase and chloroform as the mobile liquid phase.
Two zones can be identified, of which one (corresponding to the more mobile component) shows the absorption maximum in the ultraviolet characteristic of hydrocortisone and the other (the less mobile component) shows an absorption maximum in the ultraviolet at around <I> 242 </I> mu . shows. The paper chromatogram is dried and the zone corresponding to the 242 mp absorption is cut off and extracted with methanol.
The material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography, paper that has been extracted with methanol for 48 hours and the previously used chloroform-formamide system being used. The chromatogram obtained shows only a trace of a zone corresponding to the starting material hydrocortisone, while the larger zone has an absorption maximum in the ultraviolet of <I> 242 </I> m, y. The paper chromatogram is dried thoroughly and the zone corresponding to the 242 my absorption maximum is cut off and extracted with methanol.
The methanol extract is evaporated to dryness in a vacuum and gives A1.4-pregnadiene-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione.
<I> Example 2 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are produced: Cerelose. . . . . . . . 400 g edamin. . . . . . . . 400 g of grain slurry. . . . 100 ml yeast extract. . . . . . . . 20 g made up to 201 with distilled water. This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and inoculated with about one liter of a 24 hour old inoculation culture of Bacillus sphaericus (MB 431).
The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of about 24 hours, and a solution of 4 g of hydrocortisone in 40 ml of diethylformamide is added to the culture obtained. The culture containing the steroid is incubated with shaking for an additional period of about 10 hours at 28 ° C.
The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate, and the ethyl acetate extracts are combined .and evaporated to dryness in vacuo. A sample of the residue is dissolved in acetone and spotted on a paper chromatogram which is developed using formamide as the stationary phase and chloroform as the mobile phase.
Two separate zones are obtained; the lower zone corresponding to the unreacted hydrocortisone is cut off, the other zone corresponding to the A'-dehydro derivative is also cut off and eluted with methanol. The ultraviolet absorption analysis of this methanol eluate shows that the upper zone contains 1 g of 41,4-pregnadiene-11,17,21 = triol-3; 20-dione.
The main part of the residue obtained after evaporation of the ethyl acetate extract is subjected to a two phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, whereby oily impurities go into the petroleum ether phase. The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo, and the remaining aqueous slurry is extracted with ethyl acetate.
The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in acetone and subjected to paper strip chromatography using formamide as the stationary phase and chloroform as the mobile phase. The upper zone, corresponding to the A'-dehydro derivative, is cut off, extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography. The upper zone is cut off again, dried thoroughly, extracted with methanol and the methanol extract evaporated to dryness in a vacuum.
The remaining material is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether; approximately 200 mg of essentially pure d1.4-pregnadiene-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione will be obtained; M.p. 222-228 C.
<I> Example 3 </I> 20 liters of a nutrient solution of the following composition are prepared:
EMI0003.0082
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400.g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> made up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 20 <SEP> 1 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter a 24 hour old inoculum of Bacillus sphaericus (MB 43l). The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of about 24 hours and the culture obtained is added to a solution containing 4 g of cortisone dissolved in 40 ml of dimethylformamide.
The culture containing the steroid compound is incubated at 28 ° C. with shaking for a period of about 10 hours.
The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate, and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. Analysis of a sample of the remaining material by paper chromatography and subsequent measurement of the ultraviolet absorption of the material contained in the separate zones developed in the chromatogram shows
that the remaining material contains approximately 3 g of unreacted cortisone and about one gram of d1,4-pregnadiene-17a, 21-diol-3,11,20-trione.
The main part of the residue obtained after evaporation of the ethyl acetate extract is subjected to a two-phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, whereby oily impurities go into the petroleum ether phase. The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo and the aqueous slurry that remains is extracted with ethyl acetate.
The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo and the residue is chromatographed on the paper strips (acetone is used as the solvent to transfer this material in the form of strips to the paper chromatograms) using formamide as the stationary phase and benzene as the mobile phase for the development of the chromatogram. The upper zone corresponding to the Jl-dehydro derivative is cut off, extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography.
The upper zone is cut off again, thoroughly dried, extracted with methanol and the methanol extract evaporated to dryness in vacuo. The residue is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether and approximately 250 mg of essentially pure Al.4-pregnadiene-17a, 21-diol-3,11,20-trione are obtained; 232-236 C.
<I> Example 4 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are produced:
EMI0004.0035
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> filled up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 201 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter of a 24 hour old Inoculated culture of Bacillus sphaericus (MB 431). The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of about 24 hours, and a solution of 4 g of A4-pregnen-17a, 21-diol-3,20-dione in 40 ml of dimethylformamide were added.
The culture containing the steroid is incubated for about 10 hours at a temperature of 28 C with shaking. The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate, and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is subjected to a two-phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, whereby oily impurities which are soluble in the petroleum ether phase are removed.
The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo and the aqueous slurry that remains is extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo and the residue is dissolved in acetone and transferred to paper chromatograms which are developed using formamide as the stationary phase and benzene as the mobile phase.
The upper zones corresponding to the 41-dehydro derivative are cut off from each chromatogram, extracted with methanol, and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography.
The upper zone is cut off again, thoroughly dried, extracted with methanol and the methanol extract is evaporated to dryness in vacuo. The residue is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether and essentially pure Al.4-pregnadiene-17a, 21-diol-3,20-dione is obtained; M.p. 230-236 C.
<I> Example 5 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are produced:
EMI0004.0071
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> made up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 20 <SEP> 1 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter a 24 hour old inoculum of Bacillus sphaericus (MB 431). The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of about 24 hours, and a solution of 4 g of 9ad-fluoro-d4-pregnen-11j3,17a, 21-triol-3 is added to the culture obtained , 20-dione in 40 ml of dimethylformamide was added.
The culture containing the steroid compound is incubated for about 10 hours at a temperature of 28 ° C. under shaking.
The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is subjected to a two-phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, as a result of which oily impurities which are soluble in the petroleum ether phase are removed.
The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo and the remaining aqueous slurry is extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo and the residue is dissolved in acetone and applied to paper chromatograms which are developed using formamide as the stationary phase and chloroform as the mobile phase. The upper, the dl-dehydroderivat corre sponding zones are cut off, extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to the paper strip chromatography.
The upper zone is cut off again, dried thoroughly, extracted with methanol and the methanol extract is evaporated to dryness in vacuo. The residue is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether, essentially pure 9α-fluoro-dl, 4-pregnadiene-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione being obtained.
Acetylation of this material with acetic anhydride in pyridine gives essentially pure 9a-fluoro-dl> 4-pregnadiene-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione-21-acetate of m.p. 236 C.
<I> Example 6 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are produced:
EMI0005.0017
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 100M1 </B>
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> made up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 201 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter of a 24 hour old Growth of the microorganism Bacillus sphaericus (MB 431) inoculated. The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of about 24 hours, and a solution of 4 g of 44-pregnen-1lss, 21-diol-3,20-dione in 40 ml is added to the culture obtained Add dimethylformamide.
The culture containing the steroid compound is incubated for about 10 hours at a temperature of about 28 C with shaking.
The 41A steroid formed by the dehydrating activity of Bacillus sphaericus microorganisms is extracted from the fermentation liquor with ethyl acetate and purified using essentially the same purification procedure as that given in Example 4 above, including (1) two-phase separation with petroleum ether and methanol to give petroleum ether-soluble oily ones Remove impurities, (2) paper strip chromatography using formamide as the stationary phase and benzene as the movable phase and (3)
Recrystallization from ethyl acetate-petroleum ether in order to obtain essentially pure Al, 4-pregnadiene-llss, 21-diol-3,20-dione; Mp. 231-234 C. <I> Example 7 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are prepared:
EMI0005.0043
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 20 <SEP> g
<tb> made up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 201 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter of a 24 hour old Growth. of the microorganism Baeillus sphaericus (MB 431).
The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of about 24 hours, and the resulting culture becomes .a solution of 4 g of 44-pregnen-21-ol-3,20-dione in 40 n41 Dimethylformamide added. The culture containing the steroid compound is incubated with shaking for a period of about 10 hours at a temperature of approximately 28 ° C.
The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is subjected to a two-phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, whereby oily impurities which are soluble in the petroleum ether phase are removed. The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo and the aqueous slurry that remains is extracted with ethyl acetate.
The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo, the residue is dissolved in acetone and applied to paper chromatograms using 50%. Methanol'-formamide as the stationary phase and 50 / o benzene-cyclohexane as the mobile phase are developed.
The upper zones of each chromatogram corresponding to the dl-dehydroderivative are cut off, extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography. The upper zone is cut off again, thoroughly dried, extracted with methanol and the methanol extract evaporated to dryness in vacuo.
The residue is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether and essentially pure 41.4-pregnadien-21-ol-3,20-dione is obtained; 191-193 C.
<I> Example 8 </I> 50 ml of a nutrient solution with the following composition are prepared:
EMI0005.0094
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 0.25 <SEP> ml
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 0.05 <SEP> g
<tb> filled up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 50 <SEP> ml This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with approx. 5 to 5 ml of a culture obtained by incubating Bacillus sphaericus microorganisms in the same solution for 24 hours at 28 C, inoculated; the inoculated culture is then incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for a period of 24 hours.
A solution containing 10 mg of 44-pregnen-11ss-ol-3,20-dione in 0.1 ml of dimethylformamide is added to the culture obtained. The culture containing the steroid compound is incubated with shaking for a period of about 10 hours at 28 ° C.
The fermentation liquid is extracted three times with 50 ml of ethyl acetate each time and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to a volume of about 5 ml in vacuo. The concentrated solution is then used to produce paper strip chromatograms, which are calculated using 50 / c. Methanol-formamide as the stationary liquid phase and 501 / u benzene-cyclohexane as the mobile liquid phase are developed.
Two zones are recorded, one of which (corresponding to the more mobile component) shows the absorption maximum in the ultraviolet characteristic of llss-hydroxy-progesterone and the other (less mobile component) shows an absorption maximum in the ultraviolet at around 241 mAc. The paper chromatogram is dried and the zone corresponding to the less mobile component is cut off and extracted with methanol. The material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography using the solvent system previously used.
The chromatogram obtained shows only a trace of the zone corresponding to the llss-hydroxy-progesterone (starting material). The paper chromatogram is dried thoroughly, the larger zone, which has a maximum absorption in the ultraviolet at 241 m /, c, is cut off and extracted with methanol. The methanol extract is evaporated to dryness in a vacuum and di.4-Pregnadien-llss-ol-3,20-dione is kept.
<I> Example 9 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are produced:
EMI0006.0029
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> <B> 1001111 </B>
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> made up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 201 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter of a 24 hour growth of the microorganism Bacillus sphaericus (MB 431). The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for about 24 hours, and a solution of 4 g of 44-pregnene-3,20-dione in 40 ml of dimethylformamide is added to the culture obtained.
The culture containing the steroid compound is incubated with shaking for about 10 hours at a temperature of approximately 28 ° C.
The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue is subjected to a two-phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, as a result of which oily impurities which are soluble in the petroleum ether phase are removed.
The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo and the remaining aqueous slurry is extracted with ethyl acetate. The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo and the residue is dissolved in acetone and applied to paper chromatograms, which are developed using 50 1 / o methanol-formamide as the stationary phase and 50.119 benzene-cyclohexane as the mobile phase.
The upper zones of each chromatogram corresponding to the 41-dehydro derivative are cut off, extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography. The upper zone is cut off again, dried thoroughly, extracted with methanol and the methanol extract is evaporated to dryness in a vacuum. The residue is recrystallized from ethyl acetate-petroleum ether and essentially pure 41.4-pregnadiene-3,20-dione is obtained; M.p. 148 to 150 C.
<I> Example 10 </I> 20 liters of a nutrient solution with the following composition are produced:
EMI0006.0070
Cerelose <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Edamin <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 400 <SEP> g
<tb> Grain slurry <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP> 100 <SEP> ml
<tb> yeast extract <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>. <SEP>.
<SEP> 20 <SEP> g
<tb> made up with <SEP> distilled <SEP> water <SEP> <SEP> to <SEP> 201 This solution is adjusted to a pH value of 6.5 with KOH, sterilized and with about one liter of a 24 hour old Growth of the microorganism Bacillus sphaericus (MB 431) inoculated.
The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for about 24 hours, and a solution of 4 g of d3-pregnen-3-ol-20-one in 40 ml of dimethylformamide is added to the culture obtained. The culture containing the steroid compounds is incubated for about 10 hours at a temperature of approximately 28 ° C. with shaking.
The fermentation liquid is extracted repeatedly with ethyl acetate and the ethyl acetate extracts are combined ver and evaporated to dryness in vacuo. The residue is subjected to a two-phase separation with 70% aqueous methanol and petroleum ether, whereby oily impurities which are soluble in the petroleum ether phase are removed. The methanol is evaporated from the aqueous methanol phase in vacuo and the remaining aqueous slurry is extracted with ethyl acetate.
The ethyl acetate extract is evaporated to dryness in vacuo and the residue is dissolved in acetone and transferred to paper chromatograms which are developed using 50% methanol-formamide as the stationary phase and 50% benzene-cyclohexane as the mobile phase .
The upper zones of each chromatogram corresponding to the dl-dehydro derivative are cut off, extracted with methanol and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography. The upper zone is cut off again, dried thoroughly, extracted with methanol and the methanol extract is evaporated to dryness in vacuo. The residue is recrystallized from ethyl acetate - petroleum ether and essentially pure Jl, \\ - Pregnadiene-3,20-dione obtained; M.p. 148-150, C.
<I> Example 11 </I> 50 cm3, each of the seven different nutrient solutions with compositions as given in the table below, are adjusted to a pH of 7 by heating at about 120 ° C. for 15 minutes Sterilized in an autoclave, and each solution is inoculated with a culture of Bacillus sphaericus (MB 431). The inoculated cultures are incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for about 24 hours, and a solution of is added to each of the cultures obtained.
10 mg hydrocortisone in 0.1 ml dimethylformamide was added. The cultures containing the hydrocortisone are then incubated with shaking for a further period of about 24 hours at 28 ° C.
Each individual fermentation liquid obtained in this way is extracted three times with 50 ml of ethyl acetate each time and the ethyl acetate extracts corresponding to a liquid and originating from a special solution are combined and evaporated to dryness in vacuo. Each of the seven residues obtained in this way is polarographically analyzed for its content of 41,4-pregnadiene-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione by measuring the half-wave at 1.52 volts.
The following table shows the compositions of the solutions used and the amount of 41,4-pregnadiene-11ss, 17a, 21-triol-3,20-dione (dl-hydrocortisone) obtained with each such solution in Enter percent of the theoretical yield.
EMI0007.0032
Yield <SEP>
<tb> No. <SEP> Composition <SEP> of the <SEP> solution <SEP> dl-hydrocortisone
<tb> of the <SEP> theory
<tb> 1 <SEP> like <SEP> example <SEP> 1 <SEP> 3711 / o2 <SEP> 2'0l0 <SEP> soluble <SEP> distillation residues <SEP> 37114,
<tb> 3 <SEP> 2% <SEP> HCl casein hydrolyzate <SEP> 440 / a
<tb> 4 <SEP> 1%
<tb> 31%
<tb> l <SEP>% <SEP> soy flour
<tb> 5 <SEP> 2%.
<SEP> fish meal <SEP> 30%
<tb> 6 <SEP> 2% <SEP> grain slurry <SEP> 34%
<tb> 7 <SEP> 2% - <SEP> tank residues <SEP> 26% <I> Example 12 </I> 10 mg of f4-pregnen-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione are exposed to the action exposed to a Bacillus sphaericus culture (MB 431) and the dehydrated product is isolated according to the method described above in Example 8 for the dehydrogenation of d4-pregnen-llss-ol-3,20-dione, whereby 41,4-Pre- gnadien-11 / 3,17a, 21-triol-3,20-dione is obtained.
<I> Example 13 </I> 10 mg A4-androstene-3,20-dione are exposed to the action of Bacillus sphaericus (MB 431) microorganisms and the dehydrated product according to the dehydration of 44-pregnen - llss-ol-3,20-dione isolated method described above in Example 8, whereby 41,4-And'rostadien-3,20-dione is obtained.
<I> Example 14 </I> 50 ml of the edamin solution described in Example 8 are adjusted to a pH value of 7, sterilized by heating at about 120 ° C. for 15 minutes in an autoclave and the sterilized solution with Bacillus sphaericus (ATCC-245). The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 C with shaking for about 24 hours and the culture obtained is added to a solution of 10 mg of hydrocortisone in 0.1 ml of dimethylformamide.
The cultures containing the hydrocortisone are then incubated with shaking for a further period of about 10 hours at 28 ° C.
The fermentation liquid obtained in this way is extracted three times with 50 ml of ethyl acetate each time, the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue obtained in this way is analyzed polar graphically by measuring the half wave at 1.52 volts, and contains an amount of 41,4-pregnadiene-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione, the one Yield of more than 50'a / 9 corresponds to the theoretical.
<I> Example 15 </I> 50 ml of the edamine solution described above in example 8 are adjusted to a pH value of 7, sterilized by heating at about 120 ° C. for 15 minutes in an autoclave and the sterilized solution is vaccinated with Bacillus sphaericus (ATCC-7054) (variety fusiformis, sometimes also called Bacillus fusiformis).
The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 C with shaking for about 24 hours and then a solution of 10 mg of hydrocortisone in 0.1 ml of dimethylformamide is added. The culture containing the hydrocortisone is then incubated with shaking for a further period of about 10 hours at 28 ° C.
The fermentation liquid obtained in this way is extracted three times with 50 ml of ethyl acetate each time, the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. The residue obtained in this way is analyzed polarographically by measuring the half-wave at 1.52 volts, and a content of dl.4-pregnadiene-Ilss, 17a, 21-triol-3,20-dione, is found to be that of a yield of over <B> 5001a </B> which corresponds theoretically to that which can be obtained from 10 mg of hydrocortisone as the starting material.
<I> Example 16 </I> 50 ml of the edamin solution described in example 8 are adjusted to a pH value of 7, sterilized by heating for 15 minutes at about 120 ° C. in an autoclave, the sterilized solution with Baeillus sphaericus (ATCC-7055).
The inoculated culture is incubated at a temperature of 28 ° C. with shaking for about 24 hours and a solution of 10 mg of 9a-fluoro-d4-pregnen-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione in 0 to the culture obtained , Add 1 ml dimethylformamide _. The culture containing the steroid compound is incubated at 28 ° C. with shaking for about 10 hours.
The fermentation liquid obtained in this way is extracted three times with 50 ml of ethyl acetate each time, the ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo.
The residue thus obtained is polarographically analyzed by measuring the half-wave at 1.52 volts, and it. a content of 9a-fluoro-d1 # 4-pregnadiene-llss, 17a, 21-triol-3,20-dione is found which corresponds to a yield of over 50% of the theoretical. <I> Example 17 </I> 13 parts of the edamin solution described in Example 8, 50 ml each, are adjusted to a pH of 7,
sterilized by heating at about 120 C for 15 minutes in an autoclave, and each of the sterilized solutions is inoculated with a culture of Bacillus sphaericus (MB 834). The inoculated cultures are incubated at a temperature of 28 C with shaking for about 24 hours, and each of the thirteen cultures obtained is mixed with a solution of 10 mg of one of the 3-hydroxy- or 3-keto-steroids listed in the table below in 0 , 1 ml of dimethylformamide added.
The cultures containing the 3-keto steroids are then incubated with shaking for a further period of about 10 hours.
Each of the fermentation liquids obtained in this way is extracted three times with 50 ml of ethyl acetate each time, and the three ethyl acetate extracts are combined and evaporated to dryness in vacuo. Each of the thirteen residues so obtained is dissolved in acetone and placed on paper chromatograms, each of which is developed using the solvent systems given in the table below.
The upper zones of each chromatogram corresponding to the d1-dehydro derivatives are cut off, each of them extracted with methanol, and the material extracted with methanol is again subjected to paper strip chromatography. The upper zone is cut off again, then dried, extracted with methanol and the methanol extract is evaporated to dryness in vacuo. The following table also lists the dl.4-3-keto steroids obtained.
EMI0008.0061
EMI0009.0001