DE1110637B

DE1110637B - Method for the selective reduction of steroids

Info

Publication number: DE1110637B
Application number: DEC19432A
Authority: DE
Inventors: Dr Albert Wettstein; Dr Ernst Vischer
Original assignee: Ciba Geigy AG; Ciba AG
Current assignee: Novartis AG; BASF Schweiz AG
Priority date: 1958-08-01
Filing date: 1959-07-21
Publication date: 1961-07-13

Description

Verfahren zur selektiven Reduktion von Steroiden Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur selektiven Reduktion der 3ständigen Ketogruppe und/oder der 4(5)ständigen Doppelbindung von Steroidverbindungen auf mikrobiologischem Wege.Process for the selective reduction of steroids The subject of the invention is a process for the selective reduction of the 3-position keto group and / or the 4 (5) permanent double bond of steroid compounds in a microbiological way.

Die Verwendung von Mikroorganismen zur Reduktion von Oxogruppen und Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindungen in Steroidverbindungen ist seit längerem bekannt. Gemäß den bis heute gesammelten Erfahrungen mit Hefe und anderen Mikroorganismen, wie Streptornyces, Rhizopus, Curvularia-Arten u. a., ist die Art der eintretenden Reduktion sowohl vom verwendeten Organismus wie auch weitgehend von der Konstitution des eingesetzten Steroids abhängig. So findet im allgemeinen bei Verwendung von Hefe und anderen Mikroorganismen keine Reduktion der 44-3-Oxogruppe statt. Während Androstan-3,17-dion zum 3ß,17ß-Diol reduziert wird, findet beim Pregnan-3,20-dion und Allopregnan-3,20-dion überhaupt keine Reduktion statt. Ist in den zuletzt genannten Verbindungen jedoch in 11-Stellung eine Oxogruppe vorhanden, so tritt Reduktion zum 3a-Alkohol ein. Bei Anwesenheit einer 11-Oxygruppe hängt der Verlauf der Reduktion davon ab, ob die betreffende Pregnanverhindung der Normal-oder Alloreihe angehört und ob sich die 11-Oxygruppe in a- oder ß-Stellung befindet. 17- und/oder 21-Oxygruppen scheinen die Reduktion wiederum zu hindern, während bei Androstanverbindungen mit 17-Oxogruppe diese stets zur 17 ß-Oxygruppe reduziert wird.The use of microorganisms to reduce oxo groups and Carbon-carbon double bonds in steroid compounds has been around for a long time known. According to the experience gained to date with yeast and other microorganisms, such as Streptornyces, Rhizopus, Curvularia species, and others, is the species that enter Reduction of both the organism used and largely of the constitution depends on the steroid used. This is generally the case when using Yeast and other microorganisms do not reduce the 44-3 oxo group. While Androstane-3,17-dione is reduced to 3β, 17β-diol, is found in the pregnane-3,20-dione and allopregnan-3,20-dione no reduction at all takes place. Is in the latter However, if an oxo group is present in the 11-position, reduction occurs to 3a alcohol. In the presence of an 11-oxy group, the course of the reduction depends depends on whether the relevant Pregnan connection belongs to the normal or allo series and whether the 11-oxy group is in the α or β position. 17- and / or 21-oxy groups seem to prevent the reduction again, while with androstane compounds with 17-oxo group this is always reduced to 17 ß-oxy group.

Gemäß der Erfindung ist nun ein neuer Stamm der Gattung Streptomyces aufgefunden worden, welcher in d4-3-Ketonen der Androstan- und Pregnanreihe die 3-Oxogruppe zur 3ß-Oxygruppe unter Aufhebung der 4(5)-Doppelbindung und Bildung der in 5-Stel.-lung gesättigten Verbindungen mit 5a-Konfiguration reduziert, wobei andere im Molekül vorhandene reduzierbare Gruppierungen nicht reduziert werden, z. B. Oxogruppen in 17- oder 20-Stellung.According to the invention there is now a new strain of the genus Streptomyces been found, which in d4-3-ketones of the androstane and pregnane series the 3-oxo group to 3ß-oxy group with breakdown of the 4 (5) double bond and formation of the compounds with 5a configuration saturated in the 5-position, with other reducible groups present in the molecule are not reduced, z. B. oxo groups in the 17 or 20 position.

Als Zwischenprodukte der Reduktion treten die 5Ha-3-Ketone auf, welche isoliert und durch weitere Reduktion mit demselben Organismus zu den 3ß-Alkoholen reduziert werden können. Die vorliegende Erfindung liefert also unter anderem ein Verfahren zur partiellen selektiven Reduktion sowohl von 44-Androsten-3,17-dionen und 44-Pregnen-3,20-dionen wie von den entsprechenden in 5-Stellung gesättigten Verbindungen mit 5a-Konfiguration, zu den entsprechenden in 5-Stellung gesättigten 3ß-Oxy-Verbindungen.The 5Ha-3-ketones occur as intermediate products of the reduction, which isolated and by further reduction with the same organism to the 3ß-alcohols can be reduced. The present invention thus provides, among other things Process for the partial selective reduction of both 44-androstene-3,17-dione and 44-pregnene-3,20-dione as of the corresponding saturated in the 5-position Compounds with the 5a-configuration, to the corresponding saturated in the 5-position 3ß-oxy compounds.

Die Ausgangsstoffe können außer den bereits erwähnten noch weitere Substituenten aufweisen, insbesondere eine freie oder funktionell abgewandelte Oxy- oder Oxogruppe in 11y, 16-, 17=, 18-, 19- und/ öder 21-Stellung, sowie Halogenatome z. B. in 9- oder 12-Stellung. Ugter Androstan- und Pregnanverbindungen werden auch Verbindungen der Nor= und Homo-Reihe verstanden, z. B. 44-3-Oxo-19-nor-pregnene oder -androstene oder d4-D-Homo-3-oxo-19-nor-pregnene oder -androstene. Ferner können weitere Doppelbindungen vorhanden sein, z. B. in 9(11)-, 14(15)- und/oder 16(17)-Stellung. Als spezifische Ausgangsstoffe seien z. B. genannt: Cortexon, Progesteron, 16a-Oxy-progesteron, Pregnenolon, Corticosteron, Cortison, Hydrocortison und Androstendion.In addition to those already mentioned, the starting materials can also contain others Have substituents, in particular a free or functionally modified oxy- or oxo group in 11y, 16-, 17 =, 18-, 19- and / or 21-position, as well as halogen atoms z. B. in 9 or 12 position. Ugter androstane and pregnane compounds are also used Compounds of the Nor = and Homo series understood, z. B. 44-3-Oxo-19-nor-pregnene or -androstene or d4-D-homo-3-oxo-19-nor-pregnene or -androstene. Furthermore can further double bonds may be present, e.g. B. in 9 (11) -, 14 (15) - and / or 16 (17) position. As specific starting materials are z. B. named: Cortexon, Progesteron, 16a-Oxy-progesteron, Pregnenolone, corticosterone, cortisone, hydrocortisone and androstenedione.

Bei dem Aetinomyceten-Stamm der vorliegenden Erfindung handelt es sich um einen neuen Stamm von Streptomyces griseus, welcher aus einer bei La-Tourde-Peilz, Kt. Vaud, gesammelten Bodenprobe isoliert worden ist. Er wird im Institut für spezielle Botanik der Eidgenössischen Technischen Hochschule in Zürich unter der Nummer 7994 aufbewahrt. Der Organismus zeichnet sich aus durch: 1. Morphologie der Sporen im Elektronenmikroskop: ellipsoidisch, glatt.The Aetinomycete strain of the present invention is is a new strain of Streptomyces griseus, which comes from a near La-Tourde-Peilz, Kt. Vaud, collected soil sample has been isolated. He is in the institute for special Botany from the Swiss Federal Institute of Technology in Zurich under the number 7994 kept. The organism is characterized by: 1. Morphology of the spores in the Electron microscope: ellipsoidal, smooth.

2. Farbe des Luftmycels: anfangs kreideweiß oder weißgelb, in ausgereiftem Zustande gelblichgrünlichgrau.2. Color of the air mycelium: initially chalk white or white yellow, in matured Condition yellowish greenish gray.

3. Farbe des Substratmycels: weißgelb -J- bräunlichgelb - sattgelb, auf Kartoffeln dunkelrotgelb. 4. Farbe des löslichen Pigmentes: auf keinem der untersuchten Nährmedien wurde ein auffallendes lösliches Pigment gebildet.3. Color of the substrate mycelium: white yellow -J- brownish yellow - deep yellow, dark red-yellow on potatoes. 4. Color of soluble pigment: There was no noticeable soluble pigment on any of the nutrient media examined educated.

5. Melaninbildung: Nach der Methode von Ettlinger et a1. (L. Ettlinger, R. Corbaz und R. H ü t t e r : Zur Systematik der Actinomyceten 4. Eine Arteinteilung der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici, Arch. Mikrobiol., 31, S. 326 [1958]) wurde der Stamm auf seine Fähigkeit zur Melaninbildung untersucht; er war chromogen negativ.5. Melanin formation: According to the method of Ettlinger et al. (L. Ettlinger, R. Corbaz and R. Hutte r: To the systematics of the actinomycetes 4. A classification of species of the genus Streptomyces Waksman et Henrici, Arch. Mikrobiol., 31, p. 326 [1958]) the strain was examined for its ability to produce melanin; it was chromogenic negative.

6. Morphologie der Sporenketten: Sporenketten in sympodial verzweigten Büscheln mit kurzer Hauptachse; Seitenzweige gerade oder gewellt.6. Morphology of the spore chains: spore chains in sympodial branched Tufts with a short major axis; Side branches straight or wavy.

Das Wachstum dieses Pilzes ist relativ wenig temperaturabhängig; sowohl bei 18" C als auch bei 40° C entwickelt er sich gut, doch liegt das Optimum zwischen 25 und 32' C.The growth of this fungus is relatively little temperature dependent; it develops well at both 18 " C and 40 ° C, but the optimum is between 25 and 32 ° C.

Die Erfindung ist, was den beschriebenen Pilz anbelangt, nicht auf die Verwendung des Streptomyces-Stammes 7994 oder anderer der Beschreibung entsprechender Stämme beschränkt, sondern betrifft auch die Verwendung von Varianten dieser Organismen, wie sie z. B. durch Selektionierung oder Mutation, insbesondere unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder von Stickstoff-Senfölen gewonnen werden.The invention is, as far as the described mushroom is concerned, not on the use of Streptomyces strain 7994 or others as described Strains, but also affects the use of variants of these organisms, how they z. B. by selection or mutation, especially under the action from ultraviolet or X-rays or from nitrogen mustard oils.

Das neue Verfahren ist somit dadurch gekennzeichnet, daß man J4-3-Oxo-androsten- oder -pregnenverbindungen oder entsprechende in 5-Stellung gesättigte Derivate mit 5 x-Konfiguration unter den für die mikrobiologische Reduktion bekannten Bedingungen mit aeroben Kulturen des Stammes 7994 der Gattung Streptomyces oder entsprechender Varianten davon bzw. den daraus gewonnenen Enzymen behandelt. Man inkubiert dabei die Ausgangsstoffe meistens direkt mit unter aeroben Bedingungen wachsenden Kulturen des genannten Stammes. Diese werden zweckmäßig bewegt, d. h. geschüttelt oder gerührt, und enthalten assimilierbaren Kohlenstoff, insbesondere Kohlenhydrate, sowie gegebenenfalls Wuchsstoffe, beispielsweise Maisquellwasser oder Bierwürze. und anorganische Salze. Es sind somit natürliche, synthetische oder halbsynthetische Nährlösungen brauchbar. Das praktisch einfachste Verfahren ist im folgenden geschildert, ohne daß die Erfindung durch diese Angaben beschränkt sein soll: Man züchtet die Organismen in Apparaturen und unter ähnlichen Bedingungen, wie sie bei der Antibiotikafabrikation als sogenannte Tieftankverfahren bekannt sind. Die Temperatur wird vorzugsweise bei 25 bis 32' C gehalten, und unter diesen Bedingungen sind die Kulturen nach 1 bis 3 Tagen voll entwickelt. Man gibt sodann die Ausgangsstoffe unter sterilen Bedingungen, in feiner Dispersion oder Lösung, z. B. in Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan oder Propylenglykol, zu und inkubiert weiter. Nach 8 bis 36 Stunden ist die Reaktion meistens beendet. Man trennt vom Mycel ab, extrahiert gegebenenfalls das Mycel. z. B. mit Methanol oder Aceton, und gibt den eingedampften Extrakt dem Kulturfiltrat zu; man extrahiert dieses mit einem geeigneten Lösungsmittel, wie Essigester, Chloroform, Athylenchlorid oder Methylenchlorid, . wäscht den Extrakt mit verdünnter Natriumhydrogencarbonatlösung und mit Wasser und dampft ihn schließlich im Vakuum zur Trockne ein. Aus dem so gewonnenen rohen Reduktionsprodukt können die Verfahrensprodukte nach üblichen Reinigungsmethoden, wie Kristallisation, Chromatographie, Verteilungschromatographie, Verteilung zwischen miteinander nicht mischbaren Lösungsmitteln usw., rein erhalten werden. Die Reduktion kann aber auch so durchgeführt werden, daß man die wirksamen Enzyme aus entsprechenden aeroben Kulturen des Stammes 7994 der Gattung Streptomyces zuerst abtrennt und unter Ausschluß der wachsenden Kulturen verwendet.The new process is thus characterized in that J4-3-oxo-androsten- or -pregnenverbindungen or corresponding derivatives saturated in the 5-position with 5 x configuration under the conditions known for microbiological reduction with aerobic cultures of strain 7994 of the genus Streptomyces or equivalent Treated variants thereof or the enzymes obtained therefrom. One incubates thereby the starting materials mostly directly with cultures growing under aerobic conditions of the named tribe. These are expediently moved, i. H. shaken or stirred, and contain assimilable carbon, especially carbohydrates, and optionally Growth substances, for example corn steep water or beer wort. and inorganic salts. Natural, synthetic or semi-synthetic nutrient solutions can therefore be used. The practically simplest method is described below without affecting the invention should be limited by this information: One cultivates the organisms in apparatus and under conditions similar to those used in the manufacture of antibiotics as so-called Deep tank processes are known. The temperature is preferably from 25 to 32 ' C and under these conditions the cultures are full after 1 to 3 days developed. You then give the starting materials under sterile conditions, in fine Dispersion or solution, e.g. B. in methanol, ethanol, acetone, dioxane or propylene glycol, and continue to incubate. The reaction is usually complete after 8 to 36 hours. The mycelium is separated and, if necessary, the mycelium is extracted. z. B. with methanol or acetone, and add the evaporated extract to the culture filtrate; one extracted this with a suitable solvent such as ethyl acetate, chloroform, ethylene chloride or methylene chloride,. washes the extract with dilute sodium hydrogen carbonate solution and with water and finally evaporated it to dryness in a vacuum. From the so obtained crude reduction product can the process products according to conventional purification methods, such as crystallization, chromatography, partition chromatography, partition between immiscible solvents, etc., can be obtained neat. The reduction but can also be carried out in such a way that the active enzymes from appropriate aerobic cultures of strain 7994 of the genus Streptomyces first separated and under Exclusion of growing cultures used.

Bei kürzerer Inkubationszeit der Ausgangsstoffe mit den genannten Organismen oder den entsprechenden Enzymen können aus den Reduktionsprodukten neben unverändertem Ausgangsmaterial und den in 5-Stellung gesättigten 3ß-Alkoholen, die als Zwischenprodukte auftretenden, in 5-Stellung gesättigten Androstan- bzw. Allopregnan-3-ketone isoliert werden. In einigen Fällen, wie z. B. bei der Reduktion von Progesteron und Cortexon, können durch papierchromatographische Analyse noch weitere niedrigpolare Verbindungen unbekannter Konstitution ermittelt werden. Im Falle des Progesterons konnte dieses Nebenprodukt isoliert und untersucht werden: an Hand des IR-Spektrums enthält es keine Hydroxylgruppe, jedoch eine nicht konjugierte Carbonylgrupp; .With a shorter incubation time of the starting materials with the named Organisms or the corresponding enzymes can also from the reduction products unchanged starting material and the 3ß-alcohols saturated in the 5-position, the androstane or allopregnane-3-ketones which occur as intermediate products and are saturated in the 5-position to be isolated. In some cases, such as B. in the reduction of progesterone and cortexon, even more low polarity can be detected by paper chromatographic analysis Compounds of unknown constitution can be determined. In the case of progesterone this by-product could be isolated and investigated: on the basis of the IR spectrum it does not contain a hydroxyl group but has a non-conjugated carbonyl group; .

Das Verfahren der vorliegenden Anmeldung bedeutet für die Synthese verschiedener wichtiger physiologisch wirksamer Steroide einen großen Fortschritt, z. B. in Anbetracht dessen, daß bei der partiellen Reduktion von 44-3,17-Dioxo-androsten- bzw. .44-3,20-Dioxo-pregnenverbindungen zu den 3ß-Alkoholen mit chemischen Mitteln andere im Molekül vorhandene reduzierbare Gruppierungen, z. B. die 20ständige Ketogruppe, unter Umständen geschützt werden müssen und daß diese chemischen Hydrierungen nicht immer stereospezifisch verlaufen. So läßt sich nunmehr der kürzlich bekanntgewordene natriumausscheidende Faktor aus Nebennieren, das Allopregnan-3ß,16a-diol-20-on, aus 16a-Oxy-progesteron in einer einzigen Reduktionsstufe gemäß dem vorliegenden Verfahren herstellen: Die folgenden Beispiele erläutern das erfindungsgemäße Verfahren. Die Temperaturen sind in Celsiusgraden angegeben.The process of the present application represents a great advance in the synthesis of various important physiologically active steroids, e.g. B. in view of the fact that in the partial reduction of 44-3,17-dioxo-androsten- or .44-3,20-dioxo-pregnenverbindungen to the 3ß-alcohols with chemical agents other reducible groups present in the molecule, eg . B. the 20-position keto group, may have to be protected and that these chemical hydrogenations are not always stereospecific. The sodium excreting factor that has recently become known from adrenal glands, allopregnan-3ß, 16a-diol-20-one, can now be produced from 16a-oxy-progesterone in a single reduction step according to the present process: The following examples explain the process according to the invention. The temperatures are given in degrees Celsius.

Beispiel 1 Man bereitet 4 1 einer Nährlösung, die auf einen Liter Leitungswasser folgende Zusätze enthält: 10 g Rohglukose, 5 g Pepton, 3 g Fleischextrakt, 5 g Natriumehlorid und 10 g Caleiumcarbonat, stellt sie auf pH 7,5 ein, bringt sie in ein Schüttelgefäß und sterilisiert sie 30 Minuten bei 118°. Dann beimpft man sie mit einer Kultur des Stammes 7994 und läßt sie bei 27° schütteln. Nach 3 Tagen gibt man zu der nun gut entwickelten Kultur unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Cortexon in 20 cm3 Aceton und läßt weitere 36 Stunden unter den gleichen Bedingungen schütteln. Nun wird das Mycel abgetrennt und zweimal mit warmem Aceton extrahiert. Die vereinigten Acetonauszüge konzentriert man im Vakuum und gibt das Konzentrat zum Kulturfiltrat. Hierauf wird das Kulturfiltrat dreimal mit je 500 cm3 Essigester ausgezogen. Die Extrakte wäscht man dreimal mit je 100 cm3 2c/ciger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser, vereinigt sie, trocknet sie über Natriumsulfat und dampft sie im Vakuum ein. Der Rückstand wird in 80 cm3 Methanol gelöst, worauf man 100 cm3 Petroläther und 20 cm-3 Wasser zugibt. Die methanolisch-wäßrige Phase und die Petrolätherphase werden separat im Vakuum eingedampft und papierchromatographisch untersucht. Die letztere enthält keine Steroide und nur ölige Verunreinigungen, während die erstere zur Hauptsache 3ß,21_ -Dioxyallopregnan-20-on enthält. Dieses wird mittels Chromatographie an 30 gKieselsäuregel gereinigt, wobei folgende Lösungsmittel verwendet werden: Chloroform, Gemische von Chloroform und Aceton mit steigendem Acetongehalt und schließlich Aceton. Mit einem Gemisch von Chloroform-Aceton (99:1) wird die Hauptmenge der Substanz, das 3ß,21-Dioxy-allopregnan-20-on, von der Säule eluiert. Es wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch kristallisiert, F. =168 bis 174°. Beispiel 2 Wie im Beispiel 1 beschrieben, gibt man zu 41 einer Kultur des Stammes 7994 1 g Cortexon. Nach 8stündigem Schütteln bei 27° arbeitet man den Ansatz gemäß den Angaben im Beispiel 1 auf. Die papierchromatographische Untersuchung des Rohproduktes zeigt, daß es neben Cortexbn (II) und neben einem im Papierchromatogramm unterhalb Cortexon stehenden Nebenprodukt zur Hauptsache 21-Oxy-allopregnan-3,20-dion (I) und 3ß-21-Dioxy-allopregnan-20-on enthält (III). Durch Chromatographie an 30 g Kieselsäuregel unter Verwendung der im Beispiel 1 angegebenen Lösungsmittel (100-cm3-Fraktionen) können die drei Substanzen wie folgt getrennt werden. Fraktion Lösungsmittel Enthält 1 Chloroform Verunreinigungen 2-3 Chloroform I 4 Chloroform Gemisch von I und II 5-6 Chloroform II 7-8 Chloroform- III Aceton (99: 1) Das 21-Oxy-allopregnan-3,20-dion wird aus einem Aceton-Petroläther-Gemisch kristallisiert, F.= 162 bis 164°. Reisniel Zu einer gemäß den Angaben im Beispiel 1 bereiteten 4-1-Kultur des Stammes 7994 gibt man unter sterilen Bedingungen eine Lösung von 1 g Progesteron in 20 cm3 Aceton und schüttelt das Kulturgefäß 8 Stunden bei 27°. Dann arbeitet man den Ansatz gemäß Beispiel l auf und verteilt den Rohextrakt, wie beschrieben, zwischen Petroläther und 80c/o-igem wäßrigem Methanol. Nach dem Eindampfen werden die Rückstände der Petroläther- und der Methanolphase papierchromatographisch untersucht. Erstere enthält neben etwas Progesteron eine unbekannte Substanz, die im Papierchromatogramm unterhalb Progesteron steht. In der Methanolphase können Progesteron, die soeben erwähnte unbekannte Substanz, sowie Allopregnan-3,20-dion und 3ß-Oxy-allopregnan-20-on nachgewiesen werden. Der Rückstand der Methanolphase (0,958) wird in wenig Methylenchlorid gelöst und auf eine Säule von 30g Kieselsäuregel gebracht. Die Säule wird mit Methylenchlorid, Gemischen von Methylenchlorid und Aceton von steigendem Acetongehalt und mit Aceton eluiert. Die anfallenden Fraktionen (je 25 em3 Lösungsmittel) werden separat eingedampft und papierchromatographisch untersucht. Die ersten drei Fraktionen (Methylenchlorid) enthalten die erwähnte unbekannte Substanz in einheitlicher Form. Sie wird aus Aceton kristallisiert und schmilzt bei 149 bis 150°. Sie zeigt keine Absorption bei 240 mtt. Im Infrarotspektrum sind Banden unter anderem bei 5,87, 7,24, 7,38, 8,48, 8,82, 9,15, 9,53 und 11,50 t, sichtbar. Aus den Fraktionen 5 bis 8 (Methylenchlorid) kann Allopregnan-3,20-dion vom Schmp. 204 bis 206° und aus den Fraktionen 17 bis 18 (Methylenchlorid) und 19 bis 22 (Methylenchlorid-Aceton 99:1) 3ß-Oxy-allopregnan-20-on vom Schmp. 192 bis 195° isoliert werden. Beispiel 4 Man beschickt acht Erlenmeyerkolben von 500 cm Fassungsvermögen mit je 100 cm3 der im Beispiel 1 beschriebenen Nährlösung und sterilisiert sie. Dann beimpft man sie mit einer Kultur des Stammes 7994 und läßt sie 3 Tage bei 28° schütteln. Zu den gut ausgebildeten Kulturen gibt man unter sterilen Bedingungen Lösungen von je 30 mg der folgenden Steroide in 1,5 cm3 Aceton: Progesteron, 16a-Oxyprogesteron, Pregnenolon, Corticosteron, 17a-Oxycortexon (Reichsteins Substanz S), Cortison, Hydrocortison und Androstendion. Man läßt die Kulturen 14 Stunden weiterschütteln und extrahiert sie dann einzeln mit je zwei 30-cm3-Portionen Essigester. Die von den einzelnen Kulturen erhaltenen Extrakte werden separat eingedampft und papierchromatographisch untersucht. Sie enthalten alle neben wenig Ausgangsmaterial ein Gemisch der entsprechenden 3-Keto- und 3ß-Oxy-allopregnan- bzw. -androstanverbindungen.EXAMPLE 1 4 l of a nutrient solution is prepared which contains the following additives per liter of tap water: 10 g of raw glucose, 5 g of peptone, 3 g of meat extract, 5 g of sodium chloride and 10 g of calcium carbonate, adjusts it to pH 7.5, brings it in a shaking flask and sterilize it for 30 minutes at 118 °. They are then inoculated with a culture of the 7994 strain and allowed to shake at 27 °. After 3 days, a solution of 1 g of cortexone in 20 cm3 of acetone is added to the now well-developed culture under sterile conditions and the mixture is shaken for a further 36 hours under the same conditions. The mycelium is then separated off and extracted twice with warm acetone. The combined acetone extracts are concentrated in vacuo and the concentrate is added to the culture filtrate. The culture filtrate is then extracted three times with 500 cm3 of ethyl acetate each time. The extracts are washed three times with 100 cm3 of 2c / ciger sodium hydrogen carbonate solution and water, combined, dried over sodium sulfate and evaporated in vacuo. The residue is dissolved in 80 cm3 of methanol, whereupon 100 cm3 of petroleum ether and 20 cm-3 of water are added. The methanolic-aqueous phase and the petroleum ether phase are evaporated separately in vacuo and examined by paper chromatography. The latter contains no steroids and only oily impurities, while the former mainly contains 3ß, 21_-dioxyallopregnan-20-one. This is purified by chromatography on 30 g of silica gel using the following solvents: chloroform, mixtures of chloroform and acetone with increasing acetone content and finally acetone. The bulk of the substance, 3β, 21-dioxy-allopregnan-20-one, is eluted from the column with a mixture of chloroform-acetone (99: 1). It is crystallized from an acetone-petroleum ether mixture, mp = 168 to 174 °. Example 2 As described in Example 1, 1 g of cortexon is added to a culture of the 7994 strain. After shaking at 27 ° for 8 hours, the batch is worked up as described in Example 1. The paper chromatographic analysis of the crude product shows that, in addition to cortexbn (II) and a by-product which is below cortexon in the paper chromatogram, it is mainly 21-oxy-allopregnan-3,20-dione (I) and 3ß-21-dioxy-allopregnan-20- on contains (III). The three substances can be separated as follows by chromatography on 30 g of silica gel using the solvents specified in Example 1 (100 cm3 fractions). Contains solvent fraction 1 chloroform impurities 2-3 chloroform I. 4 chloroform mixture of I and II 5-6 chloroform II 7-8 chloroform-III Acetone (99: 1) The 21-oxy-allopregnan-3,20-dione is crystallized from an acetone-petroleum ether mixture, m.p. = 162 to 164 °. Reisniel A solution of 1 g of progesterone in 20 cm3 of acetone is added under sterile conditions to a 4-1 culture of strain 7994 prepared as described in Example 1 and the culture vessel is shaken at 27 ° for 8 hours. The batch is then worked up according to Example 1 and the crude extract is distributed, as described, between petroleum ether and 80% strength aqueous methanol. After evaporation, the residues of the petroleum ether and the methanol phase are examined by paper chromatography. In addition to some progesterone, the former contains an unknown substance that is below progesterone in the paper chromatogram. Progesterone, the unknown substance just mentioned, as well as allopregnan-3,20-dione and 3ß-oxy-allopregnan-20-one can be detected in the methanol phase. The residue of the methanol phase (0.958) is dissolved in a little methylene chloride and placed on a column of 30 g of silica gel. The column is eluted with methylene chloride, mixtures of methylene chloride and acetone with increasing acetone content and with acetone. The resulting fractions (25 em3 solvent each) are evaporated separately and examined by paper chromatography. The first three fractions (methylene chloride) contain the aforementioned unknown substance in a uniform form. It is crystallized from acetone and melts at 149 to 150 °. It shows no absorption at 240 mtt. In the infrared spectrum, bands are visible at 5.87, 7.24, 7.38, 8.48, 8.82, 9.15, 9.53 and 11.50 t, among others. From fractions 5 to 8 (methylene chloride) allopregnan-3,20-dione with a melting point of 204 to 206 ° and from fractions 17 to 18 (methylene chloride) and 19 to 22 (methylene chloride-acetone 99: 1) 3β-oxy- allopregnan-20-one with a melting point of 192 ° to 195 ° can be isolated. Example 4 Eight Erlenmeyer flasks with a capacity of 500 cm are charged with 100 cm3 each of the nutrient solution described in Example 1 and they are sterilized. They are then inoculated with a culture of the 7994 strain and left to shake for 3 days at 28 °. Solutions of 30 mg each of the following steroids in 1.5 cm3 of acetone are added to the well-developed cultures under sterile conditions: progesterone, 16a-oxyprogesterone, pregnenolone, corticosterone, 17a-oxycortexone (Reichstein's substance S), cortisone, hydrocortisone and androstenedione. The cultures are allowed to continue shaking for 14 hours and then extracted individually with two 30 cm3 portions of ethyl acetate. The extracts obtained from the individual cultures are evaporated separately and examined by paper chromatography. In addition to a small amount of starting material, they all contain a mixture of the corresponding 3-keto and 3ß-oxy-allopregnan- or -androstane compounds.

Claims

FATEI1IT-APPROPRIATE: 1. Procedure for the selective reduction of the 3-keto grouping and / or the 4 (5) permanent double bond of steroids, characterized in that that one on A4-3-oxo-androsten- or -pregnenverbindungen or corresponding in 5-Position Saturated Derivatives with 5α-Configuration Enzymes from Aerobic Cultures of the strain 7994 of the genus Streptomyces or corresponding variants thereof lets and from the fermentation broth with the reduction products by extraction organic, water-immiscible solvents and subsequent Crystallization isolated.

2. The method according to claim 1, characterized in that that the starting materials can be mixed directly with aerobically growing cultures of strain 7994 of the genus Streptomyces were incubated.

3. The method according to claim 1, characterized in that the mycelium from aerobically grown cultures of the strain 7994 separates the genus Streptomyces and the starting materials for the culture filtrate or to aqueous mycelium suspensions 5.

4. The method according to the claims 1 to 3; characterized in that a pre-cleaning is carried out before the crystallization of the obtained crude extract by distribution between solvents or solvent mixtures or by absorption on activated carbon, silica gel or aluminum oxide.

5. Process according to claims 1 to 4, characterized in that the incubation carried out for about 8 to 36 hours.

6. The method according to claims 1 to 5, characterized in that one cortexon. Progesterone, 16a-oxy-progesterone, pregnenolone, Corticosterone, 17a-oxy-eorticosterone, cortisone, hydrocortisone or androstenedione used as raw materials.