Procédé d'obtention d'un facteur bifidigène L'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un facteur Bifidus essentiellement différent des fac teurs de croissance du Bacterium bifidum connus à ce jour et que nous appellerons dans ce qui suit Facteur Bifidus 2 .
On sait depuis Tissier que le Bifidus (synonymes Bifidibacterium bifidum, Lactobacillus bifidus, Acti- nobacterium bifidum) est l'hôte normal de l'intestin du nourrisson au sein, chez lequel il représente jus qu'à 90 % de la flore intestinale. L'allaitement arti ficiel, même avec des préparations bien équilibrées et propres à assurer une bonne croissance du nour risson, provoque une disparition progressive du Bifidus qui est remplacé par des espèces diverses.
On sait que le Bifidus nécessite pour son déve loppement un certain nombre de facteurs de crois sance, les uns bien, les autres mal connus, et que ses besoins sont variables d'une souche à l'autre.
Toutes les souches semblent avoir un besoin relatif ou absolu en panthothénate ou acide panto- thénique, acide para-amino-benzoïque, biotine, cys- téine ou cystine.
Certains mutants ont un besoin absolu d'un fac teur apparenté au polyoside A des groupes sanguins (Petuely), remplaçable par une série de polyosides ou oligosides divers (György, Zilliken, Kuhn) 4-O-galactosidyl-N-acétyl-glucosamine, béta-éthyl- (ou méthyl- ou propyl- ou butyl-) N-acétyl- glucosaminide.
Divers oligosides présents dans le lait de femme, en particulier un hexasaccharide composé de glucose, galactose, N-acétyl-glucosamine et fucose, et les polyosides A peuvent agir comme précurseurs de ce facteur. La présence de ce facteur dans le lait de femme, alors qu'il est rare ou absent dans le lait de vache, expliquerait le maintien de la flore bifide dans l'intestin de l'enfant nourri au sein.
Cependant, la plupart des souches isolées du nourrisson au sein n'ont pas un besoin absolu de ces facteurs. Par conséquent, on comprend mal que leur présence dans le lait de femme suffise à favoriser le Bifidus au point d'en faire le germe quasi exclusif de l'intestin et que les souches isolées de l'intestin n'aient pas un besoin absolu de ce facteur.
Nous avons trouvé que le lait de femme contient un deuxième facteur, indépendant du facteur poly- osidique des auteurs précités, facteur indispensable à la plupart des souches isolées de l'intestin du nour risson et, en particulier, à la souche Tissier type. Ce facteur, dont la nature chimique n'est pas encore éta blie, prend naissance sous l'influence d'enzymes pro téolytiques agissant sur des protéines du lait, la ca séine et la lactalbumine du lait de vache spécialement.
D'une part les diverses protéines ne donnent pas les mêmes quantités de ce facteur, d'autre part, diverses enzymes agissant sur la même protéine en libèrent des quantités différentes. La papaïne, les cathépsines et l'érepsine intestinales associées semblent plus effi caces que la trypsine ou la pepsine.
Nos recherches ont démontré que le Facteur Bi fidus 2 stimulait le développement du Bifidus aussi bien in<I>vivo qu'in vitro.</I> L'administration de prépa rations riches en ce facteur permet de rétablir une flore bifide chez un enfant soumis à l'allaitement ar tificiel. Suivant les quantités de Facteur Bifidus 2 incorporées à la ration lactée journalière d'un nour risson de moins d'un an alimenté artificiellement, le Bifidus redevient l'hôte prédominant de l'intestin en 2 à 10 jours.
Ce nouveau Facteur 2 est donc capable d'assurer au Bifidus résiduel, toujours présent dans l'intestin du nourrisson même soumis à l'allaitement artificiel, un avantage sélectif considérable.
Les enzymes protéolytiques provoquant la for mation du Facteur Bifidus 2 peuvent être d'origine animale, végétale ou peuvent provenir de certains micro-organismes, tels que les moisissures (Penicil- lium, Aspergillus, par exemple Oryzae), levures et tout particulièrement de certains ferments lactiques du genre Micrococcus normalement présents dans tous les laits, comme par exemple le Micrococcus caséolyticus, Micrococcus casei.
Aux ferments sus mentionnés, viennent s'ajouter les micrococci présen tant, outre leur action protéolytique, un pouvoir aci difiant intéressant pour la préparation d'aliments lactés facilement digestibles. Le Facteur Bifidus 2, dont la formule chimique n'est pas encore définie, est thermostable et supporte, par conséquent, la pasteurisation.
Nos essais on montré, en outre, qu'il était pos sible, en partant d'un milieu protéique (lait) soumis à l'action intense d'agents protéoldytiques, de séparer, par exemple par chromatographie ou échangeurs d'ions, des fractions extrêmement riches en Facteur Bifidus 2, lesquelles peuvent être introduites en doses voulues dans n'importe quelle préparation alimentaire lactée destinée à l'alimentation artificielle des nour- rissons. L'utilisation de germes sélectionnés apparentés au Micrococcus casei présente divers avantages pour la production du Facteur Bifidus 2. Elle permet, par un réglage précis des conditions d'incubation en mi lieu lacté, l'obtention d'un pouvoir bifidigène élevé sans nécessiter de milieu de culture autre que le lait.
L'introduction dans le processus de germes étrangers à la flore normale du lait et l'adjonction de produits chimiques quelconques deviennent superflues.
En pratique, le produit lacté destiné aux nour rissons contiendra en moyenne 15 et au minimum 6 unités Raynaud de facteur Bifidus 2 au gramme. Un régime bifidigène de 15 unités Raynaud de Facteur Bifidus 2 au gramme suffit à la réapparition en 5 à 10 jours, puis au maintien d'une flore intesti nale à 40 - 70 % de germes Bifidus.
L'unité de Facteur Bifidus 2, que nous appelons unité Bifidus Raynaud, se définit par la quantité de ce facteur qui, ajoutée à un milieu de composition définie, permet à la souche Tissier de Bifidus de se développer en anaérobiose de sorte qu'après 5 jours de culture à 38 C, il en résulte une acidité finale (acide lactique + acide acétique) de 1 ml d'acide 0,1 normal, le titrage étant effectué sur la totalité de la culture (5 ml), en présence de phénolphtaléine com me indicateur. On retranche de la valeur déterminée dans le tube de culture, la valeur à blanc pour la même quantité de milieu non ensemencé.
Le milieu utilisé a la composition suivante
EMI0002.0013
Asparagine <SEP> .................... <SEP> 5 <SEP> g
<tb> <SEP> Bacto <SEP> Casitone <SEP> Difco <SEP> <SEP> Vitamin-Free <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Cystine <SEP> ...................... <SEP> 0,200 <SEP> g
<tb> Lactose <SEP> ... <SEP> .................. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Acétate <SEP> de <SEP> Na, <SEP> 6 <SEP> H2O <SEP> ............ <SEP> 5 <SEP> g
<tb> SO4Mg, <SEP> 7 <SEP> H2O <SEP> ...... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,5 <SEP> g
<tb> PO4Na2 <SEP> H, <SEP> 12 <SEP> H2O <SEP> .............. <SEP> 2,330 <SEP> g
<tb> PO4KH2 <SEP> ..... <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,900 <SEP> g
<tb> Acide <SEP> para-amino-benzoïque <SEP> ..... <SEP> 1,000 <SEP> mg
<tb> Biotine <SEP> ............. <SEP> . <SEP> ...
<SEP> 0,010 <SEP> mg
<tb> Pantothénate <SEP> de <SEP> Ca <SEP> - <SEP> 1,000 <SEP> mg
<tb> H.,O <SEP> q. <SEP> s.p. <SEP> 500 <SEP> ml
<tb> pH <SEP> = <SEP> 6,4 Stérilisation par filtration sur Seitz.
Par ailleurs, nos essais ont montré qu'un lait, condensé ou non, ensemencé après pasteurisation de germes protéolytiques apparentés au Micrococcus caséolyticus constituait un excellent milieu de culture non seulement pour les ferments lactiques générale ment utilisés dans les levains d'acidification employés dans l'industrie laitière (streptococcus lactis, Str. cre- moris, Leuconostoc citrovorus et paracitrovorus, Str. thermophilus,
Lactobc. lactis, etc.), mais encore pour les espèces plus exigeantes que sont le Lbm. acido- philum et le Bacterium bifidum.
Cette observation est d'une importance pratique évidente, étant donné qu'on cherche souvent à amé liorer la digestibilité des préparations lactées par la précoagulation de la caséine et leur valeur diététique par l'acidification bactériologique ou chimique. Les germes protéolytiques du genre Micrococcus contri buent à la coagulation par l'action de présure de leurs protéases et à l'acidification par une formation plus ou moins importante d'acide lactique ou d'acide acétique issus de la fermentation des sucres.
En améliorant les conditions de développement des autres ferments lactiques par création d'un milieu favorable, ceux-ci s'intègrent dans tout processus d'acidification bactériologique du lait pour la prépa ration industrielle d'aliments au lait acidifié destinés en particulier aux nourrissons. Leur utilisation dans la pratique industrielle peut être envisagée de diffé rentes façons. Ensemencés en cultures pures sur un lait condensé ou non et pasteurisé ou ultrapasteurisé, ils peuvent être détruits par une nouvelle pasteuri sation dès que le degré voulu de protéolyse est atteint.
Le lait ainsi traité constituera un excellent milieu de culture pour les ferments d'acidification, lesquels pourront à leur tour être détruits par un traitement thermique, séparé du processus de séchage ou lié à celui-ci, comme par exemple un séchage par pulvé risation à haute température. Si l'on veut obtenir un aliment lacté conservant une flore viable de germes dont on cherche à repeupler constamment l'intestin (Lbm. acidophilum, Bm. bifidum), on évitera ce deuxième traitement thermique et séchera de préféren ce le produit à basse température, c'est-à-dire, sous vi de et par lyophilisation.
Il est évident que l'acidification consécutive à la protéolyse bactériologique peut aussi être effectuée par voie chimique et que les opéra tions décrites ci-dessus peuvent s'appliquer à la tota lité du lait, respectivement de la préparation lactée, ou bien à une partie seulement du lait entrant dans la préparation de l'aliment.
L'action combinée de protéolyse et d'acidification bactériologique ne néces site qu'une seule opération dans un même récipient, les ferments protéolytiques et acidifiants étant en semencés à des doses adéquates et les températures d'incubation réglées pendant la culture des germes, de manière à réaliser l'équilibre des deux actions fer- mentatives. Une acidification trop poussée entravant l'activité des germes protéolytiques, on pourra pro céder à un ensemencement différé de la culture aci difiante.
Les opérations énumérées ci-dessus peuvent donc être effectuées aussi bien sur tout ou partie de la frac tion de lait entrant dans la composition de l'aliment que sur cette fraction additionnée de tout ou partie des ingrédients entrant dans la composition finale du produit. Ainsi, la protéolyse et l'acidification peuvent être effectuées dans 2 fractions de lait additionnées ou non de tout ou partie des ingrédients de la com position. Ensuite, ces 2 fractions réunies sont sou mises à l'intervention technologique finale assurant la conservation du produit: pasteurisation, ultrapas- teurisation, stérilisation ou séchage.
Les moyens de contrôle décrits plus haut permettront, vu la concor dance des résultats<I>in vitro</I> et<I>in vivo,</I> de garantir au produit fini un pouvoir bifidigène parfaitement défini. Exemple d'exécution 200 kg de lait frais, à 3 % de matière grasse et 9 % d'extrait sec non gras, sont stérilisés par ultrapasteurisation.
Ce lait est concentré à 35 % de matière sèche dans un concentreur sous vide, d'où il sort à 45 C pour être refroidi à 30 C dans un réfrigérant à plaques.
Le lait à 30 C, contenu dans un récipient iso therme, est ensemencé au moyen d'une culture pure et active de Micrococcus caséolyticus, en quantité suffisante pour réaliser un apport de 300 à 1000 germes par cc de lait concentré.
Après 48 heures d'incubation à environ 30 C, l'acidité du lait est montée à 70 - 80 C Dornic et la flore à 10 millions de germes/cc.
Le mélange est refroidi à 8 C pour stopper le développement des germes.
Dans un pétrin mélangeur à parois chauffantes, on mélange successivement, en agitant - 30 litres d'eau froide dans lesquels on dis perse, puis empèse 2,8 kg de fécule de maïs en portant à ébullition. empois est en suite refroidi à 65 C.
- 6,3 kg de sucre dextrine-maltose, dissous dans 16 litres d'eau.
- Le lait concentré acidifie par Mc. caséo- lyticus.
- 12 kg de jus de citron concentré 6 fois.
Ce mélange est homogénéisé à 50 atmosphères, puis refroidi à 40 C.
Il est ensuite séché dans un appareil pulvérisateur à dispersion du concentré par turbine. Température d'entrée de l'air: 220 C Température de sortie de l'air : 900 C Diamètre de la turbine 25 cm Vitesse de la turbine : 9000 t/min. Après tamisage, la poudre obtenue est condition née en boîtes métalliques qui sont serties après éva cuation de l'air et remplacement par de l'azote.