Verfahren zur Herstellung eines Mittels zur Bestimmung der Magensäure
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Mittels für die qualitative und quantitative Bestimmung der Magensäure. Das erfindungsgemäss hergestellte Mittel kann speziell zum Nachweis einer Magenanacidität verwendet werden. Die Bestimmung der Magenanacidität besitzt eine praktische Bedeutung für die Entdeckung des Magenkrebses. Es wurde nämlich festgestellt, dass Magenkrebs häufiger bei an Magen anacidität leidenden Individuen als bei der Bevölkerung als Ganzes angetroffen wird.
In Proc. Soc. Exp. Biol. and Med. (1950), 74, 218, beschrieben Segal, Miller und Morton eine Methode für die Bestimmung der Magensäure ohne Magenausheberung. Um über den Mageninhalt ohne Beiziehung der Magensonde Aufschluss zu erhalten, wählen die Autoren eine indirekte Methode unter Einbezug einer Urinanalyse.
Die von Segal und Mitarbeitern ausgearbeitete Untersuchungstechnik beruhte darauf, dass man der Versuchsperson ein Mittel verabreichte, aus welchem im Magen bei Anwesenheit von freier Säure eine Substanz freigesetzt wird, die nach Eintritt ins Blut durch die Nieren ausgeschieden und schliesslich mit dem Urin entleert wird. Die verwendete Verbindung war ein Chinin-Kationenaustauscherharz-Komplex.
Das Chinin wurde dabei nach der Einnahme des Chinin-Harz-Komplexes im Magen durch die Magensalzsäure freigesetzt. Die Chininmenge im Urin bestimmte man durch Extrahieren des Urins mit Äther und anschliessendes Extrahieren der ither- fraktion mit 0,1 n-Schwefelsäure. Die saure wässrige Chininlösung wurde sodann mit Ultraviolettlicht bestrahlt und die Fluoreszenz der Lösung in einem Fluorophotometer gemessen. Dieses Vorgehen war ziemlich kompliziert und erforderte die Verwendung eines Fluorophotometers, welches Spezialinstrument nicht zur Standardausrüstung eines klinischen Laboratoriums gehört.
Ferner fand Segal, dass von der verabreichten Gesamtdosis von 20-40 mg Chinin nur rund 1 0/o oder noch weniger mit dem Urin ausgeschieden wurde. Die Bestimmung derart kleiner Chininmengen bereitete natürlich Schwierigkeiten.
Ein weiterer Nachteil der Untersuchungsmethode bestand darin, dass die Messungen durch die gleichzeitige Anwesenheit einer Reihe von Substanzen verfälscht wurden, wobei hauptsächlich Chininlieferanten sowie fluoreszierende Stoffe störend wirkten.
Daher musste man vor der Durchführung der Untersuchung mit dem Chinin-Harz-Komplex während, mehreren Tagen die Verabreichung von Vitaminen und einer Reihe von Medikamenten an den Patienten, unterlassen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung eines oral applizierbaren Mittels für die Bestimmung der Magensäure ist dadurch gekennzeichnet, dass man ein Kationenaustauscherharz in der H-Form mit 2,6-Diamino-3-phenylazopyridin umsetzt.
Zur Bestimmung der Magensäure mit dem erfindungsgemäss hergestellten Mittel sind weder kostspielige Einrichtungen noch besondere technische Geschicklichkeit erforderlich.
Weiter tritt der genannte Farbstoff im Urin in solcher Menge auf, dass er mit Leichtigkeit kolorimetrisch nachweisbar ist.
Ferner wird die Untersuchung durch die Anwesenheit von Fremdstoffen nicht gestört.
Als Kationenaustauscherharz wird vorzugsweise Amberlite IRC-50 (eingetragene Marke) ein durch Acrylsäure vernetztes, Carboxylgruppen enthaltendes Harz, das von Rohm & Haas, Philadelphia, Pennsylvania, hergestellt wird, oder Permutit H-70 (eingetragene Marke), ein Corboxylgruppen enthal tendes Harz, das von der Permutit Company, New York, N. Y., erzeugt wird. Von der grossen Zahl der geprüften Kationenaustauscherharze scheinen Amberlite IRC-50 (Qualität pro Analysi) und Permutit H-70 eindeutig die besten Ergebnisse zu liefern. Die beiden genannten Harze sind dabei einander in jeder Beziehung gleichwertig. Die Harze dieses Typus haben sich ferner in der Humanmedizin bereits einen festen Platz erorbert, indem sie dort in massiven Dosen zwecks Ausscheidung von Elektro lyten aus dem Organismus verabreicht wurden.
Daher besteht auch keine Gefahr nachteiliger Wirkung nach oraler Einnahme von 2 g des Harzes, wie dies zur Bestimmung der Magensäure vorgesehen ist.
2, 6-Diamino-3 -phenylazo-pyridin wird von der Merck Inc., Rahway, New Jersey, unter der eingetragenen Marke Pyridium und von der Mallinckrodt Chemical Works, St. Louis, Missouri, unter der eingetragenen Marke Mallophene in den Handel gebracht. Dieser Farbstoff ist im Arzneimittelschatz schon seit längerer Zeit als Analgeticum der Harnwege eingeführt und besitzt daher mit Sicherheit keine unerwünschten Nebenwirkungen.
Man bereitet den Harzkomplex des oben beschriebenen Farbstoffes zweckmässig wie folgt: Man schüttelt das Harz in der H-Form rund dreissig Minuten lang mit einer Lösung des Farbstoffes. Darauf wird das Produkt auf einem Saugfilter gesammelt und der überschüssige Farbstoff ausgewaschen. Es wurde gefunden, dass der erhaltene Harzkomplex 25 bis 30 mg Farbstoff pro Gramm des Komplexes enthält. Da die Dosis des genannten Farbstoffes zur Schmerzbekämpfung (Urogenitalwege) dreimal täglich 200 mg beträgt, so kann angesichts der Menge von 30 mg pro g Harzkomplex keine Gefahr toxischer Nebenwirkungen bestehen, wenn für die Untersuchung eine Gabe von 2 g des Harzes verwendet wird.
Bei der Durchführung von Eluierversuchen mit Amberlite IRC-50 und Permutit H-70 wurde gefunden, dass das 2,6-Diamino3-phenylazo-pyridin aus seiner Harzkomplexverbindung mit hoher Ausbeute wieder freigesetzt wird. Beim Eluieren der Harzkomplexe mit Salzsäure verschiedener Konzentrationen, wie sie einerseits bei normalen Individuen und anderseits bei Individuen mit Anacydität vorkommen können, zeigt sich, dass im Salzsäurekonzentrationsbereich 0,01-0,1 n aus 1 g Harzkomplex 22-25,5 mg des Farbstoffes in Freiheit gesetzt werden. Von gleich grosser Bedeutung ist ferner das Ergebnis aus früher unternommenen und hier bestätigten Versuchen, wonach 50750/o einer oral verabreichten Menge des Farbstoffes im Urin ausgeschieden werden.
Bei den erwähnten Eluierversuchen ging man allgemein wie folgt vor:
100 mg des Harzkomplexes wurden mit 10 cm3 der Eluierflüssigkeit (Salzsäure in Konzentrationen von 0,1, 0,01, 0,001 und 0,0001 n) 10 Minuten lang geschüttelt. Sodann wurde die Lösung mit einer Pipette abgetrennt und die Eluierung weitere neun Male wiederholt. Die Lösungen mit dem eluierten Farbstoff wurden analysiert, indem man bei den mit 100/oiger Salzsäure auf 1 : 10 oder 1:100 verdünnten Lösungen die optische Dichte bei 500 me ermittelte.
Die Eluierung mit 0,01 und 0,1 n HC1 ergab für beide Harze annähernd übereinstimmende Resultate, indem nach zehn Eluierungen jeweils 22 bis 28,5 mg des Farbstoffes pro g Harzkomplex freigesetzt wurden.
Weiter wurden die Bestimmung der Magen säure mit der erfindungsgemäss hergestellten Mittel auch in vivo erprobt. Dabei verabreicht man einer Versuchsperson oral eine festgesetzte Menge des Harzkomplexes, worauf die Umwandlungsprodukte des Farbstoffes sowie etwa unveränderter Farbstoff innert relativ kurzer Zeit im Urin erscheinen. Das 2,6-Diamino-3-phenylazo-pyridin und dessen Umwandlungsprodukte lassen sich im Urin leicht durch Zufügen einer Säure zum Urin nachweisen, da die erwähnten Stoffe sich alsdann orangerot verfärben.
Die Menge der gefärbten Stoffe kann im Spektrophotometer bei 500 m,, bestimmt werden. Anderseits benutzte man aber auch eine einfache Farbfleckprobe, wie sie nachfolgend beschrieben ist, um die blosse Anwesenheit oder Abwesenheit des Farbstoffes und seiner Umwandlungsprodukte im Urin festzustellen.
Die Prüfung des Harzkomplexes erfolgte sowohl bei Personen mit normaler Magenacidität wie bei solchen Personen, bei denen eine Anacidität nachgewiesen war; dabei verwendete man verschiedene Magenstimulantien, wie Äthylalkohol, Coffein, Natriumbenzoat und Kaffeetrockenextrakt Nescafe (eingetragene Marke). Bei Benutzung von Nescafe als Stimulans für den Magensäurefluss ging man wie folgt vor: a) Die Versuchsperson entleerte im nüchternen Zustand den Urin, der verworfen wurde, und nahm sodann 5 g löslichen Kaffee-Extrakt Nescafe in einem halben Glas heissem Wasser ein. b) Nach Ablauf einer Stunde entleerte die Versuchsperson den Urin, der als Kontrollprobe aufbewahrt wurde.
Darauf nahm die Person 2 g 2,6-Di- amino-3-phenylazo-pyridin-Harz-Komplex ein, der in einem Viertelglas Wasser aufgeschlämmt war, und trank anschliessend ein weiteres Viertelglas Wasser zum Nachspülen. c) Eine Stunde nach dem Einnehmen des Farbstoff-Harz-Komplexes wurde von der Versuchsperson eine Urinprobe gesammelt. d) Zwei Stunden nach dem Einnehmen des Farbstoff-Harz-Komplexes wurde von der Versuchsperson eine weitere Urinprobe gesammelt.
Verwendet man eine Dosis von 2 g des Farbstoff Harz-Komplexes, so kann dann auf Magenanacidität geschlossen werden, wenn die ausgeschiedene Menge des Farbstoffes und seiner Umwandlungsprodukte nach Ablauf einer Stunde weniger als rund 0,3 mg beträgt, oder wenn die Totalausscheidung nach Ablauf von 2 Stunden weniger als rund 0,8 mg beträgt.
Dies erklärt sich daraus, dass der Farbstoff aus den genannten Harzkomplexen bei einem PH unter 4 freigesetzt wird, während diese Harzkomplexe bei einem PH über 4 den Farbstoff nur in ganz geringfügigem Mass freigeben.
Die oben erwähnte Farbstoffprobe zum Nach- weis des Farbstoffes im Urin kann so ausgeführt werden, dass man eine kleine Menge der Urinprobe so ansäuert, dass die Farbänderung abgegrenzt erfolgt und leicht beobachtet werden kann. Vorzugs- weise bringt man hierzu fünf Tropfen des Urins auf eine aufsaugende Unterlage, z. B. aus Fasercellulose oder Asbest oder Mischungen der beiden Materialien. Darauf wird auf den benetzten Bezirk der aufsaugenden Unterlage eine Tablette mit der folgenden oder einer vergleichbaren Zusammensetzung gelegt:
Sulfosalicylsäure, kristallin 126,6 mg
Natriumbikarbonat, gepulvert 17,7 mg
Borsäure, trockenes Pulver 17,7 mg
162,0 mg
Diese Tablette wird sodann mit z. B. zwei Tropfen Wasser befeuchtet.
Wenn der untersuchte Urin 2,6-Diamino-3-phenylazopyndin oder dessen Umwandlungsprodukte enthält, so nimmt der Bezirk auf der Unterlage rings um die Tablette alsbald eine rote Färbung an.
Eine Tablette der oben angegebenen Zusammensetzung liefert bei normalem Magensäuregehalt sehr deutliche Färbungen; indessen sind die Mengen der Komponenten in der Tablette nicht kritisch, solange genügend Säure anwesend ist, um eine Acidität im pH-Bereich 4 oder darunter zu erzeugen.
Ferner kann man auch andere feste starke Säuren, wie Zitronensäure, Weinsäure und Maleinsäure verwenden. Um eine genügende Berührung zwischen der Urinprobe und dem aktiven Tablettenbestandteil zu gewährleisten, kann der Tablette eine kleine Menge Natriumbikarbonat einverleibt werden, wodurch die Auflösung der Tablette erleichtert wird; ferner kann eine kleine Borsäuremenge zugesetzt werden, um die Tablettierung zu erleichtern. Bei der Ausführung der Probe wird alsdann aus dem Natriumbikarbonat durch Umsatz mit der Säure Kohlendioxyd freigesetzt, welches das Zerbröckeln und Auflösen der Tablette beschleunigt, worauf die Anwesenheit oder Abwesenheit des Farbstoffes im Urin durch die einfache Farbfleckreaktion nachgewiesen werden kann.
Process for the preparation of an agent for the determination of gastric acidity
The present invention relates to a process for the production of an agent for the qualitative and quantitative determination of gastric acid. The agent produced according to the invention can be used specifically for the detection of gastric anacidity. The determination of gastric anacidity is of practical importance for the detection of gastric cancer. Namely, it has been found that gastric cancer is more common in individuals suffering from gastric anacidity than in the population as a whole.
In Proc. Soc. Exp. Biol. And Med. (1950), 74, 218, Segal, Miller and Morton described a method for determining gastric acidity without gastric elevation. In order to obtain information about the stomach contents without using the gastric tube, the authors choose an indirect method that includes a urinalysis.
The investigation technique worked out by Segal and co-workers was based on giving the test subject a substance from which a substance is released in the stomach in the presence of free acid, which is excreted through the kidneys after entering the blood and finally emptied with the urine. The compound used was a quinine cation exchange resin complex.
The quinine was released by the gastric hydrochloric acid after ingestion of the quinine-resin complex in the stomach. The amount of quinine in the urine was determined by extracting the urine with ether and then extracting the ither fraction with 0.1 N sulfuric acid. The acidic aqueous quinine solution was then irradiated with ultraviolet light, and the fluorescence of the solution was measured in a fluorophotometer. This procedure was rather complicated and required the use of a fluorophotometer, which is a specialized instrument that is not standard clinical laboratory equipment.
Segal also found that of the total dose of 20-40 mg quinine administered, only about 10% or even less was excreted in the urine. The determination of such small amounts of quinine naturally caused difficulties.
Another disadvantage of the investigation method was that the measurements were falsified by the simultaneous presence of a number of substances, mainly quinine suppliers and fluorescent substances having a disruptive effect.
Therefore, before carrying out the examination with the quinine-resin complex, one had to refrain from administering vitamins and a number of medicaments to the patient for several days.
The method according to the invention for producing an orally administrable agent for the determination of gastric acid is characterized in that a cation exchange resin in the H form is reacted with 2,6-diamino-3-phenylazopyridine.
To determine gastric acid using the agent prepared according to the invention, neither expensive equipment nor special technical skills are required.
Furthermore, the said dye occurs in the urine in such an amount that it can be easily detected colorimetrically.
Furthermore, the examination is not disturbed by the presence of foreign matter.
The preferred cation exchange resin is Amberlite IRC-50 (registered trademark), a resin crosslinked by acrylic acid and containing carboxyl groups, manufactured by Rohm & Haas, Philadelphia, Pennsylvania, or Permutit H-70 (registered trademark), a resin containing corboxyl groups, manufactured by Permutit Company, New York, NY. Of the large number of cation exchange resins tested, Amberlite IRC-50 (quality per analysi) and Permutit H-70 clearly seem to give the best results. The two resins mentioned are equivalent to one another in every respect. The resins of this type have also already gained a firm place in human medicine, where they were administered in massive doses for the purpose of excreting electrolytes from the organism.
There is therefore no risk of adverse effects after oral ingestion of 2 g of the resin, as is intended for the determination of gastric acid.
2,6-Diamino-3-phenylazo-pyridine is marketed by Merck Inc., Rahway, New Jersey, under the registered trademark Pyridium and by Mallinckrodt Chemical Works, St. Louis, Missouri, under the registered trademark Mallophene . This dye has been in the drug store for a long time as an analgesic for the urinary tract and therefore certainly has no undesirable side effects.
The resin complex of the dye described above is conveniently prepared as follows: The resin is shaken in the H-shape for about thirty minutes with a solution of the dye. The product is then collected on a suction filter and the excess dye is washed out. The resulting resin complex was found to contain 25 to 30 mg of dye per gram of the complex. Since the dose of the mentioned dye to combat pain (urogenital pathways) is 200 mg three times a day, given the amount of 30 mg per g resin complex, there is no risk of toxic side effects if 2 g of the resin is used for the examination.
When carrying out elution tests with Amberlite IRC-50 and Permutit H-70, it was found that the 2,6-diamino-3-phenylazo-pyridine is released again from its resin complex compound with high yield. When the resin complexes are eluted with hydrochloric acid of various concentrations, as can occur on the one hand in normal individuals and on the other hand in individuals with anacydicity, it is found that in the hydrochloric acid concentration range 0.01-0.1 n from 1 g resin complex 22-25.5 mg of the dye be set free. Equally important are the results from earlier experiments confirmed here, according to which 50750 / o of an orally administered amount of the dye is excreted in the urine.
The general procedure for the elution tests mentioned was as follows:
100 mg of the resin complex were shaken with 10 cm3 of the eluting liquid (hydrochloric acid in concentrations of 0.1, 0.01, 0.001 and 0.0001N) for 10 minutes. The solution was then separated with a pipette and the elution repeated nine more times. The solutions with the eluted dye were analyzed by determining the optical density at 500 me for the solutions diluted to 1:10 or 1: 100 with 100% hydrochloric acid.
The elution with 0.01 and 0.1 N HCl gave approximately the same results for both resins, in that after ten elutions in each case 22 to 28.5 mg of the dye were released per g of resin complex.
In addition, the determination of gastric acid with the agents produced according to the invention were also tested in vivo. Here, a test person is administered orally a fixed amount of the resin complex, whereupon the conversion products of the dye and roughly unchanged dye appear in the urine within a relatively short time. The 2,6-diamino-3-phenylazo-pyridine and its conversion products can easily be detected in the urine by adding an acid to the urine, since the substances mentioned then turn orange-red in color.
The amount of colored substances can be determined in the spectrophotometer at 500 m. On the other hand, a simple color stain sample, as described below, was used to determine the mere presence or absence of the dye and its conversion products in the urine.
The examination of the resin complex was carried out both in persons with normal gastric acidity and in those persons in whom anacidity was proven; various gastric stimulants were used, such as ethyl alcohol, caffeine, sodium benzoate and Nescafe dry coffee extract (registered trademark). When using Nescafe as a stimulant for gastric acid flow, the procedure was as follows: a) The test person emptied the urine on an empty stomach, which was then discarded, and then took 5 g of soluble coffee extract Nescafe in half a glass of hot water. b) After one hour, the test person emptied the urine, which was kept as a control sample.
The person then took 2 g of 2,6-di-amino-3-phenylazo-pyridine-resin complex, which was suspended in a quarter glass of water, and then drank a further quarter glass of water for rinsing. c) One hour after ingesting the dye-resin complex, a urine sample was collected from the test subject. d) Two hours after ingesting the dye-resin complex, another urine sample was collected from the test subject.
If a dose of 2 g of the dye-resin complex is used, gastric anacidity can be inferred if the amount of dye and its conversion products excreted after one hour is less than around 0.3 mg, or if the total excretion after 2 hours is less than around 0.8 mg.
This is explained by the fact that the dye from the resin complexes mentioned is released at a pH below 4, while these resin complexes only release the dye to a very minor extent at a pH above 4.
The dye sample mentioned above for the detection of the dye in the urine can be carried out in such a way that a small amount of the urine sample is acidified in such a way that the change in color occurs in a delimited manner and can be easily observed. For this purpose, five drops of the urine are preferably placed on an absorbent pad, e.g. B. from fiber cellulose or asbestos or mixtures of the two materials. A tablet with the following or a comparable composition is then placed on the wetted area of the absorbent pad:
Sulfosalicylic acid, crystalline 126.6 mg
Sodium bicarbonate powder 17.7 mg
Boric acid, dry powder 17.7 mg
162.0 mg
This tablet is then coated with e.g. B. moistened two drops of water.
If the urine examined contains 2,6-diamino-3-phenylazopyndine or its conversion products, the area on the surface around the tablet immediately turns red.
A tablet of the composition given above gives very clear colorations with normal gastric acid content; however, the amounts of the components in the tablet are not critical as long as enough acid is present to produce an acidity in the pH range 4 or below.
Other solid strong acids such as citric acid, tartaric acid and maleic acid can also be used. To ensure adequate contact between the urine sample and the tablet active ingredient, a small amount of sodium bicarbonate can be incorporated into the tablet, which will facilitate the dissolution of the tablet; a small amount of boric acid can also be added to facilitate tableting. When carrying out the test, carbon dioxide is then released from the sodium bicarbonate by reaction with the acid, which accelerates the crumbling and dissolving of the tablet, whereupon the presence or absence of the dye in the urine can be demonstrated by the simple reaction of colored spots.