Verfahren zur Stabilisierung wässriger Hyaluronidaselösungen Hyaluronidase ist ein proteinartiges En- zytn, das die Eigenschaft besitzt, Hyaluron- säure zu hy drolysier en. Hyaluronsäure ist ein Mlucopolysacclharid von hohem Molekularge wicht, das eine wichtige Komponente der Grund- oder Kittsubstanz der Gewebe dar stellt. Ihre wässerigen Lösungen besitzen eine lholhe Viskosität.
Wegen ihrer lhydrolytisclhen Wirkung auf Hyaluronsäure hat sieh Hyaluronidase für klinische Zwecke zur Erleichterung der Ab sorption von therapeutischen Flüssigkeiten durch die Gewebe als geeignet erwiesen. Ihre günstige Wirkung beruht offenbar auf der Reduktion der Viskosität der Gewebeflüssig keiten infolge ihrer hydroly tischen Wirkung auf Hyaluronsäure, wobei die infolge dieser Hydrolyse reduzierte Viskosität eine raschere Diffusion der eingeführten therapeutischen Flüssigkeit ermöglicht. Durch Verwendung von Hyaluronidase kann zum Beispiel in vielen Fällen statt einer intravenösen Injek tion eine subkutane Infusion ausgeführt wer den, was sowohl für den Patienten als auch für den Arzt von Vorteil ist. Hyaluronidase kann auch mit Vorteil bei Lokalanästhesien verwendet werden. Es sind auch noch andere Anwendungen bekannt.
Hyaluronidase wurde bis jetzt in fester Form in den Handel gebracht, zum Beispiel als Pulver in Ampullen, die zur Erleichte- rung des Gebrauches solcher Präparate ein inertes Excipiens enthielten. Obschon es vom medizinischen Standpunkt aus vorteilhaft ge wesen wäre, die Hyaluronidase in Form von wässerigen Lösungen zur Verfügung zu haben, war dies wegen der Unbeständigkeit solcher Lösungen nicht möglich.
Mit der vorliegenden Erfindung wird be zweckt, wässerige Lösungen von Hyaluroni- dase, insbesondere solche, die sich für die parenterale Verabreichung eignen, zu stabili sieren und ihnen damit eine genügende Be ständigkeit zu verleihen, um in den Handel gebracht und vor der Abgabe an den Ver- braueher aufbewahrt werden zu können, bei spielsweise bei Temperaturen von 15 bis 30 C.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Sta bilisieren wässeriger Hyaluronidaselösungen ist dadurch gekennzeichnet, dass man in einer wässerigen Lösung von Hyaluronidase Äthy- lendiamintetraessigsäure oder eines ihrer was serlöslichen Salze und ein Alkali- oder Erd- alkalimetallchlorid löst.
Äthylendiamintetraessigsäure, abgekürzt ADTE, ist wegen ihrer Eigenschaft, mit Sehwermetallionen Komplexe zu bilden, be reits zum Stabilisieren verschiedener Chemi kalien, einschliesslich Pharmazeutika, verwen det worden.
Bei der Unbeständigkeit von wässerigen Hyaluronidaselösungen spielen jedoch andere Faktoren als Sehwernmetallionen die Haupt rolle.
Der einzige Versuch, ADTE zusammen mit Hyaluronidase zu verwenden, ist in einer Arbeit von Meyer und Rapport in J. Biol. Chem. 188, 485 bis 490 (1951), beschrieben. Diese Autoren haben die sofortige Inaktivie- rung von Hy aluronidase durch Schwermetall ionen und ihre Reaktivierung sowie die Ver hinderung der Inaktivierung durch verschie dene organische und anorganische Substanzen untersucht. Sie haben die Möglichkeit in Er wägung gezogen, dass die Wirkung des Schutz mittels auf einer Art Konkurrenz zwischen der Hyaluronidase und dem Sehutzmittel in der Affinität gegenüber den Schwermetall ionen beruhen könnte. In dem Masse, als das Schutzmittel bei dieser Konkurrenz obenauf schwingt, wird die Hyaluronidase gesehützt.
Als Schutzmittel wurde u. a. das Markenpro dukt Versene , eine Handelsform von ADTE, versucht. Die genannten Autoren haben aus ihren Versuchen geschlossen, dass ehelatbil- dende Substanzen, wie zum Beispiel 8- Hydroxy-chinolin (= Oxine ) und Ver- sene , bezüglich der Affinität gegenüber dem Metall schlechte Konkurrenten des Enzyms seien. Es ist zu beachten, dass die genannten Autoren nur die momentane und reversible Inaktivierung des Enzyms, und rieht seine Beständigkeit auf lange Sicht untersucht haben.
Neuere Untersuchungen haben nun ge zeigt, dass nicht Sechwermetallionen, sondern andere Faktoren für die Inaktivierung der Hyaluronidase von wesentlicher Bedeutung sind. So ist beispielsweise das mittels Kupfer gereinigte Enzym in wässerigen Lösungen be ständiger als das mittels Alkohol gereinigte, obschon das erstere einen höheren Gehalt an Kupfer- und Eisenverunreinigungen aufweist. Die mittels Alkohol gereinigte Hyahlronidase wird jedoch vom klinischen Standpunkt ans wegen ihrer höheren Reinheit und vom Her steller wegen der höheren Wirksamkeit des Reinigungsverfahrens bevorzugt. Bei der In- aktivierung der Hyaluronidase in wässeriger Lösung spielen Oberfläehenkräfte eine wieh- tige Rolle.
Es seheint, dass in verdünnten wässerigen Lösungen des Enzyms die Protein moleküle die Tendenz haben, sieh an der Grenzfläehe zwischen Luft und Wasser anzu reichern. Unter diesen Bedingungen wirken offenbar die nicht beanspruehten Oberflächen kräfte auf einige der schwaehen Bindungen zwisehen den Aminosäureketten, wodureh ein teilweiser Zerfall der Proteinmoleküle und dadurch ein Verlust der Enzymwirksamkeit verursacht wird. Diese Theorie der Inaktivie- rung des Enzyms soll jedoelh rieht als einzig mögliche hingestellt werden.
Dureh verglei chende Versuche wurde gezeigt, dass bei einer Vergrösserung der Grenzfläehe Luft/Wasser von verdünnten wässerigen Hyaluronidase- lösungen die Inaktivierungsgesehwindigkeit stark zunimmt. Dass diese Inaktivierung nietet auf einer Oxydation beruht, wurde dadureh bewiesen, dass solche Lösungen, wenn sie mit Sauerstoff gesättigt wurden, keine Steigerung der Inaktivierung aufweisen.
ADTE reduziert die Inaktivierung von Hyaluronidase in erhebliehemn Ausmass infolge Oberfläechenwirkung.
Die Beständigkeit verdünnter wässeriger Hyaluronidaselösungen wird auch dureh die Gegenwart gewisser Salze günstig beeinflusst. Kleine Mengen Natriumehlorid oder Caleiumn- chlorid zum Beispiel üben auf soleche Lösun gen eine stabilisierende Wirkung aus.
Aus den obigen Ausführungen geht her vor, dass die Inaktivierung von Hy aluronidase auf einem komplizierten Meehanisnmus beruht, bei welchem die Gegenwart von Selhwermetall- ionen eine verhältnisnmässig untergeordnete Rolle spielt. Möglicherweise spielen auch noeli andere, bisher nicht gefundene Faktoren eine Rolle. Es konnte auf Grund der bisherigen Kenntnisse rieht vorausgesehen werden, dass ADTE auf alle bekannten Inaktivierungsreak- tionen der Hv aluronidase eine starke hem inende Wirkung ausübt.
Diese experimentell festgestellte Tatsaehe gibt nun Anlass zur sehwierigen Frage nach dem lleelianismns der Sehutzwirkung. Es ist. bis jetzt nielit gelungen, den die Stabili sierung verursachenden Meelianismus eindeu- tig aufzuklären. Es ist auch möglich, dass die Schutzwirkung mindestens teilweise auf der Bildung eines Komplexes aus Hyaluronidase und Äthylendiamintetraessigsäure beruht, der beständiger als die freie Hyaluronidase ist und die Enzymwirkung der letzteren nicht stört.
Erfindungsgemäss kann eine wässerige 11y aluronidaselösung zum Beispiel wie folgt stabilisiert werden: Man löst in einer wässe rigen Lösung von Hyaluronidase, zum Beispiel in einer solchen, die 25 bis 1000 TRE/cm3 enthä lt (TRE ist die Abkürzung für soge- nunte trübungsreduzierende Einheiten, wie nie bei der von Alburn und Whitley im J. Biol. Chem. 192, 379 bis 393 [1951] be schriebenen Trübungsmethode verwendet wer den) und die keine fiebererzeugenden Agen zien aufweist, 0,15 Mol Natrium- oder Cal- ciumchllorid pro Liter sowie 0,1 bis 1,0 mg des Dinatriumsalzes von ADTE pro cm2 Lösung. Das PH der resultierenden Lösung ist ungefähr neutral, das heisst liegt zwischen 6,0 und 8,0.
Ein bestimmtes PH kann durch Zu gabe eines Puffers, zum Beispiel eines Phos phatpuffers von 0,01 Ionenstärke, eingestellt werden. Der Lösung kann auclh noch eine kleine Menge eines Konservierungsmittels, wie zum Beispiel das Markenprodukt Merthiolat (Natrium - äthylquecksilberthiosalicylat) in einer Konzentration von 1 :10 000, zugegeben werden.
In den handelsüblichen Hyaluronicdaseprä- paraten sind durchschnittlich 150 TRE in 0,2 mg enthalten. Somit sind in 0,033 mg 25 TRE und in 1,33 mg 1000 TRE enthalten. Für allgemeine therapeutische Zwecke eignen sieh Lösungen mit 150 bis 200 TRE/em3. Wenn jedoch nur eine kleine Fläche oder ein kleines Volumen mit der Lösung behandelt werden soll, beispielsweise bei Zahnanästhe sien, kann es zweckmässig sein, verdünntere Lösungen zu verwenden, zum Beispiel eine solche, die nur 25 bis 30 TRE/cm3 enthält. In andern Fällen hingegen, beispielsweise bei der Behandlung von Nierensteinen, ist es zweckmässig, konzentriertere Lösungen, zum Beispiel eine solche mit 600 TRE/cm3 oder mehr, zu verwenden.
Es wurde ferner gefunden, dass durch Zugabe einer kleinen Menge einer einfachen Aminosäure, wie zum Beispiel Glycin oder Ar ginin, in gewissen Fällen die Schutzwirkung der ARTE verstärkt werden kann.
Die im folgenden angeführten Zahlenwerte wurden auf Grund von nach der Methode von Alburn und Whitley (loc. cit. supra) durch geführten Analysen erhalten.
Die mittels Kupfer gereinigte Hyaluroni- dase wurde ans frischeingefrorenen Rinder hoden nach der auf den Arbeiten von Hahn, Biochemische Zeitschrift 315, 83 bis 96 (19J3), beruhenden Methode hergestellt, während die mittels Alkohol gereinigte Hyaluronidase nach der Methode von Tint und Bogash, J. Biol. Chem. 184, 501 (1950), hergestellt wurde. a) Beständigkeit von mittels zAlkohol gereinig ter Hyaluronidase in verschiedenen Medien bei 37 C Die Lösungen wurden in wässerigem Mer- thiolat der Konzentration 1 :10 000 herge stellt und enthielten 192 TRE/cm3. Portionen von 5 cm3 der Lösung wurden in Fläschchen von 5 cm3 Inhalt bei 37 C stehengelassen.
EMI0003.0013
Verlust <SEP> an <SEP> Wirksamkeit <SEP> in
<tb> Lösung
<tb> 30 <SEP> Tage <SEP> 60 <SEP> Tage
<tb> Wasser <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 0,01 <SEP> Mol/Liter <SEP> Phosphatpuffer, <SEP> pH <SEP> 7,0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <B>0,115</B> <SEP> Mol/Liter <SEP> NaCl <SEP> 9 <SEP> 38
<tb> 0,15 <SEP> Mol/Liter <SEP> CaCl2 <SEP> 23 <SEP> 39
<tb> 1 <SEP> mg/cm3 <SEP> ADTE <SEP> <B>-</B>Na. <SEP> 75 <SEP> 94
<tb> 1 <SEP> mgcm3 <SEP> ADTE <SEP> # <SEP> Na. <SEP> + <SEP> 0,15 <SEP> MolfLiter
<tb> Nacl <SEP> 4 <SEP> 11D G) Einfluss des Verhältnisses der G2-cnzfläcle Luft/Wasser zum Volumen der Lösung.
<I>Ohne Schütteln</I> Die Lösungen von mit Alkohol gereinigter Hyaluronidase wurden in wässerigem Mer- thiolat der Konzentration 1 :10 000 herge stellt und enthielten 192 TRE/cm3. Portionen von 3 cm3 oder 10 em3 wurden in Fläschchen von 10 em3 Inhalt bei 37 C ohne Schütteln gelagert.
EMI0004.0001
Verlust <SEP> an <SEP> Wirksamkeit <SEP> in <SEP> %
<tb> Lösung <SEP> nach <SEP> 30 <SEP> Tagen
<tb> Fläschchen <SEP> volle
<tb> mit <SEP> 3 <SEP> em3 <SEP> Fläschchen
<tb> 0,15 <SEP> Mol/Liter <SEP> NaCl <SEP> 35 <SEP> 14
<tb> 1 <SEP> mg/cm3 <SEP> ADTE <SEP> ³ <SEP> Na2 <SEP> + <SEP> 0,15 <SEP> Mol/Liter
<tb> NaCl <SEP> 6 <SEP> 6 e) Einfluss des Verhältnisses der Grenzfläche Luft/Wasser zum Volumen der Lösung.
Mit Schütteln Je 0,5 cm3 von 170 TRE/em3 enthaltenden Lösungen, hergestellt wie unter b) beschrieben, wurden in Fläsehehen von 10 em3 Inhalt ge geben. Die Fläsehehen wurden in horizontaler Lage an einem auf 37 C gehaltenen und mit 120 Umdrehungen/Min. rotierenden Kugel mühlenbehälter befestigt.
EMI0004.0002
Lösung <SEP> Verlust <SEP> an <SEP> Wirksamkeit <SEP> in <SEP> %
<tb> nach <SEP> 20 <SEP> Stunden
<tb> 0,15 <SEP> Mol/Liter <SEP> NaCl <SEP> 70
<tb> 1 <SEP> mg/cm3 <SEP> ARTE <SEP> ³ <SEP> Nag, <SEP> + <SEP> 0,15Mol/Liter <SEP> NaCl <SEP> 19 d) Vergleich zwischen dem Verhalten ton mittels Kupfer gereinigter und mittels Alkohol gereinigter Hyaluronidase Lösungen von mit Kupfer gereinigter Hyaluronidase, die 145 TRE/em3, 0,15 Mol/ Liter NaCl und 0,01 Mol/Liter Phosphatpuf- fer in wässeriger Merthiolat -Lösung der Konzentration 1:10000, mit und ohne ADTE ³ Nag, enthielten und ein pH von 7,0 aufwiesen, wurden während der unten ange führten Zeiten bei 37 C gelagert.
EMI0004.0003
Verlust <SEP> an <SEP> Wirksamkeit <SEP> in <SEP> %
<tb> Lösung <SEP> nach <SEP> nach
<tb> 41 <SEP> Tagen <SEP> 90 <SEP> Tagen
<tb> ohne <SEP> ADTE <SEP> 19 <SEP> 33
<tb> 1 <SEP> mg/cm3 <SEP> ADTE <SEP> ³ <SEP> Na2 <SEP> 8 <SEP> 17 Für die folgenden Versuche wurden mit tels Alkohol gereinigte Hyaluronidaselösungen verwendet, die 192 TRE/em3 enthielten, sonst. aber gleich zusammenaesetzt waren wie die obigen Lösungen.
EMI0005.0001
Verlust <SEP> an <SEP> Wirksamkeit <SEP> in
<tb> Lösung <SEP> nach <SEP> nach <SEP> nach
<tb> 15 <SEP> Tagen <SEP> 32 <SEP> Tagen <SEP> 60 <SEP> Tagen
<tb> ohne <SEP> ADTE <SEP> 27 <SEP> 35 <SEP> 37
<tb> 1 <SEP> mg/em3 <SEP> ADTE <SEP> ³ <SEP> Na, <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 10
<tb> Metallverunreinigungen <SEP> in <SEP> den
<tb> Hyaluronidaselösungen <SEP> bei <SEP> den <SEP> oben
<tb> beschriebenen <SEP> Versuchen
<tb> Cu <SEP> Fe
<tb> mittels <SEP> Kupfer <SEP> gereinigt <SEP> 0,2% <SEP> 0,03%
<tb> mittels <SEP> Alkohol <SEP> gereinigt <SEP> 0,002 <SEP> 0,01 e)
Beständigkeit der Hyaluronidase bei 3i C auf lange <I>Sicht</I> Lösungen von mittels Kupfer gereinigter Hyaluronidase mit einer Aktivität von 1350 TRE/mg in wässeriger Merthiolat - Lösung der Konzentration 1 :10 000, die eine Enzymkonzentration von 145 TRE/em3 auf wiesen und 0,15 Mol/Liter NaCl sowie einen Phosphatpuffer der Ionenstärke 0,01 enthiel ten, wurden während der nachstehend ange führten Zeiten bei 37 C gelagert.
EMI0005.0006
Lösung <SEP> Verlust <SEP> an <SEP> Wirksamkeit <SEP> in <SEP> l
<tb> 41 <SEP> Tage <SEP> 90 <SEP> Tage <SEP> 136 <SEP> Tage <SEP> 6 <SEP> Monate <SEP> 9 <SEP> Monate
<tb> ohne <SEP> ADTE <SEP> 19 <SEP> 33 <SEP> 50 <SEP> 55 <SEP> 61
<tb> 1 <SEP> mng/ems <SEP> ADTE <SEP> ³Na, <SEP> 8 <SEP> 17 <SEP> 32 <SEP> 28 <SEP> 34 Aus diesen Versuehsresultaten lassen sich gewisse Schlüsse ziehen: 1. Eine verdünnte Lösung von Hyaluroni- dase in Wasser ist äusserst unbeständig, in dem sie ihre ganze Wirksamkeit innert 15 Tagen bei 37 C verliert. Durch Puffern der Lösung auf pH 7 mittels Phospbatpuffer kann sie rieht stabilisiert werden (Versuch a).
2. Kleine Mengen N aCl oder CaCl2 ver bessern die Beständigkeit der Lösung (Ver such a).
3. Vergrösserung der Grenzfläche zwisehen Luft und Wasser beschleunigt die Inaktivie- rung der Lösung (Versuche b und c).
4. Sehwermetallionen (Cu und Fe) üben offenbar keine wesentliche inaktivierende Wir- kurg ans (Versuch d). 5. Durch Zugabe von ADTE wird die Inaktivierungsgeschwindigkeit in Gegenwart einer kleinen Menge von Natrium- oder Cal- eiumchlorid während längerer Zeit bei einer die Inaktivierung an sich beschleunigenden Temperatur (37 C) unter allen untersuchten Bedingungen stark reduziert (Versuche a-e).
Diese Resultate sind überraschend. Es wurde bisher angenommen, dass Äthylendi- amintetraessigsäure bloss durch Bindung von Schwermetallionen wirke. Die Verwendung; dieser Säure als Stabilisiermittel ist deshalb bisher auf solche Fälle beschränkt geblieben. Tatsächlich wird in der einzigen Arbeit (Meyer und Rapport, loc. cit.), in welcher über die Verwendung von ADTE im Zusam- ; menhang mit Hyaluronidase berichtet wird, ausgeführt, dass die Affinität dieser Säure für Cu- und Fe-Ionen nicht grösser als die jenige des Enzyms ist.
Es ist zu beachten, dass die Versuche a-e bei 37 C durchgeführt wurden. Als mittlerer Bereich der Lagerungstemperaturen kann aber derjenige von 15 bis 30 C angenommen wer den, wobei die häufigsten Temperaturen zwi schen 20 und 25 C liegen. Da die Geschwin digkeit der Inaktivierung sich bei jeder Tem peraturerhöhung um 4 C etwa verdoppelt, ist es mittels der vorliegenden Erfindung durch aus möglich, klinisch brauchbare verdünnte wässerige Lösungen von Hyaluronidase zu er halten, die während mehrerer Monate eine angemessene Wirksamkeit beibehalten. Beispiel plan stellt eine wässerige Hyaluronidase- lösung her, die eine etwa zehnmal grössere Hyaluronidasekonzentration als die in der Endlösung gewünschte aufweist.
Dieser Lö sung werden pro Liter 8,50 g NaCl, 0,10 g Merthiolat , 1,00 g ADTE ³ Nag, 12,20 g wasserfreies Na2HP04 und 2,32g NaH2PO4 H20 zugesetzt. Die Lösung wird durch ein Bakterienfilter bei oder unter Raumtempera tur filtriert. Die sterile Lösung wird auf ihre Wirksamkeit hin geprüft. Diese Lösung wird dann mit einer Lösung, die 8,50 g NaCl 0,10 g Merthiolat , 1,00 g ADTE ³ Nag pro Liter enthält, verdünnt, wobei die Wirksam keit auf den gewünschten Wert gebracht wird, für allgemeine Zwecke beispielsweise auf 150 bis 175 TRE/cms. Das pH beträgt etwa 7,3. Die fertige Lösung wird hierauf in Ampullen aus wenig löslichem Glas eingefüllt. Die Am pullen sind von solcher Grösse, dass die Glrenz- fläche zwischen Luft und Flüssigkeit eine minimale Grösse aufweist.
Die Ampullen kön nen solche für Einzeldosen mit einem Inhalt von 1 cm3 oder für mehrere Dosen fmnit einem Inhalt von 5 em3 oder mehr sein. Ampullen von 5 cm3 Inhalt für mehrere Dosen haben sich für konzentriertere Lösungen (3000 TRE oder 600 TRE/cnm3 ) als zweckmässig erwiesen.
Process for stabilizing aqueous hyaluronidase solutions Hyaluronidase is a protein-like enzyme that has the property of hydrolyzing hyaluronic acid. Hyaluronic acid is a Mlucopolysaclharid of high molecular weight, which is an important component of the basic or cement of tissues. Their aqueous solutions have a high viscosity.
Because of its hydrolytic action on hyaluronic acid, hyaluronidase has proven useful for clinical purposes in facilitating the absorption of therapeutic fluids by tissues. Their beneficial effect is apparently based on the reduction in the viscosity of the tissue fluids as a result of their hydrolytic effect on hyaluronic acid, the reduced viscosity as a result of this hydrolysis allowing the therapeutic fluid introduced to diffuse more rapidly. By using hyaluronidase, for example, a subcutaneous infusion can be carried out instead of an intravenous injection in many cases, which is advantageous for both the patient and the doctor. Hyaluronidase can also be used to advantage in local anesthesia. Other uses are also known.
Hyaluronidase has hitherto been marketed in solid form, for example as a powder in ampoules which contained an inert excipient to facilitate the use of such preparations. Although it would have been advantageous from a medical point of view to have the hyaluronidase available in the form of aqueous solutions, this was not possible because of the instability of such solutions.
The present invention aims to stabilize aqueous solutions of hyaluronidase, in particular those which are suitable for parenteral administration, and thus to give them sufficient stability to be marketed and prior to delivery to the Consumers can be stored, for example at temperatures of 15 to 30 C.
The inventive method for stabilizing aqueous hyaluronidase solutions is characterized in that ethylenediaminetetraacetic acid or one of its soluble salts and an alkali or alkaline earth metal chloride is dissolved in an aqueous solution of hyaluronidase.
Ethylenediaminetetraacetic acid, abbreviated to ADTE, has already been used to stabilize various chemicals, including pharmaceuticals, because of its property of forming complexes with sight metal ions.
However, factors other than visual metal ions play the main role in the instability of aqueous hyaluronidase solutions.
The only attempt to use ADTE together with hyaluronidase is described in a work by Meyer and Rapport in J. Biol. Chem. 188, 485 to 490 (1951). These authors investigated the immediate inactivation of hyaluronidase by heavy metal ions and their reactivation as well as the prevention of inactivation by various organic and inorganic substances. You have considered the possibility that the effect of the protective agent could be based on a kind of competition between the hyaluronidase and the protective agent in the affinity to the heavy metal ions. To the extent that the protective agent swings on top in this competition, the hyaluronidase is protected.
As a protective agent was u. a. tried the branded product Versene, a commercial form of ADTE. The authors mentioned have concluded from their experiments that substances that form marriage, such as 8-hydroxy-quinoline (= oxines) and verses, are poor competitors of the enzyme with regard to their affinity for the metal. It should be noted that the authors mentioned have only investigated the instantaneous and reversible inactivation of the enzyme, and has investigated its long-term persistence.
More recent studies have now shown that not six-weight metal ions, but other factors are of essential importance for the inactivation of hyaluronidase. For example, the enzyme purified with copper is more stable in aqueous solutions than the enzyme purified with alcohol, although the former has a higher content of copper and iron impurities. However, the alcohol-purified hyahlronidase is preferred from the clinical standpoint for its higher purity and by the manufacturer for the higher efficiency of the purification process. In the inactivation of hyaluronidase in an aqueous solution, surface forces play an important role.
It can be seen that in dilute aqueous solutions of the enzyme the protein molecules have a tendency to accumulate at the interface between air and water. Under these conditions, the unused surface forces apparently act on some of the weak bonds between the amino acid chains, causing partial disintegration of the protein molecules and thereby a loss of enzyme activity. This theory of the inactivation of the enzyme should, however, be presented as the only possible one.
It was shown by comparative tests that the rate of inactivation increases sharply when the air / water interface of dilute aqueous hyaluronidase solutions is increased. That this inactivation is not based on an oxidation has been proven by the fact that such solutions, when they are saturated with oxygen, show no increase in inactivation.
ADTE reduces the inactivation of hyaluronidase to a considerable extent due to its surface effect.
The stability of dilute aqueous hyaluronidase solutions is also favorably influenced by the presence of certain salts. Small amounts of sodium chloride or calcium chloride, for example, have a stabilizing effect on such solutions.
From the above it can be seen that the inactivation of hyaluronidase is based on a complicated meehanism in which the presence of self-contained metal ions plays a relatively minor role. It is possible that noeli other factors not yet found play a role. On the basis of previous knowledge, it could be foreseen that ADTE has a strong inhibiting effect on all known inactivation reactions of HV aluronidase.
This experimentally established fact gives rise to the difficult question about the ileelianism of the protective effect. It is. So far we have not succeeded in unambiguously clearing up the Meelianism that caused the stabilization. It is also possible that the protective effect is based at least in part on the formation of a complex of hyaluronidase and ethylenediaminetetraacetic acid, which is more stable than the free hyaluronidase and does not interfere with the enzyme action of the latter.
According to the invention, an aqueous 11y aluronidase solution can, for example, be stabilized as follows: Dissolve in an aqueous solution of hyaluronidase, for example in one that contains 25 to 1000 TRE / cm3 (TRE is the abbreviation for so-called turbidity-reducing units, as never used in the turbidity method described by Alburn and Whitley in J. Biol. Chem. 192, 379 to 393 [1951]) and which has no fever-inducing agents, 0.15 mol of sodium or calcium chloride per liter and 0.1 to 1.0 mg of the disodium salt of ADTE per cm2 of solution. The pH of the resulting solution is approximately neutral, i.e. between 6.0 and 8.0.
A certain PH can be set by adding a buffer, for example a phosphate buffer of 0.01 ionic strength. A small amount of a preservative, such as the branded product merthiolate (sodium ethylmercury thiosalicylate) in a concentration of 1: 10,000, can also be added to the solution.
The commercially available hyaluronic acid preparations contain an average of 150 TRE in 0.2 mg. Thus, 0.033 mg contains 25 TRE and 1.33 mg contains 1000 TRE. For general therapeutic purposes see solutions with 150 to 200 TRE / em3. However, if only a small area or volume is to be treated with the solution, for example in the case of dental anesthesia, it may be advisable to use more dilute solutions, for example one that contains only 25 to 30 TRE / cm3. In other cases, however, for example in the treatment of kidney stones, it is advisable to use more concentrated solutions, for example those with 600 TRE / cm3 or more.
It has also been found that adding a small amount of a simple amino acid such as glycine or arginine can in certain cases increase the protective effect of ARTE.
The numerical values given below were obtained on the basis of analyzes carried out according to the method of Alburn and Whitley (loc. Cit. Supra).
The hyaluronidase purified by means of copper was produced on the freshly frozen bovine testes according to the method based on the work of Hahn, Biochemische Zeitschrift 315, 83 to 96 (19J3), while the hyaluronidase purified by means of alcohol was produced according to the method of Tint and Bogash, J. Biol. Chem. 184, 501 (1950). a) Resistance of hyaluronidase purified by means of alcohol in various media at 37 ° C. The solutions were prepared in aqueous mothiolate with a concentration of 1: 10,000 and contained 192 TRE / cm3. 5 cm3 portions of the solution were left to stand at 37 ° C. in 5 cm3 vials.
EMI0003.0013
Loss of <SEP> at <SEP> effectiveness <SEP> in
<tb> solution
<tb> 30 <SEP> days <SEP> 60 <SEP> days
<tb> water <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> 0.01 <SEP> mol / liter <SEP> phosphate buffer, <SEP> pH <SEP> 7.0 <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> <B> 0.115 </B> <SEP> mol / liter <SEP> NaCl <SEP> 9 <SEP> 38
<tb> 0.15 <SEP> mol / liter <SEP> CaCl2 <SEP> 23 <SEP> 39
<tb> 1 <SEP> mg / cm3 <SEP> ADTE <SEP> <B> - </B> Well. <SEP> 75 <SEP> 94
<tb> 1 <SEP> mgcm3 <SEP> ADTE <SEP> # <SEP> Na. <SEP> + <SEP> 0.15 <SEP> MolfLiter
<tb> Nacl <SEP> 4 <SEP> 11D G) Influence of the ratio of the G2 surface area air / water to the volume of the solution.
<I> Without shaking </I> The solutions of hyaluronidase purified with alcohol were prepared in aqueous mothiolate at a concentration of 1: 10,000 and contained 192 TRE / cm3. Portions of 3 cm3 or 10 em3 were stored in vials of 10 em3 at 37 C without shaking.
EMI0004.0001
Loss <SEP> to <SEP> effectiveness <SEP> in <SEP>%
<tb> Solution <SEP> after <SEP> 30 <SEP> days
<tb> vial <SEP> full
<tb> with <SEP> 3 <SEP> em3 <SEP> vials
<tb> 0.15 <SEP> mol / liter <SEP> NaCl <SEP> 35 <SEP> 14
<tb> 1 <SEP> mg / cm3 <SEP> ADTE <SEP> ³ <SEP> Na2 <SEP> + <SEP> 0.15 <SEP> mol / liter
<tb> NaCl <SEP> 6 <SEP> 6 e) Influence of the ratio of the air / water interface to the volume of the solution.
With shaking 0.5 cm3 of each solution containing 170 TRE / em3, prepared as described under b), was put into bottles of 10 em3. The Fläsehehen were held in a horizontal position on a 37 C and with 120 revolutions / min. rotating ball mill container attached.
EMI0004.0002
Solution <SEP> Loss <SEP> to <SEP> effectiveness <SEP> in <SEP>%
<tb> after <SEP> 20 <SEP> hours
<tb> 0.15 <SEP> mol / liter <SEP> NaCl <SEP> 70
<tb> 1 <SEP> mg / cm3 <SEP> ARTE <SEP> ³ <SEP> Nag, <SEP> + <SEP> 0.15Mol / liter <SEP> NaCl <SEP> 19 d) Comparison between the behavior ton Hyaluronidase purified with copper and purified with alcohol Solutions of hyaluronidase purified with copper, which contain 145 TRE / em3, 0.15 mol / liter NaCl and 0.01 mol / liter phosphate buffer in aqueous merthiolate solution with a concentration of 1: 10,000 with and without ADTE 3 Nag, and had a pH of 7.0, were stored at 37 ° C. for the times given below.
EMI0004.0003
Loss <SEP> to <SEP> effectiveness <SEP> in <SEP>%
<tb> Solution <SEP> after <SEP> after
<tb> 41 <SEP> days <SEP> 90 <SEP> days
<tb> without <SEP> ADTE <SEP> 19 <SEP> 33
<tb> 1 <SEP> mg / cm3 <SEP> ADTE <SEP> ³ <SEP> Na2 <SEP> 8 <SEP> 17 For the following experiments, alcohol-purified hyaluronidase solutions containing 192 TRE / em3 were used, otherwise . but were composed the same as the above solutions.
EMI0005.0001
Loss of <SEP> at <SEP> effectiveness <SEP> in
<tb> Solution <SEP> after <SEP> after <SEP> after
<tb> 15 <SEP> days <SEP> 32 <SEP> days <SEP> 60 <SEP> days
<tb> without <SEP> ADTE <SEP> 27 <SEP> 35 <SEP> 37
<tb> 1 <SEP> mg / em3 <SEP> ADTE <SEP> ³ <SEP> Na, <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 10
<tb> Metal contamination <SEP> in <SEP> den
<tb> Hyaluronidase solutions <SEP> at <SEP> the <SEP> above
<tb> described <SEP> attempts
<tb> Cu <SEP> Fe
<tb> cleaned with <SEP> copper <SEP> <SEP> 0.2% <SEP> 0.03%
<tb> cleaned with <SEP> alcohol <SEP> <SEP> 0.002 <SEP> 0.01 e)
Resistance of hyaluronidase at 3i C in the long term <I> view </I> solutions of hyaluronidase purified by means of copper with an activity of 1350 TRE / mg in aqueous merthiolate - solution of the concentration 1: 10 000, which has an enzyme concentration of 145 TRE / em3 and contained 0.15 mol / liter NaCl and a phosphate buffer with an ionic strength of 0.01, were stored at 37 ° C. for the times given below.
EMI0005.0006
Solution <SEP> Loss of <SEP> at <SEP> effectiveness <SEP> in <SEP> l
<tb> 41 <SEP> days <SEP> 90 <SEP> days <SEP> 136 <SEP> days <SEP> 6 <SEP> months <SEP> 9 <SEP> months
<tb> without <SEP> ADTE <SEP> 19 <SEP> 33 <SEP> 50 <SEP> 55 <SEP> 61
<tb> 1 <SEP> mng / ems <SEP> ADTE <SEP> ³Na, <SEP> 8 <SEP> 17 <SEP> 32 <SEP> 28 <SEP> 34 Certain conclusions can be drawn from these test results: 1. A diluted solution of hyaluronidase in water is extremely unstable in that it loses all of its effectiveness within 15 days at 37 ° C. It can be stabilized by buffering the solution to pH 7 with a phosphate buffer (experiment a).
2. Small amounts of NaCl or CaCl2 improve the stability of the solution (test a).
3. Enlarging the interface between air and water accelerates the inactivation of the solution (experiments b and c).
4. Heavy visual metal ions (Cu and Fe) evidently have no significant inactivating effect (experiment d). 5. By adding ADTE, the inactivation rate is greatly reduced in the presence of a small amount of sodium or calcium chloride over a longer period of time at a temperature that accelerates the inactivation (37 C) under all conditions investigated (experiments a-e).
These results are surprising. It was previously assumed that ethylene diamine tetraacetic acid only acts by binding heavy metal ions. The usage; this acid as a stabilizing agent has therefore hitherto been restricted to such cases. In fact, in the only work (Meyer and Rapport, loc. Cit.) In which on the use of ADTE in conjunction; In connection with hyaluronidase, it is reported that the affinity of this acid for Cu and Fe ions is not greater than that of the enzyme.
It should be noted that experiments a-e were carried out at 37 C. However, the middle range of storage temperatures can be assumed to be 15 to 30 C, the most common temperatures being between 20 and 25 C. Since the rate of inactivation approximately doubles with each temperature increase of 4 C, it is possible by means of the present invention to obtain clinically useful dilute aqueous solutions of hyaluronidase which maintain adequate effectiveness for several months. Example plan produces an aqueous hyaluronidase solution that has a hyaluronidase concentration that is about ten times greater than that required in the final solution.
8.50 g NaCl, 0.10 g merthiolate, 1.00 g ADTE 3 Nag, 12.20 g anhydrous Na2HPO4 and 2.32 g NaH2PO4 H2O are added to this solution per liter. The solution is filtered through a bacteria filter at or below room temperature. The sterile solution is checked for its effectiveness. This solution is then diluted with a solution containing 8.50 g NaCl, 0.10 g merthiolate, 1.00 g ADTE 3 Nag per liter, bringing the potency to the desired level, e.g. 150 for general purposes up to 175 TRE / cms. The pH is about 7.3. The finished solution is then poured into ampoules made of slightly soluble glass. The ampoules are of such a size that the interface between air and liquid is minimal.
The ampoules can be those for single doses with a content of 1 cm3 or for multiple doses with a content of 5 cm3 or more. Ampoules of 5 cm3 content for several doses have proven to be suitable for more concentrated solutions (3000 TRE or 600 TRE / cnm3).