Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von 11- Oxy-steroiden durch Oxydation von in 11- Stellung unsubstituierten Steroiden.
Das Einführen von Sauerstoff in die 11- Stellung eines Steroidmoleküls war bisher technisch unwirtschaftlich, weil hierzu viel stufige Verfahren erforderlich waren und überdies die Gesamtausbeute schlecht war.
Es wurde nun gefunden, dass die Oxy dation von in 11-Stellung unsubstituierten Steroiden zu 11-Oxy-steroiden überraschen derweise glatt verläuft, wenn man die Oxy dation durch Einwirkung von Kulturen von oxydierenden Mikroorganismen von Strepto- myces-Arten oder von aus solchen erhaltenen oxydierenden Enzymen durchführt.
Vor allem lassen sich 10,13-Dimethyl- cyclopentanopolyhydrophenantrene mit Leichtigkeit in hohen Ausbeuten in die ent sprechenden 10-Oxy-steroide überführen.
Ausser in 11 -Stellung kann in vereinzelten Fällen auch in andern Stellungen des Steroid- tnoleküls eine Oxydation stattfinden. Dies ist jedoch unter Umständen nicht nachteilig, da die Bildung von weiteren Oxygruppen, z. B. in 17- oder 21-Stellung, zu wertvollen thera peutischen Produkten oder Zwischenproduk ten führen kann. Falls solche zusätzliche Gruppen unerwünscht sind, lassen sie sich mittels bekannter Methoden mit Leichtigkeit entfernen.
In den Ausgangsstoffen enthaltene Oxygruppen, die selbst zu Ketogruppen oxy- dierbar sind, können durch Überführung in eine leicht wieder in eine Oxygruppe zurück führbare Gruppe, beispielsweise durch Vsr- esterung, Verätherung, Halogenierung oder dergleichen, intermediär geschützt werden.
Die erfindungsgemäss zu oxydierenden Steroide können verschiedenerlei Substituen- ten aufweisen, beispielsweise in den Stellun gen 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 und 17, insbesondere 3-, 7- oder 12-Keto-, -Oxy- oder -Acyloxygruppen;
17-Seiten- ketten, von denen die Seitenketten des Pro gesterons und des Corticosterons (Ketol) der besonderen Erwähnung wert sind, eine 17- Ketogruppe; eine 17-Oxygruppe usw.; der Kern kann ferner aufweisen: eine oder meh rere Doppelbindungen in den Stellungen 4, 5, 6, 7, 8, 9 (11), 11(12), 16 (17) und in andern Stellungen oder Kombinationen von Stel lungen des Kerns;
durch Anlagerung von Halogen oder Halogenwasserstoff abgesät- tigte Doppelbindungen; additive Gruppen von dienophilen Verbindungen, wie z. B. in Maleinsäure-, Maleinsäureanhydrid- oder Maleinsäureester-Additionsprodukten von Steroiden, die ein System konjugierter Dop pelbindungen aufweisen, beispielsweise in, Stellung 5,7.
Als Beispiele von Steroiden, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren oxydiert wer den können, sind zu nennen: Progesteron, 9,11- oder 11,12-Dehydroprogesteron, 7,9 (11) -Bis-dehydroprogesteron, 17-Oxy-pro- gesteron, Pregnenolon, Acyloxypregnenolone, wie z.
B. Pregnenolonacetat, 11-Desoxycorti- eosteron, <B>A'(")-</B> oder 411 (")-Desoxyeorti- costeron, 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron und Acyloxyderivate, wie z. B. das Acetoxy- derivat, 21-Oxy-pregnenolon und dessen 21- Acylderivate, wie z.
B. das Acetylderivat, und Ester desselben, 17,21-Dioxy-pregnenolon und 17,21-Diacyloxyderivate des letzteren, wie z. B. das Diacetoxyderivat, Androsten- dion, Androstan-17-ol, 9,11- oder 1_l,12- Dehydroandrostendion, 3-Oxy-9(11)- oder -11(12)-pregnen-20-one, 3,21-Dioxy-9 (11)- oder -11(12)-pregnen-20-one, 3,17,
21-Trioxy- 9 (11)- oder -11(12)-pregnen-20-one, 5-An- drosten-3-ol-17-on und 3-Ester, wie z. B. das Acetat, 5-Androsten-3-ol-17-on und dessen 3-Ester, wie z.
B. das Acetat; Ergosterin, Stigmasterin, Stigmastanol und deren 3- Ester, beispielsweise die Acetate, Ergostenon, Stigmastenon, Stigmastanon, Cholestenon, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure, Cholansäure, Norcholansäure, Bisnorcholan- säure, Cholensänre,
Norcholensäure, Bis- norcholensäure und 3-Oxy-, 3-Keto-, 3,7- Dioxy-, 3,7-Diketo-, 3,7,12-Trioxy-, 3,7,12 Triketoderivate, 9,11- oder 11,12-ungesät- tigte Ester, Thiolester und weitere Derivate der vorgenannten Säuren usw.
Die Oxydation wird, wie gesagt, unter Verwendung einer oxydierenden Strepto- myces-Art oder von daraus erhältlichen oxy dierenden Enzymen ausgeführt. Als Beispiel von Streptomyces-Arten, die sich für die Durchführung des erfindungsgemässen Ver fahrens eignen, seien die folgenden angeführt Streptomyces fradiae, endus, H-39, K-93, BC-17, W-4, albus, coelicolor, vorne, cali- fornicus, flaveolus,
bobiliae, roseochromo- genus, griseolus, erythreus, cellulosae, par- vus, malenconi, diastaticus, fRmicarius, flavo- virens, olivochromogenus, diastatochromo- genes, flavochromogenes, antibiotieus,
virido- chromogenes, purpeochromogenus, phaeo- chromogenus, aureus, erythrochromogenes, lavendulae, reticuli, rubriretieuli, flav us, ruber, citreus, fulvissimus, aureofaciens, ri- mosus, gougeroti, violaceoniger,
griseus, gri- seoflavus, albidoflavus, poolensis, olivaceus, lieskei, microflavus, caeaoi, novaecaesareae, exfoliatus, gelaticus, rutgersensis, lipmanii, halstedii, hygroseopicus, alboflavus, albos- sporeous,
flocculus, melanosporeus, melano- cyclus, acidophilus, rubeseens, thermophilus thermofuscus, scabies, ipomoea, fordii, afri- canus, gallicus, pelletieri, listeri, upeottii, hortonensis, gibsonii,
beddardii, kimberi, somaliensis, panjae, willmorei; aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und zur Erzielung optimaler Ausbeuten werden im allgemeinen vorzugsweise die Arten fradiae und H-39 ver wendet. In gewissen Fällen und unter be sonderen Bedingungen können jedoch mit Vorteil auch andere Arten verwendet werden. Die Arten der Gattung Streptomyces weisen verschiedene Enzymmechanismen auf.
Sie ermöglichen, wenn in geeigneter Weise ge züchtet, die Herstellung von 11-Oxy-steroiden im grosstechnischen Massstab.
Die Mikroorganismen können aus natür lichen Quellen nach den üblichen Arbeits methoden der Mikrobiologen isoliert werden, z. B. wie folgt: Sterile Medien werden aus verschiedenen kohlehydrat- und stickstoff haltigen Substanzen hergestellt und durch Zugabe von 2% Agar zu einem Gel erstarren gelassen. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen eine grosse Zahl verschiedenartiger Substanzen in Frage, beispielsweise anorga nische Nitrate, Ammoniumsalze oder Pro teinabbauprodukte. Die Medien können mit komprimiertem Dampf oder durch Erhitzen in mit Watte verschlossenen Kolben oder Rohren im Autoklav en sterilisiert werden.
Sie werden zum aseptischen Füllen von Petrischalen verwendet, die der Einwirkung von Staub, der atmosphärischen Luft, von Erde usw. unterworfen werden. Auf diesen Schalen entwickeln sich Bakterienkolonien, von denen diejenigen der Gattung Strepto- myces von einem geübten Mikrobiologen leicht erkannt werden können. Die Organis men werden hierauf aufgenommen und ent weder auf das gleiche Medium in Prüfrohre oder auf irgend ein anderes für die Züchtung von Mikroorganismen geeignetes Medium übergeführt.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die Organismenkultur am besten von ihrer natürlichen oder künstlichen Bezugsquelle auf bestimmte bakteriologische Medien, die die Entwicklung der Mikroor ganismen fördern, übergeführt. Diese Medien enthalten mindestens eine kohlenhydrat- haltige Substanz und eine Stickstoff liefernde Substanz, in den meisten Fällen ein Neu- tralisiermittel, wie z. B. Calciumcarbonat, und Substanzen, die andere Wachstums faktoren liefern, wie z. B.
Rückstände der Branntweinbrennerei. Maiseinweichflüssig- keit und Bierhefe oder anorganische Salze usw. Das p. des Mediums im Zeitpunkt des Animpfens wird gewöhnlich auf zwischen etwa 6,5 und 7,5 eingestellt.
Bei der Behand- hing im Autoklaven zwecks Erzielung asep tischer Bedingungen wird das p. nur um einige Bruchteile einer p,-Einheit vermin- dort, diese Verminderung des p, sollte jedoch bei der Einstellung des Mediums vor der Behandlung im Autoklaven berücksichtigt werden, um am Ende dieser Behandlung optimale Wachstumsbedingungen zu erhal ten.
Nachdem die Mikroorganismen während z4-28 Stunden auf dem Gärungsmedium gewachsen sind, kann man eine beträchtliche Erhöhung des pH, gewöhnlich auf etwa 7-S; feststellen. Wenn gewünscht, kann man je doch auch in andern p. -Bereichen, beispiels weise bei einem nH von 5-7, arbeiten. Das zu oxydierende Steroid wird vorzugsweise un gefähr in diesem Stadium des Wachstums zu gesetzt. Die Gärungsflüssigkeit, die zur fer- mentativen Oxydation der Steroide verwen det werden soll, kann auch in diesem Stadium von der Kultur abgetrennt werden.
Das Impfen des Kulturmediums kann nach einer beliebigen mikrobiologischen Me thode erfolgen. So kann das Impfen z. B. in sehr zweckmässiger Weise mit vegetativen Mycelien der Organismen vorgenommen wer- den. Das Impfen mit Sporen ist gleicherweise wirksam. Das Wachstum der Mikroorganis men wird mit Leichtigkeit gefördert, indem die Inkubationstemperaturen ungefähr bei Raumtemperatur, d. h. etwa zwischen 20 und 30 C, gehalten werden. Für das Wachstum der Mikroorganismen haben sich jedoch auch Temperaturen eines weiteren Bereiches, bei spielsweise Temperaturen von ca. 15-40 C, als befriedigend erwiesen.
Die Zeit, während welcher die Mikro organismen wachsen müssen, bevor das zu oxydierende Steroid der Einwirkung der Kultur oder der Enzyme unterworfen werden kann, ist offenbar nicht kritisch. So kann das zu oxydierende Steroid beispielsweise ent weder im Zeitpunkt des Impfens des Mediums oder in einem späteren Zeitpunkt, beispiels weise 24-72 Stunden später, zugesetzt wer den. In der Praxis hat es sich gezeigt, dass die zu oxydierende Steroidverbindung dem Kul turmedium auch noch nach 4 Tagen nach dem Impfen des Mediums zugesetzt werden kann, ohne dass eine Wirkung auf das Resul tat beobachtet werden könnte.
Die Zugabe eines 11-Desoxysteroids zum Gärungsmedium erfolgt vorzugsweise nach einer Wachstums dauer von etwa 40-48 Stunden, da in diesem Stadium des Wachstums die Entwicklung des Systems oxydierender Enzyme ihren Höhe punkt erreicht hat. Soll die Oxydation unter Verwendung der die oxydierenden Enzyme enthaltenden Gärungsflüssigkeit allein durch geführt werden, so wird die Gärungsflüssigkeit vorzugsweise mindestens nach diesem Wachs tumsstadium abgetrennt.
Die Art und Weise, wie das zu oxy dierende Steroid der Kultur oder den En zymen zugesetzt wird, ist offenbar nicht kritisch. Die Zugabe kann in geeigneter Weise so ausgeführt werden, dass eine innige Berüh rung des Steroids mit der Kultur oder den Enzymen gefördert wird, beispielsweise durch Züchten der Organismen in Gegenwart fein zerteilter Kristalle des Steroids, Dispergieren des Steroids im Bakterienmedium usw. Zu diesem Zweck können, wenn gewünscht, oberflächenaktive Stoffe, Dispergierungs- mittel oder Suspendierungsmittel, wie z. B.
die im Handel erhältlichen Sorbitanester mit emulgierender Wirkung, Spans , Tweene , Aerosole , Nacconole (Markenprodukte), verwendet werden.
Das Steroid wird dem Kulturmedium oder der Gärungsflüssigkeit jedoch vorzugsweise in Form einer Lösung in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, beispielsweise in Form einer Lösung in Aceton, Alkoholen oder selbst Äther, der mit Wasser nur wenig mischbar ist, zugesetzt, worauf das Medium und das Steroid gründlich durchmischt, werden, so dass eine Suspension oder Disersion von feinen Steroidteilchen entsteht und eine maximale Berührung des zu oxydierenden Steroids mit den oxydierenden Mikroorganis men oder den Enzymen zustande kommt.
Man kann entweder submerse Kultur oder Oberflächenkultur anwenden. Bevorzugt wer den jedoch submerse Kulturen. Man kann auch die Gärungsflüssigkeit einer Mikro organismenkolonne abtrennen, mit dem Steroid oder einer Lösung davon vermischen und das Gemisch aeroben Bedingungen unter werfen, um die Oxydation des Steroids aus zuführen.
Während der Oxydation des Steroids wird die Temperatur zweckmässig in demjenigen Bereich gehalten, welche auch für die Ent wicklung und das Wachstum der Mikro- organismen günstig ist, beispielsweise zwi schen etwa 15 und 40' C ; zur Erzielung einer optimalen Wirkung der Organismen oder Enzyme wird Raumtemperatur bevorzugt.
Die in Frage stehenden Mikroorganismen wachsen aerob. Der Grad des Wachstums steht in Beziehung mit der Durchlüftung. An sich ist jede Form der aeroben Inkubation befriedigend; man sorgt aber gewöhnlich für eine kräftige Durchlüftung, beispielsweise durch Rühren und/oder Durchblasen von Luft durch das Kulturmedium, um ein maxi males Wachstum der Bakterienorganismen zu erzielen, wodurch auch die zur Umwand lung des Desoxysteroids in das in 11-Stellung oxydierte Steroid benötigte Zeit reduziert wird.
Die Geschwindigkeit der Umwandlung der Desoxysteroide in 11-Oxy-steroide hängt somit entweder vom Ausmass der Durch lüftung oder vom Ausmass des Wachs tums im Zeitpunkt der Zugabe des Steroids ab. Es wurde beobachtet, dass bei Verwen dung entweder der Bakterien oder des Gärungsmediums allein die Umwandlung rascher erfolgt, wenn das Ausmass der Durch lüftung grösser ist und ebenso, wenn man die Bakterien vor der Zugabe des zu oxydieren den Steroids während 24-72 Stunden wachsen lässt. Daraus kann geschlossen werden, dass, die oxydierende Wirkung der Mikroorganis men bzw. Enzyme erst nach dieser Wachs tumsdauer zu voller Entfaltung gekommen ist.
Die Kultivierung der Mikroorganismen kann aber auch ohne Rühren oder sonstige Durchlüftung erfolgen, ferner kann das Steroid dem Kulturmedium auch im Zeit punkt des Impfens mit demBakterienorganis- mus zugesetzt werden.
Die für die Oxydation der Desoxysteroide mittels der oxydierenden Organismen oder den daraus erhältlichen oxydierenden En zyme benötigte Zeit kann nicht mit Genauig keit angegeben werden, da verschiedene Fak toren berücksichtigt werden müssen. Im all gemeinen hat sich eine Reaktionsdauer von etwa 1-72 Stunden als befriedigend erwiesen. Es wurde jedoch beobachtet, dass die Oxy dation des Steroids praktisch unmittelbar nach dem Zusammenbringen mit der Gärungs flüssigkeit von völlig ausgewachsenen oxy dierenden Mikroorganismen oder den oxy dierenden Enzymen derselben einsetzt.
Es wird angenommen, dass die Mikroorganismen in 24-72 Stunden völlig ausgewachsen sind; i diese Zeit hängt bis zu einem gewissen Grad vom Ausmass der Durchlüftung ab. Wird das Steroid dem Gärungsmedium im Zeitpunkt, in welchem das Medium nnit den Mikro organismen geimpft wird, zugesetzt, so ist es i zur Erzielung hoher Ausbeuten an oxydier tem Steroid angezeigt, längere Zeiten zu ver wenden.
Wird das Steroid inn Zeitpunkt des Impfens des Mediums zugesetzt, so werden daher gewöhnlich Reaktionszeiten von 8-72 Stunden verwendet, wobei die günstigste Zeit umgekehrt proportional dem Ausmass der Durchlüftung ist. Wird anderseits das Steroid der Kultur oder den Enzymen erst dann zugesetzt, wenn das Wachstum der Organismen bereits erheblich fortgeschritten ist, beispielsweise nach etwa 24 Stunden, so setzt die Umwandlung der Desoxysteroide in 11-Oxy-steroide sofort ein, wobei hohe Aus beuten in 1-72 Stunden oder auch schon in kürzeren Zeiten erhalten werden. Diese Zei ten sind wieder vom Ausmass der Durch lüftung abhängig.
Nach Beendigung der oxydierenden Gä rung können die 11-Oxy-steroide in verschie- doner Weise aus dem Gärungsgemisch isoliert werden. Eine besonders zweckmässige Me thode zur Abtrennung des oxydierten Steroids besteht darin, das Oxydationsgemisch, wel ches insbesondere die Gärungsflüssigkeit und die Mycelien enthält, wenn das Steroid der Kultur direkt zugesetzt wurde, mit einem organischen Lösungsmittel, wie z. B. 30 %igem Acoton, einem halogenierten Kohlenwasser stoff, wie z.
B. Methylenchlorid, Äthylen chlorid, Chloroform, Äthern und dergleichen, entweder direkt oder nach Ansäuerung auf ein niedriges pH, beispielsweise auf ein p. von 1, mittels Mineralsäure, zu extrahieren. Die Myeelien werden erneut mit Lösungs mittel extrahiert und verworfen. Die ver einigten Filtrate werden im Vakuum destil liert. Aus dem Rückstand wird eine 20 /oige Acetonlösung hergestellt, die mit Petroläther oder Heran extrahiert wird.
Der Extrakt wird mit 20%igem Aceton zurückgewaschen, worauf die 20%igen Acetonlösungen ver einigt und mit Äthylendichlorid extrahiert werden. Der wässrige Rückstand wird ver worfen, während die Äthylendichloridfrak- tion im Vakuum destilliert und der Rück stand in Äthylessigester übergeführt wird. Die Äthylessigesterlösung wird hierauf nachein ander mit verdünntem Alkali, verdünnter Säure und Wasser gewaschen, bis ein neu trales p, erhalten wird.
Dieses neutrale Kon zentrat kann in einer Kolonne chromato- graphiert werden. Die die Umwandlungs- produkte enthaltenden Fraktionen können zur Kristallisation des 11-Oxy-steroids ver wendet werden. Es können auch andere dem Fachmann bekannte Extraktionsverfahren angewendet werden. Das kristalline Material kann nach bekannten Methoden identifiziert werden, beispielsweise durch Elementar analyse, durch den Schmelzpunkt, durch Infrarotspektren, Röntgenstrahlenbeugung, Ultraviolettspektren, Mikroverbrennung.
Das kristalline Material oder die Extrakte des nichtkristallinen Materials, die bei der Oxy dation erhalten werden, können auch mittels des im folgenden noch eingehender beschrie benen Papierchromatogrammsystems von Zaffaroni identifiziert bzw. charkterisiert werden.
Eine besonders günstige Methode zur Ab trennung der nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Oxydationsprodukte ist diejenige der Chromatographie von Ex trakten oder festen Materialien unter Ver wendung einer mit Äthylenglykol über schichteten Kolonne von Siliciumdioxyd oder Fluorosil (Magnesiumsilikat, Markenpro dukt) oder einer andern Chromatographie- kolonne. Diese Methode besteht darin, dass man den neutralen Extrakt bzw.
die festen Stoffe zuerst in Aceton, Mothylenchlorid oder in einem andern geeigneten Lösungsmittel löst, die Lösung an Filterpapierscheiben adsorbieren lässt, das Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt, um die festen Stoffein trockenem Zustand auf den Scheiben zurückzulassen, die Scheiben auf das obere Ende der Kolonne legt und die Kolonne mit Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemi- schen, die, sofern eine mit Äthylenglykol überschichtete Siliciumdioxydkolonne ver wendet wird, mit Äthylenglykol gesättigt sind, entwickelt wird.
Diese Methode eignet sich besonders gut zur Identifizierung der durch Oxydation hergestellten Verbindungen, da jede aus der Kolonne erhaltene Fraktion, wenn gewünscht, nach der Methode von Zaffaroni geprüft werden kann. Man kann mittels des Papierchromatographiesystems von Zaffaroni kleinste Mengen von nur 10-40 Mikrogramm Material prüfen, einzelne che mische Körper identifizieren, Fraktionen, die die gleichen chemischen Körper enthalten, vereinigen und die Verbindung aus den ver einigten Fraktionen kristallisieren.
Die in dieser Beschreibung und in den Beispielen erwähnte Methode von Zaffaroni ist eine verhältnismässig neue, jedoch bereits bewähzte Methode zur Identifizierung gewisser organischer Verbindungen, wie z. B. der Nebennierenrindenhormone und verwandter Verbindungen. Diese analytische Methode beruht zum Teil auf der Polarität der zu prüfenden Verbindung.
Als Literaturzitate betreffend diese Analysenmethode seien die folgenden angegeben: Burton, Zaffaroni und Keutmann, A New Analytical M thod for Adrenal Cortical Hormonas , Science 110, 442 (1949), und Zaffaroni, Burton und Keut- mann, Science 111, 6 (1950). Da die Polarität organischer Verbindungen durch Verände rungen im Molekül, z. B.
An- oder Abwesen heit gewisser Gruppen (von denen jede als solche die Polarität des Moleküls als Gan zes in bestimmter Weise beeinflusst) und Än derung der Stellung einer bestimmten Gruppe im Molekül, verändert wird, ist es möglich, mittels der Methode von Zaffaroni kleinste Mengen einer organischen Verbindung der Nebennierenrindensteroidreihe oder ver wandter Steroidverbindungen auf Grund ihrer Polarität zu identifizieren.
Es ist zwar seit langem bekannt, dass verschiedene Ver bindungen verschiedene Polaritäten auf weisen; die Methode von Zaffaroni ist jedoch gegenwärtig die einzige praktisch durchführ bare Methode, mittels welcher durch Aus wertung von Polaritätsunterschieden kleinste Mengen von Steroidverbindungen identifiziert werden können.
Diese Methode hat sich bei der Untersuchung der Oxydation von Ste- roiden mittels oxydierender Bakterienorganis men oder oxydierender Enzyme und bei der Identifikation verschiedener neuer und bisher unbekannter oxydierter Steroide sowie bei der Identifikation bekannter oxydierter Ste- roide als äusserst wertvolles Hilfsmittel er wiesen.
Die Methode von Zaffaroni et a1. ist eine Abart der bekannten Papierstreifenchroma- tographie , bei welcher im wesentlichen die gleichen Prinzipien angewendet werden wie bei der gewöhnlichen Verteilungsehromato- graphie, die unter Verwendung einer Kolonne durchgeführt wird.
Bei der Methode von Zaffaroni et a1. wird im wesentlichen wie folgt gearbeitet: Zuerst wird ein Filterpapier geeigneter Qualität von 7,6-10,2 cm Breite und 55,9 ein Länge an einer um etwa 7,6 cm vom einen Ende ent fernten Stelle gefaltet. Dann wird an einer 3,8 cm unter dem Falz befindlichen Stelle über das Papier eine Linie gezogen, um die Stelle zu markieren, an welcher das zu prü fende Steroid auf das Papier aufgebracht werden soll.
Das Papier wird hierauf der Länge nach in Streifen von etwa 0,95 cm Breite geschnitten, indem an jenem Ende mit Schneiden begonnen wird, das dem Ende, auf welches das zu prüfende Steroid aufgebracht werden soll, entgegengesetzt ist. Dadurch werden mehrere Papierbänder erhalten, die alle an einem gemeinsamen Ende befestigt sind, und die, wenn gewünscht, an beiden Enden befestigt gelassen werden können. Jedes dieser Bänder bildet eine gesonderte Spur für jeden Tüpfel der zu prüfenden Verbindung. Man kann aber auch das Zer schneiden des Papiers in getrennte Bahnen unterlassen und einen einzigen Streifen ver wenden.
In diesem Fall muss jedoch dafür Sorge getragen werden, dass die verschiedenen zu prüfenden Verbindungen auf dem einzel nen Papierstreifen nicht zu nahe beieinander, d. h. nicht näher als etwa 2,5 cm, aufgebracht werden. Es wird ein Lösungsmittelsystem gewählt, das aus einem nichtpolaren Lö sungsmittel für die bewegliche Phase und einem polaren Lösungsmittel für die ortsfeste Phase besteht.
Das nichtpolare Lösungsmit tel Benzol und das polare Lösungsmittel Formamid bilden zusammen ein solches Lösungsmittelsystem. Ein anderes dieser Lösungsmittelsysteme besteht aus dem nicht polaren Lösungsmittel Toluol und dem po- Laren Lösungsmittel Propylenglykol. Beide Systeme wurden mit Erfolg verwendet.
Das Filterpapier wird hierauf mit dem polaren Lösungsmittel, beispielsweise mit Propylenglykol, gesättigt. Das überschüssige Lösungsmittel wird mittels zusätzlichem Filterpapier, einer Ausquetschvorrichtung, einer gewöhnlichen Wringmaschine oder auf andere geeignete Weise vom Filterpapier ent fernt. Hierauf wird das nichtpolare Lösungs mittel für die bewegliche Phase (auch Ent- wicklungs -Lösungsmittel genannt), in die sem Fall Toluol, mit dem polaren Lösungs mittel gesättigt. Damit sind die verschiede nen Elemente für den Zusammenbau bereit.
Ein Batterieglas geeigneter Abmessungen, z.B. von<B>30,5X45,7</B> cm, das 100 cm' des nichtpolaren Lösungsmittels enthält, wird mit einem grossen Filterpapierblatt, das in dem für die ortsfeste Phase zu verwendenden polaren Lösungsmittel, z. B. Propylenglykol, eingeweicht wird, ausgefüttert. Ein im Innern der Kammer angeordneter ringförmiger Stän der trägt einen Behälter, der 350 cm3 des Lösungsmittels für die bewegliche Phase, d. h. Toluol, welches, wie bereits oben erwähnt, mit dem Lösungsmittel für die ortsfeste Phase, z. B. Propylenglykol, gesättigt ist, enthält.
Das kurze umgefaltete Stück oder das gemeinsame Ende des Papiers wird in den Vorratsbehälter des Entwicklungslösungs mittels, z. B. des für die bewegliche Phase be stimmten nichtpolaren Lösungsmittels To luol, das mit Propylenglykol gesättigt worden ist, eingeführt.
Das zu prüfende Steroid, in Aceton, Methylenchlorid, Methanol oder Chloroform, wird mittels einer Mikropipette in einer Menge von etwa 10-300 Mikrogramm an der etwa 3,8 cm unter dem Falz befindlichen Zu fuhrstelle aufgebracht, nachdem der Streifen zugeschnitten und mit der ortsfesten Phase, z. B. Propylenglykol, gesättigt worden ist, jedoch bevor das gemeinsame Ende in den Vorratsbehälter eingeführt wird. Die Kam mer wird hierauf mit einem Glasdeckel ge schlossen und mit einer Stärke-Glycerin- Paste abgedichtet.
Die bewegliche Phase fliesst dann infolge Adsorption über das nach unten hängende Filterpapier, wodurch die Streifen ent wickelt werden. Diese Streifen werden wäh rend 3-72 Stunden oder länger entwickelt, je nach dem Lösungsmittelsystem und den Steroiden. Nach beendeter Entwicklung, die an den Beweglichkeiten der Verbindungen erkennbar ist, werden die Papierstreifen mit tels eines Ventilators bei Raumtemperatur getrocknet.
Die Tüpfel des ungesättigten Steroids können sichtbar gemacht werden, indem man ihre Fähigkeit, ultraviolettes Licht zu absorbieren, auswertet [s. Flaines und Drake, Fed. Proc. Am. Soc. Exp. Biol. 9, 180 (März 1950) ]. Diese Entwicklung ist im Fall von Steroiden anwendbar, die ein System konjugierter Doppelbindungen aufweisen, wie z. B.
Progesteron, Corticosteron, 11-Desoxy- corticosteron, 11-Dehydrocorticosteron, 11- Dehydro-17-oxy-corticosteron, 17-Oxy-corti- costerön, 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron usw.
Der Steroidtüpfel, der sich anfänglich an der Zufuhrstelle befindet, hat sich zu sammen mit der beweglichen Phase um eine Distanz, die seiner Anziehung durch die orts feste Phase umgekehrt proportional ist und ferner vom Verteilungskoeffizienten zwischen den beiden Lösungsmitteln und dem zwischen dem Filterpapier und dem Lösungsmittel system bestehenden Adsorptions-Eluierungs- Koeffizienten abhängig ist, weiterbewegt. Die Affinität gegenüber der ortsfesten Phase, z.
B. dem Propylenglykol, ist am grössten für Steroidverbindungen mit der grössten An zahl Oxygruppen. Somit bewegen sich diese Verbindungen langsamer von der Zufuhr stelle hinweg als die Steroide, die eine kleinere Anzahl Oxygruppen enthalten.
Desoxycorti- costeron, das 3 Sauerstoffatome aufweist, bewegt sich am schnellsten von den bekann ten Rindensteroiden, während die Corti- eosteroide, die 4 Sauerstoffatome enthalten, sich langsamer bewegen und die Corti- costeroide mit 5 Sauerstoffatomen sich am langsamsten von den bekannten Corticoste- roid-Verbindungen bewegen.
Tabelle 1 zeigt die Anordnung einiger bekannter Corti- eosteroide auf Grund der Anzahl der Sauer stoffatome und der Beweglichkeiten dieser Verbindungen. In Tabelle II sind die rela tiven Beweglichkeiten gewisser Steroide bei Verwendung des Chromatographielösungs- mittelsystems Propylenglykol/Toluol ange geben.
EMI0008.0010
<I>Tabelle <SEP> I</I>
<tb> Name
<tb> OZ <SEP> Progesteron
<tb> 03 <SEP> 11-Desoxycorticosteron
<tb> 17-Oxyprogesteron
<tb> 04 <SEP> 11-Dehydrocorticosteron
<tb> 17-Oxy-11-desoxycorticosteron
<tb> (S <SEP> von <SEP> Reichstein)
<tb> Corticosteron
<tb> 0, <SEP> 17-Oxy-ll-dehydrocorticosteron
<tb> (E <SEP> von <SEP> Kendall)
<tb> 17-Oxycorticosteron <SEP> (F <SEP> von <SEP> Kendall) (von oben nach unten fallende Beweglichkeit) <I>Tabelle</I> II Bei Papierchromatographie-Untersuchun- gen ermittelte relative Beweglichkeiten meh rerer Steroide (mit fallender Beweglichkeit von oben nach unten angeordnet)
.
EMI0008.0016
<I>Propylenglykol-Toluol-System</I>
<tb> 11-Desoxycorticosteran
<tb> 17-Oxyprogesteron
<tb> lla-Oxy-progesteron <SEP> (U-III)
<tb> Corticosteron
<tb> 17-Oxy-ll-desoxycorticosteron <SEP> (S)*
<tb> 20a, <SEP> 21-Dioxy-4-pregnen-3-on*
<tb> 20ss, <SEP> 21-Dioxy-4-pregnen-3-on
<tb> 17-Oxy-ll-dehydrocorticosteron <SEP> (E)
<tb> Dioxyprogesteron <SEP> (U-I)
<tb> 17-Oxy-corticosteron <SEP> (F) <B>*</B> Unterscheiden sich in diesem System nicht. Reihenfolge der Beweglichkeit HO> Ester> Ketone in einer gegebenen Stellung in ge gebenen Verbindungen.
Die bei der Methode von Zaffaroni eine Rolle spielenden Faktoren sind im wesent- liehen die folgenden: a) Affinität der Steroid- verbindungen von verschiedener Polarität gegenüber dem stärker polaren der beiden Lösungsmittel. Die stärker polaren Steroid- verbindungen, wie z.
B. die eine oder mehrere Oxygruppen enthaltenden Steroidverbin- dungen, werden einer grösseren Attraktion durch das polare Lösungsmittel unterworfen sein, als die weniger stark polaren Verbin dungen, wie z.B. diejenigen, die keine Oxy- gruppen enthalten, welche zum Teil bestim men, in welcher Phase das Steroid vorhanden sein und wie rasch sich dessen Tüpfel be wegen wird.
b) Der Verteilungskoeffizient der zu prüfenden Steroidverbindungen zwischen zwei miteinander nicht mischbaren Lösungs mitteln, welcher bis zu einem gewissen Grad die Phase bestimmt, in welcher das Steroid vorhanden sein wird, und der ferner bestimmt, wie rasch der Tüpfel sich bewegen wird. c) der Absorptions-Eluierungs-Koeffizient des zu prüfenden, auf einen vorbehandelten Filterpapierstreifen aufgebrachten und der Einwirkung eines Gemisches von 2 mitein ander nicht mischbaren Lösungsmitteln un terworfenen Steroids, welcher ebenfalls bis zu einem gewissen Grad bestimmt, in welcher Phase das Steroid vorhanden sein und wie schnell dessen Tüpfel sich bewegen wird.
Die Kombination der drei Faktoren be stimmt, bis zu welchem Punkt des Papier- chromatogrammstreifens der Tüpfel des Ste- roids sich bewegen wird, im Vergleich zu einem Tüpfel einer bekannten Verbindung. Innerhalb gewisser Grenzen ist es somit un wichtig, wieviel Zeit zur Entwicklung des Streifens mittels der beweglichen Phase auf gewendet wird, da die nach dieser Methode durchgeführte Identifikation der zu prüfen den Verbindung auf Grund der relativen Lage des Tüpfels mit Bezug auf eine bekannte Vergleichssubstanz erfolgt.
Jeder Tüpfel auf dem Papierchromatogramm gehört zu einer einzelnen Verbindung, wobei die weniger stark polaren Verbindungen, die sich rascher bewegen, bis zu einer Stelle wandern, die vom Ausgangspunkt weiter entfernt ist als jene der stärker polaren, stärker oxydierten Ver- bindungen, die im gleichen Versuch geprüft werden. Auf diese Weise ist es möglich, die Steroidverbindung nicht nur qualitativ zu identifizieren, sondern auch ungefähr die Menge dieser bestimmten Verbindung durch Vergleich mit einer Kontrollsubstanz von bekannter Menge zu bestimmen.
Man kann aber auch diejenige Zone des Papierchroma- togramms, die das zu bestimmende Steroid enthält, ausschneiden, dieses Teilstück mit einem organischen Lösungsmittel (Alkohol, Aceton usw.) extrahieren und die Ultra violettabsorption messen.
Es ist somit mög lich, den ungefähren Grad der oxydativen Umwandlung eines Steroids in verschiedene höher oxydierte Derivate zu bestimmen, da man auf Grund der anfänglich auf dem Strei fen aufgebrachten Steroidmenge, die bekannt ist, durch blosse Feststellung der Zahl von Tüpfeln von verschiedenen, höher oxydierten Steroidverbindungen und einen Vergleich der relativen Helligkeit, Dichte oder Ultraviolett- absorption angenähert den Grad der Um wandlung in ein und die Ausbeute an einem bestimmten Steroid-Oxydationsprodukt oder einem andern Umwandlungsprodukt be stimmen kann.
Da die 11-Desoxysteroide beim Glykogen- einlagerungsprüfversuch von Pabst et a1., Endocrinology 41, 55 (1947), keine Wirksam keit von Bedeutung aufweisen, wurde der Glykogeneinlagerungsversuch von Pabst in einer grossen Zahl der Beispiele verwendet, um die Umwandlung der 11-Desoxysteroide in die entsprechenden in 11-Oxy-steroide nach dem erfindungsgemässen Verfahren aufzu zeigen.
Die in 11 -Stellung oxydierten Steroide weisen bekanntlich eine erhebliche Wirksam keit auf, wenn sie der Glykogeneinlagerungs- prüfung unterworfen werden. <I>Beispiel</I> T Es wurde eine vegetative Saat aus einer Neomycinkultur (Streptomyces fradiae, Stamm 3535) hergestellt, indem die Kultur während drei Tagen bei 24'C in hin-und her bewegten Schüttelkolben in einem Medium der folgenden Zusammensetzung gezüchtet wurde
EMI0009.0035
Cerelose <SEP> (rohe <SEP> Dextrose)
<SEP> <B><I>log</I></B>
<tb> Branntweinbrennereirückstände <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Bierhefe <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Dieses Medium wurde vor dem Impfen wäh rend 30 Minuten unter Druck sterilisiert.
Die erhaltene Saat wurde zum Impfen eines Mediums der folgenden Zusammen setzung verwendet
EMI0009.0038
Cerelose <SEP> (rohe <SEP> Dextrose) <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Branntweinbrennereirückstände <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Cobaltochlorid-hexahydrat <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Das Saatverhältnis betrug 5 cm? flüssige vegetative Saat pro 100 cm3 Medium. Pro Kolben wurden 100 cm3 Medium verwendet. Zuerst wurden die benötigten<B>150</B> Kolben mit Medium gefüllt und dann vor dem Impfen während 30 Minuten unter Druck sterilisiert.
Die Kultur wurde unter Schütteln auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung wäh rend 41 Stunden bei 24 C wachsen gelassen, worauf eine sterile Äthanollösung von 5 g 11-Desoxy-17-oxycorticosteron (Verbindung S von Reichstein) bei einer Konzentration von 33,3 mg in 3 cm3 Äthanol pro 100 cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die Kul tur wurde hierauf während weiterer 7 Stun den der Inkubation unterworfen, worauf die Kolbeninhalte (15 Liter) vereinigt wurden und mit einem gleichen Volumen Aceton ver setzt wurden.
Diesem Gemisch wurden zusätzlich 45 Liter Aceton zugesetzt, um die Aceton-Kon- zentration auf 80% zu bringen. Das Gemisch wurde während 2 Stunden gerührt und fil triert, worauf der Niederschlag mit 25 Litern 80%igem Aceton gewaschen, die Suspension des Filtrierungsrückstandes während 2 Stun- den gerührt, filtriert, der Filterkuchen ver worfen und das acetonische Filtrat mit dem bei der ersten Filtration erhaltenen ace- tonischen Filtrat vereinigt wurde.
Die ver einigten Filtrate wurden im Vakuum bei einer unter 50 C liegenden Temperatur einge dampft. Der erhaltene wässrige Rückstand wurde durch Zugabe von 4 Liter Aceton auf eine 20 % ige acetonische Lösung eingestellt, worauf die Lösung 5mal mit einem Volumen von 1/3 an gemischten Hexanen gewaschen, die vereinigten Hexanwaschfraktionen mit 2mal 1/1o Volumen 20%igen Acetons ex trahiert, der Hexanrückstand beiseite ge stellt,
die beiden 20%igen Acetonextrakte mit der vorgängig erhaltenen 20 % igen Ace- tonhauptfraktion vereinigt und der 20 % ige Gesamtacetonextrakt 6mal mit einem Vo lumen von 1/4 an Äthylendichlorid extrahiert wurde. Der erhaltene wässrige Rückstand wurde beiseite gestellt.
Die vereinigten Äthy- lendichloridfraktionen wurden hierauf mit einem Volumen von 1/1a destilliertem Wasser gewaschen, worauf das Äthylendichlorid im Vakuum bei einer unter<B>50'C</B> liegenden Tem peratur abdestilliert wurde. Der Rückstand wurde in Äthylessigester aufgelöst.
Die Lö sung wurde mit den folgenden Waschflüssig keiten gewaschen:
EMI0010.0030
2mal <SEP> 1/5 <SEP> Volumen <SEP> wässriges <SEP> Natriumbicar bonat
<tb> 1mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> Wasser
<tb> 3mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> 2%iges <SEP> wässriges
<tb> Natriumcarbonat
<tb> 1mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> Wasser
<tb> 3mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> 0,5n <SEP> Salzsäure
<tb> 1mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> Wasser
<tb> 3mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> 3%iges <SEP> wässriges
<tb> Natriumbicarbönat
<tb> 4mal <SEP> 1/1o <SEP> Volumen <SEP> destilliertes <SEP> Wasser <SEP> oder
<tb> soviel, <SEP> als <SEP> zur <SEP> Erzielung <SEP> einer <SEP> neu tralen <SEP> Reaktion <SEP> erforderlich <SEP> ist.
Jeder wässrige Waschrückstand wurde durch eine Äthylessigesterfraktion hindurchgelas sen. Die Äthylessigesterfraktionen wurden vereinigt, um eine neutrale Hormonfraktion zu erhalten. Glykogeneinlagerungsprüfungen nach der Methode von Pabst et a1. ergaben eine Aus beute von 0,28 Glykogeneinheiten pro mg Ex trakt.
Die theoretische Umwandlung in Ken- dalls Verbindung F (17-Oxy-corticosteron) war somit 2,8%, wobei die Glykogeneinheit jener Betrag von Bioaktivität ist, der einem mg 17-Oxy-corticosteron (Kendalls Verbin dung F) entspricht.
<I>Beispiel 2</I> Bei diesem Versuch wurden 200 mg der Verbindung S von Reichstein zusammen mit Neomycin (Streptomyces fradiae, Stamm 3535) während 7 Stunden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise der Inkubation unter worfen. Es wurden insgesamt 6 Kolben bzw. 600 cm3 Gärungsflüssigkeit verwendet. Gly- kogeneinlagerungsprüfungen ergaben einen Wert von 0,22 Einheiten pro mg Substrat. Dieser Wert entspricht einer theoretischen Umwandlung in Kendalls Verbindung F von 2,2%.
Nach Herstellung des neutralen Hor monextraktes in der im Beispiel 1 beschriebe nen Weise wurde eine Probe von 165 mg des neutralen Hormonkonzentrates der Papier chromatographie unterworfen. Beispiel <B><I>13</I></B>
EMI0010.0053
Kultur: <SEP> Streptomyces <SEP> H-39
<tb> <I>Saatmedium</I>
<tb> Dextrin <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Maiseinweichflüssigkeit <SEP> 80 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Das pH wurde mit Kaliumhydroxyd auf 6,6 eingestellt.
Gärungsmedium Gleiche Zusammensetzung wie das Saat medium.
Bei diesem Versuch wurden 200 mg der Verbindung 8 von Reichstein zusammen mit Streptomyces (H-39) während 7 Stunden in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise der Inkubation unterworfen. Die Gärungsflüssig- keit wurde hierauf in zwei Hälften geteilt. Ein aliquoter Teil wurde gemäss der im Bei spiel 1 beschriebenen Arbeitsweise direkt ex trahiert, während der andere aliquote Teil vor der Extraktion auf p, 1 eingestellt wurde. Die aus diesen beiden Versuchen erhaltenen neutralen Hormonkonzentrate wurden mit tels des Glykogeneinlagerungsprüfversuches geprüft.
Der Versuch mit der direkten Ex traktion der Wärungsflüssigkeit lieferte 0,35 Glykogeneinheiten pro mg Substrat. Dieser Wert entspricht einer theoretischen Um wandlung von 3, 5 % in die Verbindung F. Die Analyse desjenigen aliquoten Teils, des sen PH vor der Extraktion auf einen Wert von 1 eingestellt worden war, ergab<B>0,30</B> Ein heiten pro mg Substrat. Dieser Wert ent spricht einer theoretischen Umwandlung von 3,0% in Kendalls Verbindung F.
Beispiel <I>4</I> Bei diesem Versuch wurden 200 mg der Verbindung S von Reichstein zusammen mit einer Neomycinkultur in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise der Inkubation unter worfen. Das in der im Beispiel 1 beschriebe nen Weise erhaltene neutrale Hormonkon zentrat von 190 mg wurde in einer möglichst kleinen Menge Aceton gelöst und auf Filter- papierscheiben für die Teilungschromato- graphie durch eine Kolonne übergeführt.
Das Adsorptionsmittel bestand aus 30 g von mit 21 cm3 Äthylenglykol versetztem Sili- ciumdioxyd. In etwa 35 Minuten wurden 60 cm' Flüssigkeit durchgelassen. Die Ko lonne wurde mit vier verschiedenen Lösungs mitteln entwickelt, nämlich mit Cyclohexan, Cyclohexan/Methylendichlorid (4:1), Cyclo- hexan/Methylenchlorid (1:1) und Cyclohexan/ Methylenchlorid (1:4).
<I>Beispiel 5</I> Das zur Herstellung der vegetativen Neomycinsaat verwendete Medium enthielt die folgenden Bestandteile pro Liter: 10 g rohe Dextrose, 10 g Bierhefe, 5 g Brannt- w einbrennereirückstände, 4 g Kaliumchlorid. 100 em3 dieses Mediums wurden in einem Erlenmeyerkolben von 500 cm3 während 3 0 Minuten unter einem Wasserdampfdruck sterilisiert.
Nach erfolgter Abkühlung wurden vier Kolben mit Organismen aus einer Agar- kultur von Streptomyces fradiae, Stamm 3535, geimpft und dann während 3 Tagen in einem auf 24 C gehaltenen Brutschrank auf einer hin- und herbewegten Schüttelvorrich tung sich selbst überlassen. Die erhaltene Kultur war stark entwickelt und wurde ver wendet, um die Gärung in den fünf unten be schriebenen Kolben von 18,9 Liter Inhalt durchzuführen.
8 Liter eines aus 25 g Cerelose, 25 g Soja bohnenmehl, 5 g Natriumchlorid, 5 g Cal- ciumcarbonat, 5 g Branntweinbrennerei rückständen, 1 mg Kobaltdichlorid-hexa- hydrat und 1 Liter Leitungswasser zusam mengesetzten Mediums wurden in einem Kolben von 18,9 Litern Inhalt während 60 Minuten unter einem Wasserdampfdruck sterilisiert. Der Kolben war mit einem Rüh- rer, einem Rohr zum Einleiten von Luft am Boden des Kolbens, einem Wattefilter zur Sterilisierung der Luft,
einer Vorrichtung für die Entnahme von Proben und einem mit einem Filter versehenen Luftauslass aus gerüstet. Nach erfolgter Abkühlung des Me diums wurden die 8 Liter sterilen Mediums mit 400 cm3 der oben beschriebenen vegeta tiven Saat geimpft, in ein auf 24-26 C ge haltenes Wasserbad gestellt, bei 270 Um drehungen pro Minute gerührt und mit einer Geschwindigkeit von 6 Litern Luft pro Mi- j nute durchlüftet.
Ferner wurde Specköl in einer zur Verminderung des Schäumens ge nügenden Menge zugegeben.
47 Stunden nach dem Impfen wurden dem Gärungsgemisch 2,7 g der Verbindung S F von Reichstein in 270 cm3 Äthylalkohol zu gegeben. Diese Lösung war durch Filtrieren durch ein ultrafeines Filter aus gesintertem Glas filtriert worden. Die Gärung wurde wäh rend weiterer 7 Stunden fortschreiten gelas sen, worauf der Kolben aus dem Wasserbad genommen wurde, den 8 Litern Gärungs flüssigkeit 8 Liter Aceton zugesetzt wurden und das Gemisch in einem kalten Raum auf- bewahrt wurde, bevor es extrahiert wurde.
Glykogenprüfungen ergaben eine Ausbeute von 0,58 Einheiten pro mg Substrat, welcher Wert einer Umwandlung von 5,8% in Ken- dalls Verbindung F entspricht.
Beispiel <I>6</I> Impfmedium für Neomycin (Streptomyees fradiae, Stamm 3535)
EMI0012.0010
Rohe <SEP> Dextrose <SEP> <B><I>log</I></B>
<tb> Branntweinbrennereirückstände <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter
<tb> Bierhefe <SEP> 10 <SEP> g Das vegetative Impfmaterial wurde durch Züchten der Kultur während 3 Tagen bei 24 C in Schüttelkolben hergestellt.
EMI0012.0011
<I>Gärungsmedium</I>
<tb> Rohe <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Branntweinbrennereirückstände <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Cobaltdichlorid-hexahydrat <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Diese Kultur wurde während 24 Stundet auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 24 C wachsen gelassen, worauf eine sterile Lösung von<B>111</B> mg 11-Desoxycorticosteron in einer Konzentration von 37 mg (in 3 cm3 Äthanol) pro 100 cm3 Gärungsflüssigkeit zu gesetzt wurde.
Die Kultur wurde hierauf während weiterer 16 Stunden wachsen ge lassen, worauf die Kolbeninhalte vereinigt wurden, um 300 cm3 zu erhalten, und eine gleiche Volummenge Aceton zugesetzt wurde. Glykogenprüfungen des in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhaltenen neutralen Hormonextraktes ergaben eine Ausbeute von 0,135 Einheiten pro mg Substrat, welcher Wert einer 3,8%igen theoretischen Um wandlung in Corticosteron (Verbindung B von Kendall) entspricht.
<I>Beispiel i</I> Bei diesem Versuch wurden 200 mg 11- Desoxycorticosteron zusammen mit einer Neomycinkultur in der im Beispiel 1 be schriebenen Weise während 7 Stunden der Inkubation unterworfen. Der neutrale Hor monextrakt wurde gemäss der im Beispiel 1 beschriebenen Arbeitsweise erhalten.
Das mit der Kennziffer 169-C-MPB-3 be zeichnete Material, dessen Gewicht 5,7 mg war, wurde durch Infrarotspektroskopie analysiert. Die gleiche Verbindung wurde aus dem Inkubationsprodukt von 11-Desoxy- corticosteron mit Gewebebrei von Schweine nebennierendrüsen isoliert.
Eine Probe dieses kristallinen Materials, 192-C-MPB-3, weist ein Infrarotabsorptions- spektrum auf, welches mit dem für das Material 169-C-MPB-3 charakteristischen Spektrum identisch ist.
Diese Substanz wurde mit der Trivialbezeichnung MPS-1 belegt und weist die folgenden charakteristi schen Eigenschaften auf:
EMI0012.0040
1. <SEP> Chemische <SEP> Analyse
<tb> Berechnete
<tb> I <SEP> 1I <SEP> TII <SEP> empirische <SEP> Formel
<tb> C <SEP> 71,72 <SEP> 71,88 <SEP> 72,23 <SEP> 1 <SEP> C"H",504,2
<tb> H <SEP> 8,98 <SEP> 9,04 <SEP> 8,89 <SEP> 11 <SEP> C211131,504516
<tb> 0 <SEP> 19,30 <SEP> 19,08. <SEP> 18,12 <SEP> III <SEP> C21113104,1 (aus der Differenz ermittelt) 2. Optische Drehung (a)D = +110 Grad (Äthanol).
3. Schmelzpunkt (Koflerblock) 181-183 C. 4.Infrarotabsorptionsspektrum Die folgenden Gruppen sind vorhanden OH, normale Ketongruppe, konjugierte Ketongruppen, konjugierte Doppelbindun gen. Die relative Intensität der den kon jugierten und nichtkonjugierten Keton- gruppen entsprechenden Bänder weist auf ein Verhältnis von 1:1 hin.
5. Ultraviolettabsorption : k = 42,5 bei 238, 5 mu. 6. Die Oxydation mittels Perjodsäure (HJ04) zwecks quantitativer Erzeugung von Form aldehyd zeigt, dass diese Verbindung einen Titer aufweist, der gleich demjenigen der Verbindung F ist.
7. Die Oxydation mit Molybdänoxyd (Mo03) unter quantitativen Bedingungen zeigt, dass das Reduktionsvermögen dieser Ver bindung zweimal so gross wie dasjenige der Verbindung F ist.
B. Glykogenprüfungen zeigen, dass diese Ver bindung weniger als<B>0,33</B> Aktivitätsein- heiten pro mg besitzt.
Wie auf Grund von chromatographischen Versuchen festgestellt wurde, wandert die unbekannte Substanz MPS-1 weniger rasch als Corticosteron oder Verbindung S. Diese Beobachtung kann auch wie folgt ausge drückt werden:
MPS-1 ist stärker polar als die Verbindungen B von Kendall und S von Reichstein und weniger stark polar als die Verbindung E von Kendall. <I>Beispiel 8</I> Saatmedium für Streptomyces H-39
EMI0013.0018
Dextrin <SEP> <B>log</B>
<tb> Maiseinweichflüssigkeit <SEP> 80 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Das Medium wies ein p$ von<B>6,5-6,7</B> auf. Die vegetative Saat dieser Kultur wurde während 3 Tagen bei 24 C in einem hin- und herbewegten Schüttelbehälter wachsen ge lassen.
Gäricngsmedium Gleiche Zusammensetzung wie das Saat medium.
Diese Kultur wurde während 24 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 24 C wachsen gelassen, worauf eine sterile äthanolische Lösung von 100 mg 11-Desoxy- corticosteron in einer Konzentration von 33,3 mg (in 3 em3 Äthanol) pro 100 em3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde.
Die Kul tur wurde hierauf während weiterer 16 Stun den wachsen gelassen, worauf die Kolben inhalte vereinigt wurden, um eine Volum- menge von 300 em3 zu erhalten, und eine gleiche Volummenge Aceton zugesetzt wurde. Der neutrale Hormonextrakt wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten.
Die Glykogenprüfung mit dem neutralen Hormonkonzentrat ergab eine Ausbeute von 0,075 Einheiten pro mg Substrat, welcher Wert einer 2,1 % igen theoretischen Um wandlung in Corticosteron entspricht. <I>Beispiel 9</I> Saatmedium für Streptomyces K 93 Gleiche Zusammensetzung wie das ent sprechende Medium von Beispiel 6.
EMI0013.0038
<I>Gärungsmedium</I>
<tb> Rohe <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Bierhefe <SEP> 2,5 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 8 <SEP> g
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0,4 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Diese Kultur wurde während 48 Stunden bei 24 C in Kolben auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung wachsen gelassen, wor auf eine sterile äthanolische Lösung von 100 mg 11-Desoxycorticosteron in einer Kon zentration von 33,3 mg (in 3 em3 Äthanol) pro 100 cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde.
Die Kultur wurde hierauf während 16 Stunden weiter wachsen gelassen, worauf die Kolbeninhalte vereinigt wurden, um eine Volummenge von 300 em3 zu erhalten, und eine gleiche Volummenge Aceton zugesetzt wurde. Die neutrale Hormonfraktion wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise er halten. Glykogenprüfungen ergaben eine Aus beute von etwas mehr als 0,07 Einheiten pro mg Substrat, welcher Wert einer theoreti schen Umwandlung in Corticosteron von etwas mehr als 1,9% entspricht.
<I>Beispiel 10</I> Saatmedium <I>für</I> Streptomyces endus Gleiche Zusammensetzung wie das ent sprechende Medium von Beispiel 9. Gärungsmedium Gleiche Zusammensetzung wie das ent sprechende Medium von Beispiel 9.
100 mg 11-Desoxycorticosteron wurden zusammen mit Streptomyces endus (9.-20) während 16 Stunden der Inkubation unter worfen. Der neutrale Hormonextrakt wurde in. der im Beispiel 1 beschriebenen Weise er halten. Es wurden etwas mehr als 0,075 Glykogeneinheiten pro mg Substrat erhalten, welcher Wert einer theoretischen Umwand lung von etwas mehr als 2,1 % in die Ver bindung B (Corticosteron) entspricht. <I>Beispiel 11</I> Saatmedium <I>für</I> Streptomyces <I>W-4</I> Gleiche Zusammensetzung wie das ent sprechende Medium von Beispiel 9.
Gärungsmedium Gleiche Zusammensetzung wie das ent sprechende Medium von Beispiel 9.
100 mg Desoxycorticosteron wurden zu sammen mit Streptomyces (W-4) während 16 Stunden der Inkubation unterworfen. Der neutrale Hormonextrakt wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten. Die Glykogenprüfung ergab eine Ausbeute von etwas mehr als 0,065 Einheiten pro mg Sub strat, welcher Wert einer theoretischen Um wandlung von etwas mehr als 1,80/, in Corti- costeron entspricht.
<I>Beispiel 12</I> Saatmedium <I>für</I> Streptomyces BC <I>17</I>
EMI0014.0026
Dextrin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 16 <SEP> g
<tb> Bierhefe <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0,
2 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Die vegetative Saat wurde durch Züchten der Kultur während 3 Tagen bei 24 C in Schüttelkolben hergest-Illt.
EMI0014.0028
<I>Gärungsmedium</I>
<tb> Rohe <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Bierhefe <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 8 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0,4 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter
<tb> Kobaltdichlorid-hexahydrat <SEP> 1 <SEP> mg Diese Kultur wurde während 72 Stunden bei 24 C in Kolben auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung wachsen gelassen,
wor auf eine sterile äthanolische Lösung von 100 mg 11-Desoxycorticosteron ineiner Kon zentration von 33,3 mg (in 3 cm3 Äthanol) pro 100 cm3 Gärungsflüssigkeit zugesetzt wurde. Die Kultur wurde hierauf während weiterer 16 Stunden wachsen gelassen, wor auf die Kolbeninhalte- vereinigt wurden, um eine Volummenge von 300 c & zu erhalten, und eine gleiche Volummenge Aceton zu gesetzt wurde. Ein neutraler Hormonextrakt wurde in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise erhalten.
Die Glykogenprüfung ergab eine Aus beute von 0,06 Einheiten pro mg Substrat, welcher Wert einer theoretischen Umwand lung von 1,6 /p in Corticosteron entspricht. <I>Beispiel 13</I> Das für die Herstellung der Saat ver wendete Medium wies die folgende Zusam mensetzung auf.
EMI0014.0040
Dextrin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 16 <SEP> g
<tb> Bierhefe <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0,2 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Das pH wurde mit Kaliumhydroxyd auf 7,5 eingestellt.
100 cm3 des Mediums wurden in Kolben von 500 cm3 Inhalt während 30 Minuten mit Wasserdampf unter Druck sterilisiert und nach dem Abkühlen mit einer Agarkultur von Streptomyces sp. BD-17 geimpft. Nach dem das Medium geimpft worden war, wurde der Kolben während 3 Tagen auf einer hin- und herbewegten Schüttelvorrichtung ge schüttelt. Die Inkubationstemperatur lag bei 24 C.
Je 5 cm3 der erhaltenen stark ent wickelten vegetativen Kultur wurden zum Impfen von 3 Kolben, die 100 cm3 des fol genden Mediums enthielten, verwendet
EMI0015.0011
Rohe <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Bierhefe <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> .5 <SEP> g
<tb> Calciumcarbonat <SEP> 8 <SEP> g
<tb> Natriumchlorid <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Sojabohnenmehl <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0,4 <SEP> g
<tb> Leitungswasser <SEP> 1 <SEP> Liter Die 3 Kolben wurden während 41 Stunden auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung in einem auf 24 C gehaltenen Brutraum ge schüttelt.
In diesem Stadium der Gärung wurden jedem Kolben 33,3 mg 11-Desoxy- cortieosteron in 3 cm3 Alkohol bzw. den 3 Kolben eine Gesamtmenge von 100 mg zu gesetzt. Die äthanolische Lösung des 11- Desoxycorticosterons wurde durch Filtrieren durch ein ultrafeines Glasfilter sterilisiert. Die Kolben wurden während weiterer 7 Stun den nach der Zugabe des Steroids geschüttelt und dann von der Schüttelvorrichtung ent fernt. Die Inhalte der Kolben wurden ver einigt, wobei 300 cm@ Gärungsflüssigkeit er halten wurden, welchen 300 cm3 Aceton zu gesetzt wurden.
Das Gemisch wurde in einem kalten Raum aufbewahrt und in der im Bei spiel 1 beschriebenen Weise extrahiert.
Das neutrale Hormonkonzentrat wurde mittels der Glykogenprüfung untersucht, die positive Resultate lieferte. Es wurde eine toxische Wirkung festgestellt, die gewöhnlich zur Folge hat, dass die Aktivität gegenüber dem wahren Wert eine Verkleinerung erfährt.
Process for the preparation of 11-oxy-steroids The present invention relates to a process for the preparation of 11-oxy-steroids by oxidation of steroids which are unsubstituted in the 11-position.
The introduction of oxygen into the 11-position of a steroid molecule has hitherto been technically uneconomical because it required a large number of step processes and, moreover, the overall yield was poor.
It has now been found that the oxidation of steroids unsubstituted in the 11-position to 11-oxy-steroids surprisingly proceeds smoothly if the oxidation is carried out by the action of cultures of oxidizing microorganisms of Streptomyces species or of those obtained from them oxidizing enzymes.
In particular, 10,13-dimethyl-cyclopentanopolyhydrophenantrenes can be converted into the corresponding 10-oxy-steroids with ease and in high yields.
Apart from the 11 -position, in isolated cases an oxidation can also take place in other positions of the steroid molecule. However, this may not be disadvantageous since the formation of further oxy groups, e.g. B. in 17 or 21 position, can lead to valuable therapeutic products or intermediate products th. If such additional groups are undesirable, they can be removed with ease using known methods.
Oxy groups contained in the starting materials, which themselves can be oxidized to keto groups, can be intermediately protected by conversion into a group that can easily be returned to an oxy group, for example by esterification, etherification, halogenation or the like.
The steroids to be oxidized according to the invention can have various kinds of substituents, for example in positions 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 and 17, in particular 3-, 7- or 12-keto, -oxy or -acyloxy groups;
17 side chains, of which the side chains of progesterone and corticosterone (ketol) deserve special mention, a 17 keto group; a 17-oxy group, etc .; The core can also have: one or more double bonds in positions 4, 5, 6, 7, 8, 9 (11), 11 (12), 16 (17) and in other positions or combinations of positions of the core;
double bonds saturated by addition of halogen or hydrogen halide; additive groups of dienophilic compounds, such as. B. in maleic acid, maleic anhydride or maleic acid ester addition products of steroids which have a system of conjugated double bonds, for example in position 5.7.
Examples of steroids that can be oxidized by the process according to the invention include: progesterone, 9,11- or 11,12-dehydroprogesterone, 7,9 (11) -bis-dehydroprogesterone, 17-oxy-progesterone , Pregnenolone, acyloxypregnenolone, such as e.g.
B. pregnenolone acetate, 11-deoxycorti- eosterone, <B> A '(") - </B> or 411 (") -deoxyeorti- costerone, 11-deoxy-17-oxy-corticosterone and acyloxy derivatives, such as. B. the acetoxy derivative, 21-oxy-pregnenolone and its 21-acyl derivatives, such as.
B. the acetyl derivative, and esters thereof, 17,21-dioxy-pregnenolone and 17,21-diacyloxy derivatives of the latter, such as. B. the diacetoxy derivative, androstenedione, androstan-17-ol, 9,11- or 1_l, 12-dehydroandrostenedione, 3-oxy-9 (11) - or -11 (12) -pregnen-20-one, 3, 21-Dioxy-9 (11) - or -11 (12) -pregnen-20-one, 3.17,
21-trioxy-9 (11) - or -11 (12) -pregnen-20-one, 5-anrosten-3-ol-17-one and 3-esters, such as. B. the acetate, 5-androsten-3-ol-17-one and its 3-ester, such as.
B. the acetate; Ergosterol, stigmasterol, stigmastanol and their 3-esters, for example the acetates, ergostenone, stigmastenon, stigmastanone, cholestenone, cholic acid, deoxycholic acid, lithocholic acid, cholanic acid, norcholanic acid, bisnorcholanic acid, cholenic acid,
Norcholenic acid, bis-norcholenic acid and 3-oxy-, 3-keto-, 3,7-dioxy-, 3,7-diketo-, 3,7,12-trioxy-, 3,7,12-triketo derivatives, 9,11- or 11,12-unsaturated esters, thiolesters and other derivatives of the aforementioned acids, etc.
As stated, the oxidation is carried out using an oxidizing Streptomyces species or oxidizing enzymes obtainable therefrom. As an example of Streptomyces species which are suitable for carrying out the process according to the invention, the following are listed Streptomyces fradiae, endus, H-39, K-93, BC-17, W-4, albus, coelicolor, front, cali - fornicus, flaveolus,
bobiliae, roseochromogenus, griseolus, erythreus, cellulosae, parvus, malenconi, diastaticus, fRmicarius, flavoviruses, olivochromogenus, diastatochromogenes, flavochromogenes, antibiotieus,
virido- chromogenes, purpeochromogenus, phaeochromogenus, aureus, erythrochromogenes, lavendulae, reticuli, rubriretieuli, flav us, ruber, citreus, fulvissimus, aureofaciens, ri- musus, gougeroti, violaceoniger,
griseus, griseoflavus, albidoflavus, poolensis, olivaceus, lieskei, microflavus, caeaoi, novaecaesareae, exfoliatus, gelaticus, rutgersensis, lipmanii, halstedii, hygroseopicus, alboflavus, albos-sporeous,
flocculus, melanosporeus, melano- cyclus, acidophilus, rubeseens, thermophilus thermofuscus, scabies, ipomoea, fordii, africanus, gallicus, pelletieri, listeri, upeottii, hortonensis, gibsonii,
beddardii, kimberi, somaliensis, panjae, willmorei; For reasons of economy and to achieve optimal yields, the species fradiae and H-39 are generally preferably used. In certain cases and under special conditions, however, other types can be used to advantage. The species of the genus Streptomyces have different enzyme mechanisms.
If grown in a suitable manner, they enable the production of 11-oxy-steroids on an industrial scale.
The microorganisms can be isolated from natural sources according to the usual work methods of microbiologists, for. B. as follows: Sterile media are made from various substances containing carbohydrates and nitrogen and solidified into a gel by adding 2% agar. A large number of different substances can be used as nitrogenous nutrients, for example inorganic nitrates, ammonium salts or protein degradation products. The media can be sterilized with compressed steam or by heating in flasks or tubes closed with cotton wool in the autoclave.
They are used for aseptic filling of Petri dishes that are exposed to dust, atmospheric air, soil, etc. Bacterial colonies develop on these dishes, of which those of the genus Streptomyces can easily be recognized by a trained microbiologist. The organisms are then taken up and either transferred to the same medium in test tubes or to any other medium suitable for the cultivation of microorganisms.
For the purposes of the present invention, the organism culture is best transferred from its natural or artificial source of supply to certain bacteriological media that promote the development of microorganisms. These media contain at least one carbohydrate-containing substance and one nitrogen-supplying substance, in most cases a neutralizing agent such as B. calcium carbonate, and substances that provide other growth factors such. B.
Residues from the distillery. Corn steep liquor and brewer's yeast or inorganic salts, etc. The p. the medium at the time of inoculation is usually adjusted to between about 6.5 and 7.5.
When treating in the autoclave to achieve aseptic conditions, the p. This reduction in p should be taken into account when adjusting the medium before treatment in the autoclave in order to obtain optimal growth conditions at the end of this treatment.
After the microorganisms have grown on the fermentation medium for about 4-28 hours, a considerable increase in pH, usually to about 7-S; determine. If desired, one can, however, also in other p. Ranges, for example with an nH of 5-7, work. The steroid to be oxidized is preferably used at this stage of growth. The fermentation liquid which is to be used for the fermentative oxidation of the steroids can also be separated from the culture at this stage.
The inoculation of the culture medium can be carried out according to any microbiological method. So the vaccination z. B. be carried out in a very convenient manner with vegetative mycelia of the organisms. Inoculating with spores is equally effective. The growth of the microorganisms is easily promoted by keeping the incubation temperatures around room temperature, i.e. H. between about 20 and 30 ° C. For the growth of the microorganisms, however, temperatures in a wider range, for example temperatures of about 15-40 C, have proven to be satisfactory.
The time during which the microorganisms must grow before the steroid to be oxidized can be subjected to the action of the culture or the enzymes is obviously not critical. For example, the steroid to be oxidized can either be added at the time of inoculating the medium or at a later point in time, for example 24-72 hours later. In practice it has been shown that the steroid compound to be oxidized can still be added to the culture medium after 4 days after inoculation of the medium without any effect on the result being observed.
The addition of a 11-deoxy steroid to the fermentation medium is preferably carried out after a growth period of about 40-48 hours, since at this stage of growth the development of the system of oxidizing enzymes has reached its peak. If the oxidation is to be carried out using the fermentation liquid containing the oxidizing enzymes alone, the fermentation liquid is preferably separated off at least after this growth stage.
The way in which the steroid to be oxidized is added to the culture or the enzymes is apparently not critical. The addition can be appropriately carried out so that intimate contact of the steroid with the culture or the enzymes is promoted, for example, by culturing the organisms in the presence of finely divided crystals of the steroid, dispersing the steroid in the bacterial medium, etc. For this purpose , if desired, surface-active substances, dispersants or suspending agents, such as. B.
the commercially available sorbitan esters with an emulsifying effect, Spans, Tweene, Aerosols, Nacconole (branded products) can be used.
However, the steroid is preferably added to the culture medium or the fermentation liquid in the form of a solution in a water-miscible organic solvent, for example in the form of a solution in acetone, alcohols or even ether, which is only slightly miscible with water, whereupon the medium and the Steroid thoroughly mixed, so that a suspension or dispersion of fine steroid particles is created and maximum contact of the steroid to be oxidized with the oxidizing microorganisms or the enzymes occurs.
Either submerged culture or surface culture can be used. However, submerged cultures are preferred. You can also separate the fermentation liquid from a microorganism column, mix it with the steroid or a solution thereof and throw the mixture under aerobic conditions in order to carry out the oxidation of the steroid.
During the oxidation of the steroid, the temperature is expediently kept in that range which is also favorable for the development and growth of the microorganisms, for example between about 15 and 40 ° C .; room temperature is preferred to achieve an optimal effect of the organisms or enzymes.
The microorganisms in question grow aerobically. The degree of growth is related to ventilation. In and of itself, any form of aerobic incubation is satisfactory; however, vigorous aeration is usually provided, for example by stirring and / or blowing air through the culture medium in order to achieve maximum growth of the bacterial organisms, which also reduces the time required to convert the deoxy steroid into the steroid oxidized in the 11-position is reduced.
The rate at which the deoxysteroids are converted into 11-oxy-steroids thus depends either on the extent of ventilation or on the extent of growth at the time the steroid is added. It has been observed that when using either the bacteria or the fermentation medium alone, the conversion occurs more quickly if the degree of ventilation is greater and also if the bacteria are allowed to grow for 24-72 hours before the addition of the steroid to be oxidized . From this it can be concluded that the oxidizing effect of the microorganisms or enzymes has only fully developed after this period of growth.
The cultivation of the microorganisms can, however, also take place without stirring or other aeration; furthermore the steroid can also be added to the culture medium at the time of inoculation with the bacterial organism.
The time required for the oxidation of the deoxysteroids by means of the oxidizing organisms or the oxidizing enzymes obtainable therefrom cannot be specified with accuracy, since various factors must be taken into account. In general, a reaction time of about 1-72 hours has proven to be satisfactory. It has been observed, however, that the oxidation of the steroid begins practically immediately after exposure to the fermentation liquid of fully grown oxidizing microorganisms or the oxidizing enzymes thereof.
It is believed that the microorganisms are fully grown in 24-72 hours; i this time depends to a certain extent on the degree of ventilation. If the steroid is added to the fermentation medium at the point in time at which the medium is inoculated with the microorganisms, it is advisable to use longer times in order to achieve high yields of oxidized steroid.
If the steroid is added at the time of inoculation of the medium, reaction times of 8-72 hours are therefore usually used, the most favorable time being inversely proportional to the degree of aeration. If, on the other hand, the steroid is only added to the culture or the enzymes when the growth of the organisms has already progressed considerably, for example after about 24 hours, the conversion of the deoxysteroids into 11-oxy-steroids begins immediately, with high yields in 1 -72 hours or even shorter times. These times again depend on the degree of ventilation.
After the oxidative fermentation has ended, the 11-oxy-steroids can be isolated from the fermentation mixture in various ways. A particularly useful method Me for separating the oxidized steroid is to use the oxidation mixture, which contains especially the fermentation fluid and the mycelia, if the steroid was added directly to the culture, with an organic solvent, such as. B. 30% Acoton, a halogenated hydrocarbon, such as.
B. methylene chloride, ethylene chloride, chloroform, ethers and the like, either directly or after acidification to a low pH, for example to a p. of 1, using mineral acid to extract. The myelias are extracted again with solvent and discarded. The combined filtrates are distilled in vacuo. A 20% strength acetone solution is prepared from the residue and extracted with petroleum ether or Heran.
The extract is washed back with 20% strength acetone, whereupon the 20% strength acetone solutions are combined and extracted with ethylene dichloride. The aqueous residue is discarded, while the ethylene dichloride fraction is distilled in vacuo and the residue is converted into ethyl acetate. The ethyl acetate solution is then washed in succession with dilute alkali, dilute acid and water until a new tral p is obtained.
This neutral concentrate can be chromatographed in a column. The fractions containing the conversion products can be used to crystallize the 11-oxy-steroid. Other extraction methods known to those skilled in the art can also be used. The crystalline material can be identified by known methods, for example by elemental analysis, by the melting point, by infrared spectra, X-ray diffraction, ultraviolet spectra, micro-combustion.
The crystalline material or the extracts of the non-crystalline material which are obtained in the oxidation can also be identified or characterized by means of the Zaffaroni paper chromatogram system described in more detail below.
A particularly favorable method of separating the oxidation products produced by the process of the invention is that of chromatography of extracts or solid materials using an ethylene glycol-coated column of silicon dioxide or fluorosil (magnesium silicate, branded product) or another chromatography column. This method consists in using the neutral extract or
first dissolve the solids in acetone, methylene chloride or some other suitable solvent, let the solution adsorb on filter paper disks, remove the solvent by vacuum distillation to leave the solids in a dry state on the disks, place the disks on the top of the column and the column is developed with solvents or solvent mixtures which, if a silicon dioxide column covered with ethylene glycol is used, are saturated with ethylene glycol.
This method is particularly suitable for identifying the compounds produced by oxidation, since each fraction obtained from the column can, if desired, be tested by the Zaffaroni method. Using the Zaffaroni paper chromatography system, it is possible to test the smallest amounts of just 10-40 micrograms of material, identify individual chemical bodies, combine fractions that contain the same chemical bodies, and crystallize the compound from the combined fractions.
The Zaffaroni method mentioned in this description and in the examples is a relatively new, but already proven method for identifying certain organic compounds, such as e.g. B. the adrenal cortex hormones and related compounds. This analytical method relies in part on the polarity of the compound being tested.
The following are cited as literature citations relating to this analytical method: Burton, Zaffaroni and Keutmann, A New Analytical Method for Adrenal Cortical Hormonas, Science 110, 442 (1949), and Zaffaroni, Burton and Keutmann, Science 111, 6 (1950) . Since the polarity of organic compounds due to changes in the molecule, z. B.
If the presence or absence of certain groups (each of which as such influences the polarity of the molecule as a whole in a certain way) and the position of a certain group in the molecule are changed, it is possible to use the Zaffaroni method to measure the smallest amounts an organic compound of the adrenal cortical steroid series or related steroid compounds based on their polarity.
It has long been known that different compounds have different polarities; However, the Zaffaroni method is currently the only practically feasible method by means of which the smallest amounts of steroid compounds can be identified by evaluating polarity differences.
This method has proven to be an extremely valuable aid in the investigation of the oxidation of steroids by means of oxidizing bacterial organisms or oxidizing enzymes and in the identification of various new and previously unknown oxidized steroids as well as in the identification of known oxidized steroids.
The method of Zaffaroni et a1. is a variant of the known paper strip chromatography, in which essentially the same principles are applied as in the usual distribution chromatography, which is carried out using a column.
In the method of Zaffaroni et a1. the procedure is essentially as follows: First, a suitable quality filter paper 7.6-10.2 cm wide and 55.9 cm long is folded at a point about 7.6 cm from one end. A line is then drawn over the paper at a point 3.8 cm below the fold to mark the point at which the steroid to be tested is to be applied to the paper.
The paper is then cut lengthwise into strips about 0.95 cm wide, starting with cutting at the end opposite the end to which the steroid to be tested is to be applied. This results in a plurality of paper tapes all of which are attached to a common end and which, if desired, can be left attached to both ends. Each of these bands forms a separate lane for each well of the joint to be tested. But you can also omit cutting the paper into separate lanes and use a single strip.
In this case, however, care must be taken that the various connections to be tested on the individual paper strip are not too close to one another, i.e. H. no closer than about 2.5 cm. A solvent system is selected which consists of a non-polar solvent for the mobile phase and a polar solvent for the stationary phase.
The non-polar solvent benzene and the polar solvent formamide together form such a solvent system. Another of these solvent systems consists of the non-polar solvent toluene and the polar solvent propylene glycol. Both systems have been used with success.
The filter paper is then saturated with the polar solvent, for example with propylene glycol. The excess solvent is removed from the filter paper using additional filter paper, a squeezing device, an ordinary wringer or some other suitable means. Then the non-polar solvent for the mobile phase (also called developing solvent), in this case toluene, is saturated with the polar solvent. The various elements are now ready for assembly.
A battery jar of suitable dimensions, e.g. of <B> 30.5X45.7 </B> cm, which contains 100 cm 'of the non-polar solvent, with a large filter paper sheet, which is to be used for the fixed phase, for. B. propylene glycol, is soaked, fed out. An annular stand placed inside the chamber supports a container holding 350 cc of the solvent for the mobile phase, i.e. H. Toluene, which, as mentioned above, with the solvent for the stationary phase, for. B. propylene glycol, is saturated contains.
The short folded piece or the common end of the paper is placed in the reservoir of the developing solution by means of e.g. B. for the mobile phase be certain non-polar solvent To luene, which has been saturated with propylene glycol, introduced.
The steroid to be tested, in acetone, methylene chloride, methanol or chloroform, is applied by means of a micropipette in an amount of about 10-300 micrograms to the about 3.8 cm below the fold to drive point, after the strip is cut and fixed with the stationary Phase, e.g. B. propylene glycol, has been saturated, but before the common end is introduced into the reservoir. The chamber is then closed with a glass lid and sealed with a starch-glycerine paste.
The mobile phase then flows as a result of adsorption over the downwardly hanging filter paper, whereby the strips are developed. These strips are developed for 3-72 hours or more depending on the solvent system and the steroids. After the development, which can be recognized by the mobility of the connections, the paper strips are dried at room temperature using a fan.
The pits of the unsaturated steroid can be made visible by evaluating their ability to absorb ultraviolet light [see p. Flaines and Drake, Fed. Proc. At the. Soc. Exp. Biol. 9, 180 (March 1950)]. This development is applicable in the case of steroids which have a system of conjugated double bonds, such as e.g. B.
Progesterone, corticosterone, 11-deoxy-corticosterone, 11-dehydrocorticosterone, 11-dehydro-17-oxy-corticosterone, 17-oxy-corticosterone, 11-deoxy-17-oxy-corticosterone, etc.
The steroid well, which is initially located at the feed point, has to be together with the mobile phase by a distance which is inversely proportional to its attraction by the stationary phase and also to the distribution coefficient between the two solvents and that between the filter paper and the solvent system existing adsorption-elution coefficient is dependent, moved further. The affinity for the stationary phase, e.g.
B. propylene glycol, is the largest for steroid compounds with the greatest number of oxy groups. Thus, these compounds move more slowly away from the supply site than the steroids, which contain fewer oxy groups.
Deoxycorticosterone, which has 3 oxygen atoms, moves the fastest of the known cortical steroids, while the corticosteroids, which contain 4 oxygen atoms, move more slowly and the corticosteroids with 5 oxygen atoms move the slowest of the known corticosteroids -Move connections.
Table 1 shows the arrangement of some known corti- eosteroids based on the number of oxygen atoms and the mobility of these compounds. Table II shows the relative mobilities of certain steroids using the propylene glycol / toluene chromatography solvent system.
EMI0008.0010
<I> Table <SEP> I </I>
<tb> name
<tb> OZ <SEP> Progesterone
<tb> 03 <SEP> 11-deoxycorticosterone
<tb> 17-oxyprogesterone
<tb> 04 <SEP> 11-dehydrocorticosterone
<tb> 17-Oxy-11-deoxycorticosterone
<tb> (S <SEP> by <SEP> Reichstein)
<tb> corticosterone
<tb> 0, <SEP> 17-Oxy-II-dehydrocorticosterone
<tb> (E <SEP> by <SEP> Kendall)
<tb> 17-Oxycorticosterone <SEP> (F <SEP> by <SEP> Kendall) (mobility falling from top to bottom) <I> Table </I> II Relative mobilities of several steroids determined in paper chromatography examinations ( arranged with decreasing mobility from top to bottom)
.
EMI0008.0016
<I> Propylene glycol-toluene system </I>
<tb> 11-deoxycorticosterane
<tb> 17-oxyprogesterone
<tb> lla-oxy-progesteron <SEP> (U-III)
<tb> corticosterone
<tb> 17-Oxy-ll-desoxycorticosteron <SEP> (S) *
<tb> 20a, <SEP> 21-Dioxy-4-pregnen-3-on *
<tb> 20ss, <SEP> 21-dioxy-4-pregnen-3-one
<tb> 17-Oxy-ll-dehydrocorticosterone <SEP> (E)
<tb> Dioxyprogesterone <SEP> (U-I)
<tb> 17-Oxy-corticosterone <SEP> (F) <B> * </B> do not differ in this system. Sequence of mobility HO> ester> ketones in a given position in given compounds.
The factors that play a role in Zaffaroni's method are essentially as follows: a) Affinity of the steroid compounds of different polarity towards the more polar of the two solvents. The more polar steroid compounds, such as
B. the steroid compounds containing one or more oxy groups, will be subject to a greater attraction by the polar solvent than the less strongly polar compounds, e.g. those that do not contain oxy groups, which in part determine in which phase the steroid will be present and how quickly its tip will move.
b) The distribution coefficient of the steroid compounds to be tested between two immiscible solvents, which to a certain extent determines the phase in which the steroid will be present and which also determines how quickly the point will move. c) the absorption-elution coefficient of the steroid to be tested, applied to a pretreated filter paper strip and subjected to the action of a mixture of 2 non-miscible solvents, which also determines to a certain extent in which phase the steroid is present and how fast its point will move.
The combination of the three factors determines to which point on the paper chromatogram strip the dot of the steroid will move compared to a dot of a known compound. Within certain limits, it is therefore unimportant how much time is spent developing the stripe by means of the mobile phase, since the connection to be tested is identified using this method on the basis of the relative position of the pit with reference to a known reference substance.
Each dot on the paper chromatogram belongs to a single compound, with the less strongly polar compounds, which move faster, migrate to a point farther from the starting point than those of the more polar, more oxidized compounds, which are in the same place Attempt to be checked. In this way it is possible not only to qualitatively identify the steroid compound, but also to approximately determine the amount of this particular compound by comparison with a control substance of a known amount.
But you can also cut out the zone of the paper chromatogram that contains the steroid to be determined, extract this section with an organic solvent (alcohol, acetone, etc.) and measure the ultraviolet absorption.
It is thus possible, please include to determine the approximate degree of oxidative conversion of a steroid into various more highly oxidized derivatives, since one based on the amount of steroid initially applied to the strip, which is known, simply by determining the number of pits of different, higher oxidized steroid compounds and a comparison of the relative brightness, density or ultraviolet absorption approximates the degree of conversion into and the yield of a certain steroid oxidation product or another conversion product can be.
Since the 11-deoxysteroids in the glycogen storage test by Pabst et al., Endocrinology 41, 55 (1947), have no efficacy of importance, the glycogen storage test by Pabst was used in a large number of the examples to convert the 11-deoxysteroids to show the corresponding in 11-oxy-steroids according to the inventive method.
The steroids oxidized in the 11 -position are known to be very effective when they are subjected to the glycogen storage test. <I> Example </I> T A vegetative seed was produced from a neomycin culture (Streptomyces fradiae, strain 3535) by growing the culture for three days at 24 ° C. in reciprocating shake flasks in a medium of the following composition has been
EMI0009.0035
Cerelose <SEP> (raw <SEP> dextrose)
<SEP> <B><I>log</I> </B>
<tb> Distillery residues <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Potassium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Brewer's yeast <SEP> 10 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Tap water <SEP> 1 <SEP> liter This medium was sterilized under pressure for 30 minutes before inoculation.
The obtained seeds were used for inoculating a medium of the following composition
EMI0009.0038
Cerelose <SEP> (raw <SEP> dextrose) <SEP> 25 <SEP> g
<tb> soybean meal <SEP> 25 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Distillery residues <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Cobalt chloride hexahydrate <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> liter The seed ratio was 5 cm? liquid vegetative seeds per 100 cm3 medium. 100 cm3 of medium were used per flask. First, the required <B> 150 </B> flasks were filled with medium and then sterilized under pressure for 30 minutes before vaccination.
The culture was allowed to grow with shaking on a rotating shaker for 41 hours at 24 C, whereupon a sterile ethanol solution of 5 g of 11-deoxy-17-oxycorticosterone (compound S from Reichstein) at a concentration of 33.3 mg in 3 cm3 Ethanol was added per 100 cm3 of fermentation liquid. The culture was then incubated for a further 7 hours, whereupon the flask contents (15 liters) were combined and an equal volume of acetone was added.
An additional 45 liters of acetone were added to this mixture in order to bring the acetone concentration to 80%. The mixture was stirred and filtered for 2 hours, whereupon the precipitate was washed with 25 liters of 80% strength acetone, the suspension of the filtration residue was stirred for 2 hours, filtered, the filter cake was discarded and the acetone filtrate with that from the first filtration Acetonic filtrate obtained was combined.
The combined filtrates were evaporated in vacuo at a temperature below 50 C. The aqueous residue obtained was adjusted to a 20% strength acetone solution by adding 4 liters of acetone, whereupon the solution was washed 5 times with a volume of 1/3 of mixed hexanes, the combined hexane washing fractions with 2 times 1/10 volume of 20% strength acetone ex tracted, the hexane residue set aside,
the two 20% acetone extracts were combined with the previously obtained 20% acetone main fraction and the 20% total acetone extract was extracted 6 times with a volume of 1/4 of ethylene dichloride. The resulting aqueous residue was set aside.
The combined ethylene dichloride fractions were then washed with a volume of 1/1 a of distilled water, whereupon the ethylene dichloride was distilled off in vacuo at a temperature below 50 ° C. The residue was dissolved in ethyl acetate.
The solution was washed with the following washing liquids:
EMI0010.0030
2 times <SEP> 1/5 <SEP> volume <SEP> aqueous <SEP> sodium bicarbonate
<tb> 1 time <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> water
<tb> 3 times <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> 2% <SEP> aqueous
<tb> sodium carbonate
<tb> 1 time <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> water
<tb> 3 times <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> 0.5n <SEP> hydrochloric acid
<tb> 1 time <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> water
<tb> 3 times <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> 3% <SEP> aqueous
<tb> sodium bicarbonate
<tb> 4 times <SEP> 1 / 1o <SEP> volume <SEP> distilled <SEP> water <SEP> or
<tb> as much as <SEP> as <SEP> for <SEP> achieving <SEP> a <SEP> neutral <SEP> reaction <SEP> is required <SEP>.
Each aqueous washing residue was passed through an ethyl acetate fraction. The ethyl acetic ester fractions were combined to obtain a neutral hormone fraction. Glycogen storage tests according to the method of Pabst et a1. resulted in a yield of 0.28 glycogen units per mg extract.
The theoretical conversion to Kendall's compound F (17-oxy-corticosterone) was thus 2.8%, the glycogen unit being that amount of bioactivity corresponding to one mg of 17-oxy-corticosterone (Kendall's compound F).
<I> Example 2 </I> In this experiment 200 mg of the compound S from Reichstein together with neomycin (Streptomyces fradiae, strain 3535) were incubated in the manner described in Example 1 for 7 hours. A total of 6 flasks or 600 cm3 of fermentation liquid were used. Glycogen storage tests gave a value of 0.22 units per mg of substrate. This value corresponds to a theoretical conversion in Kendall's compound F of 2.2%.
After preparing the neutral hormone extract in the manner described in Example 1, a sample of 165 mg of the neutral hormone concentrate was subjected to paper chromatography. Example <B><I>13</I> </B>
EMI0010.0053
Culture: <SEP> Streptomyces <SEP> H-39
<tb> <I> Seed medium </I>
<tb> Dextrin <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Corn Soaking Liquid <SEP> 80 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> liter The pH was adjusted to 6.6 with potassium hydroxide.
Fermentation medium Same composition as the seed medium.
In this experiment, 200 mg of the compound 8 from Reichstein together with Streptomyces (H-39) were incubated in the manner described in Example 1 for 7 hours. The fermentation liquid was then divided into two halves. One aliquot was extracted directly according to the procedure described in Example 1, while the other aliquot was set to p.1 before extraction. The neutral hormone concentrates obtained from these two experiments were tested using the glycogen storage test.
The experiment with the direct extraction of the heating fluid yielded 0.35 glycogen units per mg of substrate. This value corresponds to a theoretical conversion of 3.5% into the compound F. The analysis of that aliquot part, the pH of which had been adjusted to a value of 1 before the extraction, gave <B> 0.30 </B> A units per mg substrate. This value corresponds to a theoretical conversion of 3.0% in Kendall's compound F.
Example <I> 4 </I> In this experiment 200 mg of the compound S from Reichstein were subjected to incubation together with a neomycin culture in the manner described in Example 1. The neutral hormone concentrate of 190 mg obtained in the manner described in Example 1 was dissolved in the smallest possible amount of acetone and transferred through a column on filter paper disks for graduation chromatography.
The adsorbent consisted of 30 g of silicon dioxide mixed with 21 cm3 of ethylene glycol. In about 35 minutes, 60 cm of liquid was passed through. The column was developed with four different solvents, namely with cyclohexane, cyclohexane / methylene dichloride (4: 1), cyclohexane / methylene chloride (1: 1) and cyclohexane / methylene chloride (1: 4).
<I> Example 5 </I> The medium used to produce the vegetative neomycin seed contained the following components per liter: 10 g raw dextrose, 10 g brewer's yeast, 5 g brandy residues, 4 g potassium chloride. 100 em3 of this medium were sterilized in a 500 cm3 Erlenmeyer flask for 30 minutes under steam pressure.
After cooling, four flasks were inoculated with organisms from an agar culture of Streptomyces fradiae, strain 3535, and then left to fend for 3 days in an incubator kept at 24 C on a reciprocating shaker. The culture obtained was well developed and was used to carry out fermentation in the five 18.9 liter flasks described below.
8 liters of a medium composed of 25 g cerelose, 25 g soybean meal, 5 g sodium chloride, 5 g calcium carbonate, 5 g distillery residues, 1 mg cobalt dichloride hexahydrate and 1 liter tap water were placed in a flask of 18.9 Liters content sterilized for 60 minutes under steam pressure. The flask was equipped with a stirrer, a tube for introducing air at the bottom of the flask, a cotton wool filter for sterilizing the air,
a device for taking samples and an air outlet equipped with a filter. After the medium had cooled, the 8 liters of sterile medium were inoculated with 400 cm3 of the vegetative seeds described above, placed in a water bath kept at 24-26 C, stirred at 270 revolutions per minute and at a rate of 6 liters of air ventilated every minute.
Bacon oil was also added in an amount sufficient to reduce foaming.
47 hours after inoculation, 2.7 g of the compound S F from Reichstein in 270 cm3 of ethyl alcohol were added to the fermentation mixture. This solution was filtered by filtering through an ultrafine sintered glass filter. Fermentation was allowed to continue for an additional 7 hours after which the flask was removed from the water bath, 8 liters of acetone were added to the 8 liters of fermentation liquor, and the mixture was placed in a cold room before being extracted.
Glycogen tests showed a yield of 0.58 units per mg of substrate, which corresponds to a conversion of 5.8% in Kendall's compound F.
Example <I> 6 </I> Inoculation medium for neomycin (Streptomyees fradiae, strain 3535)
EMI0012.0010
Raw <SEP> dextrose <SEP> <B><I>log</I> </B>
<tb> Distillery residues <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Potassium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> liter
<tb> Brewer's yeast <SEP> 10 <SEP> g The vegetative inoculum was produced by growing the culture for 3 days at 24 C in shake flasks.
EMI0012.0011
<I> Fermentation medium </I>
<tb> Raw <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> soybean meal <SEP> 25 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Distillery residues <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Cobalt dichloride hexahydrate <SEP> 1 <SEP> mg
<tb> Tap water <SEP> 1 <SEP> liter This culture was allowed to grow for 24 hours on a rotating shaker at 24 C, whereupon a sterile solution of <B> 111 </B> mg of 11-deoxycorticosterone in a concentration of 37 mg (in 3 cm3 ethanol) per 100 cm3 fermentation liquid was added.
The culture was then allowed to grow for an additional 16 hours, after which the flask contents were combined to make 300 cc and an equal volume of acetone was added. Glycogen tests of the neutral hormone extract obtained in the manner described in Example 1 showed a yield of 0.135 units per mg of substrate, which corresponds to a 3.8% theoretical conversion into corticosterone (compound B from Kendall).
<I> Example i </I> In this experiment, 200 mg of 11-deoxycorticosterone were subjected to incubation together with a neomycin culture in the manner described in Example 1 for 7 hours. The neutral hormone extract was obtained according to the procedure described in Example 1.
The material marked with the code number 169-C-MPB-3, the weight of which was 5.7 mg, was analyzed by infrared spectroscopy. The same compound was isolated from the incubation product of 11-deoxycorticosterone with tissue pulp from porcine adrenal glands.
A sample of this crystalline material, 192-C-MPB-3, has an infrared absorption spectrum which is identical to the spectrum characteristic of the material 169-C-MPB-3.
This substance has been given the trivial name MPS-1 and has the following characteristic properties:
EMI0012.0040
1. <SEP> chemical <SEP> analysis
<tb> Calculated
<tb> I <SEP> 1I <SEP> TII <SEP> empirical <SEP> formula
<tb> C <SEP> 71.72 <SEP> 71.88 <SEP> 72.23 <SEP> 1 <SEP> C "H", 504.2
<tb> H <SEP> 8.98 <SEP> 9.04 <SEP> 8.89 <SEP> 11 <SEP> C211131.504516
<tb> 0 <SEP> 19.30 <SEP> 19.08. <SEP> 18.12 <SEP> III <SEP> C21113104.1 (determined from the difference) 2. Optical rotation (a) D = +110 degrees (ethanol).
3. Melting point (Kofler's block) 181-183 C. 4. Infrared absorption spectrum The following groups are present OH, normal ketone group, conjugated ketone groups, conjugated double bonds. The relative intensity of the bands corresponding to the conjugated and non-conjugated ketone groups has a ratio of 1: 1 out.
5. Ultraviolet absorption: k = 42.5 at 238.5 mu. 6. Oxidation using periodic acid (HJ04) for the quantitative production of formaldehyde shows that this compound has a titer equal to that of compound F.
7. The oxidation with molybdenum oxide (Mo03) under quantitative conditions shows that the reducing power of this compound is twice that of compound F.
B. Glycogen tests show that this compound has less than <B> 0.33 </B> units of activity per mg.
As has been established on the basis of chromatographic tests, the unknown substance MPS-1 migrates less rapidly than corticosterone or compound S. This observation can also be expressed as follows:
MPS-1 is more polar than Kendall's compounds B and Reichstein's S and less polar than Kendall's E compound. <I> Example 8 </I> Seed medium for Streptomyces H-39
EMI0013.0018
Dextrin <SEP> <B> log </B>
<tb> Corn Soaking Liquid <SEP> 80 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 1 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Tap water <SEP> 1 <SEP> liter The medium had a p $ of <B> 6.5-6.7 </B>. The vegetative seeds of this culture were allowed to grow for 3 days at 24 ° C. in a reciprocating shaking container.
Fermentation medium Same composition as the seed medium.
This culture was allowed to grow on a rotating shaker at 24 C for 24 hours, after which a sterile ethanolic solution of 100 mg of 11-deoxycorticosterone in a concentration of 33.3 mg (in 3 em3 ethanol) per 100 em3 fermentation liquid was added.
The culture was then allowed to grow for a further 16 hours, after which the flask contents were combined to make a volume of 300 cubic meters and an equal volume of acetone was added. The neutral hormone extract was obtained in the manner described in Example 1.
The glycogen test with the neutral hormone concentrate showed a yield of 0.075 units per mg of substrate, which value corresponds to a 2.1% theoretical conversion into corticosterone. <I> Example 9 </I> Seed medium for Streptomyces K 93 Same composition as the corresponding medium from Example 6.
EMI0013.0038
<I> Fermentation medium </I>
<tb> Raw <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Brewer's yeast <SEP> 2.5 <SEP> g
<tb> ammonium sulfate <SEP> 5 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 8 <SEP> g
<tb> Potassium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Acid <SEP> Potassium Phosphate <SEP> 0.4 <SEP> g
<tb> soybean meal <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Tap water <SEP> 1 <SEP> liter This culture was allowed to grow for 48 hours at 24 C in flasks on a rotating shaker, whereupon a sterile ethanolic solution of 100 mg 11-deoxycorticosterone in a concentration of 33.3 mg (in 3 em3 ethanol) per 100 cm3 fermentation liquid was added.
The culture was then allowed to continue growing for 16 hours, after which the contents of the flask were combined to make a volume of 300 cubic meters and an equal volume of acetone was added. The neutral hormone fraction was obtained in the manner described in Example 1. Glycogen tests showed a yield of slightly more than 0.07 units per mg of substrate, which corresponds to a theoretical conversion into corticosterone of slightly more than 1.9%.
<I> Example 10 </I> Seed medium <I> for </I> Streptomyces endus Same composition as the corresponding medium from Example 9. Fermentation medium Same composition as the corresponding medium from Example 9.
100 mg of 11-deoxycorticosterone were incubated together with Streptomyces endus (9-20) for 16 hours. The neutral hormone extract was obtained in the manner described in Example 1. Slightly more than 0.075 glycogen units per mg of substrate were obtained, which value corresponds to a theoretical conversion of a little more than 2.1% into compound B (corticosterone). <I> Example 11 </I> Seed medium <I> for </I> Streptomyces <I> W-4 </I> Same composition as the corresponding medium from Example 9.
Fermentation medium Same composition as the corresponding medium from Example 9.
100 mg of deoxycorticosterone were incubated together with Streptomyces (W-4) for 16 hours. The neutral hormone extract was obtained in the manner described in Example 1. The glycogen test showed a yield of a little more than 0.065 units per mg of substrate, which corresponds to a theoretical conversion of a little more than 1.80 /, in corticosterone.
<I> Example 12 </I> Seed medium <I> for </I> Streptomyces BC <I> 17 </I>
EMI0014.0026
Dextrin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> ammonium sulfate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 16 <SEP> g
<tb> Brewer's yeast <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Potassium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Acid <SEP> Potassium Phosphate <SEP> 0,
2 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> liter The vegetative seeds were produced by growing the culture for 3 days at 24 ° C. in shake flasks.
EMI0014.0028
<I> Fermentation medium </I>
<tb> Raw <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Brewer's yeast <SEP> 5 <SEP> g
<tb> ammonium sulfate <SEP> 5 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 8 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Acid <SEP> Potassium Phosphate <SEP> 0.4 <SEP> g
<tb> soybean meal <SEP> 7 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> liter
<tb> Cobalt dichloride hexahydrate <SEP> 1 <SEP> mg This culture was grown for 72 hours at 24 C in flasks on a rotating shaker,
whereupon a sterile ethanolic solution of 100 mg of 11-deoxycorticosterone in a concentration of 33.3 mg (in 3 cm3 of ethanol) per 100 cm3 of fermentation liquid was added. The culture was then allowed to grow for a further 16 hours, after which the contents of the flask were combined to make a volume of 300 cc and an equal volume of acetone was added. A neutral hormone extract was obtained in the manner described in Example 1.
The glycogen test showed a yield of 0.06 units per mg of substrate, which corresponds to a theoretical conversion of 1.6 / p in corticosterone. <I> Example 13 </I> The medium used for the production of the seeds had the following composition.
EMI0014.0040
Dextrin <SEP> 20 <SEP> g
<tb> ammonium sulfate <SEP> 10 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 16 <SEP> g
<tb> Brewer's yeast <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Potassium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> Acid <SEP> Potassium Phosphate <SEP> 0.2 <SEP> g
<tb> tap water <SEP> 1 <SEP> liter The pH was adjusted to 7.5 with potassium hydroxide.
100 cm3 of the medium were sterilized in flasks with a capacity of 500 cm3 for 30 minutes with steam under pressure and, after cooling, with an agar culture of Streptomyces sp. BD-17 vaccinated. After the medium was inoculated, the flask was shaken on a reciprocating shaker for 3 days. The incubation temperature was 24 C.
5 cm3 each of the strongly developed vegetative culture obtained were used to inoculate 3 flasks which contained 100 cm3 of the following medium
EMI0015.0011
Raw <SEP> Dextrose <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Brewer's yeast <SEP> 5 <SEP> g
<tb> ammonium sulfate <SEP> .5 <SEP> g
<tb> calcium carbonate <SEP> 8 <SEP> g
<tb> sodium chloride <SEP> 4 <SEP> g
<tb> soybean meal <SEP> 7 <SEP> g
<tb> Acid <SEP> Potassium Phosphate <SEP> 0.4 <SEP> g
<tb> Tap water <SEP> 1 <SEP> liter The 3 flasks were shaken for 41 hours on a rotating shaker in an incubator kept at 24 ° C.
At this stage of fermentation, 33.3 mg of 11-deoxycortieosterone in 3 cm3 of alcohol or a total of 100 mg were added to each flask. The ethanolic solution of the 11-deoxycorticosterone was sterilized by filtering through an ultra-fine glass filter. The flasks were shaken for an additional 7 hours after the addition of the steroid and then removed from the shaker. The contents of the flasks were combined to obtain 300 cm @ of fermentation liquid to which 300 cm 3 of acetone was added.
The mixture was stored in a cold room and extracted in the manner described in Example 1.
The neutral hormone concentrate was tested using the glycogen test, which gave positive results. A toxic effect has been found which usually results in the activity being reduced from the true value.