Verfahren zur Herstellung von hydroxylgruppenhaltigen Verbindungen der Cyelopentanopolyhydrophenanthr enreihe. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die an sich bekannte Hydrierung von ketogruppenhaltigen Verbindungen der Cy- clopentanopolyhydrophenanthrenreihe zu hy- droxylgruppenhaltigen Verbindungen der Cy- clopentanopolyhydrophenanthrenreihe und ist dadurch gekennzeichnet,
dass man den zur Hydrierung erforderlichem Wasserstoff in Anwesenheit der Ketone auf biochemischem Wege erzeugt.
Die biochemische Hydrierung wird nach an sich bekannten Methoden durchgeführt, z. B. in der Weise, dass man das zu hydrie rende Ausgangsmaterial allmählich oder auf einmal in ein Gärungssubstrat einführt, in welchem eine reduzierende Gärung statt findet. Als Mittel, welche die reduzierende Gärung verursachen, werden vorzugsweise Mikroorganismen bezw. von diesen erhaltene Enzyme angewandt; besonders zweckmässig ist z. B. die Verwendung von obergäriger lief e.
Mit dem erfindungsgemässen biochemi schen Hydrierungsverfahren gelingt es, je nach dem verwendeten Ausgangsmaterial in verhältnismässig einfacher Weise und in guter Ausbeute ,physiologisch wertvolle Stoffe darzustellen, die sich auf rein. chemi schem Wege meistens nur schwierig bezw. nur mit geringer Ausbeute gewinnen lassen.
So kann man z. B. Androsteron durch biochemische Hydrierung leicht in cis-An- drostandiol überführen, während Dehydro- androsteron bei der biochemischen Hydrie rung Androstendiol liefert.
Als sehr geeignet erweist sich das erfin- dungsgemässe Verfahren der biochemischen Hydrierung bei Polyoxoverbindungen der Cyclopentanopolyhydrophenanthrenreihe, und zwar insbesondere bei solchen, bei denen sich in Konjugation zu der einen Ketogruppe eine Kolilenstoff-gohlenstoffdoppelbindung befindet, wie dies z. B. bei dem dl,z-Andro- stendion-3,17 und dem J1,;-Androstendion- 3,17 der Fall ist.
Gerade die letztgenannte Verbindung, das zls,;-Androstendion, liefert bei der erfin dungsgemässen biochemischen Hydrierung ein besonders wertvolles Produkt, nämlich das dl,5-Androstenol-17-on-3, das sogenannte Testosteron; es wird also in diesem Falle überraschenderweise lediglich die Ketogruppe am Kohlenstoffatom 17 hydriert, während sowohl die Ketogruppe am Kohlenstoffatoin 3 wie auch die Doppelbindung zwischen den Kohlenstoffatomen 4 und 5 unangegrzffen bleiben.
Die Anwendbarkeit des erfindungsge mässen Verfahrens ist weiterhin aus den fol genden Beispielen ersichtlich, die gleich zeitig auch als Anleitung für die praktische Durchführung des Erfindungsgedankens dienen.
<I>Beispiel 1:</I> Zu einem in vollkommener Gärung be findlichen Gemisch, -elches aus 50 g Sacclia- rose, 25g Bäckereihefe und 300 b Wasser besteht, wird eine Lösung von 150 mg d4,@,- Androstendion-3,17 in 20 cm' ÄthylallZohol tropfenweise unter Rühren hinzugefügt. Die Gärung wird 4 Tage fortgesetzt,
dann wird der Alkohol abdestilliert und der verblei bende Teil mit Äther extrahiert. Der aus dem Ätherextrakt erhältliche Rückstand wird im Hochvakuum bei 0.001 pp, und 130-170 (Luftbad) destilliert und das er haltene Destillat anschliessend mehrmals aus verdünntem Aceton umkristallisiert. Man er hält in sehr guter Ausbeute einen kristalli nen Stoff, der bei 150-151 (unkorr.) schmilzt und mit Testosteron identisch ist.
<I>Beispiel 2:</I> Ein Gemisch aus 50 g Invertzucker, 2.5 g Oberhefe (Mailand, flockige Fermente) und 300 cm' Nasser wird nach Eintritt lebhafter Gärung unter Umschütteln tropfenweise mit einer Lösung von 180 mg Dehydro-andro- steron in 20 cm' Alkohol versetzt. Man lässt das Ganze 42 Stunden bei etwa 20 gären und fügt dann nochmals 10 g Invertzucker, 10 g Oberhefe und 100 cm' Wasser hinzu. Wenn die.
Gärung im wesentlichen beendet ist und die Flüssigkeit Fehlingsche Lösung nur noch schwach reduziert, was nach etwa 90 Stunden der Fall zu sein pflegt, wird die Flüssigkeit von dem Hefesatz abgegossen. Beide Teile werden dann mehrmals mit Äther extrahiert, die vereinigten Extrakte werden eingedampft und der erhaltene ölige Rückstand im Hochvakuum (0.001 pP Hg) fraktioniert destilliert.
Der zwischen 140 bis <B>180'</B> (Luftbad) übergehende halbfeste An teil wird mit Petrolätlier gewaschen, der hierbei erhaltene feste Rückstand wird dann mehrmals aus verdiiiintem Aceton umkristal lisiert. Nan erhält 32 mg einer kristallinen Substanz vom Schmelzpunkt<B>178-179</B> , die mit J;."-Ancli-osteiidiol identisch ist.
Beispiel <I>3:</I> Man fügt zu einem in lebhafter Gärung befindlichen Gemisch aus 40 g Rohzucker, 20 g Oberhefe und 300 ein" Leitungswasser unter häufigem Umschütteln eine Lösung von 200 mg d7,. Androstendion-3.17 in 20 cm' Alkohol hinzu iuid lässt das Ganze drei Tage bei Zimmertemperatur -eiter gären. Dann giesst man die Flüssigkeit von der Hefe masse ab und extrahiert beide Teile mit Äther.
Die Ätherextrakte werden vereinigt und mit n-1Tatronla.uge. verdünnter Salz säure und Nasser gewaschen. Der beim Ein dampfen der ätherischen Lösung erhaltene Rückstand wird aus Aceton iuid Petroläther sowie anschliessend aus Aceton und verdünn tem Alkohol umkristallisiert;
man erhält eine Substanz vom Schmelzpunkt 163 bis 164 (unkorr.) und von der optischen Drehung [al -f- 4.3 , die mit Iso- androstan.diol identisch ist.
Aus der Nutterlauge des ersten Kristalli- sats aus Aceton und Petroläther kristallisiert bei mehrtägigem Stehenlassen eine kleine Menge einer Substanz, die sich nach dem Umkristallisieren aus verdünntem Aceton als A",:;y-Indrostenol-17-on-3 erweist.
<I>Beispiel</I> 4.: Zu einem aus 40 g Invertzucker, 20 g Oberhefe und 300 cm' Wasser bestehenden Ansatz wird nach Eintritt lebhafter Gärung unter häufigem Umschütteln eine Lösung von 200 mg Androstandion-3,17 in 20 cm' Al kohol hinzugefügt. Das Gärungsgemisch lässt man drei Tage bei etwa 22 gären, dann extrahiert man das Ganze mit Äther und wäscht die ätherische Lösung nacheinander mit n-Natronlauge, mit verdünnter Salz säure und mit Wasser. Die ätherische Lö sung wird dann eingedampft und der Rück stand wird im Hochvakuum (0,001,uu Hg) fraktioniert destilliert.
Den zwischen 140' bis 170 (Luftbad) übergehenden Teil kristalli siert man aus Aceton und verdünntem Al kohol um; man erhält dabei eine kristalline Substanz vom Schmelzpunkt 163-164', die sich als Isoandrostandiol erweist.
<I>Beispiel 5:</I> Zu einem Gäransatz, der aus 150 g Rohr zucker, 20 g Bierhefe, 40 g Natriumsulfit und 1500 cm' Wasser besteht, wird eine Lösung von 10 g des Natriumsalzes der 3,12-Diketo-cholansäure hinzugegeben. Das Gärungsgemisch lässt man zwei Monate bei 35 stehen; während dieser Zeit wird der Rohrzuckergehalt dreimal erneuert. Dann wird das Reaktionsgemisch mit verdünnter Salzsäure angesäuert und mit Äther extra biert.
Die ätherische Lösung wird zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus verdünntem Alkohol umkristallisiert. Man erhält auf diese Weise etwa 6 g 3-Oxy-12- ketocholansäure vom Schmelzpunkt 165 . <I>Beispiel 6:</I> Man fügt eine Lösung von 2 g Chole- stanon in 100 cm' Alkohol zu einem in leb hafter Gärung befindlichen Ansatz, der aus 150 g Rohrzucker, 20 g Bierhefe, 30 g Na triumsulfit und 1500 em3 Wasser bereitet ist.
Man lässt das Gärungsgemisch zwei Monate bei 35 stehen und erneuert während dieser Zeit den Rohrzucker dreimal. Dann -wird das Reaktionsgemisch mit Äther extrahiert, die ätherische Lösung wird mit n-Natron- lauge, mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen und anschliessend eingedampft; der Rückstand wird aus Alkohol umkristal lisiert; man erhält etwa 1,3 g Cholestanol vom Schmelzpunkt 14l-142 .
Anstatt der oben genannten Ausgangs materialien können natürlich auch andere ketogruppenhaltige Verbindungen verwendet werden, sofern sie das Cyclopentanopoly- bydrophenanthrenringsystem besitzen.
Ebenso können auch die Arbeitsweisen und Reaktionsbedingungen bei der Durch führung der biochemischen Hydrierung in mannigfacher, dem Fachmann geläufiger Art abgeändert werden. So kann man z. B. zur Förderung der Gärung sogenannte Akti vatoren, wie z. B.
Salze von der Art des primären oder sekundären Natriumphosphats, Calciumcarbonat oder stickstoffhaltige Ver bindungen, welche eine schnellere Entwick lung der Gärungsorganismen bewirken, zu dem Gärungssubstrat hinzufügen; in man chen Fällen kann sich auch ein Zusatz von Sulfiten, wie Natriumsulfit oder dergl. als empfehlenswert erweisen.
Process for the preparation of hydroxyl-containing compounds of the Cyelopentanopolyhydrophenanthren series. The present invention relates to the hydrogenation, known per se, of compounds of the cyclopentanopolyhydrophenanthrene series containing keto groups to give compounds of the cyclopentanopolyhydrophenanthrene series containing hydroxyl groups and is characterized in that
that the hydrogen required for hydrogenation is generated in the presence of the ketones by biochemical means.
The biochemical hydrogenation is carried out according to methods known per se, e.g. B. in such a way that the starting material to be hydrated is introduced gradually or all at once into a fermentation substrate in which a reducing fermentation takes place. As a means that cause the reducing fermentation, microorganisms are preferably BEZW. using enzymes obtained from them; is particularly useful z. B. the use of top-fermented ran e.
With the biochemical hydrogenation process according to the invention, it is possible, depending on the starting material used, to produce physiologically valuable substances that are pure in a relatively simple manner and in good yield. chemical path mostly difficult respectively. can only be obtained with a low yield.
So you can z. B. androsterone can easily be converted into cis-androstandiol by biochemical hydrogenation, while dehydro- androsterone yields androstenediol in biochemical hydrogenation.
The process according to the invention of biochemical hydrogenation proves to be very suitable in the case of polyoxo compounds of the cyclopentanopolyhydrophenanthrene series, specifically in particular in those in which there is a colylenic carbon double bond in conjugation to the one keto group, as is the case with e.g. B. is the case with the dl, z-androstenedione-3.17 and the J1,; - androstenedione-3.17.
Precisely the last-mentioned compound, the zls, - androstenedione, provides a particularly valuable product in the biochemical hydrogenation according to the invention, namely the dl, 5-androstenol-17-one-3, the so-called testosterone; In this case, surprisingly, only the keto group on carbon atom 17 is hydrogenated, while both the keto group on carbon atom 3 and the double bond between carbon atoms 4 and 5 remain unaffected.
The applicability of the process according to the invention can also be seen from the following examples, which also serve as instructions for the practical implementation of the concept of the invention.
<I> Example 1: </I> A solution of 150 mg d4, @, - androstenedione-3 is added to a mixture that is in complete fermentation, which consists of 50 g saccharose, 25 g baker's yeast and 300 g water Add 17 in 20 cm of ethyl alcohol dropwise with stirring. The fermentation continues for 4 days,
then the alcohol is distilled off and the remaining part is extracted with ether. The residue obtainable from the ether extract is distilled in a high vacuum at 0.001 pp, and 130-170 (air bath) and the distillate he obtained is then recrystallized several times from dilute acetone. He keeps a crystalline substance in very good yield that melts at 150-151 (uncorrupted) and is identical to testosterone.
<I> Example 2: </I> A mixture of 50 g of invert sugar, 2.5 g of upper yeast (Milan, flaky ferments) and 300 cm of wetness is mixed with a solution of 180 mg of dehydro-androstone dropwise with shaking after vigorous fermentation has started in 20 cm 'of alcohol. The whole thing is left to ferment for 42 hours at about 20 hours and then another 10 g of invert sugar, 10 g of upper yeast and 100 cm of water are added. If the.
Fermentation is essentially over and the liquid is only slightly reduced by Fehling's solution, which is usually the case after about 90 hours, the liquid is poured off the yeast sediment. Both parts are then extracted several times with ether, the combined extracts are evaporated and the oily residue obtained is fractionally distilled in a high vacuum (0.001 pP Hg).
The semi-solid portion passing over between 140 to 180 '(air bath) is washed with petroleum ether, the solid residue obtained in this way is then recrystallized several times from diluted acetone. Nan receives 32 mg of a crystalline substance with a melting point of <B> 178-179 </B>, which is identical to J;. "- Ancli-osteiidiol.
Example <I> 3: </I> A solution of 200 mg d7, androstenedione-3.17 in 20 cm 'is added to a mixture of 40 g raw sugar, 20 g upper yeast and 300% tap water in lively fermentation. Add alcohol and leave it to ferment for three days at room temperature, then pour the liquid from the yeast mass and extract both parts with ether.
The ether extracts are combined and washed with n-1 sodium hydroxide solution. diluted hydrochloric acid and water washed. The residue obtained when the ethereal solution evaporates is recrystallized from acetone iuid petroleum ether and then from acetone and dilute alcohol;
one obtains a substance with a melting point of 163 to 164 (uncorr.) and from the optical rotation [al -f- 4.3, which is identical to isoandrostan.diol.
From the mother liquor of the first crystals of acetone and petroleum ether, a small amount of a substance crystallizes on standing for several days, which after recrystallization from dilute acetone turns out to be A ",:; y-indrostenol-17-one-3.
<I> Example </I> 4 .: To a mixture consisting of 40 g of invert sugar, 20 g of upper yeast and 300 cm 'of water, a solution of 200 mg of androstandion-3.17 in 20 cm' is added after the start of vigorous fermentation with frequent shaking. Alcohol added. The fermentation mixture is left to ferment for three days at about 22, then the whole is extracted with ether and the ethereal solution is washed successively with sodium hydroxide solution, with dilute hydrochloric acid and with water. The ethereal solution is then evaporated and the residue is fractionally distilled in a high vacuum (0.001, uu Hg).
The part passing between 140 'to 170 (air bath) is crystallized from acetone and dilute alcohol; a crystalline substance with a melting point of 163-164 'is obtained, which turns out to be isoandrostandiol.
<I> Example 5: </I> A solution of 10 g of the sodium salt of the 3,12-diketone is added to a fermentation batch consisting of 150 g of cane sugar, 20 g of brewer's yeast, 40 g of sodium sulfite and 1500 cm of water. cholanic acid added. The fermentation mixture is left to stand for two months at 35; during this time the cane sugar content is renewed three times. The reaction mixture is then acidified with dilute hydrochloric acid and extracted with ether.
The ethereal solution is evaporated to dryness and the residue is recrystallized from dilute alcohol. About 6 g of 3-oxy-12-ketocholanic acid with a melting point of 165 are obtained in this way. <I> Example 6: </I> A solution of 2 g of cholestanone in 100 cm of alcohol is added to a mixture in lively fermentation, which consists of 150 g of cane sugar, 20 g of brewer's yeast, 30 g of sodium sulfite and 1500 em3 water is prepared.
The fermentation mixture is left to stand for two months at 35 and the cane sugar is renewed three times during this time. Then the reaction mixture is extracted with ether, the ethereal solution is washed with sodium hydroxide solution, with dilute hydrochloric acid and water and then evaporated; the residue is recrystallized from alcohol; about 1.3 g of cholestanol with a melting point of 141-142 are obtained.
Instead of the abovementioned starting materials, other compounds containing keto groups can of course also be used, provided they have the cyclopentanopoly- bydrophenanthrene ring system.
Likewise, the working methods and reaction conditions when carrying out the biochemical hydrogenation can also be modified in a wide variety of ways familiar to the person skilled in the art. So you can z. B. to promote fermentation so-called Akti vators such. B.
Salts of the type of primary or secondary sodium phosphate, calcium carbonate or nitrogen-containing compounds, which cause the fermentation organisms to develop more quickly, add to the fermentation substrate; In some cases, the addition of sulfites, such as sodium sulfite or the like, can also prove to be advisable.