CA3063275A1 - Milieu et procede de culture et isolement selectif de la bacterie enterococcus hirae - Google Patents
Milieu et procede de culture et isolement selectif de la bacterie enterococcus hirae Download PDFInfo
- Publication number
- CA3063275A1 CA3063275A1 CA3063275A CA3063275A CA3063275A1 CA 3063275 A1 CA3063275 A1 CA 3063275A1 CA 3063275 A CA3063275 A CA 3063275A CA 3063275 A CA3063275 A CA 3063275A CA 3063275 A1 CA3063275 A1 CA 3063275A1
- Authority
- CA
- Canada
- Prior art keywords
- culture medium
- bacteria
- enterococcus
- specific
- hirae
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/045—Culture media therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Virology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
La présente invention concerne un milieu de culture spécifique pour la culture et l'isolement sélectif d'une bactérie Enteroccus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend : - comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
Description
MILIEU ET PROCEDE DE CULTURE ET ISOLEMENT SELELI _________ iF DE LA BACTERIE
ENTEROCOCCUS HIRAE
La présente invention concerne un nouveau milieu et procédé de culture et d'isolement sélectif de la bactérie commensale Enterococcus hirae au sein d'un __ échantillon biologique, notamment de selles.
Les bactéries du genre Enterococcus sont des cocci à Gram positif, retrouvés sous forme de diplocoques. Ce sont des germes commensaux du tube digestif, le plus souvent responsables d'endocardites et d'infections urinaires [1]. Le genre Enterococcus est rangé dans le domaine des Bacteria, le phylum des Firmicutes, la ia classe des Bacilli, l'ordre des Lactobacillales, la famille des Enterococcaceae et enfin la branche des Clostridium. A l'heure actuelle, il existe 58 espèces d'entérocoques différentes [1].
Les entérocoques les plus souvent retrouvés dans les échantillons cliniques sont Enterococcus faecalis qui représentent qui représentent 75 à 85 % des souches is cliniques d'entérocoques et Enterococcus faecium qui représentent 10 à 20 Vo des souches cliniques d'entérocoques, les autres espèces des souches cliniques du genre Enterococcus représentant environ 5 % à savoir Enterococcus hirae, E.
casselfflavus, E. gallinarum et E raffinosus [14].
Enterococcus hirae est un pathogène zoonotique, retrouvé chez les 20 mammifères et les oiseaux, qui a rarement été isolé à partir d'une infection chez l'homme [2].
Actuellement, différents milieux de culture solides sont utilisés pour sélectionner les bactéries du genre Enterococcus, tel que le milieu BEA (Bile Esculine Azide) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) [3], qui permet l'isolement zs sélectif des bactéries du genre Streptococcus appartenant au groupe D et les bactéries du genre Enterococcus. Il existe également les milieux mEI Agar (Difco, BD, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis), Chromocult enterococci (Merck, Darmstadt, Allemagne), et m-Enterococcus agar (Sigma-Aldrich), qui permettent d'isoler les entérocoques [4].
ENTEROCOCCUS HIRAE
La présente invention concerne un nouveau milieu et procédé de culture et d'isolement sélectif de la bactérie commensale Enterococcus hirae au sein d'un __ échantillon biologique, notamment de selles.
Les bactéries du genre Enterococcus sont des cocci à Gram positif, retrouvés sous forme de diplocoques. Ce sont des germes commensaux du tube digestif, le plus souvent responsables d'endocardites et d'infections urinaires [1]. Le genre Enterococcus est rangé dans le domaine des Bacteria, le phylum des Firmicutes, la ia classe des Bacilli, l'ordre des Lactobacillales, la famille des Enterococcaceae et enfin la branche des Clostridium. A l'heure actuelle, il existe 58 espèces d'entérocoques différentes [1].
Les entérocoques les plus souvent retrouvés dans les échantillons cliniques sont Enterococcus faecalis qui représentent qui représentent 75 à 85 % des souches is cliniques d'entérocoques et Enterococcus faecium qui représentent 10 à 20 Vo des souches cliniques d'entérocoques, les autres espèces des souches cliniques du genre Enterococcus représentant environ 5 % à savoir Enterococcus hirae, E.
casselfflavus, E. gallinarum et E raffinosus [14].
Enterococcus hirae est un pathogène zoonotique, retrouvé chez les 20 mammifères et les oiseaux, qui a rarement été isolé à partir d'une infection chez l'homme [2].
Actuellement, différents milieux de culture solides sont utilisés pour sélectionner les bactéries du genre Enterococcus, tel que le milieu BEA (Bile Esculine Azide) (Sigma-Aldrich, Saint Quentin Fallavier, France) [3], qui permet l'isolement zs sélectif des bactéries du genre Streptococcus appartenant au groupe D et les bactéries du genre Enterococcus. Il existe également les milieux mEI Agar (Difco, BD, Franklin Lakes, New Jersey, Etats-Unis), Chromocult enterococci (Merck, Darmstadt, Allemagne), et m-Enterococcus agar (Sigma-Aldrich), qui permettent d'isoler les entérocoques [4].
2 L'objectif de la présente invention est de sélectionner spécifiquement E
hirae, parmi les autres bactéries du genre Enterococcus. En effet, cette bactérie E
hirae joue un rôle important dans l'Immunité, notamment dans le traitement du cancer du sein [5]. Il a été démontré que la présence d'E. hirae chez les femmes atteintes d'un cancer du sein favorisait la réponse au traitement par chimiothérapie. E hirae est un oncomicrobiotique , elle favorise l'effet thérapeutique anti-cancéreux du cyclophosphamide (CTX). En effet, elle active l'immunité anti-tumorale via l'induction de cellules Th17 et en augmentant le ratio des cellules cytotoxiques sur les cellules T
régulatrices [5].
io Le but de la présente invention est de sélectionner E. hirae à partir de prélèvements biologiques, en particulier de selles de patients, afin de mettre en évidence la présence ou non de cette bactérie dans le microbiote de ces patients et ainsi prédire leur possible réponse au traitement thérapeutique par cyclophosphamide [5].
is La présente invention a consisté tout d'abord à sélectionner spécifiquement les bactéries du genre Enterococcus et plus particulièrement E. faecalis, E
faecium et E
hirae sur un milieu de culture puis différencier E hirae des autres entérocoques par une technique de coloration.
On comprend que le milieu de culture pour Enterococcus selon l'invention est zo constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture sélective des entérocoques, comprenant notamment différents inhibiteurs des bactéries Gram négatif et de la plupart des bactéries Gram positif, autres que les entérocoques.
Un milieu couramment utilisé pour la mise en évidence des entérocoques est le milieu bile-esculine qui comprend :
10 % de bile de boeuf (les entérocoques tolèrent jusqu'à 40 % de bile contrairement à de nombreux autres germes) ;
- de l'azoture de sodium (un antiseptique élimine toutes les bactéries. Gram négatifs) ;
- de l'esculine et du citrate de fer ammoniacal (un composé qui permet le 30 virage vers le noir du milieu de culture lorsque l'esculine est hydrolysée).
hirae, parmi les autres bactéries du genre Enterococcus. En effet, cette bactérie E
hirae joue un rôle important dans l'Immunité, notamment dans le traitement du cancer du sein [5]. Il a été démontré que la présence d'E. hirae chez les femmes atteintes d'un cancer du sein favorisait la réponse au traitement par chimiothérapie. E hirae est un oncomicrobiotique , elle favorise l'effet thérapeutique anti-cancéreux du cyclophosphamide (CTX). En effet, elle active l'immunité anti-tumorale via l'induction de cellules Th17 et en augmentant le ratio des cellules cytotoxiques sur les cellules T
régulatrices [5].
io Le but de la présente invention est de sélectionner E. hirae à partir de prélèvements biologiques, en particulier de selles de patients, afin de mettre en évidence la présence ou non de cette bactérie dans le microbiote de ces patients et ainsi prédire leur possible réponse au traitement thérapeutique par cyclophosphamide [5].
is La présente invention a consisté tout d'abord à sélectionner spécifiquement les bactéries du genre Enterococcus et plus particulièrement E. faecalis, E
faecium et E
hirae sur un milieu de culture puis différencier E hirae des autres entérocoques par une technique de coloration.
On comprend que le milieu de culture pour Enterococcus selon l'invention est zo constitué d'un milieu de culture de base, connu pour la culture sélective des entérocoques, comprenant notamment différents inhibiteurs des bactéries Gram négatif et de la plupart des bactéries Gram positif, autres que les entérocoques.
Un milieu couramment utilisé pour la mise en évidence des entérocoques est le milieu bile-esculine qui comprend :
10 % de bile de boeuf (les entérocoques tolèrent jusqu'à 40 % de bile contrairement à de nombreux autres germes) ;
- de l'azoture de sodium (un antiseptique élimine toutes les bactéries. Gram négatifs) ;
- de l'esculine et du citrate de fer ammoniacal (un composé qui permet le 30 virage vers le noir du milieu de culture lorsque l'esculine est hydrolysée).
3 Les entérocoques se développent en hydrolysant l'esculine de sorte que les entérocoques poussent en faisant virer le milieu au noir : le noircissement du milieu traduisant l'hydrolyse par le citrate de fer ammoniacal de l'esculine en esculétine qui se lie avec le fer.
Un milieu de culture solide spécifique des entérocoques, dénommé milieu m-Enterococcus agar [3] comprend de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L:
- Extrait pancréatique de gélatine: 10 g (1%) - Extrait de levure : 30 g (3%) - Chlorure de sodium : 15 g (1,5%) - Esculine : 1 g (0,1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) - Agar : 15 g (1,5%) L'azoture de sodium présente une action inhibitrice sur les bactéries Gram négatif et sur tous les streptocoques sauf ceux du groupe D.
Le cycloheximide présente une son action antifongique.
L'acide nalidixique est un antibiotique de la classe des quinolones, utilisé
pour son action sur les bactéries Gram négatif.
Le chlorure de sodium permet d'inhiber les bactéries gram positifs autres qu'Enterocaccus, en particulier le sous-genre Streptococcus D peut être inhibé
par la salinité d'un milieu de culture. Ainsi Les Enterococcus peuvent être cultivées sélectivement sur un milieu hypersalé.
L'extrait pancréatique de gélatine et l'extrait de levure apportent les nutriments nécessaires.
La présente invention fournit un milieu de culture spécifique pour la culture et l'isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques
Un milieu de culture solide spécifique des entérocoques, dénommé milieu m-Enterococcus agar [3] comprend de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L:
- Extrait pancréatique de gélatine: 10 g (1%) - Extrait de levure : 30 g (3%) - Chlorure de sodium : 15 g (1,5%) - Esculine : 1 g (0,1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) - Agar : 15 g (1,5%) L'azoture de sodium présente une action inhibitrice sur les bactéries Gram négatif et sur tous les streptocoques sauf ceux du groupe D.
Le cycloheximide présente une son action antifongique.
L'acide nalidixique est un antibiotique de la classe des quinolones, utilisé
pour son action sur les bactéries Gram négatif.
Le chlorure de sodium permet d'inhiber les bactéries gram positifs autres qu'Enterocaccus, en particulier le sous-genre Streptococcus D peut être inhibé
par la salinité d'un milieu de culture. Ainsi Les Enterococcus peuvent être cultivées sélectivement sur un milieu hypersalé.
L'extrait pancréatique de gélatine et l'extrait de levure apportent les nutriments nécessaires.
La présente invention fournit un milieu de culture spécifique pour la culture et l'isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques
4 dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à
l'acidification Io dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
On évite en particulier la mise en oeuvre d'esculine dans le milieu de base car celle-ci colore en noir tous les entérocoques comme indiqué ci-dessus.
Selon la présente invention on tire parti du fait que E. hirae ne consomme pas de mannitol alors que le mannitol est consommé en provoquant une baisse du pH
ou acidification dudit milieu de culture spécifique, par toutes les principales autres bactéries Enterococcus susceptibles d'être présentes dans des échantillons cliniques de patients humains, notamment de selles, à savoir E. faecalis, E. faecium, E
casseliflavus, E gallinarum et E raffinosus [14].
Plus particulièrement, le dit milieu selon l'invention est sous forme solide zo comprenant un agent gélifiant de préférence à une concentration au moins 1%, de préférence encore de l'agar à la concentration de 1,5%. Le milieu selon l'invention présente ainsi la capacité d'isoler par culture Enterococcus hirae en partant d'une flore microbienne d'échantillon de selles composée d'environ 1010 bactéries /g de selle comprenant en pratique environ 400 espèces différentes. Ce milieu exerce avant tout une action de sélection sur le reste de la flore et cela grâce entre autres à
la présence d'agents inhibiteurs ce qui permet de sélectionner parmi les 400 espèces, 3 espèces seulement Enterococcus hirae, Enterococcus faecalls et Enterococcus faecium lesquelles sont différentiées par la combinaison de leur propriétés de fermentation du mannitol générant un Ph correspondant à celui d'un indicateur coloré le bromocrésol pourpre.
Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium représentent à eux deux 95%
des bactéries entérocoques pouvant être trouvées dans des échantillons cliniques de selles humains. Pour sélectionner ces 3 espèces seulement Enterococcus Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, on met en oeuvre notamment Gram
- comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à
l'acidification Io dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
On évite en particulier la mise en oeuvre d'esculine dans le milieu de base car celle-ci colore en noir tous les entérocoques comme indiqué ci-dessus.
Selon la présente invention on tire parti du fait que E. hirae ne consomme pas de mannitol alors que le mannitol est consommé en provoquant une baisse du pH
ou acidification dudit milieu de culture spécifique, par toutes les principales autres bactéries Enterococcus susceptibles d'être présentes dans des échantillons cliniques de patients humains, notamment de selles, à savoir E. faecalis, E. faecium, E
casseliflavus, E gallinarum et E raffinosus [14].
Plus particulièrement, le dit milieu selon l'invention est sous forme solide zo comprenant un agent gélifiant de préférence à une concentration au moins 1%, de préférence encore de l'agar à la concentration de 1,5%. Le milieu selon l'invention présente ainsi la capacité d'isoler par culture Enterococcus hirae en partant d'une flore microbienne d'échantillon de selles composée d'environ 1010 bactéries /g de selle comprenant en pratique environ 400 espèces différentes. Ce milieu exerce avant tout une action de sélection sur le reste de la flore et cela grâce entre autres à
la présence d'agents inhibiteurs ce qui permet de sélectionner parmi les 400 espèces, 3 espèces seulement Enterococcus hirae, Enterococcus faecalls et Enterococcus faecium lesquelles sont différentiées par la combinaison de leur propriétés de fermentation du mannitol générant un Ph correspondant à celui d'un indicateur coloré le bromocrésol pourpre.
Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium représentent à eux deux 95%
des bactéries entérocoques pouvant être trouvées dans des échantillons cliniques de selles humains. Pour sélectionner ces 3 espèces seulement Enterococcus Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, on met en oeuvre notamment Gram
5 positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, qui n'affecte pas la croissance d'Enterococcus hirae à ces concentrations.
Le pourpre de bromocrésol, a été choisi comme indicateur coloré non pas par rapport au mannitol en tant que tel mais de par sa fourchette de virage de couleur vis-à-vis du pH correspondant en l'espèce à celle résultant la consommation du mannitol par les espèces en cause dans le milieu de l'invention.
De préférence, le milieu selon l'invention comprend un inhibiteur de bactéries Gram positif entérocoques autres qu'Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, la Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8mg/L. Cet antibiotique permet d'éliminer cette bactérie Enterococcus durans laquelle comme Enterococcus hirae ne fermente pas le mannitol et apparait présentant de rares occurrences dans les échantillons de selles.
Plus particulièrement, le pH dudit milieu de culture spécifique selon l'invention est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol.
Cet indicateur coloré vire à un pH de 5,2-6,8, un pH dans cette fourchette de 5,2-6,8 correspondant à l'acidification d'un milieu de culture de PH 7,3 +/-0,2;
ensemencé par au moins une colonie isolée de bactérie Enterococcus autre que Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, le milieu de culture spécifique selon l'invention comprend au moins 10 g/L de mannitol.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10g/L. Cette concentration relativement élevée en mannitol par rapport aux autres nutriments permet de
Le pourpre de bromocrésol, a été choisi comme indicateur coloré non pas par rapport au mannitol en tant que tel mais de par sa fourchette de virage de couleur vis-à-vis du pH correspondant en l'espèce à celle résultant la consommation du mannitol par les espèces en cause dans le milieu de l'invention.
De préférence, le milieu selon l'invention comprend un inhibiteur de bactéries Gram positif entérocoques autres qu'Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, la Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8mg/L. Cet antibiotique permet d'éliminer cette bactérie Enterococcus durans laquelle comme Enterococcus hirae ne fermente pas le mannitol et apparait présentant de rares occurrences dans les échantillons de selles.
Plus particulièrement, le pH dudit milieu de culture spécifique selon l'invention est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol.
Cet indicateur coloré vire à un pH de 5,2-6,8, un pH dans cette fourchette de 5,2-6,8 correspondant à l'acidification d'un milieu de culture de PH 7,3 +/-0,2;
ensemencé par au moins une colonie isolée de bactérie Enterococcus autre que Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, le milieu de culture spécifique selon l'invention comprend au moins 10 g/L de mannitol.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10g/L. Cette concentration relativement élevée en mannitol par rapport aux autres nutriments permet de
6 favoriser la consommation prioritaire dudit sucre par les Enterococrus autres que E.
hirae d'une part offre suffisamment de nutriment pour la croissance de E.
hirae.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50mg/L.
De façon connue, lesdits nutriments sont des sources d'énergie et source de carbone, azote ou phopsphore.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques : des vitamines, des sels minéraux métalliques, notamment de métaux tels que Cu, Zn, Co, Ni, Bi, Ti, et des composés azotés.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de boeuf, et - la protéose-peptone.
La peptone permet d'apporter des acides aminés et des peptides comme source d'énergie et de carbone autre que sucres.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend :
- un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et - la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à
2%.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention
hirae d'une part offre suffisamment de nutriment pour la croissance de E.
hirae.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50mg/L.
De façon connue, lesdits nutriments sont des sources d'énergie et source de carbone, azote ou phopsphore.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques : des vitamines, des sels minéraux métalliques, notamment de métaux tels que Cu, Zn, Co, Ni, Bi, Ti, et des composés azotés.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de boeuf, et - la protéose-peptone.
La peptone permet d'apporter des acides aminés et des peptides comme source d'énergie et de carbone autre que sucres.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend :
- un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et - la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à
2%.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention
7 comprend:
- comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif:
- l'azoture de sodium, et - l'acide nalidixique à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et - la Colistine, et - comme antifongique : la Cycloheximide.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L:
Protéose-peptone 10 g (1%) - Extrait de viande de boeuf : 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique 0,10 g (0,010%) - Colistine 0,025 g (0,0025%) Clindamycine 0,008 g (0,0008 h) - Pourpre de bromocrésol 0,05 g (0,005%) - Agar : 15 g (1,5%) La présente invention fournit également un procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37 C durant un temps suffisant pour faire apparaître une coloration de bactéries Enterococcus autres qu'Entercroccus hirae par ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention permet de sélectionner une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé
- comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif:
- l'azoture de sodium, et - l'acide nalidixique à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et - la Colistine, et - comme antifongique : la Cycloheximide.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L:
Protéose-peptone 10 g (1%) - Extrait de viande de boeuf : 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique 0,10 g (0,010%) - Colistine 0,025 g (0,0025%) Clindamycine 0,008 g (0,0008 h) - Pourpre de bromocrésol 0,05 g (0,005%) - Agar : 15 g (1,5%) La présente invention fournit également un procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37 C durant un temps suffisant pour faire apparaître une coloration de bactéries Enterococcus autres qu'Entercroccus hirae par ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention.
Plus particulièrement encore, ledit milieu de culture spécifique selon l'invention permet de sélectionner une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé
8 comprenant d'autres bactéries choisies parmi E. faecalis, E. faedum, E.
casseliflavus, E. gallinarum et E. raffinosus.
Plus particulièrement encore, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes dans lesquelles:
a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au 1/10 (soit au dilution à 10-3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à
0,50 g/mL dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et b) un échantillon de selle diluée, de préférence de 100 microlitres de selle diluée, est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide, et c) au bout de 72 heures d'incubation, de préférence au moins 5 jours d'incubation, à 37 C, on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hIrae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
L'identification d'Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a été décrite [15].
Selon la présente invention, on a découvert qu'au bout d'au moins 72h, de préférence 5 jours d'incubation sur les géloses, on peut voir apparaitre avec un milieu selon l'invention une coloration pour toutes les souches d'entérocoques sauf pour Enterococcus hirae , y compris un jaunissement des colonies dE.faecium.
Plus particulièrement à l'étape a) on effectue une série de plusieurs dilutions au 1/10 du prélèvement de départ, de préférence au moins 5 (soit une dilution de le ) à partir d'un échantillon de selle, notamment prélevé à l'aide d'une oêse, à
raison de 0,15 g/mL de tampon PBS, et à l'étape b) un échantillon de chacune des dilutions est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention, de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée est ensemencé
sur le dit milieu de culture spécifique solide.
casseliflavus, E. gallinarum et E. raffinosus.
Plus particulièrement encore, le procédé selon l'invention comprend les étapes suivantes dans lesquelles:
a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au 1/10 (soit au dilution à 10-3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à
0,50 g/mL dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et b) un échantillon de selle diluée, de préférence de 100 microlitres de selle diluée, est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide, et c) au bout de 72 heures d'incubation, de préférence au moins 5 jours d'incubation, à 37 C, on détecte une dite bactérie Enterococcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hIrae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
L'identification d'Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF a été décrite [15].
Selon la présente invention, on a découvert qu'au bout d'au moins 72h, de préférence 5 jours d'incubation sur les géloses, on peut voir apparaitre avec un milieu selon l'invention une coloration pour toutes les souches d'entérocoques sauf pour Enterococcus hirae , y compris un jaunissement des colonies dE.faecium.
Plus particulièrement à l'étape a) on effectue une série de plusieurs dilutions au 1/10 du prélèvement de départ, de préférence au moins 5 (soit une dilution de le ) à partir d'un échantillon de selle, notamment prélevé à l'aide d'une oêse, à
raison de 0,15 g/mL de tampon PBS, et à l'étape b) un échantillon de chacune des dilutions est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention, de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée est ensemencé
sur le dit milieu de culture spécifique solide.
9 De préférence, on réalise au préalable (avant l'étape a)) une pré incubation à
37 C, de préférence d'au moins 24 h, du dit échantillons de selles dans un milieu de culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture spécifique solide mais sans agar et de préférence sans colorant.
Plus particulièrement, on réalise une dite pré incubation avec un dit échantillon de 0.10 à 0,50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de préférence 0.15 g/L dans du PBS, dans 10 à 100 mL dudit milieu de culture culture spécifique liquide, de préférence respectivement 40 mL
Cette pré-incubation permet d'augmenter le pouvoir sélectif du milieu Io de culture selon l'invention contre Edurans, Efaecalis et E. faeclum comme rapporté dans l'exemple B ci-après et ainsi de pouvoir observer un plus grand nombre de colonies d'E. hirae le cas échéant dès la lème dilution au 1/10 (soit une dilution de 10-3) de l'échantillon pré-incubé.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à
15 la lumière de la description détaillée de l'invention et des exemples illustratifs ci-après.
Exemple A:
Du fait que les entérocoques sont résistants aux fortes concentrations salines [1], afin d'éliminer une partie des bactéries Gram positif autres qu'entérocoques et 20 les bactéries Gram négatif, résistantes aux inhibiteurs cités précédemment, il a été
testé différentes concentrations de sel (chlorure de sodium) pour trouver la plus adéquate à ajouter à la formulation de la présente invention. Quatre concentrations ont été expérimentées (60 g/L, 65 g/L, 70 g/L et 75 g/L). Les résultats ont montrés que les 3 souches d'entérocoques E hirae, E faecium et E faecalis¨ testées sur 25 ces milieux ont eu une croissance pour chacune des concentrations testées.
Cependant, après lecture des géloses à 24 heures, il a été observé que plus les concentrations en sel étaient augmentées, plus les colonies des bactéries E.
hirae obtenues étaient de petite taille.
Pour permettre une visibilité suffisante des colonies, la concentration en 30 chlorure de sodium retenue pour un milieu sélectif selon la présente invention est d'au moins 20g/L mais pas plus de 60 g/L.
Les entérocoques les plus représentés dans les prélèvements biologiques, en particulier les selles, sont E faecalis et E faecium [2, 6, 7]. Les autres espèces d'entérocoques étant sous-dominantes, aucun inhibiteur des autres entérocoques n'a 5 été ajouté à la formulation de la présente invention. Cependant, certains entérocoques - Enterococcus casseliflavus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus - sont présents en quantité comparable à Enterococcus hirae [8]
dans les selles. La présente invention permet toutefois de les différencier d'Enterococcus hirae, comme démontré ci-après.
Le principal objectif de la présente invention est d'isoler E hirae parmi E
faecium et E faecalis. Ces deux dernières espèces bactériennes étant résistantes à
un grand nombre d'inhibiteurs auxquels E hirae résiste, il n'a pas été
possible de les éliminer des prélèvements. Les inventeurs ont alors cherché à les différencier en fonction de leur profil métabolique. Pour cela, les inventeurs ont recherché
des is sucres consommés soit exclusivement par E hirae, soit exclusivement par E. faecium et E faecalis. Après étude des données de la littérature, trois sucres ont été
retenus : le mélibiose, le raffinose et le mannitol. En effet, le mélibiose est consommépar E. hirae et de façon variable par E faecium. On entend par variable le fait que la consommation de ce sucre par E faecium est souche-dépendante.
Quant au raffinose et au mannitol, ils sont exclusivement consommés par E faecalis et E
faecium et non pas par E hirae (cf tableau 1) [9, 10, 11].
Pour mettre en évidence la consommation du sucre par les bactéries, les inventeurs ont ajouté au milieu de la présente invention un indicateur coloré
dont la couleur va varier en fonction du pH du milieu. En effet, lors de la consommation du sucre par la bactérie, il y a une acidification du milieu, ce qui entraîne un virage de l'indicateur coloré. Pour déterminer l'indicateur coloré le plus approprié, les inventeurs en ont testé plusieurs dont les trois suivants : le rouge phénol, le vert de bromocrésol et le pourpre de bromocrésol. En se basant sur les concentrations dans des milieux contenant déjà un de ces indicateurs colorés, les inventeurs ont choisi, dans un premier temps, de tester une concentration de 25 mg/L [12] pour chacun des indicateurs choisis.
1) Tests des différents indicateurs colorés Le rouge phénol est de couleur rouge ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 6.6 et 8. Le milieu ayant un pH compris entre 7.3 0.2, l'indicateur a commencé a viré vers le jaune dès l'autoclavage, ne permettant pas son utilisation dans un milieu selon la présente invention.
Le vert de bromocrésol a une couleur bleue ; il vire vers le jaune lorsque le pH
est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 3.8 et 5.4.
Cet indicateur coloré nécessite une acidification du milieu trop importante pour pouvoir io visualiser un véritable changement de couleur. Les inventeurs ont ainsi observé un virage davantage vers le vert que vers le jaune. Le contraste entre les colonies de E.
faecalis et E. faeciurn et le milieu de culture n'a donc pas été assez important pour les différencier.
Le pourpre de bromocrésol est de couleur violet ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 5.2 et 6.8.
L'avantage de cet indicateur coloré est qu'il ne nécessite pas un fort abaissement du pH pour laisser apparaitre des colonies jaunes avec un halo jaune dessous. De plus, cette zone de virage est idéale puisque le pH de la présente invention est de 7.3 0.2. Les inventeurs ont donc choisi ce dernier indicateur coloré pour la formulation de la présente invention. Voulant améliorer davantage le contraste, les inventeurs ont augmenté la concentration du pourpre de bromocrésol jusqu'à 50 mg/L.
2) Détermination du sucre Une fois l'indicateur coloré choisi, les inventeurs ont pu déterminer quel sucre était le plus adapté à la présente invention.
Le mélibiose a donné des résultats variables, du fait de la consommation variable de ce sucre par E. faecium. Ce sucre ne peut donc pas être utilisé
pour isoler les E. hirae.
Concernant le raffinose, le test n'a pas été concluant car aucun changement de couleur des colonies de E faecalis et E. faecium n'a pu être observé.
Enfin, le dernier sucre testé a été le mannitol. Pour ce sucre, les inventeurs ont constaté qu'il y avait bien un changement de couleur du milieu et des colonies pour E faecalis et E. faecium, mais pas pour celles d'if hirae qui sont restées incolores. Les inventeurs ont donc choisi le mannitol comme sucre pour la formulation de la dite invention, à une concentration de 10 g/L, concentration fréquemment retrouvée dans les milieux de culture [12].
1Mélibiose Raffinose Mannitol Enterococcus hirae + + -Enterococcus faecalis - - +
Enterococcus faecium V - +
Tableau 1 : Consommation des sucres par les 3 entérocoques étudiés Io De plus, il a été montré dans la littérature que certaines souches d'entérocoques - Enterococcus casselifla vus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus - sont présentes en quantité comparable à E hirae.
Etant donné que les bactéries appartenant au genre Enterococcus sont dans l'ensemble sensibles et résistantes aux mêmes inhibiteurs, les inventeurs ont recherché
la consommation des sucres pour ces différents entérocoques. Il s'est avéré
qu'ils consommaient tous le mannitol (cf tableau 2). Il est donc possible de distinguer E.
hirae parmi ces entérocoques.
Mannitol Enterococcus hirae -Enterococcus casselifla vus +
Enterococcus gallinarum +
Enterococcus raffinosus +
Tableau 2 : Consommation du mannitol par les espèces d'entérocoques présents en quantité comparable à E t'Irae dans les selles.
Ledit milieu de culture comprend également une source de vitamines, de sels essentiels et de composés azotés par la présence d'extrait de viande de boeuf [13] à
la concentration de 1 giL et la protéose-peptone ajoutée à 10 g/L à ladite invention qui permet d'apporter des acides aminés et des peptides (source d'énergie et de carbone). Aucun autre élément nutritif n'a été apporté à la présente invention car l'objectif est que E faecalis et E. faecium se servent en priorité du sucre, le mannitol, comme source de nutrition pour permettre leur croissance. Ces sources ne peuvent Io cependant pas être supprimées puisque E hirae, n'utilisant pas le sucre sélectionné
comme source d'énergie, a besoin de nutriments pour croitre.
Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
Un milieu de culture permettant la sélection des Entercroccus hirae selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L d'eau.
Milieu A :
- Protéose-peptone : 10 g (1%) zo - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azide de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) - Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) - Agar : 15 g (1,5%) Tous les composés de ce milieu sont référencés chez Sigma-Aldrich.
Plus particulièrement, on cultive un échantillon contenant une bactérie Enterococcus hirae à une température de 37 C durant 72 heures dans ledit milieu de culture de sélection d'Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, on réalise les étapes suivantes :
- on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant contenir Enterococcus hirae. Dans un premier temps, on effectue une série de six dilutions au dixième à partir d'une solution mère du prélèvement de départ. Cent microlitres de chacune des dilutions sont ensemencés sur une gélose, correspondant à la présente invention, et - au bout de 72 heures d'incubation à 37 C, on identifie que la bactérie détectée non colorée est une bactérie de l'espèce Enterococcus hirae par io une technique de spectrométrie de masse, de type MALDI-TOF [15]. Un milieu de culture d'Enterococcus hirae selon l'invention permet de sélectionner E. hirae au bout de 72 heures.
Aux exemples 1 à 3 ci-après, on fournit des résultats de l'ensemencement d'une série de six dilutions de divers échantillons contenant trois entérocoques - E.
hirae, E. faecalis et E. faeclum ¨ sur un milieu de culture solide selon la présente invention, au bout de 72 heures d'incubation à 37 C.
Mode opératoire :
Dans les 3 exemples, on réalise une série de six dilutions de 10-1 à 10-6 d'un échantillon de départ comme suit :
- à l'exemple 1, une colonie d'une souche d'Enterococcus hirae, d'une souche d'Enterococcus faecalis et d'une souche d'Enterococcus faecium, ont été mélangées dans un millilitre de PBS (Phosphate Buffered Saline), - à l'exemple 2, une selle est artificiellement enrichie en E. hirae, une colonie d'une souche d'Enterococcus hirae a été mélangée dans un millilitre de PBS avec l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle, à savoir environ 0,15 g, et - à l'exemple 3, l'équivalent d'une ose bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g que l'on sait riche en E. hirae a été
mélangé dans un millilitre de PBS.
Pour réaliser ces dilution, les inventeurs ont préparé six tubes eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS et, à partir du tube mère, contenant les colonies et le cas échéant les échantillons de selles, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900 microlitres de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir six dilutions de 5 104 à 10-6.
Puis, on réalise l'ensemencement de 100 pL sur un milieu de culture solide selon l'exemple A ci-dessus, de la série des six dilutions et on observe le résultat après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 c'C pendant 72 heures.
Pour les 3 exemples, on observe l'apparition de colonies jaunes pour E.
37 C, de préférence d'au moins 24 h, du dit échantillons de selles dans un milieu de culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture spécifique solide mais sans agar et de préférence sans colorant.
Plus particulièrement, on réalise une dite pré incubation avec un dit échantillon de 0.10 à 0,50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de préférence 0.15 g/L dans du PBS, dans 10 à 100 mL dudit milieu de culture culture spécifique liquide, de préférence respectivement 40 mL
Cette pré-incubation permet d'augmenter le pouvoir sélectif du milieu Io de culture selon l'invention contre Edurans, Efaecalis et E. faeclum comme rapporté dans l'exemple B ci-après et ainsi de pouvoir observer un plus grand nombre de colonies d'E. hirae le cas échéant dès la lème dilution au 1/10 (soit une dilution de 10-3) de l'échantillon pré-incubé.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront à
15 la lumière de la description détaillée de l'invention et des exemples illustratifs ci-après.
Exemple A:
Du fait que les entérocoques sont résistants aux fortes concentrations salines [1], afin d'éliminer une partie des bactéries Gram positif autres qu'entérocoques et 20 les bactéries Gram négatif, résistantes aux inhibiteurs cités précédemment, il a été
testé différentes concentrations de sel (chlorure de sodium) pour trouver la plus adéquate à ajouter à la formulation de la présente invention. Quatre concentrations ont été expérimentées (60 g/L, 65 g/L, 70 g/L et 75 g/L). Les résultats ont montrés que les 3 souches d'entérocoques E hirae, E faecium et E faecalis¨ testées sur 25 ces milieux ont eu une croissance pour chacune des concentrations testées.
Cependant, après lecture des géloses à 24 heures, il a été observé que plus les concentrations en sel étaient augmentées, plus les colonies des bactéries E.
hirae obtenues étaient de petite taille.
Pour permettre une visibilité suffisante des colonies, la concentration en 30 chlorure de sodium retenue pour un milieu sélectif selon la présente invention est d'au moins 20g/L mais pas plus de 60 g/L.
Les entérocoques les plus représentés dans les prélèvements biologiques, en particulier les selles, sont E faecalis et E faecium [2, 6, 7]. Les autres espèces d'entérocoques étant sous-dominantes, aucun inhibiteur des autres entérocoques n'a 5 été ajouté à la formulation de la présente invention. Cependant, certains entérocoques - Enterococcus casseliflavus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus - sont présents en quantité comparable à Enterococcus hirae [8]
dans les selles. La présente invention permet toutefois de les différencier d'Enterococcus hirae, comme démontré ci-après.
Le principal objectif de la présente invention est d'isoler E hirae parmi E
faecium et E faecalis. Ces deux dernières espèces bactériennes étant résistantes à
un grand nombre d'inhibiteurs auxquels E hirae résiste, il n'a pas été
possible de les éliminer des prélèvements. Les inventeurs ont alors cherché à les différencier en fonction de leur profil métabolique. Pour cela, les inventeurs ont recherché
des is sucres consommés soit exclusivement par E hirae, soit exclusivement par E. faecium et E faecalis. Après étude des données de la littérature, trois sucres ont été
retenus : le mélibiose, le raffinose et le mannitol. En effet, le mélibiose est consommépar E. hirae et de façon variable par E faecium. On entend par variable le fait que la consommation de ce sucre par E faecium est souche-dépendante.
Quant au raffinose et au mannitol, ils sont exclusivement consommés par E faecalis et E
faecium et non pas par E hirae (cf tableau 1) [9, 10, 11].
Pour mettre en évidence la consommation du sucre par les bactéries, les inventeurs ont ajouté au milieu de la présente invention un indicateur coloré
dont la couleur va varier en fonction du pH du milieu. En effet, lors de la consommation du sucre par la bactérie, il y a une acidification du milieu, ce qui entraîne un virage de l'indicateur coloré. Pour déterminer l'indicateur coloré le plus approprié, les inventeurs en ont testé plusieurs dont les trois suivants : le rouge phénol, le vert de bromocrésol et le pourpre de bromocrésol. En se basant sur les concentrations dans des milieux contenant déjà un de ces indicateurs colorés, les inventeurs ont choisi, dans un premier temps, de tester une concentration de 25 mg/L [12] pour chacun des indicateurs choisis.
1) Tests des différents indicateurs colorés Le rouge phénol est de couleur rouge ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 6.6 et 8. Le milieu ayant un pH compris entre 7.3 0.2, l'indicateur a commencé a viré vers le jaune dès l'autoclavage, ne permettant pas son utilisation dans un milieu selon la présente invention.
Le vert de bromocrésol a une couleur bleue ; il vire vers le jaune lorsque le pH
est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 3.8 et 5.4.
Cet indicateur coloré nécessite une acidification du milieu trop importante pour pouvoir io visualiser un véritable changement de couleur. Les inventeurs ont ainsi observé un virage davantage vers le vert que vers le jaune. Le contraste entre les colonies de E.
faecalis et E. faeciurn et le milieu de culture n'a donc pas été assez important pour les différencier.
Le pourpre de bromocrésol est de couleur violet ; il vire vers le jaune lorsque le pH est dans la zone de virage de l'indicateur, qui est comprise entre 5.2 et 6.8.
L'avantage de cet indicateur coloré est qu'il ne nécessite pas un fort abaissement du pH pour laisser apparaitre des colonies jaunes avec un halo jaune dessous. De plus, cette zone de virage est idéale puisque le pH de la présente invention est de 7.3 0.2. Les inventeurs ont donc choisi ce dernier indicateur coloré pour la formulation de la présente invention. Voulant améliorer davantage le contraste, les inventeurs ont augmenté la concentration du pourpre de bromocrésol jusqu'à 50 mg/L.
2) Détermination du sucre Une fois l'indicateur coloré choisi, les inventeurs ont pu déterminer quel sucre était le plus adapté à la présente invention.
Le mélibiose a donné des résultats variables, du fait de la consommation variable de ce sucre par E. faecium. Ce sucre ne peut donc pas être utilisé
pour isoler les E. hirae.
Concernant le raffinose, le test n'a pas été concluant car aucun changement de couleur des colonies de E faecalis et E. faecium n'a pu être observé.
Enfin, le dernier sucre testé a été le mannitol. Pour ce sucre, les inventeurs ont constaté qu'il y avait bien un changement de couleur du milieu et des colonies pour E faecalis et E. faecium, mais pas pour celles d'if hirae qui sont restées incolores. Les inventeurs ont donc choisi le mannitol comme sucre pour la formulation de la dite invention, à une concentration de 10 g/L, concentration fréquemment retrouvée dans les milieux de culture [12].
1Mélibiose Raffinose Mannitol Enterococcus hirae + + -Enterococcus faecalis - - +
Enterococcus faecium V - +
Tableau 1 : Consommation des sucres par les 3 entérocoques étudiés Io De plus, il a été montré dans la littérature que certaines souches d'entérocoques - Enterococcus casselifla vus, enterococcus gallinarum et Enterococcus raffinosus - sont présentes en quantité comparable à E hirae.
Etant donné que les bactéries appartenant au genre Enterococcus sont dans l'ensemble sensibles et résistantes aux mêmes inhibiteurs, les inventeurs ont recherché
la consommation des sucres pour ces différents entérocoques. Il s'est avéré
qu'ils consommaient tous le mannitol (cf tableau 2). Il est donc possible de distinguer E.
hirae parmi ces entérocoques.
Mannitol Enterococcus hirae -Enterococcus casselifla vus +
Enterococcus gallinarum +
Enterococcus raffinosus +
Tableau 2 : Consommation du mannitol par les espèces d'entérocoques présents en quantité comparable à E t'Irae dans les selles.
Ledit milieu de culture comprend également une source de vitamines, de sels essentiels et de composés azotés par la présence d'extrait de viande de boeuf [13] à
la concentration de 1 giL et la protéose-peptone ajoutée à 10 g/L à ladite invention qui permet d'apporter des acides aminés et des peptides (source d'énergie et de carbone). Aucun autre élément nutritif n'a été apporté à la présente invention car l'objectif est que E faecalis et E. faecium se servent en priorité du sucre, le mannitol, comme source de nutrition pour permettre leur croissance. Ces sources ne peuvent Io cependant pas être supprimées puisque E hirae, n'utilisant pas le sucre sélectionné
comme source d'énergie, a besoin de nutriments pour croitre.
Ledit milieu de culture est un milieu de culture solide contenant un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0.5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
Un milieu de culture permettant la sélection des Entercroccus hirae selon l'invention comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L d'eau.
Milieu A :
- Protéose-peptone : 10 g (1%) zo - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azide de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,25 g (0,025%) - Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) - Agar : 15 g (1,5%) Tous les composés de ce milieu sont référencés chez Sigma-Aldrich.
Plus particulièrement, on cultive un échantillon contenant une bactérie Enterococcus hirae à une température de 37 C durant 72 heures dans ledit milieu de culture de sélection d'Enterococcus hirae.
Plus particulièrement encore, on réalise les étapes suivantes :
- on effectue la culture d'un échantillon de prélèvement biologique pouvant contenir Enterococcus hirae. Dans un premier temps, on effectue une série de six dilutions au dixième à partir d'une solution mère du prélèvement de départ. Cent microlitres de chacune des dilutions sont ensemencés sur une gélose, correspondant à la présente invention, et - au bout de 72 heures d'incubation à 37 C, on identifie que la bactérie détectée non colorée est une bactérie de l'espèce Enterococcus hirae par io une technique de spectrométrie de masse, de type MALDI-TOF [15]. Un milieu de culture d'Enterococcus hirae selon l'invention permet de sélectionner E. hirae au bout de 72 heures.
Aux exemples 1 à 3 ci-après, on fournit des résultats de l'ensemencement d'une série de six dilutions de divers échantillons contenant trois entérocoques - E.
hirae, E. faecalis et E. faeclum ¨ sur un milieu de culture solide selon la présente invention, au bout de 72 heures d'incubation à 37 C.
Mode opératoire :
Dans les 3 exemples, on réalise une série de six dilutions de 10-1 à 10-6 d'un échantillon de départ comme suit :
- à l'exemple 1, une colonie d'une souche d'Enterococcus hirae, d'une souche d'Enterococcus faecalis et d'une souche d'Enterococcus faecium, ont été mélangées dans un millilitre de PBS (Phosphate Buffered Saline), - à l'exemple 2, une selle est artificiellement enrichie en E. hirae, une colonie d'une souche d'Enterococcus hirae a été mélangée dans un millilitre de PBS avec l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle, à savoir environ 0,15 g, et - à l'exemple 3, l'équivalent d'une ose bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g que l'on sait riche en E. hirae a été
mélangé dans un millilitre de PBS.
Pour réaliser ces dilution, les inventeurs ont préparé six tubes eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS et, à partir du tube mère, contenant les colonies et le cas échéant les échantillons de selles, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900 microlitres de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir six dilutions de 5 104 à 10-6.
Puis, on réalise l'ensemencement de 100 pL sur un milieu de culture solide selon l'exemple A ci-dessus, de la série des six dilutions et on observe le résultat après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 c'C pendant 72 heures.
Pour les 3 exemples, on observe l'apparition de colonies jaunes pour E.
10 faecium et E faecalis et de colonies transparentes pour E. hirae.
Les colonies isolées sont les plus visibles sur les dilutions 10-5 et 10-6. Les autres dilutions sont trop concentrées en bactéries pour que l'on puisse observer des colonies isolées et ainsi bien distinguer Enterococcus hirae des autres entérocoques pour l'analyse de la richesse en Enterococcus hirae de la selle testée.
Exemple B: En testant un plus grand nombre d'échantillons, à savoir plus de 100 selles cliniques, provenant du laboratoire diagnostic de bactériologie, il est apparu que le milieu de l'exemple A ci-dessus, sélectionnait dans de rares occurrences (4 échantillons sur 100 testés) la bactérie Enterococcus durans conjointement avec Enterococcus hirae, toutes deux ne fermentant pas le mannitol et apparaissant transparente en dépit de l'indicateur coloré BCP contrairement aux deux seules autres espèce présentes E faecium et E. faecalis.
Pour pallier cela, et être davantage encore sélectif vis-à-vis dEnterococcus hirae, on a trouvé un antibiotique qui inhibe la croissance d'E.durans à
savoir la clindamycine, un antibiotique de la famille des lincosamides. Cet antibiotique possède une action principalement bactériostatique à l'encontre des bactéries aérobies Gram positif y compris Enterococcus durans mais excepté les 3 espèces E. faeclum, E.
faecalis et E. hirae et à l'encontre d'un large spectre de bactéries anaérobies. Cet antibiotique a été rajouté dans le milieu à la concentration de 8 mg/L.
Par ailleurs, on a diminué la concentration de l'acide nalidixique de 250 mg/L
à pas plus de 100 mg/L du fait de sa mauvaise dilution dans l'eau au-dessus de 100mg/L et a été ajouté la colistine à une concentration 25 mg/L pour compenser, qui est un antibiotique polypeptidique de la famille des polymyxines qui a une action sur les bactéries Gram négatif.
Grâce à ce milieu B, on a pu sélectionner spécifiquement les souches suivantes : Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium.
Pour cela, on a mis en oeuvre un milieu sélectif B comprenant des inhibiteurs bactériens, tel que le NaCI à 60 g/L, le cycloheximide à 0,05 g/L, le sodium azide à
0,15 g/L, l'acide nalidixique à 0,1 g/L, la colistine à 0,025 g/L et la clindamycine à
0,008 g/L.
io La formule du milieu B est donc :
Protéose-peptone : 10 g (1%) Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) Chlorure de sodium : 60 g (6%) Mannitol 10 g (1%) Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%) Colistine 0,025 g (0,0025%) Clindamycine 0,008 g (0,0008 %) Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) Agar : 15 g (1,5%) Pour tester l'efficacité de ce milieu, les inventeurs ont ensemencé 100 selles prises au hasard, provenant du laboratoire de diagnostic (bactériologie) de l'IHU
Méditerranée infection. Pour cela, l'équivalent d'une oêse bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lmL de PBS. Les inventeurs ont décidé d'ensemencer la dilution 10-3 sur leur milieu, de façon à
observer un grand nombre de colonies sur le milieu, en cas de croissance bactérienne. Pour réaliser des dilutions, les inventeurs ont préparé trois tubes eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS, et à
partir du tube mère, contenant les échantillons de selles dans 1 mL, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900 microlitres de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir trois dilutions de 10-1à 10-3.
Puis, on a réalisé l'ensemencement de 50 pL sur un milieu de culture solide selon l'exemple ¨B ci-dessus, de la dilution 10-3 et on observe les résultats après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 C pendant 72 heures, et de préférence jusqu'à cinq jours.
Io Sur les 100 selles ensemencées, seulement 40 ont montré une croissance bactérienne. Après identification des colonies au spectromètre de type MALDI
TOF
SP, les inventeurs ont observé que les seuls bactéries obtenues étaient Enterococcus hirae (2), E faecium (16), E faecalis (22) et E durans (4).
Pour éliminer E. durans, les inventeurs ont testé un antibiotique, la clindamycine. Ce choix a été basé sur une série d'antibiogrammes que les inventeurs avaient réalisés précédemment. Afin de déterminer la meilleure concentration de clindamycine à ajouter au milieu de culture, les inventeurs ont testé trois concentrations de cet antibiotique, à savoir 2 mg/L, 4 mg/L et 8 mg/L. Les inventeurs ont ensemencé des souches d'Enterococcus hirae, E faecium, E
faecalis et E durans. Une croissance pour chacune de ces espèces a été observée pour les deux premières concentrations de clindamycine, 2 mg/L et 4 mg/L. En revanche, une absence de croissance pour E. durans a été mise en évidence à la concentration de 8 mg/L de clindamycine. Enterococcus hirae, E. faecium, E faecalis ont une croissance à cette concentration de clindamycine.
Afin de confirmer ces résultats, les inventeurs ont retesté les 4 selles où E
durans avait été mise en évidence. Pour chacune de ces selles, aucune colonie de E
durans n'a été identifiée par spectrométrie de masse MALDI TOF SP. Pour augmenter le pouvoir sélectif du milieu de culture contre E.durans dans les prélèvements testés, les inventeurs ont réalisé une pré-incubation des prélèvements durant 24h, dans des bouteilles d'hémoculture anaérobie vidées et dans lesquelles ils ont ajouté le milieu de culture hirae, sous sa forme liquide, cité ci-dessous, à raison de 40 mL
par bouteille. Pour cela, l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle clinique, contenant Edurans, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lrriL de PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture. Les inventeurs ont incubé
la bouteille à 37 C durant 24h.
s Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3ème dilution (10-3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5 jours, aucune croissance de E.durans n'a pu être observée.
Milieu de culture hirae liquide :
- Protéose-peptone : 10 g (1%) - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%) - Colistine 0,025 g (0,0025%) - Clindamycine 0,008 g (0,0008 h) L'agar a été enlevé, de façon à obtenir un milieu liquide, et l'indicateur coloré, le pourpre de bromocrésol, a également été éliminé de cette formule du milieu liquide car il n'avait pas d'utilité lors de la pré-incubation.
Par ailleurs, pour favoriser la croissance d'E.Nrae sur le milieu de culture hirae, notamment lorsque E.faecium et Efaecalis sont également présents dans l'échantillon de selle testé, une pré-incubation de ces prélèvements est également réalisée pendant 24h. Pour cela, l'équivalent d'une oêse bleue (10 microlitres) de selle clinique, contenant E.hirae, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lmL de PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture contenant 40 mL
du milieu hirae liquide. Les inventeurs ont incubé la bouteille à 37 C durant 24h. Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3ème dilution (10-3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5 jours, une croissance plus importante de Ehirae a pu être observée. Sans pré-incubation, les inventeurs pouvaient observer moins de 10 colonies de Ehirae et après pré-incubation, cette croissance était de l'ordre de 200-300 colonies à une même dilution.
REFERENCES
1. Aguilar-Galvez A, Dubois-Dauphin R, Destain 3, Campos D, Thonart P.
5 Les entérocoques : avantages et inconvénients en biotechnologie (synthèse bibliographique). Biotechnologie. Agronomie. Société.
Environnement. 2012 16(1), 67-76 2. Bourafa N, Loucif L, Boutefnouchet N and Rolain Enterococcus hirae, an unusual pathogen in humans causing urinary tract infection in a patient 10 with benign prostatic hyperplasia: first case report in Algeria.
New Microbe and New Infect. 2015; 8: 7-9 3. Rodier 3, Legube B, Merlet N, Brunet R. L'analyse de l'eau - 10e éd.:
Eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer. In : Dunod, editor. 2016 p 611 4. Maheux A, Bouchard S, Bérubé E and Bergeron M. Rapid molecular 15 identification of fecal origin-colonies growing on Enterococcus spp.-specific culture methods. Journal of water and health. 2017; doi:
10.2166/wh.2016.199 5. Daillère R et al. Enterococcus hirae and Barnesiella intestinihominis Facilitate Cyclophosphamide-Induced Therapeutic Immunoniodulatory 20 Effects. Immunity. 2016 ; 45 931-943 6. Savini V, Bonfini T, Marrollo R, Argentieri AV, Riccioni S, Astolfi D, Fazii P, D'Antonio D, Gherardi G. Enterococcus hirae: a zoonotic microorganism in human umbilical cord blood. World Journal of Microbiology and Biotechnology. April 2014; 30(4):1423-6 7. Zhanel G, Hoban D and Karlowsky J. Nitrofurantoin 15 Active against Vancomycin-Resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 3anuary 2001; 45(1): 321-326.
8. Pinto B, Pierotti R, Canale G, Reali D. Characterization of Taecal streptococcil as indicators of faecal pollution and distribution in the environment. Letters in Applied Microbiology. October 1999; 29(4):258-63 9. Berger S. GIDEON Guide to Medically Important Bacteria: 2017 edition. In :
GIDEON Informatics Inc, editor. 2017 p 761-782 10. Devriese L, Van De Kerckhove A, Kilpper-Bâlz R, Schleifer K.
Characterization and Identification of Enterococcus Species Isolated from the Intestines of Animais. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. July 1987; 37: 257-259
Les colonies isolées sont les plus visibles sur les dilutions 10-5 et 10-6. Les autres dilutions sont trop concentrées en bactéries pour que l'on puisse observer des colonies isolées et ainsi bien distinguer Enterococcus hirae des autres entérocoques pour l'analyse de la richesse en Enterococcus hirae de la selle testée.
Exemple B: En testant un plus grand nombre d'échantillons, à savoir plus de 100 selles cliniques, provenant du laboratoire diagnostic de bactériologie, il est apparu que le milieu de l'exemple A ci-dessus, sélectionnait dans de rares occurrences (4 échantillons sur 100 testés) la bactérie Enterococcus durans conjointement avec Enterococcus hirae, toutes deux ne fermentant pas le mannitol et apparaissant transparente en dépit de l'indicateur coloré BCP contrairement aux deux seules autres espèce présentes E faecium et E. faecalis.
Pour pallier cela, et être davantage encore sélectif vis-à-vis dEnterococcus hirae, on a trouvé un antibiotique qui inhibe la croissance d'E.durans à
savoir la clindamycine, un antibiotique de la famille des lincosamides. Cet antibiotique possède une action principalement bactériostatique à l'encontre des bactéries aérobies Gram positif y compris Enterococcus durans mais excepté les 3 espèces E. faeclum, E.
faecalis et E. hirae et à l'encontre d'un large spectre de bactéries anaérobies. Cet antibiotique a été rajouté dans le milieu à la concentration de 8 mg/L.
Par ailleurs, on a diminué la concentration de l'acide nalidixique de 250 mg/L
à pas plus de 100 mg/L du fait de sa mauvaise dilution dans l'eau au-dessus de 100mg/L et a été ajouté la colistine à une concentration 25 mg/L pour compenser, qui est un antibiotique polypeptidique de la famille des polymyxines qui a une action sur les bactéries Gram négatif.
Grâce à ce milieu B, on a pu sélectionner spécifiquement les souches suivantes : Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium.
Pour cela, on a mis en oeuvre un milieu sélectif B comprenant des inhibiteurs bactériens, tel que le NaCI à 60 g/L, le cycloheximide à 0,05 g/L, le sodium azide à
0,15 g/L, l'acide nalidixique à 0,1 g/L, la colistine à 0,025 g/L et la clindamycine à
0,008 g/L.
io La formule du milieu B est donc :
Protéose-peptone : 10 g (1%) Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) Chlorure de sodium : 60 g (6%) Mannitol 10 g (1%) Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%) Colistine 0,025 g (0,0025%) Clindamycine 0,008 g (0,0008 %) Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) Agar : 15 g (1,5%) Pour tester l'efficacité de ce milieu, les inventeurs ont ensemencé 100 selles prises au hasard, provenant du laboratoire de diagnostic (bactériologie) de l'IHU
Méditerranée infection. Pour cela, l'équivalent d'une oêse bleue (10 microlitres) de selle clinique, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lmL de PBS. Les inventeurs ont décidé d'ensemencer la dilution 10-3 sur leur milieu, de façon à
observer un grand nombre de colonies sur le milieu, en cas de croissance bactérienne. Pour réaliser des dilutions, les inventeurs ont préparé trois tubes eppendorf (Sigma-Aldrich), qui ont été remplis avec 900 microlitres de PBS, et à
partir du tube mère, contenant les échantillons de selles dans 1 mL, 100 microlitres ont été prélevés et mélangés au 2ème tube contenant les 900 microlitres de PBS, et des dilutions en cascade ont été réalisées jusqu'à obtenir trois dilutions de 10-1à 10-3.
Puis, on a réalisé l'ensemencement de 50 pL sur un milieu de culture solide selon l'exemple ¨B ci-dessus, de la dilution 10-3 et on observe les résultats après que les géloses aient été incubées dans une étuve à 37 C pendant 72 heures, et de préférence jusqu'à cinq jours.
Io Sur les 100 selles ensemencées, seulement 40 ont montré une croissance bactérienne. Après identification des colonies au spectromètre de type MALDI
TOF
SP, les inventeurs ont observé que les seuls bactéries obtenues étaient Enterococcus hirae (2), E faecium (16), E faecalis (22) et E durans (4).
Pour éliminer E. durans, les inventeurs ont testé un antibiotique, la clindamycine. Ce choix a été basé sur une série d'antibiogrammes que les inventeurs avaient réalisés précédemment. Afin de déterminer la meilleure concentration de clindamycine à ajouter au milieu de culture, les inventeurs ont testé trois concentrations de cet antibiotique, à savoir 2 mg/L, 4 mg/L et 8 mg/L. Les inventeurs ont ensemencé des souches d'Enterococcus hirae, E faecium, E
faecalis et E durans. Une croissance pour chacune de ces espèces a été observée pour les deux premières concentrations de clindamycine, 2 mg/L et 4 mg/L. En revanche, une absence de croissance pour E. durans a été mise en évidence à la concentration de 8 mg/L de clindamycine. Enterococcus hirae, E. faecium, E faecalis ont une croissance à cette concentration de clindamycine.
Afin de confirmer ces résultats, les inventeurs ont retesté les 4 selles où E
durans avait été mise en évidence. Pour chacune de ces selles, aucune colonie de E
durans n'a été identifiée par spectrométrie de masse MALDI TOF SP. Pour augmenter le pouvoir sélectif du milieu de culture contre E.durans dans les prélèvements testés, les inventeurs ont réalisé une pré-incubation des prélèvements durant 24h, dans des bouteilles d'hémoculture anaérobie vidées et dans lesquelles ils ont ajouté le milieu de culture hirae, sous sa forme liquide, cité ci-dessous, à raison de 40 mL
par bouteille. Pour cela, l'équivalent d'une oése bleue (10 microlitres) de selle clinique, contenant Edurans, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lrriL de PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture. Les inventeurs ont incubé
la bouteille à 37 C durant 24h.
s Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3ème dilution (10-3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5 jours, aucune croissance de E.durans n'a pu être observée.
Milieu de culture hirae liquide :
- Protéose-peptone : 10 g (1%) - Extrait de viande de boeuf: 1 g (0,1%) - Chlorure de sodium : 60 g (6%) - Mannitol 10 g (1%) - Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) - Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) - Acide nalidixique : 0,10 g (0,010%) - Colistine 0,025 g (0,0025%) - Clindamycine 0,008 g (0,0008 h) L'agar a été enlevé, de façon à obtenir un milieu liquide, et l'indicateur coloré, le pourpre de bromocrésol, a également été éliminé de cette formule du milieu liquide car il n'avait pas d'utilité lors de la pré-incubation.
Par ailleurs, pour favoriser la croissance d'E.Nrae sur le milieu de culture hirae, notamment lorsque E.faecium et Efaecalis sont également présents dans l'échantillon de selle testé, une pré-incubation de ces prélèvements est également réalisée pendant 24h. Pour cela, l'équivalent d'une oêse bleue (10 microlitres) de selle clinique, contenant E.hirae, à savoir environ 0,15 g a été mélangé dans lmL de PBS, et le tout a été injecté dans la bouteille d'hémoculture contenant 40 mL
du milieu hirae liquide. Les inventeurs ont incubé la bouteille à 37 C durant 24h. Ils ont ensuite réalisé des dilutions, comme décrit ci-dessus et ensemencé la 3ème dilution (10-3) sur le milieu hirae solide. Après 72h d'incubation, de préférence 5 jours, une croissance plus importante de Ehirae a pu être observée. Sans pré-incubation, les inventeurs pouvaient observer moins de 10 colonies de Ehirae et après pré-incubation, cette croissance était de l'ordre de 200-300 colonies à une même dilution.
REFERENCES
1. Aguilar-Galvez A, Dubois-Dauphin R, Destain 3, Campos D, Thonart P.
5 Les entérocoques : avantages et inconvénients en biotechnologie (synthèse bibliographique). Biotechnologie. Agronomie. Société.
Environnement. 2012 16(1), 67-76 2. Bourafa N, Loucif L, Boutefnouchet N and Rolain Enterococcus hirae, an unusual pathogen in humans causing urinary tract infection in a patient 10 with benign prostatic hyperplasia: first case report in Algeria.
New Microbe and New Infect. 2015; 8: 7-9 3. Rodier 3, Legube B, Merlet N, Brunet R. L'analyse de l'eau - 10e éd.:
Eaux naturelles, eaux résiduaires, eau de mer. In : Dunod, editor. 2016 p 611 4. Maheux A, Bouchard S, Bérubé E and Bergeron M. Rapid molecular 15 identification of fecal origin-colonies growing on Enterococcus spp.-specific culture methods. Journal of water and health. 2017; doi:
10.2166/wh.2016.199 5. Daillère R et al. Enterococcus hirae and Barnesiella intestinihominis Facilitate Cyclophosphamide-Induced Therapeutic Immunoniodulatory 20 Effects. Immunity. 2016 ; 45 931-943 6. Savini V, Bonfini T, Marrollo R, Argentieri AV, Riccioni S, Astolfi D, Fazii P, D'Antonio D, Gherardi G. Enterococcus hirae: a zoonotic microorganism in human umbilical cord blood. World Journal of Microbiology and Biotechnology. April 2014; 30(4):1423-6 7. Zhanel G, Hoban D and Karlowsky J. Nitrofurantoin 15 Active against Vancomycin-Resistant Enterococci. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 3anuary 2001; 45(1): 321-326.
8. Pinto B, Pierotti R, Canale G, Reali D. Characterization of Taecal streptococcil as indicators of faecal pollution and distribution in the environment. Letters in Applied Microbiology. October 1999; 29(4):258-63 9. Berger S. GIDEON Guide to Medically Important Bacteria: 2017 edition. In :
GIDEON Informatics Inc, editor. 2017 p 761-782 10. Devriese L, Van De Kerckhove A, Kilpper-Bâlz R, Schleifer K.
Characterization and Identification of Enterococcus Species Isolated from the Intestines of Animais. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. July 1987; 37: 257-259
11. Schleifer K, Kilpper-Bâlz R. Transfer of Streptococcus faecalis and Streptococcus faecium to the Genus Enterococcus nom. rev. as Enterococcus faecalis comb. nov. and Enterococcus faecium comb. nov.
io International Journal of Systematic and Evoiutionary Microbiology.
January 1984; 34: 31-34
io International Journal of Systematic and Evoiutionary Microbiology.
January 1984; 34: 31-34
12. Les milieux de culture en microbiologie [Internet]. Disponible sur :
http: //www2.ac-Iyon fi/enseigne/1Di otechimicrobi oimi lieux. html
http: //www2.ac-Iyon fi/enseigne/1Di otechimicrobi oimi lieux. html
13. Extrait de viande de boeuf [Internet]. Disponible sur:
http://www.mastqrp.com/IFUS/IFU606 FR.pdf
http://www.mastqrp.com/IFUS/IFU606 FR.pdf
14. Leclercq R. Faut-il identifier les entérocoques, et comment ? La Lettre de l'Infectiologue - Tome XVI - n 7 - septembre 2001
15. Seng P, Abat C, Rolain JM, Colson P, Lagier 3-C, Gouriet F, Pierre Edouard Fournier, Michel Drancourt, Bernard La Scola and Didier Raoult.
zo Identification of rare pathogenic bacteria in a clinical microbiology laboratory: Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization¨Time of Flight Mass Spectrometry. 3 Clin Microbiol. 2013; 51(7):2182 94.
zo Identification of rare pathogenic bacteria in a clinical microbiology laboratory: Impact of Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization¨Time of Flight Mass Spectrometry. 3 Clin Microbiol. 2013; 51(7):2182 94.
Claims
REVENDICATIONS
1. Milieu de culture spécifique pour la culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH
inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à
l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
2. Milieu de culture spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un inhibiteur de bactéries Gram positif entérocoques autres qu'Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus facium, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, la Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8 mg/L de clindamycine.
3. Milieu de culture spécifique selon la revendication 2 caractérisé en ce que le pH dudit milieu de culture spécifique est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol.
4. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé
en ce qu'il comprend au moins 10 g/L de mannitol.
5. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé
en ce qu'il comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10 g/L.
6. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé
en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L.
7. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé
en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50 mg/L.8. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques :
des vitamines, des sels minéraux métalliques et des composés azotés.
9. Milieu de culture spécifique selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de boeuf, et - la protéose-peptone.
10. Milieu de culture spécifique selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comprend :
- un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et - la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L.
11. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
12. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif:
- l'azoture de sodium, et - l'acide nalidixique à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et - la Colistine, et - comme antifongique : la Cycloheximide.
13. Milieu de de culture spécifique selon la revendication 1 à 12 caracterisé
en, ce qu'il est sous forme solide comprenant un agent gélifiant de préférence à
une concentration au moins 1%, de préférence encore de l'agar à la concentration de 1,5%.
14. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L:
-Protéose-peptone : 10 g (1%) -Extrait de viande de boeuf : 1 g (0,1%) -Chlorure de sodium : 60 g (6%) -Clindamycine : 0.008 g (0.0008%) -Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) -Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) -Acide nalidixique : 0,10 g (0,025%) -Colistine : 0.025 g (0.0025%) -Mannitol 10 g (1%) -Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) -Agar : 15 g (1,5%) 15. Procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37°C
durant un temps suffisant pour faire apparaitre une coloration de bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae par ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Procédé de culture selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'on sélectionne une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé
comprenant d'autres bactéries choisies parmi E faecalis, E faecium, Edurans, E.
casseliflavus, E.
gallinarum et E. raffinosus.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16 caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes :
a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au 1/10 (soit au dilution à 10-3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à
0,50 g/mL. dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et b) un échantillon de de selle diluée est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention, de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée, et c) au bout de 72 heures, de préférence au moins 5 jours d'incubation, à
37°C, on détecte une dite bactérie Enteroarcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
18. Procédé de culture selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisé en ce qu'on réalise au préalable une pré incubation à 37°C, de préférence d'au moins 24 h, du dit échantillons de selles dans un milieu de culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture spécifique solide mais sans agar et de préférence sans colorant.
19. Procédé de culture selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'on réalise au préalable une dite pré incubation avec un dit échantillon de 0.10 à
0.50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de préférence du PBS, dans 10 à
100 ml. dudit milieu de culture culture spécifique liquide.
1. Milieu de culture spécifique pour la culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae constitué de nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques dépourvu d'esculine, comprenant des inhibiteurs de bactéries Gram négatif et de bactéries Gram positif autres que les entérocoques et de préférence au moins un composé antifongique caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteur de bactéries Gram positif autres que les entérocoques du chlorure de sodium à une concentration d'au moins 20g/L et pas plus de 60 g/L, et - comme seul sucre du mannitol, et - comme seul colorant, un indicateur coloré qui change de couleur à un pH
inférieur au pH dudit milieu de culture spécifique correspondant à
l'acidification dudit milieu de culture spécifique résultant de la consommation du mannitol.
2. Milieu de culture spécifique selon la revendication 1 caractérisé en ce qu'il comprend un inhibiteur de bactéries Gram positif entérocoques autres qu'Enterococcus hirae, Enterococcus faecalis et Enterococcus facium, notamment inhibiteur de Enterococcus durans, la Clindamycine, de préférence à la concentration d'au moins 8 mg/L de clindamycine.
3. Milieu de culture spécifique selon la revendication 2 caractérisé en ce que le pH dudit milieu de culture spécifique est de 7,3 +/- 0,2 et l'indicateur coloré est le pourpre de bromocrésol.
4. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 3 caractérisé
en ce qu'il comprend au moins 10 g/L de mannitol.
5. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 4 caractérisé
en ce qu'il comprend des nutriments autres que le mannitol dans une concentration de pas plus de 20g/L, de préférence d'au moins au moins 10 g/L.
6. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 5 caractérisé
en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 25 mg/L.
7. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 6 caractérisé
en ce qu'il comprend comme indicateur coloré du pourpre de bromocrésol à une concentration d'au moins 50 mg/L.8. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce qu'il comprend comme nutriments autres que des sucres d'un milieu de culture de base pour la culture des entérocoques :
des vitamines, des sels minéraux métalliques et des composés azotés.
9. Milieu de culture spécifique selon la revendication 8 caractérisé en ce qu'il comprend comme source de vitamines, sels essentiels et composés azotés :
- un extrait de viande de boeuf, et - la protéose-peptone.
10. Milieu de culture spécifique selon la revendication 9 caractérisé en ce qu'il comprend :
- un extrait de viande de boeuf à la concentration de 1 g/L, et - la protéose-peptone à la concentration de 10 g/L.
11. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 10 caractérisé en ce qu'il comprend un produit gélifiant choisi de préférence parmi les géloses et agar, de préférence dans une proportion pondérale de 0,5 à 5%, de préférence encore de 1 à 2%.
12. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend :
- comme inhibiteurs de bactéries Gram négatif:
- l'azoture de sodium, et - l'acide nalidixique à une concentration de pas plus de 100 mg/L, et - la Colistine, et - comme antifongique : la Cycloheximide.
13. Milieu de de culture spécifique selon la revendication 1 à 12 caracterisé
en, ce qu'il est sous forme solide comprenant un agent gélifiant de préférence à
une concentration au moins 1%, de préférence encore de l'agar à la concentration de 1,5%.
14. Milieu de culture spécifique selon l'une des revendications 1 à 13 caractérisé en ce qu'il comprend les composants suivants, de préférence dans les quantités et proportions pondérales suivantes pour 1L:
-Protéose-peptone : 10 g (1%) -Extrait de viande de boeuf : 1 g (0,1%) -Chlorure de sodium : 60 g (6%) -Clindamycine : 0.008 g (0.0008%) -Azoture de sodium : 0,15 g (0,015%) -Cycloheximide : 0,05 g (0,005%) -Acide nalidixique : 0,10 g (0,025%) -Colistine : 0.025 g (0.0025%) -Mannitol 10 g (1%) -Pourpre de bromocrésol : 0,05 g (0,005%) -Agar : 15 g (1,5%) 15. Procédé de culture et isolement sélectif d'une bactérie Enterococcus hirae caractérisé en ce qu'on cultive un échantillon de prélèvement biologique contenant ou susceptible de contenir une bactérie Enterococcus hirae et/ou des bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae, à une température de 37°C
durant un temps suffisant pour faire apparaitre une coloration de bactéries Enterococcus autres que Enterococcus hirae par ledit colorant dans un dit milieu de culture spécifique solide selon l'une des revendications 1 à 14.
16. Procédé de culture selon la revendication 15 caractérisé en ce qu'on sélectionne une bactérie Enterococcus hirae dans un échantillon testé
comprenant d'autres bactéries choisies parmi E faecalis, E faecium, Edurans, E.
casseliflavus, E.
gallinarum et E. raffinosus.
17. Procédé selon l'une des revendications 15 ou 16 caractérisé en ce qu'on réalise les étapes suivantes :
a) on effectue une dilution de préférence au moins 3 dilutions successives au 1/10 (soit au dilution à 10-3 ), à partir d'un échantillon de selle à raison de 0,10 à
0,50 g/mL. dans une solution tampon, de préférence de tampon PBS, et b) un échantillon de de selle diluée est ensemencé sur le dit milieu de culture spécifique solide selon l'invention, de préférence un échantillon de 100 microlitres de selle diluée, et c) au bout de 72 heures, de préférence au moins 5 jours d'incubation, à
37°C, on détecte une dite bactérie Enteroarcus hirae si on identifie une colonie de bactérie non décolorée par rapport audit colorant de pourpre de bromocrésol, et d) de préférence, on confirme que la dite colonie de bactérie non décolorée est de l'espèce Enterococcus hirae par une technique d'identification par spectrométrie de masse de type MALDI-TOF.
18. Procédé de culture selon l'une des revendications 15 à 17 caractérisé en ce qu'on réalise au préalable une pré incubation à 37°C, de préférence d'au moins 24 h, du dit échantillons de selles dans un milieu de culture spécifique liquide de même composition que le dit milieu de culture spécifique solide mais sans agar et de préférence sans colorant.
19. Procédé de culture selon la revendication 18 caractérisé en ce qu'on réalise au préalable une dite pré incubation avec un dit échantillon de 0.10 à
0.50 g/mL de selle dans une solution solution tampon, de préférence du PBS, dans 10 à
100 ml. dudit milieu de culture culture spécifique liquide.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR1755310 | 2017-06-13 | ||
| FR1755310A FR3067360B1 (fr) | 2017-06-13 | 2017-06-13 | Milieu et procede de culture et isolement selectif de la bacterie enterococcus hirae |
| PCT/FR2018/051245 WO2018229380A1 (fr) | 2017-06-13 | 2018-05-30 | Milieu et procédé de culture et isolement sélectif de la bactérie enterococcus hirae |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CA3063275A1 true CA3063275A1 (fr) | 2018-12-20 |
Family
ID=59746096
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CA3063275A Pending CA3063275A1 (fr) | 2017-06-13 | 2018-05-30 | Milieu et procede de culture et isolement selectif de la bacterie enterococcus hirae |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20210139943A1 (fr) |
| EP (1) | EP3638771A1 (fr) |
| CA (1) | CA3063275A1 (fr) |
| FR (1) | FR3067360B1 (fr) |
| WO (1) | WO2018229380A1 (fr) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5817510A (en) * | 1995-02-24 | 1998-10-06 | Xechem International, Inc. | Device and method for evaluating microorganisms |
-
2017
- 2017-06-13 FR FR1755310A patent/FR3067360B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2018
- 2018-05-30 CA CA3063275A patent/CA3063275A1/fr active Pending
- 2018-05-30 WO PCT/FR2018/051245 patent/WO2018229380A1/fr unknown
- 2018-05-30 US US16/621,366 patent/US20210139943A1/en not_active Abandoned
- 2018-05-30 EP EP18731157.6A patent/EP3638771A1/fr not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20210139943A1 (en) | 2021-05-13 |
| EP3638771A1 (fr) | 2020-04-22 |
| FR3067360A1 (fr) | 2018-12-14 |
| WO2018229380A1 (fr) | 2018-12-20 |
| FR3067360B1 (fr) | 2021-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Bachtiar et al. | AI-2 of Aggregatibacter actinomycetemcomitans inhibits Candida albicans biofilm formation | |
| EP1546366B9 (fr) | Procede de detection et de comptage de microorganismes dans un echantillon | |
| EP1390524A2 (fr) | Milieux de detection specifique de staphylococcus aureus | |
| EP2925346A1 (fr) | Utilisation de microorganismes pour diminuer le taux de triméthylamine dans une cavité du corps humain, notamment pour le traitement de la triméthylaminurie ou d'une vaginose bactérienne et la prévention des maladies cardiovasculaires | |
| WO2015162377A1 (fr) | Utilisation d'acide urique pour la culture de bactéries sensibles à la tension en oxygène | |
| WO2009092982A2 (fr) | Procédé de détection et/ou d'identification de clostridium difficile | |
| Bouvenot et al. | Interplay between Yersinia pestis and its flea vector in lipoate metabolism | |
| FR2924127A1 (fr) | Milieu reactionnel pour la detection et/ou l'identification de staphyloccocus aureus | |
| CA3063275A1 (fr) | Milieu et procede de culture et isolement selectif de la bacterie enterococcus hirae | |
| EP2611903B1 (fr) | Utilisation d'un activateur de beta-glucosidase pour la détection et/ou l'identification de c.difficile | |
| Ngangbam et al. | Indole-producing bacteria from the biosynthetic organs of a muricid mollusc could contribute to Tyrian purple production | |
| EP2459736B1 (fr) | Nouveaux substrats enzymatiques de nitroreductase | |
| KR101765197B1 (ko) | 락토바실러스 속 미생물의 오토인듀서-2 신호활성 분석용 최적배지 조성물 및 이를 이용한 분석방법 | |
| EP1397504A2 (fr) | Milieu de culture pour la detection et/ou la discrimination des enterocoques | |
| EP2670858B1 (fr) | Milieu de culture de microorganismes comprenant l'acide para-aminobenzoique comme agent selectif | |
| Rosario et al. | Production of signaling molecules by the marine bacterium Pseudoalteromonas galatheae and implications for antagonistic interactions with the bloom forming coccolithophore Emiliania huxleyi | |
| FR2889705A1 (fr) | Milieu de culture bacterienne dans un milieu inorganique minimum et comportant du gentisate et/ou un de ses precurseurs, et utilisation du 3-hydroxybenzoate dans un tel milieu | |
| EP2459738B1 (fr) | Nouveaux substrats enzymatiques de nitroreductase | |
| EP3294868B1 (fr) | Enrichissement et culture selective de salmonella et de shigella | |
| Wang | Factors stimulating germination of Plasmodiophora brassicae resting spores | |
| FR3038839A1 (fr) | Eau de vichy pour moduler la croissance bacterienne | |
| Jones | Chemical Mycology of Sexual Fungi | |
| FR2983214A1 (fr) | Milieu et procede de detection de bacteries yersinia enterocolitica pathogenes |