CA2848976A1 - Augmentation de la recombinaison meiotique chez les plantes par inhibition de la proteine fancm - Google Patents
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Abstract
L' invention est relative à une méthode pour augmenter la fréquence de recombinaison méiotique chez les plantes, par l' inactivation de la protéine FANCM, notamment par mutagénèse ou extinction du gène FANCM codant pour ladite protéine. La présente invention est utilisable notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes et de la cartographie génétique.
Description
AUGMENTATION DE LA RECOMBINAISON MEIOTIQUE CHEZ LES PLANTES
PAR INHIBITION DE LA PROTEINE FANCM
La présente invention est relative à une méthode pour augmenter la recombinaison méiotique chez les plantes.
La recombinaison méiotique est un échange d'ADN
entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle intervient pendant la prophase de la première division méiotique. Un des produits de la recombinaison est le crossing-over, qui entraine un échange réciproque de continuité entre deux chromatides homologues. Cette prophase (prophase I) comprend 5 stades successifs : leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, et diacinèse. Au leptotène les chromosomes s'individualisent, chaque chromosome étant formé
de deux chromatides s urs issues de la duplication intervenue préalablement à la prophase. Durant le zygotène, les chromosomes homologues s'apparient, formant une structure appelée bivalent qui contient quatre chromatides, deux chromatides s urs maternelles et deux chromatides s urs paternelles, homologues des chromatides maternelles. Au pachytène les chromosomes sont totalement appariés, et des nodules de recombinaison se forment entre les chromatides homologues étroitement reliées entre elles par le complexe synaptonémal (SC) ; au diplotène, le SC se dissocie progressivement, et les chromosomes homologues commencent à se séparer, mais restent joints au niveau des chiasmas, qui correspondent aux sites de crossing-overs (C05). Les chromosomes se condensent au cours de la diacinèse ; les chiasmas subsistent jusqu'a la métaphase I pendant laquelle ils maintiennent l'appariement 'des bivalents de part et d'autre de la plaque équatoriale.
La recombinaison méiotique est déclenchée par la formation de cassures double-brin (CDB) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, et résulte de la réparation de ces cassures utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue.
La recombinaison méiotique a pour conséquence de provoquer un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la
PAR INHIBITION DE LA PROTEINE FANCM
La présente invention est relative à une méthode pour augmenter la recombinaison méiotique chez les plantes.
La recombinaison méiotique est un échange d'ADN
entre chromosomes homologues au cours de la méiose ; elle intervient pendant la prophase de la première division méiotique. Un des produits de la recombinaison est le crossing-over, qui entraine un échange réciproque de continuité entre deux chromatides homologues. Cette prophase (prophase I) comprend 5 stades successifs : leptotène, zygotène, pachytène, diplotène, et diacinèse. Au leptotène les chromosomes s'individualisent, chaque chromosome étant formé
de deux chromatides s urs issues de la duplication intervenue préalablement à la prophase. Durant le zygotène, les chromosomes homologues s'apparient, formant une structure appelée bivalent qui contient quatre chromatides, deux chromatides s urs maternelles et deux chromatides s urs paternelles, homologues des chromatides maternelles. Au pachytène les chromosomes sont totalement appariés, et des nodules de recombinaison se forment entre les chromatides homologues étroitement reliées entre elles par le complexe synaptonémal (SC) ; au diplotène, le SC se dissocie progressivement, et les chromosomes homologues commencent à se séparer, mais restent joints au niveau des chiasmas, qui correspondent aux sites de crossing-overs (C05). Les chromosomes se condensent au cours de la diacinèse ; les chiasmas subsistent jusqu'a la métaphase I pendant laquelle ils maintiennent l'appariement 'des bivalents de part et d'autre de la plaque équatoriale.
La recombinaison méiotique est déclenchée par la formation de cassures double-brin (CDB) dans l'une ou l'autre des chromatides homologues, et résulte de la réparation de ces cassures utilisant comme matrice une chromatide du chromosome homologue.
La recombinaison méiotique a pour conséquence de provoquer un réassortiment des allèles d'origine paternelle et maternelle dans le génome, ce qui contribue à générer de la
2 diversité génétique. Elle présente donc un intérêt particulier dans les programmes d'amélioration des plantes (WIJNKER & de JONG, Trends in Plant Science, 13, 640-646, 2008). Notamment, une amélioration du taux de recombinaison peut permettre d'augmenter le brassage génétique, et donc les probabilités d'obtenir de nouvelles combinaisons de caractéristiques ; elle peut permettre aussi de faciliter l'introgression de gènes d'intérêt, ainsi que la cartographie génétique et le clonage positionnel de gènes d'intérêt.
Diverses méthodes pour contrôler la recombinaison méiotique ont été proposées, basées sur la sur-expression ou l'extinction de l'un ou l'autre des très nombreux gènes identifiés comme étant impliqués ou potentiellement impliqués dans ce mécanisme. Par exemple, la Demande POT W0/0208432 propose la surexpression de la protéine RAD51, qui est impliquée dans la recombinaison homologue, pour stimuler la recombinaison méiotique ; la Demande US 2004023388 propose de surexprimer un activateur de la recombinaison méiotique choisi parmi : SP011, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1, DM01, RAD51, RPA, MSH4, MSHS, MLH1, RAD52, RAD54, TID1, RAD5S, RADS7, RADS9, une résolvase, une protéine liant l'ADN simple brin, une protéine impliquée dans le remodelage de la chromatine, ou une protéine du complexe synaptonémal, pour augmenter la fréquence de recombinaison entre chromatides homologues ; la Demande POT
WO 2004016795 propose d'augmenter la recombinaison entre chromosomes homologues en exprimant une protéine SP011 fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN ; la Demande POT
WO 03104451 propose d'augmenter le potentiel de recombinaison entre des chromosomes homologues par la surexpression d'une protéine (MutS) impliquée dans la réparation des mésappariements.
Cependant, dans la plupart des cas, l'effet de ces gènes candidats sur la formation de COs méiotiques in planta n'a pas été confirmé, et il est donc nécessaire d'identifier d'autres gènes intervenant dans ce phénomène.
L'un des facteurs connus pour agir sur le taux de recombinaison méiotique est le phénomène d'interférence: la formation d'un CO à un endroit du chromosome inhibe la
Diverses méthodes pour contrôler la recombinaison méiotique ont été proposées, basées sur la sur-expression ou l'extinction de l'un ou l'autre des très nombreux gènes identifiés comme étant impliqués ou potentiellement impliqués dans ce mécanisme. Par exemple, la Demande POT W0/0208432 propose la surexpression de la protéine RAD51, qui est impliquée dans la recombinaison homologue, pour stimuler la recombinaison méiotique ; la Demande US 2004023388 propose de surexprimer un activateur de la recombinaison méiotique choisi parmi : SP011, MRE11, RAD50, XRS2/NBS1, DM01, RAD51, RPA, MSH4, MSHS, MLH1, RAD52, RAD54, TID1, RAD5S, RADS7, RADS9, une résolvase, une protéine liant l'ADN simple brin, une protéine impliquée dans le remodelage de la chromatine, ou une protéine du complexe synaptonémal, pour augmenter la fréquence de recombinaison entre chromatides homologues ; la Demande POT
WO 2004016795 propose d'augmenter la recombinaison entre chromosomes homologues en exprimant une protéine SP011 fusionnée à un domaine de liaison à l'ADN ; la Demande POT
WO 03104451 propose d'augmenter le potentiel de recombinaison entre des chromosomes homologues par la surexpression d'une protéine (MutS) impliquée dans la réparation des mésappariements.
Cependant, dans la plupart des cas, l'effet de ces gènes candidats sur la formation de COs méiotiques in planta n'a pas été confirmé, et il est donc nécessaire d'identifier d'autres gènes intervenant dans ce phénomène.
L'un des facteurs connus pour agir sur le taux de recombinaison méiotique est le phénomène d'interférence: la formation d'un CO à un endroit du chromosome inhibe la
3 formation d'autres COs à proximité. Toutefois, il a été
récemment montré qu'il existait en fait 2 voies distinctes de formation des COs méiotiques (HOLLINGSWORTH & BRILL, Genes Dey., 18,117-125, 2004 ; BERCHOWITZ & COPENHAVER, Current genomics, 11, 91-102, 2010). La première génère des COs interférents dénommés COs de type I (COI), et fait intervenir un ensemble de gènes collectivement désignés sous les appellations de gènes ZMM (ZIPI, ZIP2, ZIP3, ZIP4, MER3, MSH4, MSH5) ainsi que les protéines MI,H1 et MLH3 ; la seconde voie génère des COs non-interférents, dénommés COs de type II
(COII), et dépend du gène MISSI.
L'utilisation de l'une et/ou l'autre de ces deux voies est variable d'un organisme à l'autre. Chez les végétaux supérieurs, représentés par la plante modèle Arabidopsis thaliana, les 2 voies coexistent, celle des COs de type I
étant prédominante ; il a été observé que l'inactivation des gènes AtMSH4, AtMSH5, atMER3, SHOC1, ou AtZIP4 (homologues respectifs chez Arabidopsis thaliana des gènes MSH4, MSH5, MER3, ZIP2 et ZIP4) induisait jusqu'à 85% de réduction de la fréquence des COs (HIGGINS et al., 2004, précité ; MERCIER et al., 2005, précité ; CHELYSHEVA et al., PLoS Genet. 3, e83, 2007 ; HIGGINS et al., Plant J., 55, 28-39, 2008 ; MACAISNE et al., Current Biology, 18, 1432-1437, 2008), cette diminution s'accompagnant d'une forte réduction de la fertilité.
Les Inventeurs ont maintenant découvert que l'inactivation du gène Fanconi Anemia Complementation Group M (FANCM) d'Arabidopsis thaliana (AtFNCM) compensait les effets de l'inactivation d'AtMSH5, de SHOC1, ou d'AtZIP4, et permettait d'augmenter le nombre de COs méiotiques et de restaurer la fertilité chez les mutants zmm Atzip4-/-, Atmsh5-/- and Atshocl-/-. Ils ont en outre découvert que les effets de l'inactivation du gène FANCM sur l'augmentation du nombre de COs méiotiques se produisaient non seulement chez les mutants zmm, mais également chez les plantes de type sauvage possédant des gènes ZMM fonctionnels.
La protéine FANCM a initialement été identifiée chez l'homme dans le cadre de la recherche de mutations associées à l'anémie de Fanconi, qui est une maladie génétique
récemment montré qu'il existait en fait 2 voies distinctes de formation des COs méiotiques (HOLLINGSWORTH & BRILL, Genes Dey., 18,117-125, 2004 ; BERCHOWITZ & COPENHAVER, Current genomics, 11, 91-102, 2010). La première génère des COs interférents dénommés COs de type I (COI), et fait intervenir un ensemble de gènes collectivement désignés sous les appellations de gènes ZMM (ZIPI, ZIP2, ZIP3, ZIP4, MER3, MSH4, MSH5) ainsi que les protéines MI,H1 et MLH3 ; la seconde voie génère des COs non-interférents, dénommés COs de type II
(COII), et dépend du gène MISSI.
L'utilisation de l'une et/ou l'autre de ces deux voies est variable d'un organisme à l'autre. Chez les végétaux supérieurs, représentés par la plante modèle Arabidopsis thaliana, les 2 voies coexistent, celle des COs de type I
étant prédominante ; il a été observé que l'inactivation des gènes AtMSH4, AtMSH5, atMER3, SHOC1, ou AtZIP4 (homologues respectifs chez Arabidopsis thaliana des gènes MSH4, MSH5, MER3, ZIP2 et ZIP4) induisait jusqu'à 85% de réduction de la fréquence des COs (HIGGINS et al., 2004, précité ; MERCIER et al., 2005, précité ; CHELYSHEVA et al., PLoS Genet. 3, e83, 2007 ; HIGGINS et al., Plant J., 55, 28-39, 2008 ; MACAISNE et al., Current Biology, 18, 1432-1437, 2008), cette diminution s'accompagnant d'une forte réduction de la fertilité.
Les Inventeurs ont maintenant découvert que l'inactivation du gène Fanconi Anemia Complementation Group M (FANCM) d'Arabidopsis thaliana (AtFNCM) compensait les effets de l'inactivation d'AtMSH5, de SHOC1, ou d'AtZIP4, et permettait d'augmenter le nombre de COs méiotiques et de restaurer la fertilité chez les mutants zmm Atzip4-/-, Atmsh5-/- and Atshocl-/-. Ils ont en outre découvert que les effets de l'inactivation du gène FANCM sur l'augmentation du nombre de COs méiotiques se produisaient non seulement chez les mutants zmm, mais également chez les plantes de type sauvage possédant des gènes ZMM fonctionnels.
La protéine FANCM a initialement été identifiée chez l'homme dans le cadre de la recherche de mutations associées à l'anémie de Fanconi, qui est une maladie génétique
4 se caractérisant par une instabilité génomique et une prédisposition au cancer. Cette protéine participe à la réparation de lésions de l'ADN ; la protéine FANCM humaine contient deux domaines hélicase dans sa moitié N-terminale :
un domaine DEXDc (cd00046, et un domaine HELICc (cd00079) ainsi qu'un domaine endonucléase ERCC1/XPF dans sa moitié C-terminale, ce dernier domaine n'étant toutefois probablement pas fonctionnel car il est dégénéré pour plusieurs résidus essentiels à l'activité endonucléase (MEETEI et al, Nat Genet., 37, 958-963, 2005).
La protéine FANCM apparaît conservée, et divers homologues de cette protéine ont été identifiés chez les eucaryotes, sur la base des homologies de séquences. Les protéines FANCM de vertébrés possèdent, comme la FANCM
humaine, les domaines hélicase et le domaine endonucléase ; la FANCM de drosophile, ainsi que l'homologue de FANCM chez la levure Saccharomyces cerevisiae (dénommé MPH1 pour Miltator Phenotype 1 ), sont plus courts, et possèdent uniquement les domaines hélicase. Les FANCM de plantes, représentées par la protéine d'Arabidopsis thaliana, sont également dépourvues du domaine endonucléase. AtFANCM est codée par le gène AT1G35530 ; deux isoformes prédites de cette protéine sont décrites dans les bases de données de séquences : l'une (GenBank : NP 001185141 ; UniProtKB : F4HYE4) représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, a une taille de 1390 acides aminés ; l'autre (GenBank :
NP 174785 ; UniProtKB : F4HYE5), a une taille de 1324 acides aminés. Ces deux isoformes diffèrent entre elles par la présence de deux insertions dans la séquence NP 001185141/F4HYE4 : l'une de 45 acides aminés entre les positions 575 et 576 de la séquence NP 174785/F4HYE5, et l'autre de 21 acides aminés entre les positions 1045 et 1046 de la séquence NP_174785/F4HYE5.
Quelle que soit l'isoforme concernée, AtFANCM
possède dans sa moitié N terminale, les deux domaines hélicase DEXDc (acides aminés 129-272 de SEQ ID NO: 1) et HELICc (acides aminés 445-570 de SEQ ID NO: 1) ; ces deux domaines sont respectivement décrits sous les références cd00046 et cd00079 dans la base de données CDD (MARCHLER-BAUER et al., Nucleic Acids Res.39(D)225-9, 2011).
Une recherche dans les bases de données de séquence a permis d'identifier des orthologues d'AtFANCM chez un large
un domaine DEXDc (cd00046, et un domaine HELICc (cd00079) ainsi qu'un domaine endonucléase ERCC1/XPF dans sa moitié C-terminale, ce dernier domaine n'étant toutefois probablement pas fonctionnel car il est dégénéré pour plusieurs résidus essentiels à l'activité endonucléase (MEETEI et al, Nat Genet., 37, 958-963, 2005).
La protéine FANCM apparaît conservée, et divers homologues de cette protéine ont été identifiés chez les eucaryotes, sur la base des homologies de séquences. Les protéines FANCM de vertébrés possèdent, comme la FANCM
humaine, les domaines hélicase et le domaine endonucléase ; la FANCM de drosophile, ainsi que l'homologue de FANCM chez la levure Saccharomyces cerevisiae (dénommé MPH1 pour Miltator Phenotype 1 ), sont plus courts, et possèdent uniquement les domaines hélicase. Les FANCM de plantes, représentées par la protéine d'Arabidopsis thaliana, sont également dépourvues du domaine endonucléase. AtFANCM est codée par le gène AT1G35530 ; deux isoformes prédites de cette protéine sont décrites dans les bases de données de séquences : l'une (GenBank : NP 001185141 ; UniProtKB : F4HYE4) représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1, a une taille de 1390 acides aminés ; l'autre (GenBank :
NP 174785 ; UniProtKB : F4HYE5), a une taille de 1324 acides aminés. Ces deux isoformes diffèrent entre elles par la présence de deux insertions dans la séquence NP 001185141/F4HYE4 : l'une de 45 acides aminés entre les positions 575 et 576 de la séquence NP 174785/F4HYE5, et l'autre de 21 acides aminés entre les positions 1045 et 1046 de la séquence NP_174785/F4HYE5.
Quelle que soit l'isoforme concernée, AtFANCM
possède dans sa moitié N terminale, les deux domaines hélicase DEXDc (acides aminés 129-272 de SEQ ID NO: 1) et HELICc (acides aminés 445-570 de SEQ ID NO: 1) ; ces deux domaines sont respectivement décrits sous les références cd00046 et cd00079 dans la base de données CDD (MARCHLER-BAUER et al., Nucleic Acids Res.39(D)225-9, 2011).
Une recherche dans les bases de données de séquence a permis d'identifier des orthologues d'AtFANCM chez un large
5 panel d'eucaryotes, et il peut être supposé que cette protéine est conservée dans l'ensemble des plantes supérieures.
A titres d'exemples non-limitatifs d'orthologues d'AtFANCM, on citera notamment :
- la protéine de Vitis vinifera dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès, CBI18266 ;
- la protéine de Physcomitrella patens dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès Pp1s9_477V6 ;
- la protéine de Ricinus communis dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès XP 002526811 ;
- la protéine d'Oryza sativa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AAX96303 ;
- la protéine de Populus tri chocarpa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès POPTR_0013s11390.
La présente invention a pour objet une méthode pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inhibition dans ladite plante, d'une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine ayant au moins 30%, et par ordre de préférence croissante, au moins 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 1, et contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un domaine hélicase HELICc (cd00079).
Selon un mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase DEXDc de ladite protéine FANCM a au moins 65%, et par ordre de préférence
A titres d'exemples non-limitatifs d'orthologues d'AtFANCM, on citera notamment :
- la protéine de Vitis vinifera dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès, CBI18266 ;
- la protéine de Physcomitrella patens dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès Pp1s9_477V6 ;
- la protéine de Ricinus communis dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès XP 002526811 ;
- la protéine d'Oryza sativa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d'accès AAX96303 ;
- la protéine de Populus tri chocarpa dont la séquence polypeptidique est disponible dans la base de données Phytozome sous le numéro d'accès POPTR_0013s11390.
La présente invention a pour objet une méthode pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisée en ce qu'elle comprend l'inhibition dans ladite plante, d'une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine ayant au moins 30%, et par ordre de préférence croissante, au moins 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité de séquence, ou au moins 45%, et par ordre de préférence croissante, au moins 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 1, et contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un domaine hélicase HELICc (cd00079).
Selon un mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase DEXDc de ladite protéine FANCM a au moins 65%, et par ordre de préférence
6 croissante, au moins 70,75, 80, 85, 90, 95 ou 98% d'identité
de séquence, ou au moins 75%, et par ordre de préférence croissante, au moins 80,85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc de la protéine AtFANCM (acides aminés 129-272 de la SEQ ID NO: 1).
Selon un autre mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase HELICc de ladite protéine FANCM a au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98%
d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine HELICc de la protéine AtFANCM (acides aminés 445-570 de la SEQ ID NO: 1).
Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées ici sont calculées en utilisant le programme BLASTP
ou le programme Needle avec les paramètres par défaut. Les calculs de similarité sont effectués en utilisant la matrice BLOSUM62.
L'inhibition de la protéine FANCM peut être obtenue en supprimant ou en diminuant son activité ou en supprimant ou diminuant l'expression du gène correspondant.
L'inhibition peut notamment être obtenue par mutagenèse du gène FANCM. Par exemple, une mutation dans la séquence codante peut induire, selon la nature de la mutation, l'expression d'une protéine inactive, ou d'une protéine à
activité réduite; une mutation au niveau d'un site d'épissage peut également altérer ou abolir la fonction de la protéine ;
une mutation dans la séquence promotrice peut induire l'absence d'expression de ladite protéine, ou la diminution de son expression.
La mutagenèse peut être effectuée par exemple par la suppression de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANCM, ou par insertion d'une séquence exogène, par exemple un transposon ou un ADN-T, au sein de ladite séquence codante ou dudit promoteur. Elle peut également être effectuée en induisant des mutations ponctuelles, par exemple par mutagénèse ENS, ou par radiations.
de séquence, ou au moins 75%, et par ordre de préférence croissante, au moins 80,85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc de la protéine AtFANCM (acides aminés 129-272 de la SEQ ID NO: 1).
Selon un autre mode de mise en uvre préféré de la présente invention, le domaine hélicase HELICc de ladite protéine FANCM a au moins 60%, et par ordre de préférence croissante, au moins 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 98%
d'identité de séquence, ou au moins 70%, et par ordre de préférence croissante, au moins 75, 80, 85, 90, 95 ou 98% de similarité de séquence avec le domaine HELICc de la protéine AtFANCM (acides aminés 445-570 de la SEQ ID NO: 1).
Les valeurs d'identité et de similarité de séquence indiquées ici sont calculées en utilisant le programme BLASTP
ou le programme Needle avec les paramètres par défaut. Les calculs de similarité sont effectués en utilisant la matrice BLOSUM62.
L'inhibition de la protéine FANCM peut être obtenue en supprimant ou en diminuant son activité ou en supprimant ou diminuant l'expression du gène correspondant.
L'inhibition peut notamment être obtenue par mutagenèse du gène FANCM. Par exemple, une mutation dans la séquence codante peut induire, selon la nature de la mutation, l'expression d'une protéine inactive, ou d'une protéine à
activité réduite; une mutation au niveau d'un site d'épissage peut également altérer ou abolir la fonction de la protéine ;
une mutation dans la séquence promotrice peut induire l'absence d'expression de ladite protéine, ou la diminution de son expression.
La mutagenèse peut être effectuée par exemple par la suppression de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANCM, ou par insertion d'une séquence exogène, par exemple un transposon ou un ADN-T, au sein de ladite séquence codante ou dudit promoteur. Elle peut également être effectuée en induisant des mutations ponctuelles, par exemple par mutagénèse ENS, ou par radiations.
7 Les allèles mutés peuvent être détectés par exemple par PCR, en utilisant des amorces spécifiques du gène FANON.
Différentes méthodes de mutagénèse et de criblage à
haut débit sont décrites dans l'art antérieur. A titre d'exemples, on peut citer des méthodes de type TILLING
(Targeting Induced Local Lesions In Genome), décrit par McCALLUM et al., Plant Physiol., 123, 439-442, 2000).
L'absence de fonctionnalité de FANON chez les mutants peut être vérifiée sur la base des caractéristiques phénotypiques de leur descendance ; les plantes homozygotes pour une mutation inactivant le gène FANON ont un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne portant pas la mutation dans le gène FANON) dont elles sont issues.
Généralement ce taux de COs méiotiques est au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 3 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues.
Les plantes mutantes contenant une mutation dans le gène FANCM qui induit l'inhibition de la protéine FANON font également partie de l'objet de la présente invention, à
l'exception des plantes de l'espèce Arabidopsis thaliana chez lesquelles ladite mutation est une insertion d'ADN-T dans ledit gène. Cette mutation peut être par exemple une délétion de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANON, ou bien une mutation ponctuelle de cette séquence codante ou de ce promoteur.
Avantageusement, l'inhibition de la protéine FANON
est obtenue par extinction (silencing) du gène FANON.
Différentes techniques d'extinction de gènes dans les plantes sont connues en elles-mêmes (pour revue voir par exemple :
WATSON & GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (Hiatt, A, ed) New York : Marcel Dekker, 255-281, 1992 ; CHICAS & MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001). On peut citer l'inhibition antisens ou co-suppression, décrites par exemple dans les Brevets US 5190065 et US 5283323. Il est également possible d'utiliser des ribozymes ciblant l'ARNm de la protéine FANON.
De préférence, l'extinction du gène FANON est induite par interférence ARN ciblant ledit gène.
Différentes méthodes de mutagénèse et de criblage à
haut débit sont décrites dans l'art antérieur. A titre d'exemples, on peut citer des méthodes de type TILLING
(Targeting Induced Local Lesions In Genome), décrit par McCALLUM et al., Plant Physiol., 123, 439-442, 2000).
L'absence de fonctionnalité de FANON chez les mutants peut être vérifiée sur la base des caractéristiques phénotypiques de leur descendance ; les plantes homozygotes pour une mutation inactivant le gène FANON ont un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne portant pas la mutation dans le gène FANON) dont elles sont issues.
Généralement ce taux de COs méiotiques est au moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 3 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues.
Les plantes mutantes contenant une mutation dans le gène FANCM qui induit l'inhibition de la protéine FANON font également partie de l'objet de la présente invention, à
l'exception des plantes de l'espèce Arabidopsis thaliana chez lesquelles ladite mutation est une insertion d'ADN-T dans ledit gène. Cette mutation peut être par exemple une délétion de tout ou partie de la séquence codante ou du promoteur de FANON, ou bien une mutation ponctuelle de cette séquence codante ou de ce promoteur.
Avantageusement, l'inhibition de la protéine FANON
est obtenue par extinction (silencing) du gène FANON.
Différentes techniques d'extinction de gènes dans les plantes sont connues en elles-mêmes (pour revue voir par exemple :
WATSON & GRIERSON, Transgenic Plants : Fundamentals and Applications (Hiatt, A, ed) New York : Marcel Dekker, 255-281, 1992 ; CHICAS & MACINO, EMBO reports, 21, 992-996, 2001). On peut citer l'inhibition antisens ou co-suppression, décrites par exemple dans les Brevets US 5190065 et US 5283323. Il est également possible d'utiliser des ribozymes ciblant l'ARNm de la protéine FANON.
De préférence, l'extinction du gène FANON est induite par interférence ARN ciblant ledit gène.
8 Un ARN interférent (ARNi) est un petit ARN qui peut éteindre un gène cible de manière séquence spécifique. Les ARN
interférents comprennent en particulier les petits ARN
interférents (siRNA) et les micro-ARN (miRNA).
Initialement, les constructions d'ADN pour exprimer des ARN interférents dans les plantes contenaient un fragment de 300 pb ou plus (généralement de 300 à 800 pb) de l'ADNc du gène ciblé, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Actuellement, les constructions les plus largement utilisées sont celles qui peuvent produire un transcrit d'ARN
en épingle à cheveux (hpRNA). Dans ces constructions, le fragment du gène cible est inversement répété, avec généralement une région d'espacement entre les répétitions (pour revue, cf. WATSON et al., FEBS Letters, 579, 5982-5987, 2005). On peut également utiliser des micro-ARN artificiels (amiRNAs) dirigés contre le gène FANCM (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et al., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics.,
interférents comprennent en particulier les petits ARN
interférents (siRNA) et les micro-ARN (miRNA).
Initialement, les constructions d'ADN pour exprimer des ARN interférents dans les plantes contenaient un fragment de 300 pb ou plus (généralement de 300 à 800 pb) de l'ADNc du gène ciblé, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié. Actuellement, les constructions les plus largement utilisées sont celles qui peuvent produire un transcrit d'ARN
en épingle à cheveux (hpRNA). Dans ces constructions, le fragment du gène cible est inversement répété, avec généralement une région d'espacement entre les répétitions (pour revue, cf. WATSON et al., FEBS Letters, 579, 5982-5987, 2005). On peut également utiliser des micro-ARN artificiels (amiRNAs) dirigés contre le gène FANCM (OSSOWSKI et al., The Plant Journal, 53, 674-690, 2008 ; SCHWAB et al., Methods Mol Biol., 592, 71-88, 2010 ; WEI et al., Funct Integr Genomics.,
9, 499-511, 2009).
La présente invention a pour objet des constructions d'ADN recombinant, et notamment des cassettes d'expression, produisant un ARNi permettant d'éteindre le gène FANCM.
Une cassette d'expression conforme à l'invention comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARNi, notamment un hpRNA ou un amiRNA, ciblant le gène FANCM, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale.
Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes hétérologues dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans l'art.
Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à
partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à
savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques.
Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur Actine-Intron-actine du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221).
Dans le cadre de la présente invention on pourra aussi utiliser un promoteur spécifique de la méiose (c'est-à-dire actif exclusivement ou préférentiellement dans les cellules en méiose). A titre d'exemple non limitatif on peut citer le promoteur DM01 (KLIMYUK & JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997).
Les cassettes d'expression de l'invention comprennent généralement un terminateur transcriptionnel, par exemple le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER
et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Oeil, 21, 285-294, 1980).
Elles peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs.
Les constructions d'ADN recombinant conformes à
l'invention englobent également des vecteurs recombinants contenant une cassette d'expression conforme à l'invention.
Ces vecteurs recombinants peuvent également inclure un ou plusieurs gènes marqueurs, qui permettent la sélection des cellules ou plantes transformées.
Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc.
L'invention a également pour objet une cellule-hôte comprenant une construction d'ADN recombinant conforme à
l'invention. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote, par exemple une cellule d'Agrobacterium, ou une cellule eucaryote, par exemple une cellule végétale
La présente invention a pour objet des constructions d'ADN recombinant, et notamment des cassettes d'expression, produisant un ARNi permettant d'éteindre le gène FANCM.
Une cassette d'expression conforme à l'invention comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARNi, notamment un hpRNA ou un amiRNA, ciblant le gène FANCM, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale.
Un large choix de promoteurs appropriés pour l'expression de gènes hétérologues dans des cellules végétales ou des plantes est disponible dans l'art.
Ces promoteurs peuvent être obtenus par exemple à
partir de plantes, de virus de plantes, ou de bactéries comme Agrobacterium. Ils incluent des promoteurs constitutifs, à
savoir des promoteurs qui sont actifs dans la plupart des tissus et cellules et dans la plupart des conditions environnementales, ainsi que des promoteurs tissu-spécifiques ou cellule spécifiques, qui sont actifs uniquement ou principalement dans certains tissus ou certains types de cellules, et des promoteurs inductibles qui sont activés par des stimuli physiques ou chimiques.
Des exemples de promoteurs constitutifs qui sont couramment utilisés dans les cellules végétales sont le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV) décrit par KAY et al. (Science, 236, 4805, 1987), ou ses dérivés, le promoteur du virus de la mosaïque des nervures de manioc (CsVMV) décrit dans la Demande Internationale WO 97/48819, le promoteur de l'ubiquitine du maïs ou le promoteur Actine-Intron-actine du riz (McELROY et al., Mol. Gen. Genet., 231, 150-160, 1991 ; GenBank numéro d'accès S 44221).
Dans le cadre de la présente invention on pourra aussi utiliser un promoteur spécifique de la méiose (c'est-à-dire actif exclusivement ou préférentiellement dans les cellules en méiose). A titre d'exemple non limitatif on peut citer le promoteur DM01 (KLIMYUK & JONES, Plant J., 11, 1-14, 1997).
Les cassettes d'expression de l'invention comprennent généralement un terminateur transcriptionnel, par exemple le terminateur 3'NOS de la nopaline synthase (DEPICKER
et al., J. Mol. Appl. Genet., 1, 561-573, 1982), ou le terminateur 3'CaMV (FRANCK et al., Oeil, 21, 285-294, 1980).
Elles peuvent également comprendre d'autres éléments de régulation de la transcription tels que des amplificateurs.
Les constructions d'ADN recombinant conformes à
l'invention englobent également des vecteurs recombinants contenant une cassette d'expression conforme à l'invention.
Ces vecteurs recombinants peuvent également inclure un ou plusieurs gènes marqueurs, qui permettent la sélection des cellules ou plantes transformées.
Le choix du vecteur le plus approprié dépend notamment de l'hôte prévu et de la méthode envisagée pour la transformation de l'hôte en question. De nombreuses méthodes pour la transformation génétique de cellules végétales ou de plantes sont disponibles dans l'art, pour de nombreuses espèces végétales, dicotylédones ou monocotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer la transformation médiée par virus, la transformation par microinjection, par électroporation, la transformation par microprojectiles, la transformation par Agrobacterium, etc.
L'invention a également pour objet une cellule-hôte comprenant une construction d'ADN recombinant conforme à
l'invention. Ladite cellule-hôte peut être une cellule procaryote, par exemple une cellule d'Agrobacterium, ou une cellule eucaryote, par exemple une cellule végétale
10 génétiquement transformés par une construction d'ADN de l'invention. La construction peut être exprimée transitoirement, elle peut aussi être incorporée dans un réplicon extrachromosomique stable, ou intégrée dans le chromosome.
L'invention fournit également un procédé pour produire une plante transgénique ayant un taux de COs méiotiques supérieur à celui de la plante sauvage dont elle est issue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la transformation d'une cellule végétale avec un vecteur contenant une cassette d'expression conforme à
l'invention ;
- la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression.
L'invention englobe également des plantes génétiquement transformées par une construction d'ADN de l'invention. De préférence, lesdites plantes sont des plantes transgéniques, dans laquelle ladite construction est contenue dans un transgène intégré dans le génome de la plante, de sorte qu'il est transmis aux générations successives de plantes. L'expression de la construction d'ADN de l'invention résulte en une régulation négative de l'expression du gène FANCM, qui confère auxdites plantes transgéniques un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne contenant pas la construction d'ADN de l'invention) dont elles sont issues. Généralement ce taux de COs méiotiques est au
L'invention fournit également un procédé pour produire une plante transgénique ayant un taux de COs méiotiques supérieur à celui de la plante sauvage dont elle est issue, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- la transformation d'une cellule végétale avec un vecteur contenant une cassette d'expression conforme à
l'invention ;
- la culture de ladite cellule transformée afin de régénérer une plante ayant dans son génome un transgène contenant ladite cassette d'expression.
L'invention englobe également des plantes génétiquement transformées par une construction d'ADN de l'invention. De préférence, lesdites plantes sont des plantes transgéniques, dans laquelle ladite construction est contenue dans un transgène intégré dans le génome de la plante, de sorte qu'il est transmis aux générations successives de plantes. L'expression de la construction d'ADN de l'invention résulte en une régulation négative de l'expression du gène FANCM, qui confère auxdites plantes transgéniques un taux de COs méiotiques supérieur à celui des plantes sauvages (ne contenant pas la construction d'ADN de l'invention) dont elles sont issues. Généralement ce taux de COs méiotiques est au
11 moins 2 fois supérieur, de préférence au moins 3 fois supérieur à celui des plantes sauvages dont elles sont issues.
La présente invention peut s'appliquer notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes, afin d'accélérer l'obtention de nouvelles variétés. Elle permet aussi de faciliter le croisement entre espèces apparentées, et donc l'introgression de caractères d'intérêt. Elle permet également d'accélérer l'établissement de cartes génétiques et les clonages positionnels.
La présente invention s'applique à un large éventail de plantes d'intérêt agronomique monocotylédones ou dicotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer le colza, le tournesol, la pomme de terre, le maïs, le blé, l'orge, le seigle, le sorgo, le riz, le haricot, la carotte, la tomate, la courgette, le poivron, l'aubergine, le navet, l'oignon, le pois, le concombre, le poireau, l'artichaut, la betterave, le choux, le chou-fleur, les salades, l'endive, le melon, la pastèque, le fraisier, le pommier, le poirier, le prunier, le peuplier, la vigne, le coton, la rose, la tulipe, etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples non-limitatifs illustrant les effets de mutations du gène AtFANCM sur la recombinaison méiotique et le taux de COs.
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MUTANTS SUPPRESSEURS DE MUTATIONS DE
GENES ZMM
Des graines d'Arabidgpsis thaliana homozygotes pour l'insertion d'ADN-T dans ZIP4, SHOC1, ou MSH5 (Atzip4-/-, Atmsh5-/- ou Atshocl-/-) ont été mutées par ENS (éthylméthane sulfonate). Les plantes issues des graines mutées (population Ml, hétérozygotes pour les mutations induites par l'EMS, et homozygotes pour la mutation du gène ZMM) ont un phénotype identique, résultant de l'inactivation du gène ZMM, qui se traduit par une diminution forte de la fréquence de CO et une baisse très importante de la fertilité (plantes semi stériles ), résultant en la formation de siliques courtes qui se différencient facilement de celles des plantes sauvages.
La présente invention peut s'appliquer notamment dans le domaine de l'amélioration des plantes, afin d'accélérer l'obtention de nouvelles variétés. Elle permet aussi de faciliter le croisement entre espèces apparentées, et donc l'introgression de caractères d'intérêt. Elle permet également d'accélérer l'établissement de cartes génétiques et les clonages positionnels.
La présente invention s'applique à un large éventail de plantes d'intérêt agronomique monocotylédones ou dicotylédones. A titre d'exemples non-limitatifs, on peut citer le colza, le tournesol, la pomme de terre, le maïs, le blé, l'orge, le seigle, le sorgo, le riz, le haricot, la carotte, la tomate, la courgette, le poivron, l'aubergine, le navet, l'oignon, le pois, le concombre, le poireau, l'artichaut, la betterave, le choux, le chou-fleur, les salades, l'endive, le melon, la pastèque, le fraisier, le pommier, le poirier, le prunier, le peuplier, la vigne, le coton, la rose, la tulipe, etc.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à
des exemples non-limitatifs illustrant les effets de mutations du gène AtFANCM sur la recombinaison méiotique et le taux de COs.
EXEMPLE 1 : OBTENTION DE MUTANTS SUPPRESSEURS DE MUTATIONS DE
GENES ZMM
Des graines d'Arabidgpsis thaliana homozygotes pour l'insertion d'ADN-T dans ZIP4, SHOC1, ou MSH5 (Atzip4-/-, Atmsh5-/- ou Atshocl-/-) ont été mutées par ENS (éthylméthane sulfonate). Les plantes issues des graines mutées (population Ml, hétérozygotes pour les mutations induites par l'EMS, et homozygotes pour la mutation du gène ZMM) ont un phénotype identique, résultant de l'inactivation du gène ZMM, qui se traduit par une diminution forte de la fréquence de CO et une baisse très importante de la fertilité (plantes semi stériles ), résultant en la formation de siliques courtes qui se différencient facilement de celles des plantes sauvages.
12 Les plantes M1 ont été auto-pollinisées, pour produire une population de descendants (population M2) contenant potentiellement des plantes homozygotes pour les mutations induites par l'EMS. Des plantes de la population M2 ayant une silique plus longue que celle des plantes zmm homozygotes de la génération M1 ont été sélectionnées et génotypées afin de vérifier leur statut homozygote pour l'insertion d'ADN-T dans le gène ZMM concerné. La ségrégation de leurs chromosomes au cours de la méiose a été comparée avec celle de plantes sauvages et de plantes zmm homozygotes non-mutées à l'EMS.
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
Légende de la Figure 1 : Le haut de la figure montre la longueur des siliques des différentes plantes comparées. Les encadrés en bas de la figure illustrent la ségrégation des chromosomes lors de la métaphase I. A :
ZMM/SUPPRESSOR : plante sauvage ; B : zmm/SUPPRESSOR : plante homozygote pour la mutation zmm et sauvage pour la mutation à
l'EMS ; C : zmm/suppressor : plante homozygote pour la mutation zmm et pour la mutation induite par l'EMS ; D :
ZMM/suppressor : plante ne portant pas la mutation zmm et homozygote pour la mutation induite par l'EMS.
Dans les plantes zmm/SUPPRESSOR, on observe une mauvaise ségrégation des chromosomes qui résulte d'une diminution de la formation des CO et donc des bivalents, induite par la mutation zmm, et qui conduit à des gamètes déséquilibrés, non-viables. Au contraire, dans les plantes zmm/suppressor et ZNA/suppressor comme dans les plantes sauvages, on observe une ségrégation des chromosomes normale, identique à celle des plantes sauvages, et conduisant à la formation de gamètes équilibrés.
La fertilité des plantes ZNAlsuppressor est identique à celle des plantes sauvages. Elles ne présentent par ailleurs pas de différences phénotypiques visibles avec les plantes sauvages. Les mutations induites par l'EMS sont récessives. En effet, elles ne se traduisent pas par un phénotype détectable à l'état hétérozygote dans la population de mutants Ml, et les plantes résultant du rétrocroisement des mutants zmm/suppressor avec les mutants zmm initiaux dont ils
Les résultats sont illustrés par la Figure 1.
Légende de la Figure 1 : Le haut de la figure montre la longueur des siliques des différentes plantes comparées. Les encadrés en bas de la figure illustrent la ségrégation des chromosomes lors de la métaphase I. A :
ZMM/SUPPRESSOR : plante sauvage ; B : zmm/SUPPRESSOR : plante homozygote pour la mutation zmm et sauvage pour la mutation à
l'EMS ; C : zmm/suppressor : plante homozygote pour la mutation zmm et pour la mutation induite par l'EMS ; D :
ZMM/suppressor : plante ne portant pas la mutation zmm et homozygote pour la mutation induite par l'EMS.
Dans les plantes zmm/SUPPRESSOR, on observe une mauvaise ségrégation des chromosomes qui résulte d'une diminution de la formation des CO et donc des bivalents, induite par la mutation zmm, et qui conduit à des gamètes déséquilibrés, non-viables. Au contraire, dans les plantes zmm/suppressor et ZNA/suppressor comme dans les plantes sauvages, on observe une ségrégation des chromosomes normale, identique à celle des plantes sauvages, et conduisant à la formation de gamètes équilibrés.
La fertilité des plantes ZNAlsuppressor est identique à celle des plantes sauvages. Elles ne présentent par ailleurs pas de différences phénotypiques visibles avec les plantes sauvages. Les mutations induites par l'EMS sont récessives. En effet, elles ne se traduisent pas par un phénotype détectable à l'état hétérozygote dans la population de mutants Ml, et les plantes résultant du rétrocroisement des mutants zmm/suppressor avec les mutants zmm initiaux dont ils
13 sont respectivement issus, ont un phénotype qui ne diffère pas de celui des mutants initiaux. Par ailleurs, la ségrégation des phénotypes fertile et semi-stérile chez les descendants issus de l'auto-pollinisation des plantes résultant du rétrocroisement des mutants zmm/suppressor avec les mutants zmm initiaux dont ils sont respectivement issus indique qu'un seul locus est concerné par la mutation.
EXEMPLE 2 : LOCALISATION DES MUTATIONS DANS LE GENE FANCM
Parmi les mutants EMS décrits à l'Exemple 1 ci-dessus, cinq lignées de mutants suppresseurs de mutation du gène ZIP4, 3 lignées de mutants suppresseurs de la mutation du gène SHOC1, et une lignée de mutants suppresseurs de la mutation du gène MSH5 ont été isolées. Ces lignées sont respectivement dénommées : zip4(s)1), zip4(s)3, zip4(s)6, zip4(s)7, zip4(s)8, shocl(s)8, shocl(s)14, shoc1(s)38, et msh5(s)59.
Les mutations correspondantes ont toutes été
localisées dans un même gène (At1g35530), homologue du gène FANCM (Fanconi Anemia Complementation Group M). Des tests de complémentation ont confirmé que ces mutations étaient bien responsables du phénotype observé.
Le Tableau I ci-dessous indique la nature et la position des mutations identifiées.
Tableau I
Noms de l'allèle Effet de la mutation / position par rapport à la protéine FANCM
zip4(s)1 fancm-1 Substitution G510D
zip4(s)3 fancm-2 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 17 zip4(s)6 fancm-3 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 13 /
zip4(s)7 fancm-4 Substitution E586K
zip4(s)8 fancm-5 Substitution G138R
shoc1(s)8 fancm-6 Substitution S535F
shoc1(s)14 fancm-7 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 2 msh5(s)59 fancm-8 Substitution G402E
EXEMPLE 3 : INFLUENCE DE L'INACTIVATION DU GENE FACNCM SUR LA
FREQUENCE DE RECOMBINAISON MEIOTIQUE
La fréquence de recombinaison méiotique chez des plantes FANCM/ZIP4 (plantes sauvages), FANCM/zip4 (homozygotes pour la mutation zip4 et non-mutées dans FANCM), fancm-1/ZIP4 (homozygotes pour la mutation fancm-1 et non-mutées dans ZIP4)
EXEMPLE 2 : LOCALISATION DES MUTATIONS DANS LE GENE FANCM
Parmi les mutants EMS décrits à l'Exemple 1 ci-dessus, cinq lignées de mutants suppresseurs de mutation du gène ZIP4, 3 lignées de mutants suppresseurs de la mutation du gène SHOC1, et une lignée de mutants suppresseurs de la mutation du gène MSH5 ont été isolées. Ces lignées sont respectivement dénommées : zip4(s)1), zip4(s)3, zip4(s)6, zip4(s)7, zip4(s)8, shocl(s)8, shocl(s)14, shoc1(s)38, et msh5(s)59.
Les mutations correspondantes ont toutes été
localisées dans un même gène (At1g35530), homologue du gène FANCM (Fanconi Anemia Complementation Group M). Des tests de complémentation ont confirmé que ces mutations étaient bien responsables du phénotype observé.
Le Tableau I ci-dessous indique la nature et la position des mutations identifiées.
Tableau I
Noms de l'allèle Effet de la mutation / position par rapport à la protéine FANCM
zip4(s)1 fancm-1 Substitution G510D
zip4(s)3 fancm-2 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 17 zip4(s)6 fancm-3 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 13 /
zip4(s)7 fancm-4 Substitution E586K
zip4(s)8 fancm-5 Substitution G138R
shoc1(s)8 fancm-6 Substitution S535F
shoc1(s)14 fancm-7 Mutation du site accepteur d'épissage de l'exon 2 msh5(s)59 fancm-8 Substitution G402E
EXEMPLE 3 : INFLUENCE DE L'INACTIVATION DU GENE FACNCM SUR LA
FREQUENCE DE RECOMBINAISON MEIOTIQUE
La fréquence de recombinaison méiotique chez des plantes FANCM/ZIP4 (plantes sauvages), FANCM/zip4 (homozygotes pour la mutation zip4 et non-mutées dans FANCM), fancm-1/ZIP4 (homozygotes pour la mutation fancm-1 et non-mutées dans ZIP4)
14 et fancm-1/zip4 (homozygotes pour les 2 mutations zip4 et fancm-1, a été comparée.
La fréquence de recombinaison méiotique a été
mesurée par analyse de tétrades à l'aide de marqueurs fluorescents, comme décrit par BERCHOWITZ & COPENHAVER (Nat.
Protoc., 3, 41-50, 2008).) La distance génétique dans 2 intervalles adjacents sur le chromosome 5 (I5c et I5d) a été mesurée chez des plantes FANCM/ZIP4, FANCM/zip4, fancm-1/zip4 ou fancm-1/ZIP4.
Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
Légende de la Figure 2 :
Axe des abscisses : génotype des plantes testées ;
Le nombre de tétrades testées pour chaque génotype est indiqué
entre parenthèses.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
En noir : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5c ; en gris clair : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5d.
I5c et I5d mesurent respectivement 6,19 cM et 5,65 cM chez les plantes FANCM/ZIP4 et seulement 2,98 cM et 1,86 cM
chez les plantes FANCM/zip4. En revanche la distance génétique est très fortement augmentée dans les plantes fancm/zip4 (18,45 cM et 14,57 cM pour I5c et I5d respectivement) et encore plus dans le cas de fancm/ZI24 (respectivement 21,06 cM
et 17,20 cM pour I5c et I5d).
Dans une autre série d'expérimentations, la distance génétique a été mesurée sur un plus grand nombre d'intervalles adjacents, situés sur le chromosome 1 (Ilb et Ilc), le chromosome 2 (I2a et I2b), le chromosome 3 (I3b et I3c), et le chromosome 5 (I5c et I5d). Les résultats sont illustrés par la Figure 3.
Légende de la Figure 3 :
ri= FANCM/ZIP4 LI= : FANCM/zip4 = fancm-1/zip4 e : fancm-1/ZIP4 Axe des abscisses : intervalle testé.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
La recombinaison est réduite d'un facteur de 2 à 3 chez le mutant FANCM/zip4 comparé au type sauvage. Chez fancm-1/zip4 les distances génétiques sont augmentées d'un facteur 5 de 1,9 à 3,1 par rapport au type sauvage (P < 10-5). Ceci confirme que la mutation de FANCM non seulement restaure la formation de COs en l'absence de ZIP4, mais augment également la fréquence des COs bien au-delà de celle observée chez les plantes sauvages Chez fancm-1/ZIP4), la recombinaison est 10 augmentée encore plus que chez fancm-1/zip4, en moyenne de 12%
(P < 0.05 dans 3 intervalles individuels sur 6). Ainsi, si l'on compare le mutant fancm-1 au type sauvage, la distance génétique est augmentée d'un facteur de 2 à 3.6 (P < 10-8) sur les 8 intervalles testés, ce qui souligne l'importance de
La fréquence de recombinaison méiotique a été
mesurée par analyse de tétrades à l'aide de marqueurs fluorescents, comme décrit par BERCHOWITZ & COPENHAVER (Nat.
Protoc., 3, 41-50, 2008).) La distance génétique dans 2 intervalles adjacents sur le chromosome 5 (I5c et I5d) a été mesurée chez des plantes FANCM/ZIP4, FANCM/zip4, fancm-1/zip4 ou fancm-1/ZIP4.
Les résultats sont illustrés par la Figure 2.
Légende de la Figure 2 :
Axe des abscisses : génotype des plantes testées ;
Le nombre de tétrades testées pour chaque génotype est indiqué
entre parenthèses.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
En noir : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5c ; en gris clair : distance génétique mesurée pour l'intervalle I5d.
I5c et I5d mesurent respectivement 6,19 cM et 5,65 cM chez les plantes FANCM/ZIP4 et seulement 2,98 cM et 1,86 cM
chez les plantes FANCM/zip4. En revanche la distance génétique est très fortement augmentée dans les plantes fancm/zip4 (18,45 cM et 14,57 cM pour I5c et I5d respectivement) et encore plus dans le cas de fancm/ZI24 (respectivement 21,06 cM
et 17,20 cM pour I5c et I5d).
Dans une autre série d'expérimentations, la distance génétique a été mesurée sur un plus grand nombre d'intervalles adjacents, situés sur le chromosome 1 (Ilb et Ilc), le chromosome 2 (I2a et I2b), le chromosome 3 (I3b et I3c), et le chromosome 5 (I5c et I5d). Les résultats sont illustrés par la Figure 3.
Légende de la Figure 3 :
ri= FANCM/ZIP4 LI= : FANCM/zip4 = fancm-1/zip4 e : fancm-1/ZIP4 Axe des abscisses : intervalle testé.
Axe des ordonnées : distance génétique (en cM).
La recombinaison est réduite d'un facteur de 2 à 3 chez le mutant FANCM/zip4 comparé au type sauvage. Chez fancm-1/zip4 les distances génétiques sont augmentées d'un facteur 5 de 1,9 à 3,1 par rapport au type sauvage (P < 10-5). Ceci confirme que la mutation de FANCM non seulement restaure la formation de COs en l'absence de ZIP4, mais augment également la fréquence des COs bien au-delà de celle observée chez les plantes sauvages Chez fancm-1/ZIP4), la recombinaison est 10 augmentée encore plus que chez fancm-1/zip4, en moyenne de 12%
(P < 0.05 dans 3 intervalles individuels sur 6). Ainsi, si l'on compare le mutant fancm-1 au type sauvage, la distance génétique est augmentée d'un facteur de 2 à 3.6 (P < 10-8) sur les 8 intervalles testés, ce qui souligne l'importance de
15 FANCM dans la limitation de la fréquence des COs.
Claims (11)
1) Procédé pour augmenter la fréquence des COs méiotiques chez une plante, caractérisé en ce qu'il comprend l'inhibition dans ladite plante, d'une protéine ci-après dénommée FANCM, ladite protéine contenant un domaine hélicase DEXDc (cd00046) et un domaine hélicase HELICc (cd00079), et ayant au moins 30% d'identité de séquence, ou au moins 45% de similarité de séquence avec la protéine AtFANCM de séquence SEQ ID NO: 1.
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine hélicase DEXDc de ladite protéine FANCM a au moins 65% d'identité de séquence, ou au moins 75% de similarité de séquence avec le domaine DEXDc de la protéine AtFANCM (acides aminés 129-272 de la SEQ ID NO: 1).
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le domaine hélicase HELICc de ladite protéine FANCM a au moins 60% d'identité de séquence, ou au moins 70% de similarité de séquence avec le domaine HELICc de la protéine AtFANCM (acides aminés 445-570 de la SEQ
ID NO: 1).
ID NO: 1).
4) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibition de la protéine FANCM
est obtenue par mutagenèse du gène FANCM ou de son promoteur.
est obtenue par mutagenèse du gène FANCM ou de son promoteur.
5) Procédé selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'inhibition de la protéine FANCM
est obtenue par extinction du gène FANCM en exprimant dans ladite plante un ARN interférent ciblant ledit gène.
est obtenue par extinction du gène FANCM en exprimant dans ladite plante un ARN interférent ciblant ledit gène.
6) Cassette d'expression, caractérisée en ce qu'elle comprend une séquence d'ADN recombinant dont le transcrit est un ARN interférent ciblant le gène FANCM placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur fonctionnel dans une cellule végétale.
7) Cassette d'expression selon la revendication 6, caractérisée en ce que ledit ARN interférent est choisi parmi :
- un hpRNA ciblant le gène FANCM;
- un amiRNA ciblant le gène FANCM;
- un hpRNA ciblant le gène FANCM;
- un amiRNA ciblant le gène FANCM;
8) Vecteur recombinant contenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 6 ou 7.
9) Cellule-hôte contenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 6 ou 7.
10) Plante mutante caractérisée en ce qu'elle contient une mutation dans le gène FANCM, ladite mutation induisant l'inhibition de la protéine FANCM dans ladite plante à l'exception d'une plante de l'espèce Arabidopsis thaliana chez laquelle ladite mutation est une insertion d'ADN-T dans ledit gène.
11) Plante transgénique contenant un transgène comprenant une cassette d'expression selon une quelconque des revendications 6 ou 7.
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