CA2530382A1

CA2530382A1 - Method for dosing a biological or chemical sample

Info

Publication number: CA2530382A1
Application number: CA002530382A
Authority: CA
Inventors: Francois Perraut; Emmanuelle Schultz
Original assignee: Individual
Current assignee: Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date: 2003-06-27
Filing date: 2004-06-24
Publication date: 2005-01-06
Also published as: FR2856792A1; JP2007516411A; WO2005001449A1; AU2004252258A1; EP1639349A1; FR2856792B1

Abstract

L'invention concerne un procédé de dosage d'un échantillon biologique ou chimique comportant les étapes suivantes éclairement de l'échantillon (10) a u moyen d'un faisceau lumineux (17) issu d'une source (11), réalisation d'une image comprenant l'image du faisceau (18) diffusé par l'échantillon (10), analyse de l'image selon des critères de référence, extraction d'une information spécifique à l'interaction faisceau lumineux/échantillon, calcul du dosage.The invention relates to a method for determining a biological or chemical sample comprising the steps of illuminating the sample (10) by means of a light beam (17) originating from a source (11), producing a image comprising the image of the beam (18) scattered by the sample (10), analysis of the image according to reference criteria, extraction of information specific to the light beam / sample interaction, calculation of the assay.

Description

B 14352.3 D8 PROCEDE DE DOSAGE D'UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE OU
CHIMIQUE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne un procédé
de dosage d'un échantillon biologique ou chimique, Le domaine de l'invention est notamment celui des mesures de concentration de molécules fluorescentes appelées fluorochromes contenues dans des solutions. De telles molécules sont utilisées pour doser la quantité d'une espèce biologique donnëe. La quantité de molécules de cette espèce biologique est alors liée à la quantité de molécules fluorescentes.
Une mesure de l'intensité émise lors de l'excitation de ces molécules fluorescentes permet, par calibrage de l'appareil de mesure utilisé, de déduire la quantité ou la concentration de molécules biologiques. De telles mesures sont couramment utilisées en biologie, en chimie et, en physique.
Dans la suite de la description, pour des raisons de simplification d'exposé, l'invention est décrite dans ce domaine de mesures de fluorescence d'échantillons.
ETAT DE LA TECHNIQûE ANTERIEURE
De nombreux appareils de commerce, tels que les fluorimètres et les spectro-fluorimètres, permettent de mesurer la fluorescence d'une solution.
Ces appareils permettent d'effectuer une mesure dans B 14352.3 DB B 14352.3 D8 METHOD FOR ASSAYING A BIOLOGICAL SAMPLE OR
CHEMICAL
DESCRIPTION
TECHNICAL AREA
The present invention relates to a method for dosing a biological or chemical sample, The field of the invention is in particular that of measuring the concentration of molecules fluorescents called fluorochromes contained in solutions. Such molecules are used to measure the amount of a given biological species. The quantity of molecules of this biological species is then related to the amount of fluorescent molecules.
A measure of the intensity emitted during the excitation of these fluorescent molecules allows, by calibration of the measuring device used, to deduce the quantity or the concentration of biological molecules. Such measurements are commonly used in biology, chemistry and, in physics.
In the remainder of the description, for reasons for simplification of disclosure, the invention is described in this field of fluorescence measurements of samples.
STATE OF THE PRIOR ART
Many trading devices, such as fluorimeters and spectrofluorometers, measure the fluorescence of a solution.
These devices make it possible to perform a measurement in B 14352.3 DB

2 une cuve dont la géométrie est variable et fonction de l'application.
D'autres appareils de mesure en solution utilisent des capillaires comme cuve. Ce sont par exemple les systèmes de mesures pour appareil d'électrophorèse.
Dans tous ces appareils on mesure un échantillon placé dans une cuve, auquel on associe un détecteur unique.
Dans certaines applications de spectro-fluorimétrie on utilise des détecteurs multiples. Le spectre d'émission des molécules fluorescentes est alors dispersé sur un capteur d'image afin de mesurer simultanément l'ênergie dans toutes les longueurs d'onde, ce qui revient à associer un détecteur unique pour chaque intervalle spectral. Plusieurs pixels sont parfois associés dans la direction orthogonale à celle de la dispersion afin de réaliser une opération appelée « binning » qui permet d'augmenter le rapport signal sur bruit de chaque mesure spectrale en réduisant le bruit de lecture des détecteurs devant le flux de photons. Des détecteurs multiples sont également utilisés dans certains appareils multi-échantillons. La présence de plusieurs échantillons impose alors l'emploi de plusieurs cuves et la mesure pour chaque échantillon est faite via un capteur d'image.
La sensibilité de détection de tels appareils est insuffisante pour doser de faibles quantités de molécules, typiquement de l'ordre du picoMolaire, soit pour faire un diagnostic de maladie, soit pour étudier la pureté d'une solution. Certains B 143â2.3 DB 2 a tank whose geometry is variable and function of the application.
Other measuring devices in solution use capillaries as a tank. These are by example device measurement systems Electrophoresis.
In all these devices we measure a sample placed in a tank, which is associated with a unique detector.
In some spectral applications fluorimetry multiple detectors are used. The emission spectrum of fluorescent molecules is then scattered on an image sensor in order to measure simultaneously energy in all lengths waveform, which amounts to associating a single detector for each spectral interval. Several pixels are sometimes associated in the direction orthogonal to that of the dispersion in order to perform an operation called "Binning" which increases the signal ratio noise of each spectral measurement by reducing the reading noise of the detectors in front of the flow of photons. Multiple detectors are also used in some multi-sample devices. The presence of several samples then imposes the use of several tanks and the measurement for each sample is made via an image sensor.
The detection sensitivity of such devices is insufficient to dose low quantities of molecules, typically of the order of picoMolaire, either to make a diagnosis of illness, to study the purity of a solution. Some B 143.2.3 DB

3 types de dosages sont méme impossibles à faire en dessous d'une certaine concentration : dans le domaine des immuno-analyses (dosage des antigènes), le seuil de détection statistique de l'art connu, exprimé en concentration de cibles, le plus bas obtenu pour une mesure en solution est de l'ordre de la centaine de picoMolaire. Typiquement, les appareils de commerce en cuve ne permettent pas de mesurer une fluorescence en dessous d'une concentration de cibles de 1nM
(nanoMolaire) .
Pour diminuer la limite de détection on peut focaliser la lumière d'une source laser dans un très petit volume, comme cela est réalisé en électrophorèse capillaire. L'échantillon passe alors dans un capillaire de quelques centaines de micromètres de diamètre. La limite de détection obtenue est de l'ordre du nM, comme décrit dans le document référencé
[1] en fin de description.
On retrouve une telle limite de détection en marqueurs dans un système complexe comportant une optique confocale intégrëe scrutant l'intérieur d'un capillaire, comme décrit dans le document référencé
[2] .
Les systèmes de mesure utilisant des capillaires ne permettent pas un débit d'échantillon très grand, par exemple d'une dizaine à une centaine de microlitre/minute. Une mesure sur un échantillon de grand volume est donc impossible. Le prélèvement qui s'ensuit réduit l'échantillonnage moléculaire et augmente le seuil de détection. Par exemple, s'il est possible de détecter la présence d'une molécule unique B 14352.3 D8 3 types of dosages are even impossible to below a certain concentration: in the field immunoassays (antigen assay), the statistical detection of the known art, expressed in concentration of targets, the lowest obtained for a measurement in solution is of the order of one hundred picomolar. Typically, trading devices in tank do not measure a fluorescence in below a target concentration of 1nM
(nanoMolar).
To decrease the detection limit can focus the light of a laser source into a very small volume, as is done in capillary electrophoresis. The sample then passes in a capillary of a few hundred micrometers of diameter. The detection limit obtained is the order of the nM, as described in the referenced document [1] at the end of the description.
We find such a limit of detection markers in a complex system with a integrated confocal optics scanning the inside of a capillary, as described in the referenced document [2].
Measuring systems using capillaries do not allow a sample flow very large, for example from ten to a hundred microliters / minute. A measurement on a sample of large volume is impossible. The levy ensured reduced molecular sampling and increases the detection threshold. For example, if he is possible to detect the presence of a single molecule B 14352.3 D8

4 par des techniques de corrélation de fluorescence, comme décrit dans document référencé [3], le volume sondé est très faible, de l'ordre du femtolitre.
Détecter une molécule dans un tel volume donne une limite de dëtection de l'ordre du nM.
Pour augmenter la densité de puissance dans le volume excité on peut focaliser la lumière d'excitation. Comme l'ëmission de fluorescence est quasi proportionnelle à la quantitê d'énergie reçue lors de l'excitation, l'augmentation dë la densitê de puissance permet d'augmenter le nombre de photons émis en fluorescence. Pour un système de mesure bien conçu, comme c'est le cas de la plupart des instruments du commerce, plus le nombre de photons mesurés est grand et plus l'incertitude relative de cette mesure est faible. Cette incertitude varie comme ~~ où N est le nombre de photons transformés en électrons lors de la conversion par le détecteur. Ceci justifie le choix d'une augmentation de la densité de puissance dans le volume excité. Cependant, une forte densité de puissance s'accompagne d'une photo-extinction d'autant plus rapide que l'énergie lumineuse est grande. Pour la mesure d'une très faible concentration de molécules fluorescentes, il faut alors exposer ce vo lame pendant un temps supërieur au temps de photo-blanchiment, qui correspond à une propriété des molécules fluorescentes consistant à. s' arrêter d' émettre de la lumière au bout d'un certain temps. I1 est alors impossible de collecter suffisamment de photons pour atteindre le seuil de détection requis.

8 14352.3 DB
Des facteurs de limitation du seuil de détection résident dans l'auto-fluorescence des liquides, qui est une fluorescence intrinsèque de ces milieux, et dans la diffusion Raman. Le niveau de 4 by fluorescence correlation techniques, as described in referenced document [3], the volume probed is very weak, of the order of femtoliter.
Detecting a molecule in such a volume gives a limit of detection of the order of the nM.
To increase the power density in the excited volume we can focus the light excitation. As the fluorescence emission is almost proportional to the amount of energy received during excitation, increasing the density of power makes it possible to increase the number of photons emitted in fluorescence. For a well-designed measurement system, as is the case with most instruments of the trade, the higher the number of photons measured and the more the relative uncertainty of this measure is low. This uncertainty varies as ~~ where N is the number of photons transformed into electrons during the conversion by the detector. This justifies the choice of an increase in the power density in the excited volume. However, a high density of power comes with a photo-extinction of as many faster than the light energy is great. For the measuring a very low concentration of molecules fluorescents, it is then necessary to expose this film during a time greater than the time of photo-whitening, which corresponds to a property of fluorescent molecules consists in. to stop emitting light at the end of a certain time. It is impossible to collect enough photons to reach the threshold of detection required.

8 14352.3 DB
Limiting factors of the threshold of resident detection in the auto-fluorescence of liquids, which is an intrinsic fluorescence of these backgrounds, and in Raman scattering. The level of

5 lumière émis réduit, en effet, les performances de détection car 1'« offset » de photoluminescence du tampon utilisé est de même nature que le signal, dit « spécifique », que l'on veut détecter. Si le système de mesure est seulement limité par le « bruit de grenaille », dit également « bruit de photons », alors le plus petit signal mesurable au sens statistique Smin est égal à 3x Offset , où « Offset » est une mesure exprimée en électrons primaires (électrons résultants directement de la conversion des photons par une photo-cathode dans le cas d'un photomultiplicateur ou d'une surface semi-conductrice) et 3 est un facteur arbitraire qui permet de garantir une discrimination à
99% entre Sn,in et Offset. Pour résoudre un tel problème Les solutions de l'art connu réalisent .
1) un choix judicieux des liquides, 2) un choix du marqueur, 3) une augmentation du temps de mesure pour accumuler des photons, 4) une augmentation de la puissance d'excitation pour collecter plus de photons.
Mais le principal facteur de limitation du seuil de détection est la non-reproductibilité des mesures, qui, pour de faibles niveaux de signaux, devient très vite dominante. Cette non reproductibilité
provient essentiellement d'un mauvais repositionnement mêcanique de la cuve de mesure et de la lumière qui est B 14352.3 DB 5 emitted light reduces, in fact, the performance of detection because the photoluminescence "offset" of the buffer used is of the same nature as the signal, says "Specific", which one wants to detect. If the system measurement is only limited by the "noise of shot, "also says" photon noise, "then the smallest measurable signal in the statistical sense Smin is equal to 3x Offset, where "Offset" is a measure expressed in primary electrons (resulting electrons directly from the conversion of photons by a photo-cathode in the case of a photomultiplier or a semiconductor surface) and 3 is a factor arbitrariness which makes it possible to guarantee discrimination 99% between Sn, in and Offset. To solve such a problem The solutions of the known art realize.
1) a judicious choice of liquids, 2) a choice of the marker, 3) an increase in measurement time for accumulate photons, 4) an increase in power of excitation to collect more photons.
But the main limiting factor of detection threshold is the non-reproducibility of measures which, for low signal levels, very quickly becomes dominant. This non-reproducibility comes mainly from a bad repositioning the measuring vessel and the light that is B 14352.3 DB

6 collectée par le ménisque liquide dans cette cuve et qui est dirigée dans l'espace de façon aléatoire.
Une solution pour réduire de telles non reproductibilités consiste à réaliser l'injection dans la cuve d'un plus grand volume de solution. Mais une telle injection est insuffisante pour obtenir une bonne sensibilité. De plus il n'est pas toujours possible ou souhaitable de travailler avec des grands volumes, Le positionnement mécanique n'est pas améliorable facilement. De plus dans une telle solution on ne traite pas, alors, des variations provoquées, par exemple, par Z' éclairage ambiant et la variation de la forme du ménisque.
Une autre solution pour réduire de telles non-reproductibilités consiste à utiliser des cuves comprenant une fenêtre transparente en verre ee noir », qui corresponde à la zone considérée pour la mesure.
Mais cette solution réduit le flux de photons collecté
par le système de mesure, et donc élève la limite de détection. De plus, elle ne permet pas de connaître les variations de 1'« offset », qui peuvent être causées par une modification de la lumière ambiante, par un mauvais état de surface des faces de la cuve (salissures, rayures eto.), par une diffusion provenant du ménisque et des parois.
Ainsi ces différentes solutions de l'art connu ne permettent ni une bonne sensibilité, ni une bonne reproductibilitê des mesures.
L'invention a pour objet de pallier ces inconvénients en proposant un nouveau procédé de dosage d'un échantillon biologique ou chimique qui utilise un B 14352.3 DB 6 collected by the liquid meniscus in this tank and which is randomly directed into space.
A solution to reduce such non reproducibility is to perform the injection into the tank of a larger volume of solution. But a such an injection is insufficient to obtain a good sensitivity. Moreover it is not always possible or desirable to work with large volumes, Mechanical positioning is not easily upgraded. Moreover in such a solution we do not deal, then, with the variations caused by example, by Z 'ambient lighting and the variation of the shape of the meniscus.
Another solution to reduce such non-reproducibility is to use vats comprising a transparent black glass window ", which corresponds to the area considered for the measure.
But this solution reduces the flow of photons collected by the measuring system, and therefore raises the limit of detection. Moreover, it does not allow to know the variations of 1 'offset', which can be caused by a modification of the ambient light, by a poor surface condition of the sides of the tank (dirt, scratches eto.), by a diffusion coming meniscus and walls.
So these different solutions of art known do not allow either a good sensitivity or a good reproducibility of measurements.
The object of the invention is to overcome these disadvantages by proposing a new assay a biological or chemical sample that uses a B 14352.3 DB

7 dispositif d'enregistrement spatial de l'image de l'interaction entre la lumière issue d'une source et de cet échantillon comme moyen pour sélectionner les informations utiles.
EXPOSÉ DE D'INVENTION
L'invention concerne un procédé de dosage d'un échantillon biologique ou chimique, comportant les étapes suivantes .
- introduction éventuelle de l'échantillon dans une cuve dont toutes les faces sont transparentes, - éclairement de l'échantillon au moyen d'un faisceau lumineux issu d'une source, caractérisé en ce qu'il comporte, en outre, les étapes suivantes .
. - réalisation d'une image comprenant l'image de la lumière diffusée par l'échantillon, - analyse de l'image selon des critères de référence, - extraction d'une information spécifique à
l'interaction faisceau lumineux/échantillon, - calcul du dosage.
Dans ce procédé la diffusion peut étre une diffusion Raman, une diffusion par fluorescence, une dîffusion moléculaire ou particulaire. L'analyse peut consister en l'étude de la structure spatiale de l'image et de la distribution de l'énergie lumineuse dans cette image. Le calcul du dosage peut se faire par rapport â un étalonnage entre la mesure d'énergie lumineuse et~ la concentration ou la quantité
d'échantillon. Le calcul du dosage peut également se B 14352,3 DB 7 spatial recording device of the image of the interaction between light from a source and this sample as a way to select the useful information.
STATEMENT OF INVENTION
The invention relates to a method for assaying a biological or chemical sample containing the following steps .
- possible introduction of the sample in a tank with all sides transparent, - illumination of the sample by means of a light beam from a source, characterized in that it further comprises the following steps.
. - production of an image comprising the image of the light scattered by the sample, - analysis of the image according to criteria of reference, - extraction of information specific to the light beam / sample interaction, - calculation of the dosage.
In this process the diffusion can be a Raman scattering, fluorescence scattering, molecular or particulate fusion. The analysis can consist of studying the spatial structure of image and distribution of light energy in this picture. The calculation of the dosage can be done by relation to a calibration between the energy measurement bright and ~ the concentration or quantity sample. The calculation of the dosage can also be B 14352.3 DB

8 faire par rapport à l'analyse de la cinétique de la réaction biologique ou chimique.
Dans ce procédé, avantageusement, on définit une première zone d'intérêt autour de la zone de volume excité, et une seconde zone d'intérêt disposée à côté de cette première zone, et on mesure le signal spécifique en réalisant la soustraction entre la somme de tous les pixels de la première zone et la somme de tous les pixels de la seconde zone.
suivants .
L'invention présente les avantages - Elle permet d'atteindre une limite de détection expérimentale beaucoup plus faible que celle l5 des systèmes conventionnels.
- Elle permet de réaliser un dosage en utilisant un grand volume de solution avec un grand débit, et donc d'envisager des applications comme une analyse des eaux de rivière, des systèmes d'aération dans des immeubles.
- Elle n'impose pas de focaliser la lumière dans un petit volume. Le photo-blanchiment des molécules fluorescentes est donc très faible.
- Elle permet, du fait de la géométrie de la cuve, d'exciter simultanêment un grand nombre de molêcules, ce qui permet de collecter de nombreux photons.
- Ni l'auto -fluorescence, ni la diffusion Raman du milieu liquide ne sont une limitation à la sensibilité de l'invention. Elle permet donc de WO 2005/001448 do with respect to the analysis of the kinetics of the biological or chemical reaction.
In this process, advantageously, defines a first area of interest around the area of excited volume, and a second area of interest placed next to this first zone, and the specific signal by performing the subtraction between the sum of all the pixels of the first zone and the sum of all the pixels of the second zone.
following.
The invention has the advantages - It allows to reach a limit of much lower than experimental detection 15 conventional systems.
- It allows to perform a dosage in using a large volume of solution with a large flow, and therefore to consider applications as a river water analysis, aeration systems in buildings.
- It does not impose the focus of light in a small volume. The photo-whitening of Fluorescent molecules is therefore very weak.
- It allows, because of the geometry of the tank, to simultaneously excite a large number of molecules, which makes it possible to collect many photons.
- Neither self-fluorescence nor diffusion Raman from the liquid medium are only a limitation to the sensitivity of the invention. It allows to WO 2005/00144

9 PCT/FR2004/050289 B 14352.3 DB

travailler avec tous les marqueurs du commerce, ce qui réduit les contraintes de marquage.
- Zes non-reproductibilités dues à la mécanique de la cuve, le nettoyage ou l'altération de faces optiques de la cuve, et la présence d'artefacts (bulles, poussières) ne sont plus une contrainte.
L'invention permet, par analyse d'image, de les réduire voire de les supprimer. Un décalage de la position de la cuve devant le système de mesure de l'invention ou une translation de la lumière d'excitation du milieu peut être totalement corrigé après mesure de la position de la trace fluorescente dans l'image enregistrée. De même, des poussières présentes dans le volume excité, qui pourraient modifier de façon significative la mesure, sont de petite taille devant le volume excité, et peuvent ain si être repérées et retirées de la mesure sans perdre celle-ci, ce qui est impossible à réaliser avec un mono-détecteur. En cas d'altération des faces optiques de la cuve, qui peut entraîner une modification de la quantité de lumière qui excite effectivement l'échantillon, l'invention permet de connaître les variations de la puissance effective et de corriger la mesure.
- Les variations de lumière ambiante causées soit par l'échantillon soit par l'environnement sont compensées, par une mesure dans l'image, puis un retrait des « offsets » possibles, - L'analyse de l'information dans une image peut être conduite à partir d'éléments déterminés à.
l'avance (fonction d'éclairement, positions prédéterminées des différentes zones utiles), ou de B 14352.3 DB
façon dynamique pour faire face à des perturbations aléatoires et/ou imprévues par application de méthodes de traitement des images (maximisation de l'entropie, réseau de neurones).
5 - La dynamique de dosage de l'invention, qui, pour un certain type de mesures, permet d'atteindre expérimentalement une dynamique de dosage biologique de 2 200, est très supérieure à celle de l'art connu, qui, pour un même type de mesures, est 9 PCT / FR2004 / 050289 B 14352.3 DB

work with all trade markers, which reduces marking constraints.
- Zes not reproducible due to tank mechanics, cleaning or alteration of optical faces of the tank, and the presence of artifacts (bubbles, dust) are no longer a constraint.
The invention makes it possible, by image analysis, to reduce them even to delete them. A shift of the position of the tank in front of the measuring system of the invention or a translation of the excitation light of the medium can be fully corrected after measuring the position of the fluorescent trace in the image recorded. Similarly, dust present in the excited volume, which could change so significant measure, are small in front of the excited volume, and can so be spotted and withdrawn from the measure without losing it, which is impossible to achieve with a single detector. In case alteration of the optical faces of the tank, which can cause a change in the amount of light which actually excites the sample, the invention allows to know the variations of the power effective and correct the measure.
- The variations of ambient light caused either by the sample or by the environment are compensated by a measure in the image and then a removal of possible offsets, - Analysis of information in an image can be conducted from elements determined to.
advance (illumination function, positions predetermined areas of the different useful areas), or B 14352.3 DB
Dynamic way to deal with disturbances random and / or unforeseen by application of methods image processing (maximizing entropy, neural network).
5 - The dosage dynamics of the invention, which, for a certain type of measure, allows to experimentally achieve a dynamic of dosage biological diversity of 2,200 is much higher than known art, which, for the same type of measurements, is

10 comprise typiquement entre 5 et 10.
L'invention est applicable dans de nombreux domaines, et notamment .
- dans tous les domaines où il est utile de faire la mesure d'une solution fluorescente, l5 - en biologie, plus particulièrement pour le dosage de molécules biologiques ou d'intérêt biologique . antigènes, anticorps, peptides, ADN, cellules, bactéries..., pour le diagnostic clinique, - en chimie (dosage), - en pharmacie . dosage d'activité, contamination..., - en physique . recherche de traces de produits, fluidique, analyse de mélange....
BR~VE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 illustre une vue de dessus d'un premier mode de réalisation d'un dïspositif mettant en aeuvre le procédé de l'invention.
Les figures 2 et 3 illustrent une image de la cuve obtenue avec le dispositif d'enregistrement d'image représenté sur la figure 1.

B 143â2.3 DB Typically between 5 and 10.
The invention is applicable in many areas, and in particular.
- in all areas where it is useful to measure a fluorescent solution, 15 - in biology, especially for the dosage of biological molecules or of interest organic . antigens, antibodies, peptides, DNA, cells, bacteria ..., for the clinical diagnosis, - in chemistry (dosage), - in pharmacy. activity dosage, contamination..., - in physics. search for traces of products, fluidics, mixing analysis ....
BR ~ VE DESCRIPTION OF THE DRAWINGS
Figure 1 illustrates a top view of a first embodiment of a device the process of the invention.
Figures 2 and 3 illustrate an image of the tank obtained with the recording device image shown in Figure 1.

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11 Les figures 4 à 6 illustrent un second mode de réalisation d'un dispositif mettant en oeuvre le procédé de l'invention.
La figure 7 illustre un troisième mode de réalisation d'un dispositif mettant en aeuvre le procédé
de l'invention.
Les figures 8 à 10 illustrent trois exemples de réalisation d'un dispositif mettant en ouvre le procédé de l'invention.
7.0 EXPOS~ DÉTAILL~ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Le procédé de l'invention est un procédé de dosage (mesure d'une concentration ou d'une quantité) d'un échantillon biologique ou d'intérêt biologique (antigènes, anticorps, peptides, ADN, cellules, bactéries, toxines) ou chimique (solvant, gaz dissous, formulation, activitë chimique), qui peut être un solide, un liquide; un gel...
Dans un premier mode de réalisation illustrë sur la figure 1, un échantillon 10 est éclairé
par un faisceau lumineux 17 .issu d'une source 11 accordée avec le fluorochrorne employé. On peut utiliser par exemple un laser Argon 488 nm pour de la fluorescéine ou un laser Hélium-Néon à 633 nm pour du Cy5. L'échantillon 10 est placé dans une cuve 12, par exemple de section rectangulaire dont toutes les faces sont transparentes. La section de cette cuve 12 peut, en effet, être rectangulaire, carrée, cylindrique ou elliptique. Un système d'objectif 13, équipé d'un fïltre d'arrét 14, est monté devant un dispositif d'enregistrement de la structure spatiale d' une image B 14352.3 DB 11 Figures 4 to 6 illustrate a second mode implementation of a device implementing the method of the invention.
Figure 7 illustrates a third mode of realization of a device implementing the process of the invention.
Figures 8 to 10 illustrate three examples of realization of a device opens the process of the invention.
7.0 DETAILED DESCRIPTION OF PARTICULAR EMBODIMENTS
The method of the invention is a method of dosage (measuring a concentration or quantity) a biological sample or biological interest (antigens, antibodies, peptides, DNA, cells, bacteria, toxins) or chemical (solvent, dissolved gas, formulation, chemical activity), which can be a solid, a liquid; a gel...
In a first embodiment illustrated in FIG. 1, a sample 10 is illuminated by a light beam 17. issued from a source 11 granted with the fluorochrorne used. We can use for example a 488 nm Argon laser for the fluorescein or Helium-Neon laser at 633 nm for Cy5. Sample 10 is placed in a tank 12, by example of rectangular section with all faces are transparent. The section of this tank 12 can, indeed, be rectangular, square, cylindrical or elliptical. A lens system 13, equipped with a 14 stopper, is mounted in front of a device recording the spatial structure of an image B 14352.3 DB

12 15, par exemple une camêra CCD ou un système à
balayage, relié à un organe de traitement 16. Le dispositif 15 qui reçoit le faisceau 18 diffusé par l'échantillon 10, permet l'enregistrement d'une image de laquelle peut être extraite un signal spécifique de mesure.
Ze procëdë de l'invention comprend les étapes suivantes .
- éclairement de l'échantillon 10 au moyen du faisceau lumineux 17 issu de la source 11, qui peut être un laser à gaz, un laser solide, une diode laser, une diode électroluminescente, une diode organique, une lampe spectrale comme une lampe halogène, à mercure, à
xénon, à deutérium, - réalisation d'une image du faisceau lumineux 18 diffusë par l'échantillon 10, l'origine de la diffusion pouvant être une diffusion Raman, une diffusion par fluorescence, une diffusion moléculaire (diffusion Rayleight) ou particulaire (utïlïsation de nano-particules), - analyse de l'image par rapport à des références, cette analyse consistant alors en l'étude de la structure spatiale de l'image et de la distribution de l'énergie lumineuse dans cette image, ces réfêrences étant constituées, par exemple, par l'expérience d'un utilisateur ou par des critères morphologiques (forme et position d'une trace lumineuse), photométrique (fréquences des variations spatiales de la lumière dans l'image), statistiques (variation d'estimateurs de mesures, d'entropie dans l'image), s 1435a.3 ns 12 15, for example a camera CCD or a system to scan connected to a treatment organ 16. The device 15 which receives the beam 18 diffused by sample 10, allows the recording of an image from which can be extracted a specific signal from measured.
The process of the invention comprises following steps .
- illumination of the sample 10 by means of of the light beam 17 coming from the source 11, which can to be a gas laser, a solid laser, a laser diode, an electroluminescent diode, an organic diode, a spectral lamp such as a halogen lamp, mercury, xenon, deuterium, - making an image of the beam light scattered by sample 10, the origin of the diffusion being able to be a Raman diffusion, a fluorescence scattering, molecular diffusion (Rayleight scattering) or particulate (use of nano-particles) - analysis of the image in relation to references, this analysis then consisting of the study of the spatial structure of the image and the distribution of light energy in this image, these references being constituted, for example, by the experience of a user or by criteria Morphological (shape and position of a trace luminous), photometric (frequencies of variations spatial patterns of light in the image), statistics (variation of measurement estimators, entropy in the image), s 1435a.3 ns

13 - extraction de l'information spécifique à
l'interaction entre le faisceau 17 et l'échantillon 10, cette extraction consistant, par exemple, en des opérations arithmétiques entre l'image et d'autres images ou des constantes (par exemple, des soustractions, additions, divisions, multiplications), morphologiques (érosion, dilatation, binarisation, détourage, segmentations, correction de décalage) ou photométriques (corrections polynomiales, convolutions, filtres, seuillages), - calcul du dosage, ce calcul se faisant par rapport à un étalonnage entre la mesure d'énergie lumineuse et la concentration ou la quantité de l'échantillon biologique ou chimique. Ce calcul peut aussi être effectué en enregistrant la cinétique de la réaction biologique ou chimique et en analysant cette cinétique par des méthodes connues de l'homme de l'art.
Dans le procédé de l'invention la mesure est faite dans une image obtenue par le dispositif d'enregistrement de la structure spatiale d'une image 15. L'invention ne rëside pas dans l'emploi d'un tel dispositif 15 mais principalement dans .
- le fait d'enregistrer le faisceau 18 diffusé par l'échantillon 10 sous la forme d'une image, - le fait d'extraire l'information de cette image, - le côté adaptatif obtenu par l'application d'une analyse de l'image.
La figure 2 illustre l' image de la cuve 12 obtenue avec le dispositif d'enregistrement de la structure spatiale d'une image 15. La cuve peut avoir B 14352.3 DB 13 - extracting specific information from the interaction between the beam 17 and the sample 10, this extraction consisting, for example, in arithmetic operations between the image and others images or constants (for example, subtractions, additions, divisions, multiplications), morphological (erosion, dilation, binarisation, clipping, segmentation, offset correction) or photometric (polynomial corrections, convolutions, filters, thresholds), - calculation of the dosage, this calculation being done compared to a calibration between the energy measurement light and the concentration or quantity of the biological or chemical sample. This calculation can also be performed by recording the kinetics of the biological or chemical reaction and by analyzing this kinetics by methods known to those skilled in the art.
In the method of the invention the measurement is made in an image obtained by the device recording the spatial structure of an image 15. The invention does not lie in the use of such device 15 but mainly in.
- recording the beam 18 diffused by the sample 10 in the form of an image, - extracting information from this picture, - the adaptive side obtained by the application of an image analysis.
Figure 2 illustrates the image of the tank 12 obtained with the recording device of the spatial structure of an image 15. The tank may have B 14352.3 DB

14 des dimensions plus petites que celles de l'image. Elle peut par exemple être remplacée par un ou plusieurs capillaires.
De plus, le faisceau lumineux peut être indifféremment plus petit ou plus grand que la cuve.
Dans cette image on peut distinguer plusieurs zones .
- une zone 20 de volume éclairé, qui correspond au volume de la cuve 12 excité par le faisceau 17, - la zone 21 d'entrée de ce faisceau 17 dans la cuve 12, - la zone 22 de sortie de ce faisceau 17 de la cuve 12, - une zone 23 de ménisque, - une zone 24 d'artefact.
On peut ainsi, comme illustré sur la figure 3, définir une première région d°intérêt 25 autour de la zone 20 de volume éclairé et une deuxième région d'intérét 26 disposée à côté de cette zone 25. La mesure du signal spêcifique est alors donné par le calcul , ERIi-ERI2 ; c'est-à-dire la soustraction entre la somme de tous les pixels de la première région d'intérêt 25 et la somme de tous les pixels de la seconde région d' ixltérêt 2 6 , Sur la figure 3 les deux régions d'intérêt 25 et 26 ont la même taille, ce qui n'est pas indispensable, Lorsque ces régions n'ont pas la même taille, il suffit soit de réaliser un moyennage des niveaux de gris de chaque région, soit une pondération des valeurs par le nombre de pixels.

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L'analyse de l'image ainsi représentée conduit à certaines observations .
- La trace fluorescente du faisceau lumineux (zone 20) donne le signal spécifique.
5 - Le ménisque (zone 23), délimitant le liquide de l'air, est fortement lumineux. Son origine provient de ladite trace. La forme de ce ménisque est fortement aléatoire. L'amplitude du signal provenant de ce ménisque est donc très variable.
10 - Un artefact (zone 24) peut être, pour un montage donné, une rondelle ressort destinée à assurer un bon positionnement mécanique de la cuve 12.
- Les zones 21 et 22 correspondent respectivement aux points d'entrée et de sortie du 14 dimensions smaller than those of the image. She can for example be replaced by one or more capillaries.
In addition, the light beam can be indifferently smaller or larger than the tank.
In this image we can distinguish several areas.
a zone 20 of illuminated volume, which corresponds to the volume of the tank 12 excited by the beam 17, the input zone 21 of this beam 17 in the tank 12, the output zone 22 of this beam 17 of the tank 12, a zone 23 of meniscus, a zone 24 of artifact.
We can thus, as illustrated in the figure 3, define a first region of interest 25 around the illuminated volume area 20 and a second region of interest 26 disposed next to this zone 25. The measurement of the specific signal is then given by the calculation, ERIi-ERI2; that is, the subtraction between the sum of all pixels in the first region of interest 25 and the sum of all the pixels of the second region of interest 2 6, In Figure 3 the two regions of interest 25 and 26 are the same size, which is not indispensable, When these regions do not have the same size, it is sufficient either to carry out an averaging of the levels of gray in each region, ie a weighting values by the number of pixels.

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The analysis of the image thus represented leads to some observations.
- The fluorescent trace of the beam light (zone 20) gives the specific signal.
5 - The meniscus (zone 23), delimiting the liquid from the air, is strongly luminous. His origin comes from said trace. The shape of this meniscus is highly random. The amplitude of the signal coming from this meniscus is therefore very variable.
10 - An artifact (zone 24) can be, for a given assembly, a spring washer intended to ensure a good mechanical positioning of the tank 12.
- Zones 21 and 22 correspond respectively at the points of entry and exit

15 faisceau lumineux dans la cuve 12.
Avec un autre réglage des seuils d'affichage, on peut mieux mettre en évidence les niveaux de lumière les plus faibles.
Le procédé de l'invention permet d'améliorer le coefficient de variation CV (écart type/moyenne). En effet le coefficient CV obtenu avec le procédé de l'invention est bien inférieur au coefficient CV calculé en faisant la somme de tous les pixels d'une caméra CCD, qui correspond à une mesure faite avec un mono-détecteur. Le coefficient CV obtenu avec le procédé de l'invention est d'ailleurs du même ordre de grandeur que celui obtenu avec un grand volume de solution, comme envisagé précédemment dans l'introduction de ladite demande. Ce coefficient CV
obtenu avec le procédé de l'invention est plus faible que celui obtenu par la mesure dans chacune des zones B 14352.3 DB 15 light beam in the tank 12.
With another threshold setting display, we can better highlight the lowest light levels.
The method of the invention to improve the coefficient of variation CV (deviation deviation / mean). Indeed the CV coefficient obtained with the process of the invention is well below CV coefficient calculated by summing all pixels of a CCD camera, which corresponds to a measurement made with a mono-detector. The CV coefficient obtained with the method of the invention is also of the same order of magnitude than that obtained with a large volume solution, as previously envisaged in the introduction of the said application. This CV coefficient obtained with the process of the invention is weaker that obtained by the measurement in each of the zones B 14352.3 DB

16 d'intérêt 25 et 26. La soustraction des mesures effectuées dans ces deux zones d'intérêt permet de corriger des variations d'éclairage qui affectent toutes les régions. L'invention permet d'effectuer ainsi un filtrage spatial dans le plan qui permet d'extraire le signal contenant l'information spécifique du phénomène de fluorescence. De plus l'invention permet d'extraire les régions d'intérêt qui sont vraiment pertinentes dans une image ou une pseudo-1.0 image, alors qu' un système de mesure utilisant un seul détecteur mono-pixel ne peut pas réaliser une telle fonction.
Dans un second mode de réalisation, un mono-détecteur associé à une matrice de pixels à
transparence programmable 30 telle qu"une matrice de cristaux liquides ou de micro-miroirs ou tout autre système êquivalent est disposé devant la cuve, 12 illustrée sur la figure 4. Cette matrice 30 est intercalée entre la cuve 12 et le détecteur via un système de formation des images ou non. On réalise alors une première mesure en « ouvrant » les pixels correspondant à la première zone d'intërêt 25, comme illustré sur la figure 5, puis une deuxième mesure en ouvrant les pixels correspondant à la seconde zone d'intérêt 26, comme illustré sur la figure 6.
L'emploi d'une telle matrice 30 à
transparence variable permet d'éviter l'enregistrement systématique d' une image, en réalisant par exemple les étapes suivantes .
- enregistrement de l'image du faisceau diffusé par l'ouverture/fermeture successives de tous B 14352.3 DB

les pixels de la matrice 30 en synchronisation avec la mesure effectuée par le mono-détecteur, - analyse de l'image et définition de la ou des zones d'intérêt permettant d'extraire l'information spécifique, - enregistrement de tels paramètres pour une utilisation ultérieure, - lors de l'analyse d'un échantillon donné, ouvertures successives des régions définies lors de l0 l'étape d'analyse et enregistrement des résultats de mesures pour chacune de ces zones, - extraction de l'information utile, - calcul du dosage.
Dans un troisième mode der réalisation illustré sur la figure 7, deux détecteurs mono-pixel 35 et 36 observent chacun une région d'intérêt 25 ou 26.
Deux moyens de formation d'image 37 et 38 sont placés respectivement devant chacun de ces deux détecteurs 35 et 36. La mesure du signal provenant de la première rêgion d'intérêt 25 est faite avec le détecteur 35, celle pour la seconde région d'intérêt 26 est faite avec le détecteur 36. La zone 39 représente la trace fluorescente en vue de face, L'invention permet d'adapter l'extraction du signal spécifique aux conditions d'expériences. Par exemple, si la cuve a bougé entre deux séries de mesures, il est possible, par analyse automatique de l'image, de repositionner les régions d'intérêt de manière automatique, opération impossible à effectuer avec un système statique.

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Exemples de réalisation de 1°invention Les trois exemples de réalisation décrits ci-dessous correspondent respectivement aux trois modes de réalisation définis précédemment.
Dans un premier exemple de rëalisation illustré sur la figure 8, une source lumineuse 40, par exemple un laser ou une diode électroluminescente, excite, dans une cuve 41, le liquide contenant des molécules fluorescentes au travers d'optiques de mise en forme non représentées, et de divers accessoires tels qu'un obturateur 42, et un diaphragme 43. Un premier objectif 44, disposé par exemple perpendiculairement à la direction principale du faisceau lumineux, collecte une partie de ce faisceau lumineux, émis par les molécules fluorescentes dans la cuve 41. Un filtre d'arrêt 45 est disposé derrière le premier objectif 44, juste devant un second objectif 46. L'association des objectifs 44 et 46 permet de former une image de la cuve 41 sur le détecteur d'image 47 qui est relié à un système de commande et de contrôle 49. Pour une cuve 41 d' une largeur intérieure de 1 cm, ce détecteur 47 peut être un détecteur de 512 x 512 pixels de 10 um de côté. Le premier objectif 44 peut avoir une focale 50 mm et le second objectif 46 une focale 25 mm.
Dans un second exemple de réalisation, illustré sur la figure 9, dont la configuration est la même que celle de la figure 8 pour l'excitation, on n'utilise qu'un seul détecteur. Une matrice à
transparence variable 56, qui peut être une matrice à
cristaux liquide ou une matrice de micro-miroirs, joue B 14352.3 DB

le rôle d'un diaphragme de champ. Za matrice 56 peut être remplacée par une fente mobile actionnée par un actuateur mécanique ou électro-mécanique, par exemple, un électro-aimant ou un moteur électrique.
Dans un troisième exemple de réalisation illustré sur la figure 10, la configuration pour exciter l'intérieur de la cuve 41 est la même que pour la figure 8 et la configuration pour la collection de lumière est la même que pour celle de la figure 9. Deux l0 mono-détecteurs 50 et 51, par exemple des photo-multiplicateurs décalés, permettent d'observer deux régions différents de la cuve 41. Devant chaque détecteur 50 et 51, une optique de reprise 52 et 53 permet de former l'image de la rêgion d°intérêt sur un diaphragme de champ 54 et 55 qui limite la région observée. Un filtre d'arrêt peut être disposé avant, dans ou derrière le diaphragme. La zone 56 représente la trace fluorescente.

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REFERENCES
[1] "Some applications of near-ultraviolet laser-induced fluorescence detection in nanomolar- and 5 subnanomolar-range high-performance liquid chromatography or micro-high performance liquid chromatography" de N. Siméon, R. Myers, C. Bayle, M.
Hertz, J.K. Stewart, F. Couderc (2001, Journal of Chromatography A, Vol 913, I 1-2, pages 253-259).
[2] "Performance of an integrated microoptical system for fluorescence detection in microfluidic systems" de J,C. Roulet, R. Volkel, H.P. Herzig, E. Verpoorte, N.F.
Rooij, R. Dandliker (2002 , Anal ytical Chem istry, Vol.
74 (14), pages 3400-3407).
[3] "Single molecule detection of specific nucleic acid sequences in unamplified genomic DNA" de A. Castro, et J.G. Wîlliams (1997, Analytical chemistry, Vol. 69 (19) , pages 3915-3920) . 16 25 and 26. Subtraction of measures performed in these two areas of interest allows for correct lighting variations that affect all the regions. The invention makes it possible to perform thus a spatial filtering in the plane that allows to extract the signal containing the specific information of the fluorescence phenomenon. In addition, the invention allows to extract the regions of interest that are really relevant in an image or pseudo 1.0 image, whereas a measurement system using a single mono-pixel detector can not achieve such function.
In a second embodiment, a mono-detector associated with a matrix of pixels to programmable transparency such as a matrix of liquid crystals or micro-mirrors or any other Equivalent system is placed in front of the tank, 12 illustrated in Figure 4. This matrix 30 is interposed between the tank 12 and the detector via a imaging system or not. We realize then a first step by "opening" the pixels corresponding to the first area of interest 25, as illustrated in Figure 5, then a second measurement in opening the pixels corresponding to the second zone of interest 26, as illustrated in FIG. 6.
The use of such a matrix 30 to Variable transparency prevents registration of an image, for example by following steps .
- recording of the beam image broadcast by the successive opening / closing of all B 14352.3 DB

the pixels of the matrix 30 in synchronization with the measurement performed by the mono-detector, - image analysis and definition of the areas of interest to extract information specific, - recording such parameters for later use, - when analyzing a given sample, successive openings of the regions defined during 10 the step of analysis and recording of the results of measures for each of these areas, - extraction of useful information, - calculation of the dosage.
In a third embodiment illustrated in FIG. 7, two single-pixel detectors 35 and 36 each observe a region of interest 25 or 26.
Two image forming means 37 and 38 are placed respectively in front of each of these two detectors 35 and 36. The measurement of the signal from the first the region of interest is made with the detector 35, that for the second region of interest 26 is made with the detector 36. The zone 39 represents the trace fluorescent in front view, The invention makes it possible to adapt the extraction signal specific to the conditions of experiments. By example, if the tank has moved between two sets of measurements, it is possible, by automatic analysis of image, to reposition the regions of interest of automatic way, operation impossible to perform with a static system.

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Embodiments of the invention The three embodiments described below correspond respectively to the three modes previously defined.
In a first example of realization illustrated in FIG. 8, a light source 40, by example a laser or a light emitting diode, excites, in a tank 41, the liquid containing fluorescent molecules through optics in unrepresented form, and various accessories such as a shutter 42, and a diaphragm 43. A
first objective 44, arranged for example perpendicular to the main direction of the light beam, collecting some of this beam bright, emitted by fluorescent molecules in the 41. A stop filter 45 is disposed behind the first goal 44, just in front of a second goal 46. The combination of objectives 44 and 46 allows forming an image of the tank 41 on the image sensor 47 which is connected to a control system and control 49. For a tank 41 with an internal width of 1 cm, this detector 47 can be a detector of 512 x 512 pixels of 10 um side. The first goal 44 can have a focal length of 50 mm and the second objective 46 a focal length of 25 mm.
In a second embodiment, illustrated in Figure 9, whose configuration is the same as that of Figure 8 for excitation, one only use one detector. A matrix to variable transparency 56, which can be a matrix to liquid crystals or matrix of micro-mirrors, plays B 14352.3 DB

the role of a field diaphragm. Za matrix 56 can be replaced by a movable slot operated by a mechanical or electro-mechanical actuator, for example, an electromagnet or an electric motor.
In a third embodiment illustrated in Figure 10, the configuration for to excite the interior of the tank 41 is the same as for Figure 8 and the configuration for the collection of light is the same as that shown in Figure 9. Two 10 mono-detectors 50 and 51, for example offset multipliers, allow to observe two different regions of the tank 41. In front of each detector 50 and 51, recovery optics 52 and 53 allows to form the image of the region of interest on a field diaphragm 54 and 55 which limits the area observed. A stop filter can be arranged before, in or behind the diaphragm. Area 56 represents the fluorescent trace.

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REFERENCES
[1] "Some applications of near-ultraviolet laser-induced fluorescence detection in nanomolar- and 5 subnanomolar-range high-performance liquid gold chromatography micro-high performance liquid Chromatography "by N. Simeon, R. Myers, C. Bayle, M.
Hertz, J.K. Stewart, F. Couderc (2001, Journal of Chromatography A, Vol 913, 1-2, pages 253-259).
[2] "Performance of an integrated microoptical system for fluorescence detection in microfluidic systems "from J, C. Roulet, R. Volkel, HP Herzig, E. Verpoorte, NF
Rooij, R. Dandliker (2002, Anal Chemical Chemistry, Vol.
74 (14), pages 3400-3407).
[3] "Single molecule detection of specific nucleic acid sequences in unamplified genomic DNA "by A. Castro, and JG Wiliams (1997, Analytical Chemistry, Vol 69 (19), pp. 3915-3920).

Claims

1. Method of assaying a sample biological or chemical, including a step illumination of the sample (10) by means of a light beam (17) from a source (11), characterized in that it further comprises the steps following:
- production of an image comprising the image of the beam (18) scattered by the sample (10) - analysis of the image according to criteria of reference, - extraction of information specific to the light beam / sample interaction, - calculation of the dosage, and in that the analysis consists of studying the spatial structure of image and distribution of the light energy in this image.

2. Method according to claim 1, which has a preliminary step of introduction of the sample (10) in a tank (12) all of which faces are transparent.

3. Method according to claim 1, in which the diffusion is a Raman scattering, a fluorescence scattering, molecular diffusion or particulate.

4. Method according to claim 1, in which the calculation of the dosage is made in relation to a calibration between light energy measurement and concentration or the amount of sample.

5. The process according to claim 1, wherein which the calculation of the dosage is made in relation to the analysis of the kinetics of the biological reaction or chemical.

6. Process according to claim 1, in which defines a first area of interest (25) around the excited volume zone, and a second zone of interest (26) arranged next to this first zone, and we measure the specific signal by realizing the subtraction between the sum of all the pixels of the first area (25) and the sum of all the pixels of the second zone (26).

7. Application of the process according to one any of the preceding claims to fluorescence.