CA2395742A1 - Compositions comprising nucleic acids incorporated in bilaminar mineral particles - Google Patents
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Abstract
Description
COMPOSITIONS COMPRENANT DES ACIDES NUCLEIQUES INCORPORES DANS DES PARTICULES
MINERALES BILAMELLAIRES
La présente invention se rapporte à des compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables, leur procédé de préparatïon et leurs applications pour la transfection i~
vivo, in vitro et/ou ex vivo d'acides nucléiques.
Avec le développement des biotechnologies, la possibilité de transférer efficacement des acides nucléiques dans les cellules (c'est-à-dire de les introduire dans les cellules de façon à ce que le gène d'intérêt qu'ils portent y soit exprimé) est devenue une technique de base avec de nombreuses applications biotechnologiques. Il peut s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules ih vitro , par exemple pour la production de protéines recombinantes, ou au laboratoire pour l'étude de la régulation de l'expression des gènes, le clonage de gènes ou tout autre manipulation impliquant l'ADN. Il peut également s'agir du transfert d'acides nucléiques dans des cellules i~ vivo, par exemple pour la réalisation de vaccins, des études de marquage ou également des approches thérapeutiques. Il peut encore s'agir du transfert de gènes ex vivo dans des cellules prélevées d'un organisme, en vue de leur réadministration ultérieure, par exemple pour la création d'animaux transgéniques.
Il existe à ce jour de nombreuses méthodes de transfert d'acides nucléiques dans des cellules : La précipitation au phosphate de calcium, l'électroporation, la microinjection, l'infection virale, l'injection d'ADN nu, ou encore l'utilisation de vecteurs non-viraux, comme par exemple les polymères cationiques, les vecteurs biochimiques (constitués d'une protéine cationique associée à un récepteur cellulaire), ou encore les lipofectants, et plus particulièrement les lipides cationiques.
Toutefois, ces techniques développées à ce jour présentent de nombreux inconvénients qui limitent l'efficacité de la transfection et ne permettent pas de résoudre de manière satisfaisante les difficultés liées au transfert de gènes dans les cellules et/ou l'organisme. Ainsi, la précipitation au phosphate de calcium est une COMPOSITIONS COMPRISING NUCLEIC ACIDS INCORPORATED IN PARTICLES
BILAMELLAR MINERALS
The present invention relates to compositions comprising at least one nucleic acid and a mineral particle having a sheet structure exchangeable, their method of preparation and their applications for transfection i ~
vivo, in vitro and / or ex vivo of nucleic acids.
With the development of biotechnology, the possibility of transferring efficiently nucleic acids in cells (i.e.
introduce in cells so that the gene of interest they carry is there expressed) is become a basic technique with many applications biotechnology. he can be the transfer of nucleic acids into ih vitro cells, by example for the production of recombinant proteins, or in the laboratory for the study of the regulation of gene expression, gene cloning or any other handling involving DNA. It can also involve the transfer of nucleic acids in i ~ vivo cells, for example for making vaccines, studies of marking or also therapeutic approaches. It can still be the transfer of genes ex vivo in cells taken from an organism, with a view to their re-administration later, for example for the creation of transgenic animals.
To date, there are many methods of transferring nucleic acids.
in cells: Precipitation with calcium phosphate, electroporation, microinjection, viral infection, injection of naked DNA, or the use of non-viral vectors, such as, for example, cationic polymers, vectors biochemicals (consisting of a cationic protein associated with a receptor cellular), or also lipofectants, and more particularly cationic lipids.
However, these techniques developed to date have many disadvantages which limit the efficiency of transfection and do not allow no satisfactorily resolve the difficulties associated with gene transfer in the cells and / or the organism. So calcium phosphate precipitation is a
2 méthode qui est assez inefficace, notamment par rapport à l'injection d'ADN
nu, et elle a donc été abandonnée depuis longtemps. S'il a été montré que l'injection d'acides nucléiques « nus », c'est-à-dire non-formulés, permet d'obtenir des niveaux de transfection acceptables dans certains types cellulaires ih vivo (voir notamment la demande de brevet W090/11092), les acides nucléique nus ne jouissent cependant que d'une demi-vie plasmatique courte, en raison de leur dégradation par les enzymes et de leur élimination par les voies urinaires. Le niveau d'efficacité de transfert de gènes par injection d'acide nucléique nu reste trop faible pour la plupart des applications envisagées. L'utilisation de polymères ou de lipides cationiques constitue ainsi un remède possible vis-à-vis des dégradations enzymatiques que subit l'ADN à
transfecter, mais il a été souvent constaté que leur utilisation inhibe plus ou moins fortement l'efficacité de transfection dans le muscle et qu'ils induisent en outre une toxicité à l'égard des cellules. Si les virus recombinants permettent d'obtenir une bonne efficacité de transfert des acides nucléiques, leur emploi présente cependant certains risques liés à leur nature virale tels que la pathogénicité, la transmission, la réplication, la recombinaison, la transformation, fimmunogénicité, etc... Il est donc préférable d'éviter les techniques de transfection virale. Enfin, des techniques telles que l'électroporation constituent une alternative intéressante mais limitée à
une administration locale. Elles provoquent bien souvent des dégats irréversibles sur les membranes cellulaires. Il apparaît donc qu'il serait souhaitable de disposer d'un vecteur de transfert qui permette à la fois de protéger les acides nucléiques des dégradations enzymatiques et d'obtenir une efficacité de transfert satisfaisante dans les cellules, sans pour autant les endommager ni induire de toxicité.
La présente invention apporte une solution avantageuse à ces problèmes. La demanderesse a en effet montré que les compositions comprenant un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables permettent le transfert in vitro, ex vivo ou in vivo dudit acide nucléique dans une cellule et/ou un organe avec une efficacité supérieure à celles obtenues à ce jour avec les techniques classiques de transfert non-viral. Les compositions de l'invention permettent en outre 2 method which is quite ineffective, especially compared to DNA injection naked, and it has therefore been abandoned for a long time. If the injection has been shown of “naked” nucleic acids, that is to say non-formulated nucleic acids, makes it possible to obtain levels acceptable transfection in certain cell types ih vivo (see especially the patent application WO90 / 11092), however, naked nucleic acids do not than a short plasma half-life, due to their degradation by enzymes and their elimination through the urinary tract. The level of efficiency of transfer from genes by naked nucleic acid injection remains too weak for most envisaged applications. The use of polymers or cationic lipids constitutes thus a possible remedy vis-à-vis the enzymatic degradations which undergoes DNA to transfect, but it has often been found that their use inhibits more or less strongly transfection efficiency in the muscle and that they induce besides a toxicity to cells. If recombinant viruses allow to get a good nucleic acid transfer efficiency, their use is however certain risks linked to their viral nature such as pathogenicity, transmission, the replication, recombination, transformation, immunogenicity, etc.
is therefore better to avoid viral transfection techniques. Finally, techniques such that electroporation constitutes an interesting alternative but limited to a local government. They often cause irreversible damage on the cell membranes. It therefore appears that it would be desirable to have of a transfer vector which both protects nucleic acids of enzymatic degradations and obtain transfer efficiency satisfactory in cells, without damaging them or inducing toxicity.
The present invention provides an advantageous solution to these problems. The Applicant has indeed shown that the compositions comprising an acid nucleic and a mineral particle having a structure with exchangeable sheets allow the in vitro, ex vivo or in vivo transfer of said nucleic acid into a cell and / or a organ with greater efficiency than those obtained to date with techniques non-viral transfer classics. The compositions of the invention allow in addition
3 d'éviter les inconvénients liés à l'emploi de vecteurs viraux ou de techniques physiques de transfection.
Ainsi, un premier objet de la présente invention concerne les compositions comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables.
Au sens de l'invention, on entend par « particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables » des particules minérales dont la structure est basée sur un empilement de feuillets de composition M(OH)2 analogues à ceux bien connus de la brucite (Mg(OH)Z), M représentant un métal divalent, mais dans lesquels une partie des métaux divalents est remplacée par des métaux trivalents de façon à
rendre les feuillets globalement cationiques. Les espaces inter-feuillets comprennent des entités anioniques solvatées par des molécules d'eau. Une telle structure est représentée à la figure 1 et est également appelée « hydroxyde double lamellaire ».
Ces particules ont pour formule générale II III x+ m- x-~MI-x Mx WH)2j L~x~m .nHZOj dans laquelle M~ représente un cation métallique divalent, MIn représente un cation métallique trivalent, Xm représente un anion interfoliaire et m est un entier supérieur ou égal à 1, x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0.
De telles particules minérales ont déjà été décrites pour des applications dans de nombreux domaines tels que la catalyse ou l' environnement. En effet, elles forment des matériaux nanostructurés où des espèces moléculaires ou colloïdales sont intercalées dans une structure hôte lamellaire. Les propriétés de ces stnlctures peuvent ainsi être mises à profit en catalyse hétérogène ou homogène sur support, dans des techniques d'échanges et de séparation notamment des isomères optiques, pour la conception de membranes éventuellement sélectives pour filtration et perméation, pour le piégeage et la restitution contrôlée de molécules, ou encore pour la conception de matériaux et dépôts électro-actifs, d'électrodes et de dispositifs électroniques. 3 avoid the disadvantages of using viral vectors or techniques physical transfection.
Thus, a first object of the present invention relates to the compositions comprising at least one nucleic acid and one mineral particle having a structure with exchangeable sheets.
For the purposes of the invention, the term “mineral particles having a exchangeable sheet structure "of mineral particles whose structure is based on a stack of sheets of composition M (OH) 2 similar to those well known brucite (Mg (OH) Z), M representing a divalent metal, but in which a part of the divalent metals is replaced by trivalent metals so as to return globally cationic sheets. The inter-sheet spaces include of anionic entities solvated by water molecules. Such a structure is shown in Figure 1 and is also called "double hydroxide lamellar ".
These particles have the general formula II III x + m- x-~ MI-x Mx WH) 2d L ~ x ~ m .nHZOj in which M ~ represents a divalent metal cation, MIn represents a cation trivalent metal, Xm represents an interfoliar anion and m is an integer superior or equal to 1, x is between 0 and 1 strictly, and n is strictly greater than 0.
Such mineral particles have already been described for applications in many fields such as catalysis or the environment. Indeed, they form nanostructured materials where molecular species or colloids are intercalated in a lamellar host structure. The properties of these stnlctures can thus be taken advantage of in heterogeneous or homogeneous catalysis on support, in of exchange and separation techniques, in particular optical isomers, for the design of possibly selective membranes for filtration and permeation, for trapping and controlled release of molecules, or for design of electroactive materials and deposits, electrodes and devices electronic.
4 Ainsi l'article de Choy et al (1999, J. Am. Chem. Soc. 121(6), 1399-1400) décrit la préparation de nanoparticules hybrides composées de feuillets d'un Hydroxyde Double Lamellaire (HDL), la pristine (Mg2Al(N03)-LDH), entre lesquels sont intercalés des nucléosides monophoshatés ou des fragments d'ADN de testicules de hareng. Les molécules nucléiques intercalées dans les particules décrites dans cet article présentent une taille inférieure à 1000 paires de bases. Aucune utilisation de ces molécules n'est décrite.
Cependant, de telles particules minérales n'avaient jamais été utilisées pour le transfert d'acides nucléiques et rien ne laissait prévoir qu'il serait possible d'obtenir une très nette amélioration de l'efficacité de transfert, en particulier par rapport aux résultats de transfection obtenus par injection d'ADN nu ou formulé avec les vecteurs synthétiques classiques tels que les lipides cationiques.
Les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables utilisables dans le cadre de la présente invention sont souvent nommées d'après la I S nature des cations métalliques majeurs des feuillets : par exemple l'hydrotalcite (Mg-Al), la pyroaurite (Mg-Fe), la stichtite (Mg-Cr) ou encore la takovite (Ni-Al). La formule générale indiquée ci-avant sous-tend la grande variété des particules minérales qu'il est possible de préparer en faisant varier la nature des deux cations métalliques Mai et MIII, leurs proportions respectives avec extension possible à plus de deux types de cations (par exemple Mg, Zn et Al), la nature des anions interfoliaires, ou encore l'état d'hydratation. En outre, la richesse de la formule générale indiquée ci-avant est encore accrue par une diversité structurale résultant de l'existence de polytypes différant par la séquence d'empilement des feuillets ainsi que de l'apparition de surstructures dues par exemple à un classement cationique dans le feuillet hydroxylé.
Les cations métalliques divalents M° peuvent être choisis par exemple parmi le magnésium (Mg), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), 1e fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co), le cuivre (Cu), le calcium (Ca) ou encore le zinc (Zn). De préférence, le cation métallique divalent est Ie magnésium. Les cations métalliques trivalents Muj peuvent être choisis par exemple parmi l'aluminium (Al), le chrome (Cr), le manganèse (Mn), le fer (Fe), le nickel (Ni), le cobalt (Co) ou encore le gallium (Ga).
De préférence, le cation métallique trivalent est l'aluminium. En outre, les deux membres du couple M~ et M« peuvent également correspondre au même élément (par 4 Thus the article by Choy et al (1999, J. Am. Chem. Soc. 121 (6), 1399-1400) describes the preparation of hybrid nanoparticles composed of sheets of a Double Lamellar Hydroxide (HDL), pristine (Mg2Al (N03) -LDH), between which are interspersed with monophoshated nucleosides or DNA fragments of testicles herring. The nucleic molecules inserted in the described particles in this item have a size less than 1000 base pairs. Any the use of these molecules are only described.
However, such mineral particles had never been used for the transfer of nucleic acids and there was no indication that it would be possible to get a marked improvement in transfer efficiency, in particular by compared to transfection results obtained by injection of naked DNA or formulated with vectors conventional synthetics such as cationic lipids.
Mineral particles having a structure with exchangeable sheets usable in the context of the present invention are often called according to IS nature of the major metal cations of the sheets: for example hydrotalcite (Mg-Al), pyroaurite (Mg-Fe), stichtite (Mg-Cr) or takovite (Ni-Al). The general formula given above underpins the wide variety of particles mineral which can be prepared by varying the nature of the two cations metallic May and MIII, their respective proportions with possible extension over two types of cations (for example Mg, Zn and Al), the nature of the anions interfoliar, or the state of hydration. In addition, the richness of the general formula indicated above is further increased by a structural diversity resulting from the existence of polytypes differing in the stacking sequence of the sheets as well as the appearance of super-structures due for example to a cationic classification in the hydroxylated sheet.
The divalent metal cations M ° can be chosen by example among magnesium (Mg), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), the cobalt (Co), copper (Cu), calcium (Ca) or even zinc (Zn). Of preferably the divalent metal cation is magnesium. Metal cations Muj trivalent can be chosen for example from aluminum (Al), chromium (Cr), manganese (Mn), iron (Fe), nickel (Ni), cobalt (Co) or even gallium (Ga).
Preferably, the trivalent metal cation is aluminum. In addition, of them members of the couple M ~ and M "can also correspond to the same element (for
5 exemple Fen/Fei~ ou MnB/MnIB).
Les anions interfoliaires Xm- peuvent être par exemple choisis parmi les halogénures, les oxoanions, les iso- et hétéroanions, les anions complexes, ou encore les anions organiques. Citons à titre d'exemple les fluorures, les chlorures, les bromures, les carbonates, les nitrates, les sulfates ou encore les oxoanions tétraédriques tels que Cr042-. De préférence, l'anion est choisi parmi les carbonates C032-.
La valeur de x est comprise strictement entre 0 et 1, c'est-à-dire que 0 et 1 sont des valeurs exclues. De préférence, x est compris entre 0,05 et 0,95, et de préférence entre 0,1 et 0,9. Encore plus préférentiellement, x est compris entre 0,2 et 0,85. A titre d'exemple, x peut être égal à 0,25. En ce qui concerne la valeur de n, celle-ci indique l'état d'hydratation de la particule en question et elle est strictement supérieure à 0. De préférence, n est supérieur ou égal à 0,1. Par exemple, n peut être égal à 0,5. m est un entier supérieur ou égal à 1 qui représente la charge de l'anion interfoliaire. Par exemple, m peut être égal à l, 2, 3, 4, 5 ou 6.
Des particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables selon la présente invention peuvent être choisies par exemple parmi l'hydrotalcite de formule Mg6A1zC03(OH),6.4H20, la manasseite de formule Mg6A12C03(OH)i6..4H20, la pyroaurite de formule Mg6Fe2C03(OH)16.4H~0, la stichtite de formule Mg6Cr2C03(OH)16.4H20, la takovite de formule Ni6A12C03(OH)i6.4H20, la reevesite de formule Ni6Fe2C03(OH)16.4H20, ou encore la comblainite de formule Ni6Co2C03(OH)16.4H20. D'autres particules minérales ayant une structure à
feuillets échangeables peuvent également convenir. 5 example Fen / Fei ~ or MnB / MnIB).
The interfoliar anions Xm- can for example be chosen from halides, oxoanions, iso- and heteroanions, complex anions, or again organic anions. Let us quote by example fluorides, chlorides, the bromides, carbonates, nitrates, sulfates or oxoanions tetrahedral such as Cr042-. Preferably, the anion is chosen from among the carbonates C032-.
The value of x is strictly between 0 and 1, i.e. 0 and 1 are excluded values. Preferably, x is between 0.05 and 0.95, and of preferably between 0.1 and 0.9. Even more preferably, x is understood between 0.2 and 0.85. For example, x can be equal to 0.25. Regarding the value from n, this indicates the hydration state of the particle in question and is strictly greater than 0. Preferably, n is greater than or equal to 0.1. For example, n may be equal to 0.5. m is an integer greater than or equal to 1 which represents the charge of the anion interfoliar. For example, m can be 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
Mineral particles having a structure with exchangeable sheets according to the present invention can be chosen for example from hydrotalcite of formula Mg6A1zC03 (OH), 6.4H20, the manasseite of formula Mg6A12C03 (OH) i6..4H20, the pyroaurite of formula Mg6Fe2C03 (OH) 16.4H ~ 0, the stichtite of formula Mg6Cr2C03 (OH) 16.4H20, the takovite of formula Ni6A12C03 (OH) i6.4H20, the reevesite of formula Ni6Fe2C03 (OH) 16.4H20, or the comblainite of formula Ni6Co2C03 (OH) 16.4H20. Other mineral particles having a structure with leaflets exchangeable may also be suitable.
6 De préférence, les compositions selon la présente invention comprennent au moins un acide nucléique et de l'hydrotalcite de formule Mg6AlZC03(OH)I6.4H20.
Les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables selon la présente invention sont soit commerciales, soït elles peuvent être préparées selon des méthodes qui s'apparentent aux méthodes connues dites de « chimie douce ».
Notamment, la préparation des particules minérales selon l'invention peut être basée sur la précipitation contrôlée de solutions ou de suspensions aqueuses contenant à la fois les cations métalliques destinés à prendre place dans la charpente hydroxylée et les anions destinés à occuper les domaines interlamellaires. Dans ces conditions, il y a simultanément construction des domaines interlamellaires constitués d'anions et de molécules d'eau, et du feuillet. La nature et la texture des phases obtenues sont fortement dépendantes des conditions opératoires (température, vitesse d'addition et concentration des réactifs, contrôle du pH), mais aussi de la géométrie du réacteur et de l'état d'association préalable des cations métalliques dans les réactifs (existence d'oligomères). Le procédé de préparation se ramène finalement toujours à
mettre en présence, à concentration et réactivité adéquates, les espèces conduisant à la construction des particules minérales dans des conditions optimales. Ces conditions optimales sont déterminées au cas par cas selon la méthode classique des tâtonnements.
On entend au sens de l'invention par "acide nucléique" aussi bien un acide désoxyribonucléique qu'un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences naturelles ou artificielles, et notamment d'ADN génomique (ADNg), d'ADN complémentaire (ADNc), d'ARN messager (ARNm), d'ARN de transfert (ARNt), d'ARN ribosomique (ARNr), de séquences hybrides ou de séquences synthétiques ou semi-synthétiques, d'oligonucléotides modifiés ou non. Ces acides nucléiques peuvent être par exemple d'origine humaine, animale, végétale, bactérienne ou virale. Ils peuvent être obtenus par toute technique connue de l'homme du métier, et notamment par criblage de banques, par synthèse chimique, ou encore par des méthodes mixtes incluant la modification chimique ou enzymatique de séquences obtenues par criblage de banques. Ils peuvent être modifiés chimiquement.
Concernant plus particulièrement les acides désoxyribonucléiques, ils peuvent être simple ou double brin ou encore des oligonucléotides courts ou des séquences plus longues. En particulier, les acides nucléiqûes sont avantageusement constitués par exemple par des plasmides, des vecteurs, des épisomes ou des cassettes d'expression. Ces acides désoxyribonucléiques peuvent notamment porter une origine de réplication fonctionnelle ou non dans la cellule cible, un ou plusieurs gènes marqueurs, des séquences régulatrices de la transcription ou de la réplication, des gènes d'intérêt thérapeutique, des séquences antisens modifiées ou non ou encore des régions de liaison à d'autres composants cellulaires.
De préférence, Iedit acide nucléique présente une taille supérieure à 1000 paires de bases. Encore plus préférentiellement il présente une taille comprise entre environ 1000 paires de bases et environ 2.000.000 paires de bases (2 Mb), environ 1000 paires de bases et environ 100.000 paires de bases ( 100 kb), et environ paires de bases et environ 20.000 paires de bases (20 kb).
De manière avantageuse l'acide nucléique comprend un ou plusieurs gènes d'intérêt thérapeutique sous contrôle de séquences de régulation, par exemple un ou plusieurs promoteurs et un terminateur transcriptionnel actifs dans les cellules cibles.
Au sens de l'invention, on entend par gène d'intérêt thérapeutique notamment tout gène codant pour un produit protéique ayant un effet thérapeutique. Le produit protéique ainsi codé peut être notamment une protéine ou un peptide. Ce produit protéique peut être exogène homologue ou endogène vis-à-vis de la cellule cible, c'est-à-dire un produit qui est normalement exprimé dans la cellule cible lorsque celle-ci ne présente aucune pathologie. Dans ce cas, l'expression d'une protéine permet par exemple de pallier une expression insuffisante dans la cellule ou (expression d'une protéine inactive ou faiblement active en raison d'une modification, ou encore de surexprimer ladite protéine. Le gène d'intérêt thérapeutique peut aussi coder pour un mutant d'une protéine cellulaire ayant par exemple une stabilité
accrue ou une activité modifiée. Le produit protéique peut également être hétérologue vis-à
vis de la cellule cible. Dans ce cas, une protéine exprimée peut par exemple compléter ou apporter une activité déficiente dans la cellule, lui permettant de lutter contre une pathologie, ou stimuler une réponse immunitaire.
Parmi les produits thérapeutiques au sens de la présente invention, on peut citer plus particulièrement les enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines (par exemple les interleukines, les interférons ou le TNF : voir FR 92/03120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques (par exemple BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NTS ou HARP/pléiotrophine), les apolipoprotéines (par exemple ApoAI, ApoAIV ou ApoE : voir FR 93/05125), la dystrophine ou une minidystrophine (FR 91/11947), la protéine CFTR associée à
la mucoviscidose, les gènes suppresseurs de tumeurs (par exemple p53, Rb, RaplA, I S DCC ou k-rev : voir FR 93/04745), les gënes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation (Facteurs VII, VIII, IX), les gènes intervenant dans la réparation de l'ADN, les gènes suicides (thymidine kinase, cytosine déaminase), les gènes de l'hémoglobine ou d'autres transporteurs protéiques, les enzymes du métabolisme ou catabolisme.
L'acide nucléique d'intérêt thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent, par exemple, être transcrites dans la cellule cible en ARN
complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Les gènes thérapeutiques comprennent également les séquences codant pour des ribozymes, qui sont capables de détruire sélectivement des ARN cibles (EP 321 201).
Comme indiqué plus haut, l'acide nucléique peut également comporter un ou plusieurs gènes codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez (homme ou l'animal une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, (invention permet la réalisation soit de vaccins soit de traitements immunothérapeutiques appliqués à l'homme ou à l'animal, notamment contre des micro-organismes, des virus ou des cancers. il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'Epstein Barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 1 ~5 573), du virus de la pseudo-rage, du "syncitia forming virus", d'autres virus ou encore de peptides antigéniques spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Comme indiqué précédemment, (acide nucléique comprend de préférence également des séquences permettant l'expression du gène d'intérêt thérapeutique et/ou du gène codant pour le peptide antigénique dans la cellule ou l'organe désiré.
Il peut s'agir des séquences qui sont naturellement responsables de l'expression du gène considéré lorsque ces séquences sont susceptibles de fonctionner dans la cellule infectée. Il peut également s'agir de séquences d'origine différente (responsables de (expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter.
De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus. A
cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs des gènes EIA, MLP, CMV, RSV
ou HSV. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par exemple par addition de séquences d'activation ou de régulation. Il peut aussi s'agir de promoteurs inductibles ou répressibles.
Par ailleurs, (acide nucléique peut également comporter, en particulier en amont du gène d'intérêt thérapeutique, une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible.
Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit thérapeutique, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle. L'acide nucléique peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit thérapeutique synthétisé vers un compartiment particulier de la cellule.
Les çompositions selon la présente invention peuvent être préparées par mélange d'une solution aqueuse contenant une particule minérale ayant une structure 5 à feuillets échangeables et d'une solution contenant les acides nucléiques.
Plus précisément, les compositions selon la présente invention peuvent être préparées en mettant les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables en solution aqueuse à un pH proche de la neutralité~(par exemple entre 6 et 8, et plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5), puis en ajoutant la solution aqueuse ainsi obtenue 10 à une solution contenant les acides nucléiques ou bien en ajoutant ladite solution contenant les acides nucléiques à la solution aqueuse de particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables. La solution contenant les acides nucléiques est de préférence une solution isotonique dans du chlorure de sodium ou dans du glucose.
De préférence, les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables et les acides nucléiques sont introduits dans la composition en quantités telles que le rapport massique entre les particules minérales ayant une structure à
feuillets échangeables et les acides nucléiques est compris entre 0,01 et 1000, de préférence entre 0,01 et 500, plus préférentiellement entre 0,01 et 100, et encore plus préférentiellement entre 0,5 et 100. En tout état de cause, les quantités respectives de chaque composant peuvent être ajustées et optimisées aisément par l'homme du métier par la méthode habituelle des tâtonnements, en fonction de la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables utilisée, de (acide nucléique, et des applications recherchées (notamment du type cellulaire à transfecter).
L'invention a également pour objet les compositions telles que défnies ci-avant pour utilisation comme médicament.
L'invention a également pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-avant pour le transfert d'acides nucléiques dans les cellules in vitro, in vivo ou ex vivo. Plus précisément, la présente inventïon a pour objet l'utilisation des compositions telles que définies ci-avant pour la préparation d'un médicament destiné
à traiter les maladies, en particulier les maladies qui résultent d'une déficience en un produit protéique ou nucléique. L'acide nucléique contenu dans ledit médicament code ledit produit protéique ou nucléique, ou constitue ledit produit nucléique, apte à
corriger lesdites maladies in vivo ou ex vivo. Ledit médicament peut en outre être un vaccin et dans ce cas, l'acide nucléique transfecté induit une réponse immunitaire.
Pour des utilisations in vivo, par exemple en thérapie ou pour l'étude de la régulation de gènes ou la création de modèles animaux de pathologies, les compositions selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations notamment par voie topique, cutanée, orale, rectale, vaginale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, intratrachéale ou intrapéritonéale. De préférence, les compositions de l'invention contiennent un véhïcule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau de l'organe désiré, ou pour une administration par voie topique (sur peau et/ou sur muqueuse). Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. En outre, les compositions selon l'invention peuvent contenir un ou des adjuvants classiquement utilisés en pharmacie.
Les doses d'acides nucléiques utilisées pour l'injection ainsi que le nombre d'administrations peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. En ce qui concerne plus particulièrement le mode d'administration, il peut s'agir . soit d'une injection directe dans les tissus, par exemple au niveau des tumeurs, ou dans les voies circulatoires, soit d'un traitement de cellules en culture suivi de leur réimplantation ih vivo, par injection ou greffe. Les tissus concernés dans le cadre de la présente invention sont par exemple les muscles, la peau, le cerveau, les poumons, le foie, la rate, la moelle osseuse, le thymus, le coeur, la lymphe, le sang, les os, les cartilages, le pancréas, les reins, la vessie, l'estomac, les intestins, les testicules, les ovaires, le rectum, le système nerveux, les yeux, les glandes ou les tissus conjonctifs.
Un autre objet de la présente invention concerne une méthode de transfert d'acides nucléiques dans les cellules comprenànt les étapes suivantes (1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment, et (2) la mise en contact des cellules avec la composition formée en (1).
Plus particulièrement, la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique du corps humain ou animal comprenant les étapes suivantes (1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment, et (2) la mise en contact des cellules du corps humain ou animal avec la composition formée en ( 1 ).
La mise en contact des cellules avec la composition selon la présente invention peut être réalisée par incubation des cellules avec ladite composition ou par injection de la composition dans l'organisme ou une partie de l'organisme. L'incubation est réalisée de préférence en présence de par exemple de 0,01 à 1000 ~g d'acide nucléique pour 106 cellules. Pour une administration in vivo, des doses d'acide nucléique allant de 0,01 à 10 mg peuvent par exemple être utilisées.
Les compositions de l'invention peuvent en outre contenir un ou plusieurs adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Dans ce cas, le ou les adjuvants sont préalablement mélangés à la solution aqueuse contenant la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables selon (invention et/ou à la solution d'acide(s) nucléique(s).
La présente invention fournit ainsi une méthode particulièrement avantageuse pour le transfert d'acides nucléiques, notamment pour le traitement de maladies, comprenant l'administration ifa vivo ou ex vivo d'un acide nucléique codant pour une protéine ou pouvant être transcrit en un acide nucléique apte à
corriger ladite maladie, ledit acide nucléique étant associé à une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie précédemment dans les conditions définies ci-avant.
Les compositions selon la présente invention sont particulièrement utiles pour le transfert d'acides nucléiques dans des cellules primaires ou dans des lignées établies.
Il peut s'agir par exemple de cellules fibroblastiques, musculaires, nerveuses (neurones, astrocytes, cellules gliales), hépatiques, hématopoiétiques (par exemple les lymphocytes, CD34, ou dendritiques) ou épitheliales, sous forme différenciées ou pluripotentes (précurseurs).
Outre les dispositions qui précèdent, la présente invention comprend également d'autres caractéristiques et avantages qui ressortiront des exemples et figures qui suivent, et qui doivent être considérés comme illustrant l'invention sans en limiter la portée.
FIGURES
Fi _ r~ structure idéalisée des particules minérales ayant une structure à
feuillets échangeables (hydroxydes doubles lamellaires) selon la présente invention.
Fi vre 2 : représentation schématique de l'hydrotalcite Mg6A12C03(OH)i6.4H~0.
Fi.. u~ re 3 _ mesure du potentiel zéta de particules d'hydrotalcite seules en solution.
Fore 4: mesure du potentiel zéta de compositions contenant des particules d'hydrotalcite et de l'ADN dans un rapport massique égal à 0,5.
Fil: Mesure du pourcentage d'ADN restant dans le surnageant par râpport à la quantité initiale d'ADN introduite, en fonction du rapport massique hydrotalcite/ADN. Les mesures ont été faites pour trois concentrations différentes d'ADN introduites : 20 p,g d'ADN/ml, 50 pg d'ADN/ml, et 100 pg d'ADN/ml.
Figure 6 : Electrophorèse sur gel d'agarose de différentes formulations d'ADN.
La colonne « a » constitue le contrôle (ADN non-formulé et non-soumis aux nucléases), la colonne « b » représente l'ADN non-formulé soumis aux nucléases, et les colonnes « c » à « f » représentent des compositions hydrotalcite/ADN à des rapports massiques de 0,125 ou 0,25 ou 0,5 ou 1 qui sont soumises aux nucléases.
Fi re 7 : visualisation sous forme d'histogramme de l'efficacité de transfert de gène in vivo (par injection dans le muscle tibial cranial de souris) de compositions ADN/hydrotalcite dans différents rapports massiques, comparativement à
l'injection d'ADN nu.
Fi re 8: Représentation schématique du plasmide pXL3031 utilisé dans les expériences de transfert d'ADN dans les cellules EXEMPLES
A1 MATÉRIEL ET MÉTHODES
Souris utilisées Les souris utilisées dans les expériences de transfert in vivo de gènes sont des souris 5 femelles C57B16 âgées de 8 semaines, et réparties en 9 groupes de 12 souris.
Particule minérale selon l'invention utilisée la particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables utilisées dans les différents essais est l'hydrotalcite en solution aqueuse à une concentration de 20 g/1 et à pH 7. Cette hydrotalcite est commercialisée par la société Süd-Chemie AG
10 (Allemagne).
ADN
Le plasmide utilisé est le pXL3031 qui contient le gène luc codant pour la luciférase sous contrôle du promoteur P/E CMV du cytomégalovirus, représenté à la figure 8. Sa taille est de 3671 bp. La solution de plasmide utilisée contient 320 pg d'ADN/ml dans 15 une solution de chlorure de sodium (NaCI) à 150 mM.
Complexes hydrotalcite/ADN
Les complexes sont préparés par mélange équivolumétrique de deux solutions :
l'une contenant l'hydrotalcite et l'autre l'ADN plasmidique.
Exemple I : Mesure des potentiels zéta de l'hydrotalcite seul et des complexes ADN/hydrotalcite Le but de cet exemple est de montrer que l'ADN est capable de s'associer avec une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite.
La mesure du potentiel zéta renseigne sur la nature de la charge de surface d'une particule placée dans un liquide. Le potentiel zéta n'est pas une mesure directe de la charge de surface, mais est le potentiel qui existe autour de le particule lorsque celle ci se déplace dans une solution lorsqu'elle est soumise à un champs électrique. Par conséquent si les particules ont une charge de surface positive, le potentiel zéta, qui est la seule grandeur mesurable, sera lui aussi positif. Le potentiel zéta joue un rôle déterminant dans la stabilité colloïdale des particules en solution. En effet, lorsque le potentiel zéta est fortement positif ou négatif, les particules ne s'agrègent pas car des forces de répulsions électrostatiques les maintiennent isolées. Par contre, les particules qui possèdent un potentiel zéta proche de zéro ne sont pas stables car les forces de Van Der Waals attirent les particules entre elles, et les font précipiter.
Le potentiel zéta de l'hydrotalcite et des complexes hydrotalcite/ADN a été
mesuré
par un zétamètre de marque Coulter (Delsa 440 SX). La solution d'hydrotalcite contenait 0,15 mg d'hydrotalcite/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCI) à
20 mM, soit une conductivité de 2,3 mS/cm. Les complexes hydrotalcite/ADN ont été
préparés â des concentrations de 250 ~g d'ADN/ml dans une solution de chlorure de sodium (NaCI) à 20 mM, au rapport massique de 0,5. La mesure a été effectuée en appliquant un champs électrique de 1,5 mA pendant 60 secondes.
La figure 3 représente le potentiel zéta de l'hydrotalcite seul avant d'être mélangé
avec l'ADN. Ce potentiel zéta est de + 32 mV et indique donc une charge en surface globalement cationique, ce qui est cohérent avec la structure et la composition de l'hydrotalcite (voir figures 1 et 2). La figure 4 représente le potentiel zéta de complexes hydrotalcite/ADN au rapport massique de 0,5. Dans ce cas, le potentiel zéta est de - 41 mV. La charge de surface a donc été modifiée et est à présent globalement anionique, ce qui indique que les molécules d'ADN anioniques se sont associées sur la surface de l'hydrotalcite modifiant ainsi sa charge de surface.
Exemple 2 : Mise en évidence de l'association entre l'ADN et les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que I'hydrotalcite Le but de cet exemple est de montrer que les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite s'associent avec l'ADN.
Des isothermes d'adsorption sont réalisées en mélangeant des quantités croissantes d'hydrotalcite avec une quantité constante d'ADN. Les mélanges hydrotalcite/ADN
sont préparés par mélange équivolumétrique d'une solution contenant l'ADN et d'une solution contenant l'hydrotalcite. L'ensemble de ces mélanges est ensuite ultracentrifugé à 50000 tour/minute pendant 10 minutes (Ultracentrifugeuse Beckman TL100). Le graphique de la figure 5 indique que la quantité d'ADN
présente dans le surnageant diminue progressivement avec l'augmentation du rapport massique hydrotalcite/ADN. A un rapport hydrotalcite/ADN de 50 poids/poids, il n'y a plus d'ADN présent dans le surnageant. Ceci indique que toutes les molécules d'ADN sont associées avec l'hydrotalcite et se trouvent dans le culot après ultracentrifugation. Le même phénomène a été observé à trois concentrations d'ADN
différentes : 20, 50 et 100 ~.g d'ADN/ml. Par conséquent, on peut en déduire qu'il y a bien association entre l'hydrotalcite et l'ADN. ' Exemple 3 : Protection de l'ADN vis-à-vis des dégradations causées par les nucléases Le but de cet exemple est de montrer que l'ADN est protégé vis-à-vis des dégradations enzymatiques lorsqu'il est associé à une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite.
Des échantillons d'ADN nu et d'ADN formulé avec l'hydrotalcite ont été soumis au test de résistance aux dégradations causées par les nucléases. Pour cela, les échantillons ont été incubés avec un prélèvement de liquide musculaire. La figure 6 indique que lorsque l'ADN est associé avec l'hydrotalcite à différents rapports massiques (colonnes « c », « d », « e » et « f »), il n'est pas dégradé par les nucléases puisqu'il est tout à fait possible d'observer une bande d'ADN sur le gel. Par contre, la colonne « b » qui rëprésente l'ADN nu non-associé avec l'hydrotalcite est totalement dégradé par les nucléases car au lieu d'avoir une bande d'ADN bien identifiée sur le gel, on observe une multitude de petits fragments qui migrent dans Ie gel.
Ainsi, lorsque l'ADN est associé avec les particules minérales d'hydrotalcite, il est protégé de l'action de dégradation des nucléases, par opposition à l'ADN nu qui est rapidement dégradé. Cette propriété conférée par les particules minérales ayant une structure à feuillets échangeables telle que l'hydrotalcite est trés intéressante car une plus grande quantité d'ADN peut ainsi atteindre le noyau des cellules pour y être transcrit, avec les conséquences bénéfiques que cela implique en terme d'efficacité de transfection.
Exemple 4 : Transfection in vivo de complexes hydrotalcite l ADN
a) Injections Les injections ont été réalisées en bilatéral dans le muscle tibial cranial des souris à
raison de 25 ~,l /muscle, soit 4 ~g d'ADN/muscle.
Les animaux sont anesthésiés avec 250 ~l de Ketamine/Xylazine par voie intrapéritonéale (3,9 ml d'imalgène 1000, 0,6 ml Rompun à 2%, et 40,5 ml d'une solution de chlorure de sodium NaCI à 150 mM). Ensuite, les animaux sont rasés et inj ectés au niveau des deux muscles tibial cranial.
b) Prélèvement des muscles IO Les muscles tibial cranial sont repris 6 jours post-injection dans I ml de tampon de lyse/muscle (Lysis Buffer de Promega E) supplementé par des inhibiteurs de protéase (coktail tablets - Boehringer). Les muscles sont prélevés dans les tubes spéciaux de chez BIOl Ol et conservés à -20°C, avant broyage et lecture.
ç) Extraction de la luciférase exprimée par les cellules musculaires L'extraction de la luciférase est réalisée avec un appareil « Fastprep machine » dans des conditions d'extraction utilisant 1 ml de tampon de lyse par tube à une vitesse de 6,5 m/s, pendant 30 secondes. Les tubes sont ensuite mis dans la glace et centrifugés à
12000 g pendant I O minutes à 4°C.
d) Détermination de l'activité luciférase L'activité luciférase est mesurée en utilisant un kit de test de luciférase (Promega) et un luminomètre Dynex MLX. La lecture de cette activité est mesurée en RLU
(« Relative Light Unit » : Unité de Lumière Relative).
e) transfection i~z vivo dans le muscle Les résultats du transfert de gène in vivo dans le muscle sont représentés à
la figure 7.
Ces résultats indiquent qu'au rapport massique hydrotalcite/ADN de 0,5 une augmentation de l'activité Iuciférase d'un facteur 14 est obtenu par rapport à
l'ADN
nu. Plus généralement, les compositions ADNlhydrotalcite présentent une efficacité
de transfection améliorée par rapport à celle obtenue par injection d'ADN nu. 6 Preferably, the compositions according to the present invention comprise at least minus one nucleic acid and the hydrotalcite of formula Mg6AlZC03 (OH) I6.4H20.
The mineral particles having a structure with exchangeable sheets according to the present invention are either commercial, or they can be prepared according to methods which are similar to known methods known as "soft chemistry".
In particular, the preparation of the mineral particles according to the invention can be based on the controlled precipitation of aqueous solutions or suspensions containing at the times the metal cations intended to take place in the frame hydroxylated and the anions intended to occupy the interlamellar domains. In these conditions there are simultaneously construction of the interlamellar domains made up of anions and of water molecules, and sheet. The nature and texture of the phases obtained are strongly dependent on operating conditions (temperature, speed addition and concentration of reagents, pH control), but also of the geometry of the reactor and the state of prior association of metal cations in the reactants (existence oligomers). The preparation process ultimately always boils down to bring into presence, at adequate concentration and reactivity, the species leading to construction of mineral particles under optimal conditions. These conditions are determined on a case-by-case basis according to the classical method of trial and error.
For the purposes of the invention, the term “nucleic acid” is understood to mean both an acid deoxyribonucleic than a ribonucleic acid. It can be sequences natural or artificial, and in particular genomic DNA (gDNA), complementary DNA
(CDNA), messenger RNA (mRNA), transfer RNA (tRNA), ribosomal RNA
(RRNA), hybrid sequences or synthetic or semi-sequences synthetic, modified or unmodified oligonucleotides. These nucleic acids can be by example of human, animal, plant, bacterial or viral origin. They can be obtained by any technique known to a person skilled in the art, and in particular by screening for banks, by chemical synthesis, or by mixed methods including chemical or enzymatic modification of sequences obtained by screening for banks. They can be chemically modified.
As regards more particularly deoxyribonucleic acids, they can be single or double stranded or short oligonucleotides or of longer sequences. In particular, the nucleic acids are advantageously constituted for example by plasmids, vectors, episomes or cassettes of expression. These deoxyribonucleic acids can in particular carry a origin of functional replication or not in the target cell, one or more Genoa markers, regulatory sequences for transcription or replication, genes of therapeutic interest, antisense sequences modified or not or more regions of binding to other cellular components.
Preferably, said nucleic acid has a size greater than 1000 base pairs. Even more preferably it has a size between around 1,000 base pairs and around 2,000,000 base pairs (2 Mb), about 1000 base pairs and approximately 100,000 base pairs (100 kb), and approximately base pairs and approximately 20,000 base pairs (20 kb).
Advantageously, the nucleic acid comprises one or more genes of therapeutic interest under the control of regulatory sequences, for example one or several promoters and a transcriptional terminator active in the target cells.
Within the meaning of the invention, the term gene of therapeutic interest in particular any gene encoding a protein product having a therapeutic effect. The product protein thus encoded can be in particular a protein or a peptide. This product protein can be exogenous homologous or endogenous towards the cell target, i.e. a product which is normally expressed in the target cell when this one presents no pathology. In this case, the expression of a protein allows for example to compensate for an insufficient expression in the cell or (expression of an inactive or weakly active protein due to a modification, or to overexpress said protein. The gene of therapeutic interest can also code for a mutant of a cellular protein having for example a stability increased or a modified activity. The protein product can also be heterologous Visa screw of the target cell. In this case, an expressed protein can for example complete or bring a deficient activity in the cell, allowing it to fight against a pathology, or stimulate an immune response.
Among the therapeutic products within the meaning of the present invention, one can more particularly mention enzymes, blood derivatives, hormones, the lymphokines (e.g. interleukins, interferons or TNF: see FR 92/03120), growth factors, neurotransmitters or their precursors or synthetic enzymes, trophic factors (e.g. BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, VEGF, NT3, NTS or HARP / pleiotrophin), apolipoproteins (for example ApoAI, ApoAIV or ApoE: see FR 93/05125), dystrophin or a minidystrophin (FR 91/11947), the CFTR protein associated with the cystic fibrosis, tumor suppressor genes (e.g. p53, Rb, RaplA, IS DCC or k-rev: see FR 93/04745), the genes coding for factors involved in coagulation (Factors VII, VIII, IX), the genes involved in the repair of DNA, suicide genes (thymidine kinase, cytosine deaminase), genes for hemoglobin or other protein transporters, enzymes of metabolism or catabolism.
The nucleic acid of therapeutic interest can also be a gene or a antisense sequence, the expression of which in the target cell makes it possible to control gene expression or transcription of cellular mRNAs. Such sequences can, for example, be transcribed in the target cell into RNA
complementary of cellular mRNAs and thus block their translation into protein, depending on the technical described in patent EP 140 308. The therapeutic genes include also sequences coding for ribozymes, which are capable of destroying selectively target RNAs (EP 321,201).
As indicated above, the nucleic acid may also contain one or several genes coding for an antigenic peptide capable of generating in (man or the animal an immune response. In this particular mode of implementation artwork, (invention allows the realization either of vaccines or of treatments immunotherapeutics applied to humans or animals, especially against microorganisms, viruses or cancers. these may include peptides specific antigens of the Epstein Barr virus, of the HIV virus, of the hepatitis B (EP 1 ~ 5,573), of the pseudo-rabies virus, of the "syncitia forming virus", other viruses or also tumor-specific antigenic peptides (EP 259,212).
As indicated above, (nucleic acid preferably comprises also sequences allowing the expression of the gene of interest therapeutic and / or of the gene encoding the antigenic peptide in the desired cell or organ.
he can these are the sequences which are naturally responsible for the expression of the uncomfortable considered when these sequences are likely to function in the cell infected. It can also be sequences of different origin (responsible for (expression of other proteins, or even synthetic). In particular, it can to be promoter sequences of eukaryotic or viral genes. For example, it can to be promoter sequences from the genome of the cell to be infected.
Of even, they may be promoter sequences originating from the genome of a virus. AT
this regard may be made, for example, to promoters of the EIA, MLP, CMV, RSV genes or HSV. In addition, these expression sequences can be modified for example through addition of activation or regulation sequences. It can also be promoters inducible or repressible.
Furthermore, (nucleic acid can also comprise, in particular in upstream of the gene of therapeutic interest, a signal sequence directing the product therapeutic synthesized in secretory pathways of the target cell.
This sequence signal may be the natural signal sequence of the drug, but he can also be any other functional signal sequence, or a sequence artificial signal. The nucleic acid can also have a sequence signal directing the synthesized therapeutic product to a particular compartment of the cell.
The compositions according to the present invention can be prepared by mixture of an aqueous solution containing a mineral particle having a structure 5 with exchangeable sheets and a solution containing the nucleic acids.
More specifically, the compositions according to the present invention can be prepared in putting the mineral particles having a structure with exchangeable sheets in aqueous solution at a pH close to neutral ~ (for example between 6 and 8, and more preferably between 6.5 and 7.5), then adding the aqueous solution thus obtained 10 to a solution containing the nucleic acids or by adding the said solution containing the nucleic acids in the aqueous solution of mineral particles having a structure with exchangeable sheets. The solution containing the acids nucleic is preferably an isotonic solution in sodium chloride or in glucose.
Preferably, the mineral particles having a sheet structure exchangeable and the nucleic acids are introduced into the composition in amounts such that the mass ratio between the mineral particles having a structure at leaflets exchangeable and the nucleic acids is between 0.01 and 1000, from preference between 0.01 and 500, more preferably between 0.01 and 100, and even more preferably between 0.5 and 100. In any event, the quantities respective of each component can be easily adjusted and optimized by a person skilled in the art profession by the usual method of trial and error, depending on the particle mineral having a structure with exchangeable sheets used, of (acid nucleic acid, and researched applications (in particular of the cell type to be transfected).
A subject of the invention is also the compositions as defined above.
before for use as medicine.
The invention also relates to the use of compositions such as defined above for the transfer of nucleic acids into cells in in vitro, in vivo or ex vivo. More specifically, the present invention relates to the use of compositions as defined above for the preparation of a medicament intended to treat illnesses, especially illnesses that result from deficiency in one protein or nucleic acid product. The nucleic acid contained in said drug encodes said protein or nucleic acid product, or constitutes said product nucleic, suitable for correct said diseases in vivo or ex vivo. Said medicament may further be a vaccine and in this case the transfected nucleic acid induces a response immune.
For in vivo uses, for example in therapy or for the study of regulation of genes or the creation of animal models of pathologies, compositions according to the invention can be formulated for administration especially topically, skin, oral, rectal, vaginal, parenteral, intranasal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraocular, transdermal, intratracheal or intraperitoneal. Preferably, the compositions of the invention contain a pharmaceutically acceptable vehicle for a formulation injectable, in particular for direct injection into the desired organ, or for topical administration (on the skin and / or mucosa). he can act in particular of sterile, isotonic solutions, or dry compositions, especially freeze-dried, which, by addition as appropriate of sterilized water or serum physiological, allow the constitution of injectable solutions. In addition, the compositions according to the invention may contain one or more adjuvants conventionally used in pharmacy.
The doses of nucleic acids used for the injection as well as the number administrations can be adapted according to different parameters, and in particular depending on the mode of administration used, the pathology concerned, the gene to be expressed, or the duration of the treatment sought. In what relates more particularly to the mode of administration, it may be. is of a direct injection into the tissues, for example at the level of tumors, or into the paths circulatory, or treatment of cells in culture followed by their relocation ih vivo, by injection or graft. The fabrics concerned in the context of the present invention are for example the muscles, the skin, the brain, the lungs, the liver, the spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bones, cartilages, the pancreas, kidneys, bladder, stomach, intestines, testes, ovaries, the rectum, nervous system, eyes, glands or connective tissue.
Another object of the present invention relates to a transfer method of nucleic acids in cells comprising the following steps (1) the formation of a composition comprising at least one nucleic acid and a mineral particle having a structure with exchangeable sheets such as defined previously, and (2) bringing the cells into contact with the composition formed in (1).
More particularly, the present invention relates to a method of therapeutic treatment of the human or animal body comprising the steps following (1) the formation of a composition comprising at least one nucleic acid and a mineral particle having a structure with exchangeable sheets such as defined previously, and (2) bringing cells of the human or animal body into contact with the composition formed in (1).
Bringing the cells into contact with the composition according to the present invention can be carried out by incubating the cells with said composition or by injection composition in the body or part of the body. The incubation East preferably carried out in the presence of for example from 0.01 to 1000 ~ g of acid nucleic acid for 106 cells. For in vivo administration, doses acid nucleic acid ranging from 0.01 to 10 mg can for example be used.
The compositions of the invention may also contain one or more pharmaceutically acceptable adjuvants. In this case, the adjuvant (s) are previously mixed with the aqueous solution containing the mineral particle having a structure with exchangeable sheets according to (invention and / or solution acid (s) nucleic acid (s).
The present invention thus provides a particularly method advantageous for the transfer of nucleic acids, in particular for the Treatment of diseases, including ifa vivo or ex vivo administration of a nucleic acid coding for a protein or which can be transcribed into a nucleic acid capable of correct said disease, said nucleic acid being associated with a mineral particle having a exchangeable sheet structure as defined previously in the conditions defined above.
The compositions according to the present invention are particularly useful for the transfer of nucleic acids into primary cells or into established lines.
It can be for example fibroblastic, muscular, nervous cells (neurons, astrocytes, glial cells), hepatic, hematopoietic (by example the lymphocytes, CD34, or dendritic) or epithelial, in differentiated form or pluripotent (precursors).
In addition to the foregoing arrangements, the present invention includes also other characteristics and advantages which will emerge from the examples and figures which follow, and which should be regarded as illustrating the invention without limit the scope.
FIGURES
Fi _ r ~ idealized structure of mineral particles having a structure leaflets exchangeable (double lamellar hydroxides) according to the present invention.
Fi vre 2: schematic representation of the hydrotalcite Mg6A12C03 (OH) i6.4H ~ 0.
Fi .. u ~ re 3 _ measurement of the zeta potential of hydrotalcite particles alone in solution.
Fore 4: measurement of the zeta potential of compositions containing particles hydrotalcite and DNA in a mass ratio of 0.5.
Thread: Measurement of the percentage of DNA remaining in the supernatant by reference to the initial amount of DNA introduced, depending on the mass ratio hydrotalcite / DNA. Measurements were made for three concentrations different of DNA introduced: 20 p, g of DNA / ml, 50 pg of DNA / ml, and 100 pg of DNA / ml.
Figure 6: Electrophoresis on agarose gel of different DNA formulations.
The column "a" constitutes the control (DNA not formulated and not subject to nucleases), column “b” represents the unformulated DNA subjected to nucleases, and the columns “C” to “f” represent hydrotalcite / DNA compositions at ratios mass 0.125 or 0.25 or 0.5 or 1 which are subjected to nucleases.
Fi re 7: visualization in the form of a histogram of the transfer efficiency gene in vivo (by injection into the cranial tibial muscle of mice) compositions DNA / hydrotalcite in different mass ratios, compared to the injection naked DNA.
Fi re 8: Schematic representation of the plasmid pXL3031 used in the DNA transfer experiments in cells EXAMPLES
Mice used The mice used in the in vivo gene transfer experiments are mouses 5 C57B16 females 8 weeks old, divided into 9 groups of 12 mice.
Mineral particle according to the invention used the mineral particle having a structure with exchangeable sheets used in the different tests is hydrotalcite in aqueous solution at a concentration of 20 g / 1 and at pH 7. This hydrotalcite is sold by the company Süd-Chemie AG
10 (Germany).
DNA
The plasmid used is pXL3031 which contains the luc gene coding for the luciferase under the control of the cytomegalovirus P / E CMV promoter, represented in the figure 8. His size is 3671 bp. The plasmid solution used contains 320 pg DNA / ml in 15 150 mM sodium chloride (NaCl) solution.
Hydrotalcite / DNA complexes The complexes are prepared by equivolumetric mixing of two solutions:
Moon containing hydrotalcite and the other plasmid DNA.
EXAMPLE I Measurement of the Zeta Potentials of Hydrotalcite Alone and of the Complexes DNA / hydrotalcite The purpose of this example is to show that DNA is able to associate with a mineral particle having a structure with exchangeable sheets such as hydrotalcite.
The measurement of the zeta potential provides information on the nature of the surface charge of a particle placed in a liquid. Zeta potential is not a measure direct from the surface charge but is the potential that exists around the particle when that this moves in a solution when it is subjected to a field electric. Through therefore if the particles have a positive surface charge, the potential zeta, which is the only measurable quantity, will also be positive. Zeta potential play a role determining in the colloidal stability of the particles in solution. Indeed, when the zeta potential is strongly positive or negative, the particles do not aggregate not because forces of electrostatic repulsion keep them isolated. On the other hand, the particles which have a zeta potential close to zero are not stable because the Van Der Waals forces attract particles and make them precipitate.
The zeta potential of hydrotalcite and hydrotalcite / DNA complexes has been measured by a Coulter brand zetameter (Delsa 440 SX). Hydrotalcite solution contained 0.15 mg hydrotalcite / ml in sodium chloride solution (NaCI) to 20 mM, i.e. a conductivity of 2.3 mS / cm. The hydrotalcite / DNA complexes have summer prepared at concentrations of 250 ~ g DNA / ml in a chloride solution of sodium (NaCI) at 20 mM, at a mass ratio of 0.5. The measurement has been made in applying an electric field of 1.5 mA for 60 seconds.
Figure 3 shows the zeta potential of hydrotalcite alone before being mixed with DNA. This zeta potential is + 32 mV and therefore indicates a charge in area broadly cationic, which is consistent with the structure and composition of hydrotalcite (see Figures 1 and 2). Figure 4 shows the zeta potential of hydrotalcite / DNA complexes with a mass ratio of 0.5. In this case, the potential zeta is - 41 mV. The surface charge has therefore been changed and is now globally anionic, indicating that the anionic DNA molecules are associated on the surface of the hydrotalcite thus modifying its charge of area.
EXAMPLE 2 Demonstration of the Association Between DNA and Particles mineral having a structure with exchangeable sheets such as Hydrotalcite The purpose of this example is to show that mineral particles having a structure with exchangeable sheets such as hydrotalcite associate with DNA.
Adsorption isotherms are produced by mixing quantities growing hydrotalcite with a constant amount of DNA. Mixtures hydrotalcite / DNA
are prepared by equivolumetric mixing of a solution containing DNA and of a solution containing hydrotalcite. All of these mixtures are then ultracentrifuge at 50,000 rpm for 10 minutes (Ultracentrifuge Beckman TL100). The graph in Figure 5 indicates that the amount of DNA
present in the supernatant gradually decreases with increasing report mass hydrotalcite / DNA. At a hydrotalcite / DNA ratio of 50 w / w, it there has more DNA present in the supernatant. This indicates that all of the molecules DNA are associated with hydrotalcite and are found in the pellet after ultracentrifugation. The same phenomenon was observed at three concentrations DNA
different: 20, 50 and 100 ~ .g of DNA / ml. Therefore, we can deduce that there is good association between hydrotalcite and DNA. '' Example 3 Protection of DNA against Damage Caused by nucleases The purpose of this example is to show that DNA is protected against enzymatic degradations when associated with a mineral particle having a exchangeable sheet structure such as hydrotalcite.
Bare DNA and DNA formulated with hydrotalcite were submitted at test for resistance to degradation caused by nucleases. For this, the samples were incubated with a sample of muscle fluid. The figure 6 indicates that when DNA is associated with hydrotalcite to different reports mass (columns “c”, “d”, “e” and “f”), it is not degraded by nucleases since it is quite possible to observe a DNA band on the gel. Through against the column “b” which represents the naked DNA not associated with the hydrotalcite is totally degraded by nucleases because instead of having a well identified DNA band on the gel, a multitude of small fragments are observed which migrate in the gel.
So when DNA is associated with the hydrotalcite mineral particles, he is protected from nuclease degrading action, as opposed to naked DNA
who is quickly degraded. This property conferred by mineral particles having a exchangeable sheet structure such as hydrotalcite is very interesting because a more DNA can reach the nucleus of cells to be transcribed, with the beneficial consequences that this implies in terms efficiency of transfection.
EXAMPLE 4 In Vivo Transfection of DNA Hydrotalcite Complexes a) Injections The injections were performed bilaterally in the cranial tibial muscle mice to 25 ~ l / muscle, i.e. 4 ~ g DNA / muscle.
The animals are anesthetized with 250 ~ l of Ketamine / Xylazine per route intraperitoneally (3.9 ml imalgene 1000, 0.6 ml 2% Rompun, and 40.5 ml of a 150 mM NaCl solution of sodium chloride). Then the animals are shaved and injected into the two cranial tibial muscles.
b) Removal of muscles IO The cranial tibial muscles are taken up 6 days post-injection in I ml of stamp of lysis / muscle (Lysis Buffer from Promega E) supplemented with inhibitors protease (coktail tablets - Boehringer). Muscles are taken from the tubes specials of at BIOl Ol and stored at -20 ° C, before grinding and reading.
ç) Extraction of luciferase expressed by muscle cells Luciferase extraction is carried out with a “Fastprep machine”
" in extraction conditions using 1 ml of lysis buffer per tube at one speed of 6.5 m / s, for 30 seconds. The tubes are then put in ice and centrifuged at 12000 g for 10 minutes at 4 ° C.
d) Determination of luciferase activity Luciferase activity is measured using a luciferase test kit (Promega) and a Dynex MLX luminometer. The reading of this activity is measured in RLU
(“Relative Light Unit”: Relative Light Unit).
e) transfection i ~ z vivo in the muscle The results of in vivo gene transfer into muscle are shown in Figure 7.
These results indicate that at the hydrotalcite / DNA mass ratio of 0.5 a Iuciferase activity increased by a factor of 14 is obtained compared to DNA
bare. More generally, the DNA hydrotalcite compositions have a efficiency transfection improved compared to that obtained by injection of naked DNA.
Claims (30)
1000 paires de bases et une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables. 2. Composition comprising at least one nucleic acid having a size better than 1000 base pairs and a mineral particle having a sheet structure exchangeable.
dans laquelle M II représente un cation métallique divalent, M III représente un cation métallique trivalent, X m- représente un anion interfoliaire et m est un entier supérieur ou égal à 1, x est compris entre 0 et 1 strictement, et n est strictement supérieur à 0. 5. Composition according to one of claims 1 to 4 characterized in that said mineral particle having an exchangeable sheet structure has the formula general:
wherein M II represents a divalent metal cation, M III represents a cation trivalent metal, X m- represents an interlayer anion and m is a upper integer or equal to 1, x is between 0 and 1 strictly, and n is strictly greater than 0.
1, 2, 3, 4, 5 ou 6. 12. Composition according to claim 5, characterized in that m is equal to 1, 2, 3, 4, 5 or 6.
26 pour la préparation d'un médicament destiné à la transfection de cellules. 27. Use of a composition as defined in any of the claims 1 to 26 for the preparation of a drug intended for the transfection of cells.
(1) la formation d'une composition comprenant au moins un acide nucléique une particule minérale ayant une structure à feuillets échangeables telle que définie dans l'une des revendications 1 à 26, et (2) la mise en contact des cellules avec la composition formée en (1). 30. Method for transferring nucleic acids into cells in vitro or ex long live including the following steps:
(1) forming a composition comprising at least one nucleic acid a mineral particle having an exchangeable sheet structure such as defined in one of claims 1 to 26, and (2) contacting the cells with the composition formed in (1).
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