【発明の詳細な説明】
粒状組成物
本発明は、微生物の細胞標的部位に、抗微生物的な活性のある蛋白を運搬する
組成物に関する。特に、本発明は、標的部位に運搬される、無機多孔性担体粒子
に蛋白が吸着されている組成物に関する。
一方が他方の基質を産生し、ポリエチレンイミンのような合成ポリマーに共有
結合を通じて結合されている酵素の組み合わせを、標的部位と結合可能な抗体又
は抗体フラグメントによって、標的部位に運搬することは周知である。このよう
な試みは、例えば、欧州特許公開第０４５０８００号公報、及び欧州特許公開第
０４５１９７２号公報（ユニリーバ（Unilever））に記載されており、口腔ミク
ロフローラを攻撃するための特定の使用の製品が開示されている。酵素の化学的
カップリングは、毒性であるかもしれない試薬を使用することを含み、口腔での
使用を意図した製品にはそれらを除去する工程を行う必要がある。
欧州特許公開第０５６６３６８号公報（ユニリーバ）は、皮膚及び／又は髪の
標的部位に、美容上効果的で有益な薬物を運搬するための化粧組成物を記載して
いる。この組成物は、有益な薬物を含み、標的部位の有機表面に結合する手段を
有する粒子を含む。開示されている適する粒子は、ポリシアノアクリレートのよ
うな合成重合体又はアルブミン又はゼラチンのような蛋白から製造されている。
開示され、実施されている好ましい粒子は、有益な薬物が封入されているリポゾ
ームである。
国際公開第９３／０５８１５号から、無機粒子（特に生物分解可能な金属酸化
物又は塩）に、細胞結合成分、すなわち、特定の細胞のタイプのための標的分子
、及び核酸を付加することによって、細胞を核酸の標的にすることが周知である
。
ベルギー特許第８４４６５７号は、種々の生物的活性のある分子を可逆的に結
合したアミノ化されたポリサッカライドで被覆された、シリカのような多孔性無
機粒子を開示している。この粒子は、このような分子を精製するために、クロマ
トグラフィーのような工程において使用され得る。
類似の物質が特開昭６３−０３１５３８号公報に開示されている。ポリエチレ
ンイミンのようなカチオン性ポリマーが、コーティングとして使用されている。
この場合、結合は、不可逆的であるとされている。
微生物細胞の標的部位に結合することが可能な、陽電荷の無機多孔性担体粒子
に吸着された抗微生物活性のある蛋白が、高い親和性及び特異性で標的部位に効
率的に運搬され得ることが発見された。従って、標的部位における抗微生物活性
のある蛋白の保持及び作用の延長が達成され得る。さらに、蛋白を粒子担体へ吸
着することによって、化学的なカップリング反応の必要を避けることが可能であ
り、容易にスケールアップすることが可能な簡単な製造方法を導くことができる
。
第一の観点に鑑みて、本発明は、一つ以上の抗微生物活性のある蛋白が吸着さ
れている、陽電荷の多孔性無機担体粒子を含む組成物を提供する。
第二の観点に鑑みて、本発明は、第一の観点の組成物を標的に適用し、微生物
細胞を阻害又は殺傷することを含む、抗微生物活性のある蛋白を微生物細胞標的
へ運搬するための方法を提供する。
更なる観点では、本発明は、多孔性無機担体粒子に陽電荷を荷し、多孔性無機
担体粒子上に一つ以上の抗微生物活性のある蛋白を吸着させることを含む、本発
明の第一の観点の組成物の製造方法を提供する。
本発明に使用するのに適する多孔性無機粒子は、クロスフィールド（Cros-fie
ld）、Ｗ−Ｒ グレース（Grace）、又は、ローヌ プーラン（RhonePoulenc）
から入手可能なシリカ、及びクロスフィールドから市販されていて入手可能であ
るようなハイドロタルサイトを含む。多孔性粒子は、蛋白の分子サイズに適する
孔径を有すると都合がよい。例えば、蛋白が大きな酵素である場合、平均孔径は
好ましくは、２０ｎｍ、より好ましくは５０ｎｍよりも大きい孔が十分に存在す
るようにしなければならない。孔径は、好ましくは２００ｎｍより小さいが、し
かし、技術的にはより大きい孔を使用することが可能である。シリカに類似する
特性を有する他の多孔性無機物質も使用し得る。多孔構造を有する担体物質を使
用する利点は、有益な薬物を大量に担持させることが可能な広い内表面を有する
ことである。
陽電荷の無機（例えば、シリカ）粒子は、陰電荷のシリカ粒子の表面に、陽電
荷のリガンドを物理的に吸着することによって製造され得る。使用し得る適する
陽電荷リガンドは、ポリエチレンイミン又はポリリジンのような有機ポリマー、
及びＡｌ3+及びＭｇ2+のような金属イオンを含む。クロスフィールドからマクロ
ーブ（Macrosorb）の商品名で市販されていて入手可能な多孔性ハイドロタルサ
イトは、本質的にアルミニウム及びマグネシウムイオンを含み、従って、本質的
に陽電荷である。従って、このような担体粒子は、使用の前に、特に荷電したリ
ガンドでさらに誘導体化する必要がないので、本発明において特に有用である。
本発明の目的に鑑みて、「抗微生物活性のある蛋白」という文言は、微生物を
殺傷するか、又は生長又は増殖を阻害するような方法で微生物に直接作用するよ
うな、それ自体が抗微生物活性である蛋白か、又は微生物又はその環境に存在す
る他の化合物と反応して、直接又は間接的に上記の活性のいずれかを有する化合
物を産生する蛋白のいずれかをいう。
従って、担体粒子に吸着される抗微生物活性のある蛋白は、それ自体が抗微生
物活性である酵素を一つ以上含むか、又は、抗微生物活性のある分子を生成する
のに適する基質を組み合わて含むことが好ましい。種々のオキシダーゼ及びペル
オキシダーゼ、プロテアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼなどがその例である。
特に、オキシダーゼは、細胞毒性のある薬物として機能し得る。グルコールオキ
シダーゼ及びガラクトースオキシダーゼのようなオキシダーゼは、細胞毒である
過酸化水素を産生する。ペルオキシダーゼは、基質として、過酸化水素を使用し
てさらにより細胞毒性のあるハイポハライト（hypohalite）を形成する。これら
のオキシダーゼと結合して使用するのに適し得る、市販されていて入手可能なペ
ルオキシドは、セイヨウワサビペルオキシダーゼ及びラクトペルオキシダーゼを
含む。他の適するペルオキシダーゼは、クロロペルオキシダーゼである。過酸化
水素及びハイポハライドは両方とも、生体内で迅速に分解されるが、本発明によ
って意図された活性部位に効率的に運搬され得るため、活性を有する。
本発明の組成物は、例えば、微生物細胞の近辺に存在する基質を、抗微生物活
性のある酵素によって使用し得る基質へと変換することによって、抗微生物活性
のある酵素の作用を補助する他の酵素をも含む。このような他の酵素も又、好ま
しくは担体粒子に吸着される。このような他の酵素の例は、以下に概要を示すよ
うに、インベルターゼである。
本発明の組成物は、口腔ケア活性のある薬物として抗微生物剤の運搬に有用に
使用され得る。特に、本発明の一つの試みは、口腔ケア活性のある薬物、特に歯
垢中の微生物種に対して、上記のような酸化酵素を運搬することに係る。適する
標的微生物は、ストレプトコッカス ミュータンス（Streptococcus mutans）及
びエス．サングイス（S．sanguis）である。
粒子は、酵素の基質の一部又は全てを運搬するか、又は酵素の基質の一部又は
一部が標的部位に存在し得る。例えば、グルコースオキシダーゼが使用され、意
図された標的微生物が口腔内に存在する場合、食用のグルコースが酵素の基質と
され得るか、又は粒子はグルコースを組み込み得る。任意選択的に、粒子はスク
ロースをグルコースへ転換するインベルターゼを組み込み得る。
他の酵素は、環境、例えば、歯垢のｐＨを、微生物が生長するのに適さない又
はあまり適さないレベルへ変化させ得る。従って、特定の酵素は、歯垢中の微生
物の生長に適さないレベルへｐＨを上昇させることが可能である。一つの例は、
ウレアーゼであって、尿素をアンモニア及び二酸化炭素へ変換する。
本発明のさらに好ましい実施態様において、標的は、一般家庭装置の表面に存
在する微生物である。このような微生物の例は、エス．アウレウス（S.aureus）
、ピー．アエルギノサ（P．aeruginosa）及びイー コリ（E．coli）を含む。こ
の適用において使用するのに適する有益な薬物は、セイヨウワサビペルオキシダ
ーゼ、ラクトペルオキシダーゼ、又はバナジウムクロロペルオキシダーゼのよう
な酵素を含む。
本発明は、上記の種々の適用のみに制限されることはない。
本発明の組成物は、適用及び適用部位での分布を促進するために、好ましくは
、粒子の希釈剤、分散剤、又は担体として作用する媒体を含む。媒体の選択は、
組成物を適用する方法及び適用部位に依る。例えば、口腔内への適用では、媒体
は口腔内での局所的使用に許容可能でなければならない。従来の、美容上許容可
能な媒体は、当業者に周知であり、そして水又は液性又は固体のエモリエント、
溶剤、湿潤剤、増粘剤及び粉末のような物質を含み得る。
組成物が、口内（歯科）での適用を意図される場合、美容上許容可能な媒体は
、市販されていて入手可能な媒体を、組成物の重量をベースにして、一般に１０
乃至９９．９％、好ましくは５０乃至９９．９％である。口腔での使用を意図さ
れた本発明の組成物は、洗口液、歯磨粉、又はトローチとして簡便に配合され得
る。任意選択的に、本発明の組成物は、固体又は半固体で有り得、例えば、適す
るアプリケーターと共に使用するスティック、クリーム又はゲルであり得る。
本発明の組成物中の抗微生物活性のある蛋白の割合は、意図された適用によっ
て変化する。典型的には、有益な薬剤は、粒子の０．０１重量％乃至１０重量％
で付与される。一般に、有益な薬剤は、組成物の０．００５重量％乃至１．５重
量％で付与される。
本発明の組成物は、意図された適用によって、一般に、当技術分野に周知の種
々の他の成分を含み得る。歯磨粉の場合、通常の磨き剤のような成分を含み得る
。多くの組成物は、表面活性又は洗浄剤活性のある成分を含み得る。歯磨粉及び
他の口腔ケアのための組成物は、一般に、適するフレーバー、特にミント又はメ
ントール様のフレーバーを含み得る。
実施例
以下の実施例は、例示のために示される。
Ｉ）ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）によるシリカの誘導体化
多孔性シリカ粒子の２つのサンプル、ＳＤ１４９７（＝Gasil ２３ＤＰ）粒径
５μｍ）平均孔径約２２ｎｍ）及びＳＤ１４９８（粒径４μｍ、平均孔径約８０
ｎｍ、国際公開第９４／１１３０２号に従って調製された広い孔のシリカ）をク
ロスフィールドから入手した。各サンプルを、室温においてポリエチレンイミン
（ＰＥＩ）（シグマ（Sigma））の０．２％溶液中で一晩回転させることによっ
て誘導体化した。誘導体化されたシリカは、遠心分離によって分離され、次に１
０ｍＭトリス（ｐＨ８）で３回洗浄された。
II）グルコースオキシダーゼ酵素の粒子への吸着
６つの異なる粒子、すなわち、ＰＥＩで誘導体化されたＳＤ１４９７及びＳＤ
１４９８、誘導体化されていないＳＤ１４９７及びＳＤ１４９８、マクロソーブ
ＣＴ１００（粒径３．７μｍ、平均孔径３０ｎｍ）、及びマクロソーブ
ＣＴ２０００（粒径４μｍ、平均孔径１０ｎｍ）を調査した。各々のこれらの粒
子の１２．５％スラリーの０．５ｍｌの部分（粒子の総質量＝６２．５ｍｇ）を
、１０ｍＭのトリス（ｐＨ８）中に調整した４ｍｇのグルコースオキシダーゼ酵
素と混合した。混合物の総体積は２ｍｌであった。混合物を室温で一晩静かに回
転させた。次に粒子を遠心分離によって分離した。上清中に残った酵素の量は、
０．２μｍフィルターを通して濾過した後に、分光測光的に測定した。この値は
、粒子に吸着された酵素の量を推定するために、添加した酵素の量から引かれた
。
陰電荷表面の全ての粒子は、グルコースオキシダーゼと結合した。ＰＥＩで誘
導体化されたＳＤ１４９８は、最も高い能力を有した（固体１ｇ当たり８８ｍｇ
の酵素）。誘導体化されていないシリカのいずれもが、グルコースオキシダーゼ
と結合しなかった（第１図を参照のこと）。
III）インベルターゼ及びグルコースオキシダーゼのマクロソーブ粒子への吸着
１２.５％スラリーのマクロソーブ（ＣＴ１００）を、１０ｍＭトリス（ｐＨ
８）中に調製した。このスラリーの０．５ｍｌの部分（粒子の総質量＝６２．５
ｍｇ）をガラスバイアルに添加した。次にインベルターゼ（シグマ）をストック
溶液（５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭトリス（ｐＨ８）中）から添加した。０、０．１
ｍｇ、０．２ｍｇ、０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、及び５．０ｍｇ、すなわち、粒子
のｇ当たり、０、１．６ｍｇ、３．２ｍｇ、８ｍｇ、１６ｍｇ、及び８０ｍｇの
、異なる量のインベルターゼを各バイアルに添加した。各バイアルに１０ｍＭト
リス（ｐＨ８）を加えて１．５ｍｌにした。バイアルを４時間室温でゆっくりと
回転させた。次に粒子を遠心分離（２，０００ｒｐｍ、５分間）で分離した。上
清に残ったインベルターゼの量は、０.２μｍのフィルターを通じて濾過した後
に分光測光的に測定した。この値は、粒子に吸着された酵素の量を推定するため
に、添加した酵素の量から引かれた。
インベルターゼに感作された粒子を、２ｍｇのグルコースオキシダーゼ（粒子
１ｇ当たり３２ｍｇに相当）を含む、１０ｍＭのトリス１．５ｍｌ中に懸濁させ
た。チューブを室温で一晩回転させた。二重の酵素感作された粒子を遠心分離で
分離し、前記のように、吸着したグルコースオキシダーゼの量を測定した。粒子
は１０ｍＭトリス（ｐＨ８）で洗浄され、次に貯蔵された。
マクロソーブ粒子（ＣＴ１００）は、インベルターゼ及びグルコースオキシダ
ーゼの双方で誘導体化されることに成功した。インベルターゼのグルコースに対
する比は、二段階反応において、異なる量のインベルターゼ及び固定量のグルコ
ースオキシダーゼで感作されることによって効率的に制御された（第２図を参照
のこと）。
IV）ストレプトコッカス類（Streptococci）の、インベルターゼ及びグルコース オキシダーゼで誘導体化されたマクロソーブ粒子での殺傷
エス．サングイス細胞を一晩培養させ、培養汁を、リン酸緩衝された生理食塩
水（ＰＢＳ）（ｐＨ７）中で繰り返し遠心分離で洗浄し、最終的な反応混合物（
細胞＋粒子＋基質）が、初代培養細胞濃度を含有するように、ＰＢＳ（ｐＨ６．
５）中で再度懸濁させた。実施例IIIで得られた酵素を担持されたマクロソーブ
サンプルを、混合しながらエス．サングイス懸濁液へ添加し、０．５％の固体の
最終的な濃度へ合わせ、最後に、酵素の基質を添加した（９.６％スクロース、
１０ｍＭ ＫＩ、１０μｇ／ｍｌラクトペルオキシダーゼ）。基質の添加の直後
、生存数測定のために、時間０のサンプルを反応混合物から取り出した。さらに
、３７℃において、１、５、１０、２０及び３０分間のインキュベーションの後
にサンプルを取り出した。インキュベーションの間、マクロソーブ粒子の沈殿は
、規則的な撹拌によって防がれた。サンプルは、ＰＢＳ（ｐＨ６．５）の中の１
２ｍｇ／ｍｌ塩酸システインを含む冷却溶液中へ取り出された後、肉眼で見える
細胞を、Miles、 Misra及びIrwin法（A A Miles、S S Misra及びJ 0 Irwin、Journ
al of Hygiene １９３８、３８、７３７−４８）で数えた。
インベルターゼ及びグルコースオキシダーゼの両方でラベルされているマクロ
ソーブ粒子が、上記の基質系とともに存在すると、懸濁されたエス．サングイス
細胞の生存数の減少は迅速に起こった。細胞の生存数の８ｌｏｇの減少が、基質
のインキュベーションの５乃至１０分の間に観察された（第３図を参照のこと）
。最も多くのインベルターゼを担持させた粒子が、最も殺傷活性能力があるわけ
ではなく、これは、最大活性を達成させるためには、ＧＯｘとインベルターゼの
担持比のバランスが望ましいことを示す。The present invention relates to a composition for delivering a protein having antimicrobial activity to a cell target site of a microorganism. In particular, the present invention relates to compositions in which proteins are adsorbed to inorganic porous carrier particles that are delivered to a target site. It is well known that a combination of enzymes, one producing the other substrate and covalently attached to a synthetic polymer such as polyethyleneimine, is delivered to the target site by an antibody or antibody fragment capable of binding the target site. is there. Such attempts are described, for example, in EP 0 450 800 and EP 0 451 972 (Unilever), where products of particular use for attacking oral microflora are described. It has been disclosed. Chemical coupling of enzymes involves the use of reagents that may be toxic, and products intended for oral use require steps to remove them. EP 0 566 368 (Unilever) describes cosmetic compositions for delivering cosmetically effective and beneficial drugs to target sites on the skin and / or hair. The composition includes a particle that includes a beneficial agent and has a means for binding to the organic surface of the target site. Suitable particles disclosed are made from synthetic polymers such as polycyanoacrylate or proteins such as albumin or gelatin. A preferred particle disclosed and practiced is a liposome encapsulating a beneficial agent. From WO 93/05815, by adding, to inorganic particles (especially biodegradable metal oxides or salts), cell-binding components, ie target molecules for specific cell types, and nucleic acids, It is well known to target cells for nucleic acids. Belgian Patent 844,657 discloses porous inorganic particles, such as silica, coated with an aminated polysaccharide that reversibly binds various biologically active molecules. The particles can be used in a process such as chromatography to purify such a molecule. A similar substance is disclosed in JP-A-63-031538. Cationic polymers such as polyethyleneimine have been used as coatings. In this case, the coupling is said to be irreversible. A protein having antimicrobial activity adsorbed on positively charged inorganic porous carrier particles capable of binding to a target site of a microbial cell can be efficiently transported to the target site with high affinity and specificity. Was found. Thus, retention of the antimicrobial active protein at the target site and prolonged action can be achieved. Further, by adsorbing the protein to the particle carrier, it is possible to avoid the necessity of a chemical coupling reaction, and it is possible to derive a simple production method that can be easily scaled up. In view of the first aspect, the present invention provides a composition comprising positively charged porous inorganic carrier particles to which one or more proteins having antimicrobial activity have been adsorbed. In view of the second aspect, the present invention provides a method for delivering a protein having antimicrobial activity to a microbial cell target, comprising applying the composition of the first aspect to the target and including inhibiting or killing the microbial cell. To provide a way. In a further aspect, the invention relates to a first aspect of the invention, comprising loading a porous inorganic carrier particle with a positive charge and adsorbing one or more antimicrobial active proteins on the porous inorganic carrier particle. The present invention also provides a method for producing the composition. Porous inorganic particles suitable for use in the present invention are silica available from Crossfield, WR Grace, or RhonePoulenc, and commercially available from Crossfield. Including hydrotalcite as it is available. Conveniently, the porous particles have a pore size suitable for the molecular size of the protein. For example, if the protein is a large enzyme, the average pore size should preferably be sufficient to allow for pores larger than 20 nm, more preferably greater than 50 nm. The pore size is preferably smaller than 200 nm, but technically larger pores can be used. Other porous inorganic materials having properties similar to silica may also be used. An advantage of using a carrier material having a porous structure is that it has a large internal surface that can carry a large amount of a beneficial drug. Positively charged inorganic (eg, silica) particles can be produced by physically adsorbing a positively charged ligand to the surface of the negatively charged silica particles. Suitable positively charged ligands that can be used include organic polymers such as polyethyleneimine or polylysine, and metal ions such as Al3 + and Mg2 + . Porous hydrotalcite, commercially available from Crossfield under the trade name Macrosorb, contains essentially aluminum and magnesium ions and is therefore essentially positively charged. Thus, such carrier particles are particularly useful in the present invention as they do not need to be further derivatized prior to use, especially with charged ligands. For the purposes of the present invention, the phrase "protein having antimicrobial activity" refers to an antimicrobial agent that itself acts directly on the microorganism in such a way as to kill or inhibit growth or growth. Either a protein that is active or that reacts with a microorganism or other compound present in its environment to produce, either directly or indirectly, a compound having any of the above activities. Accordingly, the antimicrobial active protein adsorbed on the carrier particles may contain one or more enzymes that are themselves antimicrobial active, or may be combined with a suitable substrate to produce an antimicrobial active molecule. It is preferred to include. Various oxidases and peroxidases, proteases, glycosidases, lipases and the like are examples. In particular, oxidases can function as cytotoxic drugs. Oxidases such as glycol oxidase and galactose oxidase produce the cytotoxic hydrogen peroxide. Peroxidase uses hydrogen peroxide as a substrate to form even more cytotoxic hypohalite. Commercially available peroxides that may be suitable for use in conjunction with these oxidases include horseradish peroxidase and lactoperoxidase. Another suitable peroxidase is chloroperoxidase. Both hydrogen peroxide and hypohalides are active because they are rapidly degraded in vivo but can be efficiently transported to the active site contemplated by the present invention. The compositions of the present invention may be used to assist the action of antimicrobial active enzymes, for example, by converting a substrate present in the vicinity of a microbial cell into a substrate that can be used by the antimicrobial enzyme. Including enzymes. Such other enzymes are also preferably adsorbed on the carrier particles. An example of such another enzyme is invertase, as outlined below. The compositions of the present invention can be usefully used to deliver antimicrobial agents as oral care active drugs. In particular, one attempt of the present invention relates to delivering an oxidizing enzyme as described above to drugs having oral care activity, especially microbial species in plaque. Suitable target microorganisms are Streptococcus mutans and S. mutans. This is S. sanguis. The particles may carry some or all of the substrate for the enzyme, or some or part of the substrate for the enzyme may be present at the target site. For example, if glucose oxidase is used and the intended target microorganism is present in the oral cavity, edible glucose may be a substrate for the enzyme, or the particles may incorporate glucose. Optionally, the particles may incorporate invertase, which converts sucrose to glucose. Other enzymes can change the pH of the environment, such as plaque, to a level that is unsuitable or poorly suited for microbial growth. Thus, certain enzymes can raise the pH to a level unsuitable for the growth of microorganisms in plaque. One example is urease, which converts urea to ammonia and carbon dioxide. In a further preferred embodiment of the present invention, the target is a microorganism present on the surface of a household device. Examples of such microorganisms are described in S. aureus, p. Includes P. aeruginosa and E. coli. Beneficial drugs suitable for use in this application include enzymes such as horseradish peroxidase, lactoperoxidase, or vanadium chloroperoxidase. The invention is not limited to only the various applications described above. The compositions of the present invention preferably include a medium that acts as a diluent, dispersant, or carrier for the particles to facilitate application and distribution at the site of application. The choice of vehicle will depend on the method and site of application of the composition. For example, for intra-oral applications, the vehicle must be acceptable for topical use in the oral cavity. Conventional, cosmetically acceptable vehicles are well known to those skilled in the art and may include such materials as water or liquid or solid emollients, solvents, humectants, thickeners and powders. When the composition is intended for buccal (dental) applications, the cosmetically acceptable medium is generally 10 to 99.9, based on the weight of the composition, based on the commercially available medium and the available medium. %, Preferably 50 to 99.9%. Compositions of the invention intended for use in the oral cavity can be conveniently formulated as a mouthwash, toothpaste, or troche. Optionally, the compositions of the present invention can be solid or semi-solid, for example, a stick, cream or gel for use with a suitable applicator. The percentage of antimicrobial active protein in the compositions of the present invention will vary with the intended application. Typically, the beneficial agent is provided at 0.01% to 10% by weight of the particles. Generally, beneficial agents will be provided at from 0.005% to 1.5% by weight of the composition. The compositions of the present invention may, depending on the intended application, generally comprise various other ingredients, which are well known in the art. In the case of a toothpaste, it may contain ingredients such as a normal dentifrice. Many compositions may include surface active or detergent active ingredients. Compositions for toothpastes and other oral care can generally include suitable flavors, especially mint or menthol-like flavors. Examples The following examples are given by way of illustration. I) Derivatization of silica with polyethyleneimine (PEI) Two samples of porous silica particles, SD1497 (= Gasil 23DP) particle size 5 μm) average pore size about 22 nm) and SD1498 (particle size 4 μm, mean pore size about 80 nm, international) Wide pore silica prepared according to Publication No. 94/11302) was obtained from Crossfield. Each sample was derivatized by spinning overnight in a 0.2% solution of polyethyleneimine (PEI) (Sigma) at room temperature. The derivatized silica was separated by centrifugation and then washed three times with 10 mM Tris (pH 8). II) Adsorption of glucose oxidase enzyme on particles Six different particles: SD1497 and SD1498 derivatized with PEI, SD1497 and SD1498 underivatized, Macrosorb CT100 (3.7 μm particle size, average pore size 30 nm). , And Macrosorb CT2000 (particle size 4 μm, average pore size 10 nm). A 0.5 ml portion of a 12.5% slurry of each of these particles (total mass of particles = 62.5 mg) was mixed with 4 mg of glucose oxidase enzyme adjusted in 10 mM Tris (pH 8). The total volume of the mixture was 2 ml. The mixture was gently swirled at room temperature overnight. The particles were then separated by centrifugation. The amount of enzyme remaining in the supernatant was determined spectrophotometrically after filtration through a 0.2 μm filter. This value was subtracted from the amount of enzyme added to estimate the amount of enzyme adsorbed on the particles. All particles on the negatively charged surface bound glucose oxidase. SD1498 derivatized with PEI had the highest potency (88 mg enzyme / g solid). None of the underivatized silica bound glucose oxidase (see FIG. 1). III) Adsorption of Invertase and Glucose Oxidase on Macrosorb Particles A 12.5% slurry of Macrosorb (CT100) was prepared in 10 mM Tris (pH 8). A 0.5 ml portion of this slurry (total mass of particles = 62.5 mg) was added to a glass vial. Invertase (Sigma) was then added from a stock solution (5 mg / ml in 10 mM Tris, pH 8). 0, 0.1 mg, 0.2 mg, 0.5 mg, 1.0 mg, and 5.0 mg, i.e., 0, 1.6 mg, 3.2 mg, 8 mg, 16 mg, and 80 mg / g of particles An amount of invertase was added to each vial. 10 mM Tris (pH 8) was added to each vial to 1.5 ml. The vial was rotated slowly at room temperature for 4 hours. The particles were then separated by centrifugation (2,000 rpm, 5 minutes). The amount of invertase remaining in the supernatant was determined spectrophotometrically after filtration through a 0.2 μm filter. This value was subtracted from the amount of enzyme added to estimate the amount of enzyme adsorbed on the particles. The particles sensitized to invertase were suspended in 1.5 ml of 10 mM Tris containing 2 mg of glucose oxidase (corresponding to 32 mg / g of particles). The tube was rotated overnight at room temperature. The double enzyme-sensitized particles were separated by centrifugation and the amount of glucose oxidase adsorbed was measured as described above. The particles were washed with 10 mM Tris (pH 8) and then stored. Macrosorb particles (CT100) were successfully derivatized with both invertase and glucose oxidase. The ratio of invertase to glucose was efficiently controlled by sensitization with different amounts of invertase and fixed amounts of glucose oxidase in a two-step reaction (see FIG. 2). IV) Killing of Streptococci with macrosorb particles derivatized with invertase and glucose oxidase . The Sanguis cells were grown overnight and the culture was washed by repeated centrifugation in phosphate buffered saline (PBS) (pH 7), and the final reaction mixture (cells + particles + substrate) was It was resuspended in PBS (pH 6.5) to contain the culture cell concentration. The macrosorb sample carrying the enzyme obtained in Example III was mixed with S.S. It was added to the Sanguis suspension and adjusted to a final concentration of 0.5% solids, and finally the enzyme substrate was added (9.6% sucrose, 10 mM KI, 10 μg / ml lactoperoxidase). Immediately after addition of the substrate, a time zero sample was removed from the reaction mixture for viability determination. In addition, samples were removed after incubation at 37 ° C. for 1, 5, 10, 20, and 30 minutes. During the incubation, precipitation of macrosorb particles was prevented by regular agitation. After the samples were removed into a cooling solution containing 12 mg / ml cysteine hydrochloride in PBS (pH 6.5), the macroscopic cells were subjected to the Miles, Misra and Irwin methods (AA Miles, SS Misra and J0). Irwin, Journal of Hygiene 1938, 38 , 737-48). When macrosorb particles labeled with both invertase and glucose oxidase are present with the substrate system described above, suspended S. aureus particles are present. The decrease in viable numbers of Sanguis cells occurred quickly. An 8 log reduction in cell viability was observed between 5 and 10 minutes of substrate incubation (see FIG. 3). The particles with the most invertase loaded are not the most capable of killing activity, indicating that a balance of GOx and invertase loading ratio is desirable to achieve maximum activity.
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(31)優先権主張番号 ９５３０９３４９．９
(32)優先日 平成７年12月21日(1995．12．21)
(33)優先権主張国 ヨーロッパ特許庁（ＥＰ）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ
Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ
，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ
，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，
ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ
Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ
，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，
ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ
Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ
，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，
ＶＮ
(72)発明者 デイビス、ポール・ジェイムズ
英国、ベッドフォード・エムケイ44・１エ
ルキュー、シャーンブルック、コルワー
ス・ハウス、シー／オー・ユニリーバー・
リサーチ・コルワース・エルエイビー（番
地なし)
(72)発明者 ポーター、フィリップ
英国、ベッドフォード・エムケイ44・１エ
ルキュー、シャーンブルック、コルワー
ス・ハウス、シー／オー・ユニリーバー・
リサーチ・コルワース・エルエイビー（番
地なし)────────────────────────────────────────────────── ───
Continuation of front page
(31) Priority claim number 953093499.9
(32) Priority date December 21, 1995 (December 21, 1995)
(33) Countries claiming priority European Patent Office (EP)
(81) Designated countries EP (AT, BE, CH, DE,
DK, ES, FI, FR, GB, GR, IE, IT, L
U, MC, NL, PT, SE), OA (BF, BJ, CF)
, CG, CI, CM, GA, GN, ML, MR, NE,
SN, TD, TG), AP (KE, LS, MW, SD, S
Z, UG), UA (AM, AZ, BY, KG, KZ, MD
, RU, TJ, TM), AL, AM, AT, AU, AZ
, BA, BB, BG, BR, BY, CA, CH, CN,
CU, CZ, DE, DK, EE, ES, FI, GB, G
E, HU, IL, IS, JP, KE, KG, KP, KR
, KZ, LC, LK, LR, LS, LT, LU, LV,
MD, MG, MK, MN, MW, MX, NO, NZ, P
L, PT, RO, RU, SD, SE, SG, SI, SK
, TJ, TM, TR, TT, UA, UG, US, UZ,
VN
(72) Inventor Davis, Paul James
Bedford MK 44.1E, UK
Luke, Sharnbrook, Colwa
House, Sea / O Unilever
Research Colworth L.A.
Without ground)
(72) Inventor Porter, Philip
Bedford MK 44.1E, UK
Luke, Sharnbrook, Colwa
House, Sea / O Unilever
Research Colworth L.A.
Without ground)