CA2349674A1

CA2349674A1 - Capsules with porous mineral cortex

Info

Publication number: CA2349674A1
Application number: CA002349674A
Authority: CA
Inventors: Catherine Jourdat; Dominique Dupuis
Original assignee: Individual
Current assignee: Rhodia Chimie SAS
Priority date: 1998-10-30
Filing date: 1999-10-27
Publication date: 2000-05-11
Also published as: WO2000025761A1; NZ511365A; FR2785292B1; EP1124542A1; FR2785292A1; AU6346999A; BR9914907A; JP2003515310A; AU764016B2

Abstract

The invention concerns a mineral capsule consisting of a mineral cortex and a liquid core wherein is immobilised at least an active biological material. The invention also concerns a method for preparing said capsules and their uses.

Description

Capsules à écorce minérale poreuse s La présente invention a pour objet de nouvelles capsules à écorce, minérale poreuse au sein desquelles sont immobilisées, dans un milieu IiquideL
une ou plusieurs matières actives biologiques.
D'une manière générale, les techniques d'immobilisation de io matières actives visent à limiter et plus préférentiellement à faire obstacle à leur migration libre dans un milieu environnant.
II existe deux méthodes générales d'immobilisation La première méthode consiste à lier la matière active à
immobiliser à une surface de type support soit par adsorption (interactions de is type ionique, liaisons Van der Waals), soit par liaison covalente ou via un composé intermédiaire.
La seconde méthode vise en revanche à retenir physiquement la matière active à l'intérieur d'une matrice solide ou poreuse telle qu'un gel stabilisé.
2o Cette seconde approche est largement utilisée pour l'immobilisation de matières actives biologiques de type cellules ou enzymes par exemple. On procède le plus couramment à une encapsulation physique des matières actives biologiques considérées à l'intérieur d'une matrice polymérique.
2s Le matériau d'encapsulation doit en fait répondre à plusieurs exigences - ll doit contribuer à assurer la stabilité de la structure et l'activité de la matière active immobilisée ;
- II doit posséder une porosité suffisante pour contrôler la 3o diffusion de la matière active immobilisée et le cas échéant ses échanges avec le milieu environnant et - II doit permettre le cas échéant une réutilisation aisée de la matière active immobilisée.

WO 00/25761 PCT/FR99/02ô14 Porous mineral bark capsules s The present invention relates to new bark capsules, porous mineral in which are immobilized, in an IiquideL medium one or more biological active ingredients.
In general, the immobilization techniques of io active ingredients aim to limit and more preferably to do obstacle to their free migration in a surrounding environment.
There are two general methods of immobilization The first method is to link the active ingredient to immobilize on a support type surface either by adsorption (interactions of is ionic type, Van der Waals bonds), either by covalent bond or via a intermediate compound.
The second method, on the other hand, aims to physically retain the active ingredient inside a solid or porous matrix such as a gel stabilized.
2o This second approach is widely used to immobilization of biological active materials such as cells or enzymes for example. Most commonly, physical encapsulation biological active ingredients considered within a matrix polymeric.
2s The encapsulation material must in fact respond to several requirements - It must contribute to ensuring the stability of the structure and the activity of the immobilized active ingredient;
- It must have sufficient porosity to control the 3o diffusion of the immobilized active ingredient and, where appropriate, its exchanges with the surrounding environment and - It must allow, where appropriate, easy reuse of the immobilized active ingredient.

WO 00/25761 PCT / FR99 / 02ô14

2 Les matériaux les plus fréquemment mis en oeuvre pour procéder à ce type d'immobilisation sont les gels hydrocollôtdes. A titre illustratif de ces gels, on peut notamment citer les gels naturels tels que les alginates et les carraghénanes. Toutefois d'autres réseaux polymériques de nature synthétique s ont également été développés comme celui à base de polyacrylamide.
Ce type d'encapsulation est généralement obtenu par addition dé
la matière active à immobiliser sous la forme d'une suspension dans une solution aqueuse d'un précurseur du matériau d'encapsulation. La solution de précurseur y est ensuite transformée en gouttelettes généralement par io dispersion. Enfin, ces gouttelettes sont stabilisées sous forme de billes dans lesquelles la matière active est piégée, soit par polymérisation ou tout autre type de réticulation.
II a également été proposé d'encapsuler des enzymes dans une structure poreuse de nature minérale. La technique d'encapsulation retenue est is alors apparentée à la technique sol-gel. Selon ce mode d'encapsulation, on initie l'hydrolyse et la polycondensation d'un alcoxyde métallique dans l'eau ou en milieu hydroalcoolique, on y disperse l'enzyme et la composition résultante est ensuite gélifiée puis séchée.
Comparativement à des matrices organiques à base d'un gel 2o naturel de type alginate ou carraghénane, ces matrices inorganiques sont particulièrement avantageuses. Leur résistance mécanique est considérablement accrue. Elles présentent généralement un caractère hydrophile ainsi qu'une meilleure stabilité aux solvants et aux pH. Qui plus est, elles sont stables en milieu salin concentré contrairement aux matrices 2s organiques à base d'alginate par exemple.
Toutefois, tout comme les systémes d'encapsulation matriciels organiques, ces matrices inorganiques sont inadaptées au conditionnement de matières actives biologiques nécessitant d'être conservées dans un milieu liquide. Par ailleurs, la faible porosité de ces systèmes, en raison de leur 3o caractère matriciel, constitue un obstacle à la croissance de matières actives biologiques et au maintien de leur activité.

WO 00/25761 PCT/FR99/02b14 2 The materials most frequently used to proceed to this type of immobilization are hydrocolloid gels. By way of illustration of these gels, mention may in particular be made of natural gels such as alginates and carrageenans. However, other synthetic polymer networks s have also been developed, such as that based on polyacrylamide.
This type of encapsulation is generally obtained by adding the active ingredient to be immobilized in the form of a suspension in a aqueous solution of a precursor of the encapsulation material. The solution of precursor is then transformed into droplets generally by io dispersion. Finally, these droplets are stabilized in the form of beads in which the active ingredient is trapped, either by polymerization or any other type of crosslinking.
It has also been proposed to encapsulate enzymes in a porous structure of mineral nature. The encapsulation technique selected is is then related to the sol-gel technique. According to this mode of encapsulation, we initiates hydrolysis and polycondensation of a metal alkoxide in water or in an alcoholic medium, the enzyme and the resulting composition are dispersed there is then gelled and dried.
Compared to organic matrices based on a gel 2o natural alginate or carrageenan type, these inorganic matrices are particularly advantageous. Their mechanical resistance is considerably increased. They generally have a character hydrophilic as well as better stability to solvents and pH. Who more East, they are stable in concentrated saline environment unlike the matrices 2s organic based on alginate for example.
However, just like matrix encapsulation systems organic, these inorganic matrices are unsuitable for conditioning biological active ingredients that need to be stored in an environment liquid. Furthermore, the low porosity of these systems, due to their 3o matrix character, constitutes an obstacle to the growth of materials active and the maintenance of their activity.

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3 La présente invention a précisément pour objet de proposer un nouveau mode d'encapsulation, particulièrement avantageux dans la mesure où il permet justement de conserver des matières actives biologiques dans un environnement liquide propice à la conservation de leur structure et activité
et le s cas échéant leur développement interne tout en les protégeant efficacement contre toute dégradation susceptible de leur être occasionnée par le milieû
environnant.
La présente invention a donc pour premier objet une capsule io minérale constituée d'une écorce minérale et d'un noyau liquide dans lequel est immobilisée au moins une matière active biologique.
Au sens de la présente invention on entend couvrir sous la dénomination matière active biologique toute molécule, cellule ou organisme is possédant un intérêt industriel en raison de son activité biologique.
A titre illustratif de ces matières actives biologiques, on peut notamment citer les organismes cellulaires comme les microorganismes de type bactéries, levures, champignons et algues, les cellules d'origine animale ou végétale, les enzymes ou protéines de type anticorps par exemple.
2o II s'agit plus préférentiellement de cellules ou organismes vivants.
Comme exemples de molécules biologiquement actives, on peut plus particulièrement mentionner les enzymes telles les hydrolases, nucléases, oxydases, protéases, isomérases et analogues.
II peut en particulier s'agir d'oxydoréductases telles les alcools 2s deshydrogénases, les oxygénases et les glucose deshydrogénases, de transférases comme la D-glutamyl transférase, de lyases comme les fumarase et aspartase, d'hydrolases comme les lipases, nitrilehydratases, lactases et acylases ainsi que d'isomérases. II peut également s'agir de protéines ou de complexes protéiques de type cytochrome C, hémoglobine, rnyoglobine, 3o transferrine ou superoxyde dismutase ou d'anticorps.
Comme exemple de bactéries, on peut plus particulièrement citer les bactéries lactiques et les bactéries de l'environnement.

WO OO/Z5761 PCT/FR99/02ô14 3 The object of the present invention is precisely to propose a new encapsulation method, particularly advantageous in the measurement where it allows to keep biological active ingredients in a liquid environment conducive to the conservation of their structure and activity and the s where appropriate their internal development while effectively protecting them against any damage likely to be caused to them by the environment surrounding.
The present invention therefore has for first object a capsule io mineral consisting of a mineral shell and a liquid core in which East immobilized at least one biological active material.
For the purposes of the present invention, it is intended to cover under the name of biological active ingredient any molecule, cell or organism is having an industrial interest due to its biological activity.
As an illustration of these biological active materials, it is possible to include cell organisms such as microorganisms from type bacteria, yeasts, fungi and algae, cells of animal origin or vegetable, enzymes or proteins of antibody type for example.
2o It is more preferably cells or living organisms.
As examples of biologically active molecules, one can more particularly mention enzymes such as hydrolases, nucleases, oxidases, proteases, isomerases and the like.
It can in particular be oxidoreductases such as alcohols 2s dehydrogenases, oxygenases and glucose dehydrogenases, transferases like D-glutamyl transferase, lyases like fumarase and aspartase, hydrolases such as lipases, nitrilehydratases, lactases and acylases as well as isomerases. It can also be proteins or protein complexes of cytochrome C type, hemoglobin, rnyoglobin, 3o transferrin or superoxide dismutase or antibody.
As an example of bacteria, one can more particularly cite lactic acid bacteria and environmental bacteria.

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4 Par opposition aux systèmes d'encapsulation classiques évoqués ci-dessus, la matière active biologique est dans le cas de la présente invention non pas adsorbée sous une forme dispersée au sein d'une matrice mais concentrée dans un milieu liquide qui est isolé du milieu environnant par une s écorce minérale.
Au sens de la présente invention, on entend par milieu liquide, un milieu apte à assurer la conservation de l'activité et la structure et/ou la survie et le cas échéant le développement interne d'une matière active biologique, ce milieu étant sous une forme fluide de type liquide. A ce titre, il diffère des ~o milieux de type alginate ou carraghénane qui s'apparentent eux à des milieux sous forme gel.
II peut notamment s'agir du milieu biologique naturel de la matière active biologique immobilisée. Généralement ce milieu biologique liquide est ou dérive d'un milieu aqueux.
is Bien entendu, ce milieu liquide peut être tamponné et/ou supplémenté en oligo-éléments, sucres, sels et tout autre agent nutritif susceptible d'étre nécessaire à la conservation de l'activité et la structure et/ou la survie et le cas échéant au développement interne de la matière active biologique immobilisée.
2o Ces matières actives, selon leur caractère hydrosoluble, sont soit solubilisées ou dispersées dans le milieu liquide.
L'écorce minérale obtenue selon le procédé de l'invention ' a pour double avantage de protéger efficacement le milieu liquide et la ou les matières) actives) qu'il contient, et le cas échéant de permettre ses échanges 2s avec le milieu environnant des capsules. Ceci est notamment réalisé en ajustant le degré de porosité des capsules minérales obtenues selon l'invention.
Selon une première variante de (invention, les capsules minérales obtenues peuvent être non poreuses. Cette spécificité est plus particulièrement avantageuse lorsque l'on souhaite essentiellement assurer une protection 3o efficace du milieu liquide, incorporant au moins une matière active biologique, vis à vis de son milieu environnant. Par opposition aux microcapsules obtenues par polycondensation interfaciale et qui sont constituées d'une écorce organique, les capsules obtenues selon l'invention sont beaucoup plus résistantes mécaniquement, thermiquement et chimiquement en raison du caractère minéral de leur écorce. Dans ce cas particulier, le milieu aqueux et le cas échéant la matière active qu'il contient sont libérés généralement par fractionnement de la capsule ou encore par dégradation induite de celle-ci.
Selon une seconde variante de l'invention, les capsules obtenues peuvent être poreuses et cette porosité est contr8lable. Ceci présente uri intérêt significatif lorsque l'on souhaite, outre protéger le milieu liquide et la matière active qu'il contient, permettre ses échanges avec le milieu environnant desdites capsules.
lo En fait, cet ajustement de la porosité de même que celui de la taille des capsules sont accomplis à travers principalement le choix du matériau minéral constituant l'écorce minérale ou plus précisément le choix du précurseur de ce matériau. Cet aspect de l'invention est discuté de manière plus détaillée ci-après.
is La présente invention est donc particulièrement avantageuse dans la mesure où elle propose un mode de conditionnement fiable, compatible avec le développement interne des matières actives immobilisées et modulable en fonction de la nature et la quantité de matières) actives) immobilisée(s).
2o La préservation au sein de la capsule d'un milieu liquide qui peut être le milieu biologique naturel de la matière active immobilisée est une garantie d'un fonctionnement prolongé de ladite matière active, fonctionnement qui peut par exemple se traduire par une production de métabolites ou étre enzymatique.
2s La nature minérale de l'écorce des capsules revendiquées constitue une barrière de protection efficace à la matière active biologique vis-à-vis du milieu environnant tout en autorisant le cas échéant ses échanges avec celui-ci.
La taille des capsules étant maîtrisable, elle peut être ajustée en 3o fonction des contraintes liées à la dimension des matières actives à
encapsufer ou encore au nombre de ces matières actives biologiques.
Enfin, cette capsule est préparée dans le cadre de la présente invention dans des conditions opératoires suffisamment douces pour ne pas affecter l'intégrité desdites matières actives. La matière active à
immobiliser n'est en effet pas exposée lors de son conditionnement à des valeurs de température et le cas échéant de pH susceptibles de lui porter préjudice.
s En ce qui concerne la composition de l'écorce minérale, elle est constituée d'au moins un oxyde etlou hydroxyde d'aluminium, de silicium, d~
zirconium et/ou d'un métal de transition.
Par métal de transition on entend plus particulièrement les métaux de la quatrième période allant du scandium au zinc dans la mesure où ceux-ci io sont bien entendu compatibles en terme d'innocuité avec l'application visée. II
s'agit plus particulièrement d'un oxyde ou hydroxyde de titane, manganèse, fer, cobalt, nickel ou de cuivre.
Bien entendu, cette écorce minérale peut comprendre des oxydes etlou hydroxydes de natures différentes.
is Conviennent plus particulièrement à la présente invention les oxydes et/ou hydroxydes de silicium, aluminium, titane et de zirconium.
Selon un mode préférentiel de l'invention, les capsules comprennent une écorce minérale à base d'au moins un oxyde de silicium.
2o De manière générale, la taille des capsules selon l'invention peut être comprise entre 1 et plusieurs dizaines de micromètres. La taille des particules du matériau minéral constituant l'écorce de ces capsules peut varier pour sa part entre 1 et 200 nm.
En ce qui concerne plus particulièrement l'épaisseur de l'écorce 2s minérale, elle peut varier entre 1 et 200 nm.
On peut également caractériser ces capsules par la quantité de milieu liquide que l'écorce minérale retient en introduisant le paramètre rétention de la capsule. Celui-ci correspond au rapport de la masse du milieu liquide contenue dans la capsule et celle de l'écorce minérale.
3o Lorsque l'écorce est trop poreuse, la rétention de la capsule est faible. On peut dont faire varier la rétention des capsules en fixant la taille des particules du matériau constituant l'écorce minérale ainsi que l'épaisseur de cette dernière.

WO 00/25761 PCT/FR99/02b14 La présente invention a également pour objet un procédé utile pour préparer des capsules minérales conformes à la présente invention ledit procédé comprenant s 1 ) la mise en émulsion d'un milieu liquide contenant au moins une matière active biologique au sein d'une seconde phase non miscible avec ledit milieu liquide de manière à fy disperser sous forme de gouttelettes, 2) la mise au contact, au sein de l'émulsion inverse ainsi obtenue, d'au moins un composé hydrolysable et polycondensable de zirconium, silicium, lo aluminium etlou un métal de transition dans des conditions de température et de pH propices à la formation d'un précipité constitué de l'oxyde ou l'hydroxyde correspondant et 3) la récupération des capsules minérales ainsi formées et le cas échéant leur purification, is ledit procédé étant caractérisé en ce que la formation du précipité minéral dans la seconde étape est conduite en présence d'un système tensioactif amphiphile, présent au niveau de l'émulsion et capable de concentrer le dépôt des particules minérales dudit précipité formé à l'interface des gouttelettes et de la seconde phase et de bloquer efficacement leur diffusion au sein desdites zo gouttelettes.
Le système tensioactif amphiphile proposé selon l'invention a pour avantage de bloquer le phénomène de diffusion naturel des particules minérales vers le centre des gouttelettes.
Au sens de l'invention, on entend désigner par système tensioactif zs amphiphile soit un composé unique au niveau duquel coexistent deux régions dotées de solubilités très différentes et suffisamment éloignées l'une de Pautre pour se comporter de manière indépendante, soit une association d'au moins deux composés possédant des solubilités très différentes tels un premier composé à caractère hydrophile et un second composé à caractère 3o hydrophobe. Généralement ces deux régions ou composés comprennent respectivement au moins un groupement hydrophile et une ou plusieurs longues chaînes à caractère hydrophobe.

WO 00/25761 PCT/FR99/02ô14 En conséquence, le système tensioactif mis en oeuvre selon l'invention peut étre représenté par un composé unique et qui sera alors introduit préalablement à la réalisation de la seconde étape c'est-à-dire l'étape d'hydrolyse et de polycondensation ou encore résulté d'une interaction in situ s d'au moins deux composés comme par exemple un tensioactif organosoluble initialement présent dans la seconde phase généralement organosoluble et ur~
composé hydrosoluble présent dans le milieu liquide généralement aqueux. On peut également envisager un couplage ou une complexation entre un premier agent organosoluble et un second agent organosoluble à caractère ionique io comme un ammonium quaternaire. Les deux composés se rencontrent à
l'interface des gouttelettes formées lors de la mise en émulsion. De part leur interaction, ils contribuent d'une part à stabiliser le système en diminuant la tension interfaciale à (interface des gouttelettes et agissent vraisemblablement comme une barrière stérique ou électrostatique.
is Dans le procédé revendiqué, est plus particulièrement préféré le mode de réalisation mettant en oeuvre au moins deux composés distincts capables d'interagir pour conduire à un système tensioactif apte à s'opposer efficacement à la diffusion des particules minérales dans les gouttelettes 2o aqueuses et à stabiliser ladite émulsion.
Le système tensioactif proposé selon l'invention comprend de préférence au moins un tensioactif doté d'une valeur HLB inférieure à 7.
Le terme HLB désigne le rapport de l'hydrophilie des groupements polaires de la molécule de tensioactif sur l'hydrophobie de la partie lipophile de zs cette même molécule.
Dans ce cas particulier, les deux composés sont de préférence respectivement présents dans le milieu liquide, généralement aqueux et la seconde phase généralement organosoluble et interagissent l'un vis à vis de l'autre lors de la mise en émulsion du milieu liquide dans ladite seconde phase.
3o Cette option a pour avantage de conférer à l'émulsion correspondante une stabilité satisfaisante dès sa formation. Qui plus est, il s'avère possible, si nécessaire, en sélectionnant de manière appropriée les agents constituant le système tensioactif amphiphile, d'ajuster le pH à une valeur compatible avec la matière active.
En ce qui concerne la mise en émulsion, elle peut étre réalisée en appliquant une énergie mécanique d'agitation intense aux deux phases initiales, s etlou une sonication. La taille des gouttelettes obtenues à l'issue de l'étape de mise en émulsion peut être comprise entre environ 0,1 et une dizaine de pm.
Le composé présent au niveau du milieu liquide, généralement aqueux possède de préférence une action viscosifiante.
Plus particulièrement, ce composé peut être un composé choisi parmi les sucres et leurs dérivés. Conviennent à ce titre les oses (ou monosaccharides), les osides et les polyholosides fortement dépolymérisés. On entend des composés dont la masse mollaire en poids est plus particulièrement inférieure à 20 000 glmole.
ls Parmi les oses on peut mentionner les aldoses tels que le glucose, mannose, galactose et les cétoses tels que le fructose.
Les osides sont des composés qui résultent de la condensation, avec élimination d'eau, de molécules doses avec des molécules non glucidiques. Parmi les osides, on préfère les holosides qui sont formés par ta 2o réunion de motifs exclusivement glucidiques et plus particulièrement les oligoholosides (ou oligosaccharides) qui ne comportent qu'un nombre restreint de ces motifs, c'est-à-dire un nombre en général inférieur ou égal à 10. A
titre d'exemples d'oligoholosides on peut mentionner le saccharose, le lactose, la cellobiose, le maltose.
2s Les polyholosides (ou polysaccharides) fortement dépolymérisés convenables sont décrits par exemple dans l'ouvrage de P. ARNAUD intitulé
"Cours de chimie organique", LUTHIER-VILLARS éditeurs, 1987. Plus particulièrement, on met en oeuvre des polyholosides dont la masse moléculaire en poids est plus particulièrement inférieure à 20 000 g/mole.
3o A titre d'exemple non limitatif de potyholosides fortement dépolymérisés, on peut citer le dextran, l'amidon, la gomme xanthane et les galactomannanes tels que le guar ou la caroube. Ces polysaccharides présentent de préférence un poids de fusion supérieur à 100°C et une solubilité
dans l'eau comprise entre 10 et 500 g/l.
Conviennent également à l'invention la gomme arabique, la gélatine et leurs dérivés gras comme les sucroesters d'acides gras, les s carbohydrates alcools de type sorbitol, mannitol, les carbohydrates éthers comme les méthyl-, éthyl-, carboxyméthyl-, hydroxyéthyl- et hydroxypropyl-éthers de cellulose et les glycérols, pentaérythrol, propyléneglycol, éthylène glycol, les diols non visqueux et/ou alcools polyvinyliques.
II s'agit de préférence d'un hydrocolloïde. A titre représentatif de lo ce type de composés on peut notamment citer les alginates, les polysaccharides de type gomme naturelle comme les carraghénanes, la xanthane et le guar et tout particulièrement les dérivés de cellulose.
De manière préférée, il s'agit d'un dérivé de cellulose et plus préférentiellement de l'hydroxyéthylcellulose.
ls Le ou les tensioactifs) généralement organosoluble(s) présents) au niveau de la seconde phase peuvent ëtre choisis) parmi les alcools gras, les triglycérides, les acides gras, les esters de sorbitan, les amines grasses, ces composés étant ou non sous une forme polyalcoxylée, les lécithines 20 liposolubles, tes polyalkylénes dipolyhydroxystéarates, les sels d'ammonium quaternaires, les monoglycérides, les esters de polyglycérol, le polyricinoléate de polyglycérol et les esters lactiques.
Les alcools gras comprennent généralement de 6 à 22 atomes de carbone. Les triglycérides peuvent être des triglycérides d'origine végétale ou 2s animale (tels que le saindoux, le suif, l'huile d'arachide, l'huile de beurre, l'huile de graine de coton, l'huile de lin, l'huile d'olive, l'huile de poisson, l'huile de coprah, l'huile de noix de coco).
Les acides gras sont des esters d'acide gras (tels que par exemple l'acide oléïque, l'acide stéarique).
3o Les esters de sorbitan sont des esters du sorbitol cyclisés d'acide gras comprenant de 10 à 20 atomes de carbone comme l'acide laurique, l'acide stéarique ou l'acide oléïque.

Selon un mode préféré de l'invention, ce tensioactif est un ester de sorbitan tel que défini ci-dessus et plus préférentiellement le sesquioléate de sorbitan.
Comme il ressort de l'exposé précédent, fe composé présent dans s le milieu liquide généralement aqueux doit interagir avec le tensioactif présent dans la seconde phase généralement hydrophobe pour conduire à un systèmé
tensioactif capable de constituer une ban-fière de diffusion efficace à
l'égard des particules du précipité minéral. En conséquence, leurs choix respectifs doivent être effectués en tenant compte de cet impératif.
lo Bien entendu la nature de la matière active à encapsuler de même que la composition de l'écorce minérale des capsules préparées selon l'invention sont également des éléments déterminants dans le choix du système tensioactif et l'appréciation des quantités respectives des deux composés correspondants. Ces ajustements relèvent en fait des compétences de l'homme ls de l'art.
Dans le cas particulier où est privilégiée selon l'invention la mise en oeuvre d'un unique composé de type amphiphile conviennent tout particulièrement ceux répondant à la formule générale I
2o R2 (A)~ L ~'(CHR ~~C]~ N-Q
g g I
dans laquelle R2 représente un radical alkyle ou alcényle comprenant 7 à 22 zs atomes de carbone, R~ représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle comprenant 1 à 6 atomes de carbone, A représente un groupement (CO) ou (OCH2CH2), n vaut 0 ou 1, x vaut 2 ou 3, y vaut 0 à 4, Q représente un radical -R3-COOM avec R2 représentant un radical alkyle comprenant 1 à 6 atomes de carbone, M représente un atome d'hydrogène, un métal alcalin, un métal 3o alcalino-terreux ou encore un groupement ammonium quaternaire dans lequel les radicaux liés à l'atome d'azote, identiques ou différents, sont choisis parmi l'hydrogène ou un radical alkyle ou hydroalkyle possédant 1 à 6 atomes de carbone, et B- représente H ou Q.

De préférence, M représente un atome d'hydrogène, le sodium, le potassium et un groupement NH4.
Parmi ces tensioactifs correspondants à la formule I, on met plus particulièrement en oeuvre les dérivés amphotères des alkyl polyamines comme s l'amphionic XL~, le Mirataine H2C-HA~ commercialisés par Rhodia Chimie ainsi que fAmpholac 7T/X~ commercialisés par Berol Nobel.
On peut également mettre en oeuvre un tensioactif principal non-ionique dont la partie hydrophile contient un ou plusieurs motifs) saccharide(s).
Lesdits motifs saccharides contiennent généralement de 5 à 6 atomes de ~o carbone. Ceux-ci peuvent dériver de sucres comme le fructose, le glucose, le mannose, le galactose, le talose, le gulose, l'allose, l'altose, fidose, farabinose, le xylose, le lyxose etlou le ribose.
Parmi ces agents tensioactifs à structure saccharide, on peut mentionner les alkylpolyglycosides. Ceux-ci peuvent être obtenus par ls condensation (par exemple par catalyse acide) du glucose avec des alcools gras primaires (US-A-3 598 865 ; US-A-4 565 647 ; EP-A-132 043 ; EP-A-132 046 ; Tenside Surf. Det. 28, 419, 1991, 3 ; Langmuir 1993, 9, 3375-3384) présentant un groupe alkyle en C4-C2o, de préférence de l'ordre de 1,1 à 1,8 par mole d'alkylpolyglycoside (APG) ; on peut mentionner notamment ceux 2o commercialisés respectivement sous les dénominations GLUCOPON 600 EC~, GLUCOPON 650 ECm, GLUCOPON 225 CSUP~, par HENKEL.
A titre illustratif, la concentration en système tensioactif amphiphile peut être comprise entre environ 1 % et 10% en poids par rapport à la phase organosoluble.
2s Selon un mode préférentiel de (invention, le tensioactif incorporé
au niveau de la seconde phase généralement organosoluble, est un ester de sorbitan et plus préférentiellement le sesquioléate de sorbitan. Quant au composé incorporé dans le milieu liquide, il s'agit préférentiellement d'un dérivé
de cellulose et plus particulièrement de fhydroxyéthyle de cellulose.
3o Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la matière de (écorce minérale dérive de l'hydrolyse et la polycondensation d'un ou plusieurs alcoxydes de formule II.

M(R)~(P~" II
dans laquelle - M représente un élément choisi parmi le titane, manganèse, fer, cobalt, nickel, silicium, aluminium ou zirconium, s - R est un substituant hydrolysable, - n est un entier compris entre 1 et 6, - P est un substituant non hydrolysable et - m est un entier compris entre 0 et 6.
Selon un mode préféré de l'invention lo - M est choisi parmi la silice, l'aluminium, le titane et le zirconium, - R est un groupement choisi parmi les groupements alkoxy et/ou aryloxy en C~ à C~s et de préférence en Cz à C8 et n est un entier compris entre 2 et 4 et - P est un groupement choisi parmi les groupements alkyles en C~ à Cs, ls aryles ou alcényle en C2 à C8.
En ce qui concerne R, il s'agit de préférence d'un groupement alkoxy en C~ à Cg et plus préférentiellement en C2 à C4. Ce groupement alkoxy peut le cas échéant être substitué par un groupement alkyle ou alkoxy en C~ à
C4 ou un atome d'halogène. Dans la formule générale II, R peut représenter des 2o groupements alkoxy identiques ou différents.
Bien entendu, on peut mettre en aeuvre plusieurs composés de formule II.
Comme discuté précédemment, il s'avère possible à travers le 2s choix de ce composé hydrolysable et polycondensable minéral d'ajuster la porosité et la taille des capsules.
De même, on peut conférer un caractère plus ou moins hydrophobe à la capsule en jouant sur la nature et par exemple la longueur des chaînes alkyles etlou alcoxy constituant ce composé hydrolysable et 3o polycondensable minéral.

Généralement, l'hydrolyse et la polycondensation de ce précurseur minéral s'accomplissent soit spontanément par mise en présence de celui-ci avec l'émulsion soit sont initiées par ajustement du pH et/ou de la température de l'émulsion à une valeur propice à leur manifestation. Cet s ajustement peut notamment relever de la présence dans l'émulsion d'ions hydrosolubles comme NH40H, NaOH ou HCI ou organosolubles de type amines. Ces ajustements relèvent de la compétence de l'homme du métier.
Selon une variante préférée de la présente invention, l'écorce minérale obtenue selon l'invention est à base d'oxyde de silicium. Elle dérive de lo la précipitation d'au moins un silicate.
Comme silicate convenant à la présente invention, on peut plus particulièrement citer le tétraméthylorthosilicate, TMOS, le tétraéthylorthosilicate, TEOS , le tétrapropylorthosilicate, TPOS, les alkylalcoxysilanes et les halogénoalkylsilanes.
ls Selon un mode de réalisation particulier de (invention, la capsule minérale est obtenue par formation d'un précipité minéral en présence d'un agent d'hydrolyse et de condensation dudit composé.
L'hydrolyse de ces alcoxydes de silicium peut se faire aussi bien 2o en catalyse acide qu'en catalyse basique sous réserve que les oxydes etlou hydroxydes correspondants soient obtenus sous une forme pulvérulente.
De préférence on met en oeuvre un alcoxyde de silicium comme le tétraéthylorthosilicate, TEOS, en présence d'ammoniaque, à titre d'agent d'hydrolyse et polycondensation.
2s La seconde phase est généralement une phase huileuse non miscible avec le milieu liquide généralement aqueux et est de préférence composée d'une huile choisie parmi les huiles végétales, animales et minérales. II peut par exemple s'agir d'une huile parrafinique ou d'une huile de 3o silicone.
Toutefois, on peut également envisager de mettre en oeuvre d'autres solvants organiques comme les solvants perfluorés sous réserve que ces solvants soient utilisés dans des conditions appropriées, par exemple sous forme d'un mélange pour conduire à une émulsion avec le milieu liquide.
A titre de seconde phase convenant tout particulièrement à
l'invention, on peut notamment citer le solvant Isopar~ qui est une isoparrafine s commercialisée par la société Exxon Chemicals.
Cette seconde phase comprend au moins un tensioactif généralement organosoluble qui est de préférence choisi parmi les esters de sorbitan et plus préférentiellement est représenté par le sesquioléate de sorbitan.
lo En ce qui concerne le milieu liquide généralement aqueux, il comprend au moins un hydrocolloïde, éventuellement l'agent d'hydrolyse et de polycondensation du précurseur hydrolysable et polycondensable minéral.
En ce qui concerne l'hydrocolloïde, il s'agit de préférence d'un ls dérivé de cellulose et plus préférentiellement de l'hydroxyéthylcellulose.
Les capsules minérales selon l'invention sont particulièrement intéressantes pour des utilisations dans les domaines de fermentation biomédicaux, alimentaires et en industrie chimique.
2o On peut ainsi envisager d'immobiliser, au sein des capsules revendiquées, des cellules possédant une activité intéressante pour la production de produits pharmaceutiques, de métabolites etlou de réactifs comme des intermédiaires de synthèse chimiques ou pharmaceutiques ou encore des polymères biodégradables.
2s L'immobilisation selon l'invention de microorganismes de type levures ou bactéries est également particulièrement intéressante pour l'industrie alimentaire et tout particulièrement pour les industries laitière et viticole.
Des enzymes immobilisées selon (invention peuvent représenter pour leur part des réactifs de choix dans de nombreux procédés de fabrication 3o industriels pour des méthodes catalytiques ou analytiques.
De même on peut envisager de mettre en oeuvre des capsules selon l'invention à base de cellules vivantes ou d'enzymes dans le traitement des eaux usées ou des déchets.

WO 00/25761 PCT/FR99/02ô14 Les exemples et la figure qui suivent sont présentés à titre illustratif et non limitatif de l'objet de la présente invention.
s Fjg~
- Figure 1 : Photographie par microscopie en balayage (MEB) de capsules selon l'invention incorporant E. coli.
- Figure 2 : Visualisation d'E. coli encapsulée par microscopie électronique de transmission (MET). , io ati r ~emières Isopar M~ (EXXON) Densité à 15°C : 0,786 Arlacel 83~ (ICI) Sesquioléate de sorbitan HEC (SIGMA ALDRICH) Hydroxyéthylcellulose ls Solution aqueuse d'ammoniaque (NH40H) Densité à 20°C : 0,880 Concentration en NH3 : 20 Silicate de méthyle : Si(OMe)4 Masse molaire : 156 g 2o Densité à 20°C : 1,032 Tampon phosphate de sodium à pH 7.
Escherichia Coli K12 exprimant une ~i-galactosidase.
zs x mil 1 ~ Enca~sulation de E. Coli Phase aqueuse : H20 43,40 g 3o HEC 2,61 g (6 %leau) NH3 5,00 g (1 mol/l) E. Coli 4 g (soit 1 g de cellules sèches) WO 00/25761 PCT/FR99/02'614 Phase organique : Arlacel 83~ 17,35 g Isopar M ~ 850 g tétraméthylorthosilane ~ TMOS 28,5 g s On homogénéise le HEC dans l'eau épurée au bain marie à 40°C
pendant 20 minutes environ. On obtient ainsi un mélange visqueux jaune io limpide. On y ajoute alors les cellules puis la solution aqueuse ammoniacale.
Per giration de ia hap se organi ue On solubilise fArcacel 83~ dans flsopar M~.
ls Per paration de l'émulsion La phase organique et la phase aqueuse sont émulsifiées à l'aide d'un Ultraturrax~, on obtient ainsi une émulsion eau/huife présentant une 2o stabilité de plusieurs heures. La taille des gouttelettes est voisine de la dizaine de microns.
2s Dans un tricot de 2 litres muni d'un barreau aimanté, on introduit l'émulsion préparée précédemment.
On y ajoute le tétraméthylorthosilane TMOS(28,5 g) avec un débit de 0,5 ml/min. (durée de l'introduction de TMOS = 1 heure) à 25°C.
3o Les particules obtenues sont séparées et lavées au méthanol puis 2 fois au tampon phosphate par centrifugation puis séchées à température ambiante pendant une nuit.

W O 00/25761 PC'T/FR99/02514 La taille des particules de silice qui constitue l'écorce est voisine de quelques nanométres.
s Les capsules présentent une taille de l'ordre d'une dizaine de Nm (MEB). L'encapsulation des bactéries est parfaitement visualisée par MET
(microscopie électronique de transmission), ainsi que la porosité de la capsule.
Les photographies présentées en figures 1 et 2 rendent compte de lo l'aspect de ces capsules.
xem;ple 2 ~ détermination de l'activité enzyrmatiyue des bioca~gules is L'activité enzymatique de la ~i-galactosidase de E. Coli est déterminée après hydrolyse enzymatique du para-nitrophényle-~i-D-galactoside (p-NPG) en p-nitrophénol. La mesure quantitative du p-nitrophénol par spectrophotométrie permet d'en déduire l'activité enzymatique des biocapsules.
2o L'activité enzymatique des biocapsufes de l'exemple 1 est exprimée en Nmolelhlmg de CS (cellules sèches), ceci comparativement à la bioactivité des cellules de départ. L'activité enzymatique des cellules de départ est de 0,2 Nmolelhlmg de CS, le rendement d'activité des biocapsules est d'environ 50 %. L'activité des cellules est donc bien préservée.
2s Y m~,[g 3 ~ Obtention de ca osules de silice, avec une taille des r~articules ~onstit~ant l'écorce de au_ algues nanomètres.
3o Con~nosition globale du milieu réactionael Phase aqueuse : H20 43,40 g HEC 2,61 g (6 %/eau) NH3 5,0 g (1 molli) E. Coli 4 g (soit 1 g de cellules sèches) Phase organique : Arlacel 83~ 17,35 g (2,04 %/lsopar) Isopar M ~ 850 g TEOS 39 g s On homogénéise le HEC dans l'eau épurée au bain marie à 40°C
pendant 20 minutes environ. On obtient ainsi un mélange visqueux jaune lo limpide. On y ajoute alors les cellules puis la solution aqueuse ammoniacale.
On solubilise l'Arcacel 83 ~ dans l'Isopar M ~.
ls pro arp ation de l'émulsion La phase organique et la phase aqueuse sont émulsifiées à l'aide d'un ultraturrax, on obtient ainsi une dispersion eaulhuile présentant une 2o stabilité de plusieurs heures. La taille des gouttelettes est voisine de la dizaine de microns.
2s Dans un tricot de 2 litres d'un barreau aimanté, on introduit l'émulsion préparée précédemment.
On y ajoute le silicate d'éthyle (39 g) avec un débit de 0,8 ml/min (durée de l'introduction de TEOS = 1 heure) à 25°C.
Les capsules obtenues sont séparées et lavées 1 fois à l'éthanol 3o puis 2 fois au tampon phosphate puis séchées à température ambiante pendant une nuit.

La taille des capsules est comprise entre 1 et une dizaine de Nm (MEB).
s La taille des particules de silice constitutrices de l'écorce est de quelques nanomètres. Les observations faites par MET mettent clairement en évidence l'encapsulation des bactéries par la capsule de silice.
to -Rytl-e 4 ~ Obtention dg caRsules amac TMOS et co-alcoxvde (fNH~
Q,1 molli).
is Phase aqueuse : H20 43,40 g HEC 2,61 (6 %leau) g NH3 0,37 soit [NH3] = 0,1 mol/l g E. Coli 4 g (soit 1 g de cellules sches) Phase organique : Arlacel (2,04 %/lsopar) 83~ 17,35 g 2o Isopar M ~ 850 g Phase organique 2 : TMOS 22,8 g O-TMOS 5,7 g 2s On homogénéise le HEC dans l'eau épurée au bain marie à 40°C
pendant 20 minutes environ. On obtient ainsi un mélange visqueux jaune limpide. On y ajoute alors les cellules puis la solution aqueuse ammoniacale (0,37 g).
On solubilise fArcacel 83~ dans flsopar M~.

WO 00/25761 PCT/FR99/OZÖ14 Per' paration de l'émulsion La phase organique 1 et la phase aqueuse sont émulsifiées à
s l'aide d'un ultraturrax, on obtient ainsi une dispersion eau/huile présentant une stabilité de plusieurs heures. La taille des gouttelettes est voisine de la dizaine de microns.
io Dans un tricot de 2 litres muni d'un barreau aimanté, on introduit l'émulsion préparée précédemment.
On y ajoute le mélange d'alcoxydes (phase organique 2) avec un débit de 0,5 ml/min (la durée de l'introduction est de 1 heure) à 25°C.
is Les particules obtenues sont séparées et lavées au méthanol puis séchées à température ambiante pendant une nuit. Les particules ainsi obtenues sont hydrophobes.
La taille des particules est comprise entre 1 et une dizaine de Nm (MEB).
La taille des particules de silice constitutrices de l'écorce est de quelques nanomètres (MET). 4 As opposed to the conventional encapsulation systems mentioned above, the biological active material is in the case of the present invention not adsorbed in a dispersed form within a matrix but concentrated in a liquid medium which is isolated from the surrounding medium by a s mineral bark.
For the purposes of the present invention, the term “liquid medium” means a medium capable of ensuring the conservation of the activity and the structure and / or the survival and if necessary, the internal development of a biological active material, medium being in a fluid type of liquid type. As such, it differs from ~ o alginate or carrageenan type media which are similar to environments in gel form.
It can in particular be the natural biological environment of the material immobilized biological active. Generally this liquid biological medium is or derives from an aqueous medium.
is Of course, this liquid medium can be buffered and / or supplemented with trace elements, sugars, salts and any other nutrient likely to be necessary for the conservation of the activity and the structure and or survival and, where appropriate, internal development of the active ingredient immobilized biological.
2o These active ingredients, depending on their water-soluble nature, are either solubilized or dispersed in the liquid medium.
The mineral bark obtained according to the process of the invention 'has for double advantage of effectively protecting the liquid medium and the active) that it contains, and if necessary to allow its exchanges 2s with the surrounding medium of the capsules. This is notably achieved by adjusting the degree of porosity of the mineral capsules obtained according to the invention.
According to a first variant of (invention, the mineral capsules obtained can be non-porous. This specificity is more particularly advantageous when it is essentially desired to provide protection 3o effective liquid medium, incorporating at least one active material organic, with respect to its surrounding environment. As opposed to the microcapsules obtained by interfacial polycondensation and which consist of a bark organic, the capsules obtained according to the invention are much more mechanically, thermally and chemically resistant due to the mineral character of their bark. In this particular case, the aqueous medium and the if necessary the active ingredient it contains are generally released by fractionation of the capsule or by induced degradation thereof.
According to a second variant of the invention, the capsules obtained can be porous and this porosity is controllable. This presents uri significant interest when it is desired, in addition to protecting the liquid medium and the active substance it contains, allow its exchanges with the environment surrounding of said capsules.
lo In fact, this adjustment of the porosity as well as that of the size of the capsules are accomplished through mainly the choice of material mineral constituting the mineral bark or more precisely the choice of precursor of this material. This aspect of the invention is discussed in a way more detailed below.
is The present invention is therefore particularly advantageous in insofar as it offers a reliable packaging method, compatible with internal development of immobilized and modular active ingredients in depending on the nature and the amount of active ingredients) immobilized.
2o The preservation within the capsule of a liquid medium which can to be the natural biological environment of the immobilized active ingredient is a guarantee of prolonged operation of said active ingredient, operation which can, for example, result in the production of metabolites or enzymatic.
2s The mineral nature of the bark of the claimed capsules constitutes an effective protective barrier to the biological active material Visa-vis-à-vis the surrounding environment while allowing if necessary its exchanges with this one.
The size of the capsules being manageable, it can be adjusted in 3o depending on the constraints linked to the size of the active ingredients to encapsulate or one of these biological active ingredients.
Finally, this capsule is prepared in the context of this invention under operating conditions gentle enough not to affect the integrity of said active ingredients. The active ingredient to immobilize is not exposed during its conditioning to values of temperature and where appropriate pH likely to harm it.
s Regarding the composition of the mineral bark, it is consisting of at least one oxide and / or aluminum hydroxide, silicon, d ~
zirconium and / or a transition metal.
By transition metal is meant more particularly the metals of the fourth period going from scandium to zinc insofar as these io are of course compatible in terms of safety with the application aimed. II
more particularly it is an oxide or hydroxide of titanium, manganese, iron, cobalt, nickel or copper.
Of course, this mineral bark can include oxides and / or hydroxides of different natures.
is more particularly suitable for the present invention the oxides and / or hydroxides of silicon, aluminum, titanium and zirconium.
According to a preferred embodiment of the invention, the capsules comprise a mineral shell based on at least one silicon oxide.
2o In general, the size of the capsules according to the invention can be between 1 and several tens of micrometers. The size of particles of the mineral material making up the bark of these capsules can vary for its part between 1 and 200 nm.
As regards more particularly the thickness of the bark 2s mineral, it can vary between 1 and 200 nm.
These capsules can also be characterized by the amount of liquid medium that the mineral bark retains by introducing the parameter retention of the capsule. This corresponds to the ratio of the mass of the medium liquid contained in the capsule and that of the mineral bark.
3o When the bark is too porous, the retention of the capsule is low. We can therefore vary the retention of the capsules by fixing the size of particles of the material constituting the mineral crust as well as the thickness of the latter.

WO 00/25761 PCT / FR99 / 02b14 The present invention also relates to a useful method for preparing mineral capsules in accordance with the present invention, said process comprising s 1) the emulsification of a liquid medium containing at least one biological active material in a second phase immiscible with said liquid medium so as to disperse in the form of droplets, 2) bringing into contact, within the inverse emulsion thus obtained, at least one hydrolyzable and polycondensable compound of zirconium, silicon, lo aluminum and / or a transition metal under temperature conditions and of pH suitable for the formation of a precipitate consisting of the oxide or hydroxide correspondent and 3) the recovery of the mineral capsules thus formed and the case if necessary their purification, is said process being characterized in that the formation of the mineral precipitate in the second step is carried out in the presence of an amphiphilic surfactant system, present at the level of the emulsion and capable of concentrating the deposition of mineral particles of said precipitate formed at the interface of the droplets and of the second phase and effectively block their dissemination within said zo droplets.
The amphiphilic surfactant system proposed according to the invention has for advantage of blocking the natural diffusion phenomenon of particles towards the center of the droplets.
For the purposes of the invention, the term “surfactant system” is intended to denote zs amphiphile is a unique compound in which two regions coexist with very different solubilities and sufficiently distant one of Other to behave independently, an association of at least two compounds with very different solubilities such as a first compound with hydrophilic character and a second compound with character 3o hydrophobic. Generally these two regions or compounds include respectively at least one hydrophilic group and one or more long hydrophobic chains.

WO 00/25761 PCT / FR99 / 02ô14 Consequently, the surfactant system used according to the invention can be represented by a single compound and which will then be introduced prior to the completion of the second step, i.e.
the stage hydrolysis and polycondensation or even the result of an in situ interaction s of at least two compounds, for example an organosoluble surfactant initially present in the second phase, generally organosoluble and ur ~
water-soluble compound present in the generally aqueous liquid medium. We can also consider a coupling or a complexation between a first organosoluble agent and a second organosoluble agent of ionic nature io as a quaternary ammonium. The two compounds meet at the interface of the droplets formed during the emulsification. Because of their interaction, they contribute on the one hand to stabilize the system by decreasing the interfacial tension at (interface of the droplets and act presumably as a steric or electrostatic barrier.
is In the claimed process, more particularly preferred is the embodiment using at least two separate compounds capable of interacting to lead to a surfactant system capable of opposing effectively at the diffusion of mineral particles in the droplets 2o aqueous and to stabilize said emulsion.
The surfactant system proposed according to the invention comprises preferably at least one surfactant with an HLB value of less than 7.
The term HLB designates the hydrophilicity ratio of the groups of the surfactant molecule on the hydrophobicity of the part lipophilic zs this same molecule.
In this particular case, the two compounds are preferably respectively present in the liquid medium, generally aqueous and the second phase generally organosoluble and interact with one another the other when the liquid medium is emulsified in said second phase.
3o This option has the advantage of giving the emulsion corresponding satisfactory stability from its formation. What's more, it is possible, if necessary, by selecting the appropriate agents constituting the amphiphilic surfactant system, to adjust the pH to a value compatible with the active ingredient.
As regards the emulsification, it can be carried out in applying intense mechanical agitation energy to the two phases initials, s and / or sonication. The size of the droplets obtained after the stage of emulsification can be between about 0.1 and ten pm.
The compound present in the liquid medium, generally aqueous preferably has a viscosifying action.
More particularly, this compound can be a chosen compound among sugars and their derivatives. The dares (or monosaccharides), strongly depolymerized osides and polyholosides. We means compounds of which the mass by weight is more particularly less than 20,000 glmole.
ls Among the dares one can mention the aldoses such as the glucose, mannose, galactose and ketoses such as fructose.
Osides are compounds that result from condensation, with elimination of water, of dose molecules with molecules not carbohydrates. Among the osides, we prefer holosides which are formed by ta 2o meeting of exclusively carbohydrate patterns and more particularly the oligoholosides (or oligosaccharides) which contain only a limited number of these patterns, that is to say a number generally less than or equal to 10. A
title examples of oligoholosides include sucrose, lactose, cellobiose, maltose.
2s Polyholosides (or polysaccharides) highly depolymerized suitable are described for example in the work of P. ARNAUD entitled "Course in organic chemistry", LUTHIER-VILLARS éditeurs, 1987. More in particular, polyholosides are used whose molecular mass by weight is more particularly less than 20,000 g / mole.
3o By way of nonlimiting example of potyholosides strongly depolymerized, there may be mentioned dextran, starch, xanthan gum and galactomannans such as guar or carob. These polysaccharides preferably have a melting weight greater than 100 ° C and a solubility in water between 10 and 500 g / l.
Also suitable for the invention are gum arabic, gelatin and their fatty derivatives such as fatty acid sucroesters, s alcohol carbohydrates such as sorbitol, mannitol, ether carbohydrates such as methyl-, ethyl-, carboxymethyl-, hydroxyethyl- and hydroxypropyl-cellulose ethers and glycerols, pentaerythrol, propylene glycol, ethylene glycol, non-viscous diols and / or polyvinyl alcohols.
It is preferably a hydrocolloid. As representative of lo this type of compound include alginates, natural gum-like polysaccharides such as carrageenans, xanthan and guar and especially cellulose derivatives.
Preferably, it is a cellulose derivative and more preferably hydroxyethylcellulose.
ls The surfactant (s) generally organosoluble (s) present) at the level of the second phase can be chosen) from fatty alcohols, triglycerides, fatty acids, sorbitan esters, amines oily, these compounds being or not in a polyalkoxylated form, the lecithins 20 fat-soluble, polyalkylenes dipolyhydroxystearates, ammonium salts quaternaries, monoglycerides, polyglycerol esters, polyricinoleate polyglycerol and lactic esters.
Fatty alcohols generally contain from 6 to 22 atoms of carbon. Triglycerides can be triglycerides of plant origin or 2s animal (such as lard, tallow, peanut oil, butter, oil cottonseed, linseed oil, olive oil, fish oil, oil coconut, coconut oil).
Fatty acids are fatty acid esters (such as by example oleic acid, stearic acid).
3o Sorbitan esters are acid cyclized sorbitol esters fatty comprising from 10 to 20 carbon atoms such as lauric acid, acid stearic or oleic acid.

According to a preferred embodiment of the invention, this surfactant is an ester sorbitan as defined above and more preferably the sesquioleate from sorbitan.
As is clear from the preceding discussion, the compound present in s the generally aqueous liquid medium must interact with the surfactant present in the second generally hydrophobic phase to lead to a system surfactant capable of constituting an effective diffusion banner to with regard to particles of the mineral precipitate. As a result, their respective choices have to be done with this imperative in mind.
lo Of course the nature of the active material to be encapsulated likewise that the composition of the mineral bark of the capsules prepared according to the invention are also decisive elements in the choice of the system surfactant and the appreciation of the respective amounts of the two compounds correspondents. These adjustments are in fact human skills ls of art.
In the particular case where privileging according to the invention is the setting using a single compound of amphiphilic type are suitable particularly those corresponding to general formula I
2o R2 (A) ~ L ~ '(CHR ~~ C] ~ NQ
gg I
in which R2 represents an alkyl or alkenyl radical comprising 7 to 22 zs carbon atoms, R ~ represents a hydrogen atom or an alkyl radical comprising 1 to 6 carbon atoms, A represents a group (CO) or (OCH2CH2), n is 0 or 1, x is 2 or 3, y is 0 to 4, Q represents a radical -R3-COOM with R2 representing an alkyl radical comprising 1 to 6 atoms of carbon, M represents a hydrogen atom, an alkali metal, a metal 3o alkaline earth or a quaternary ammonium group in which the radicals linked to the nitrogen atom, identical or different, are chosen among hydrogen or an alkyl or hydroalkyl radical having 1 to 6 atoms of carbon, and B- represents H or Q.

Preferably, M represents a hydrogen atom, sodium, potassium and an NH4 group.
Among these surfactants corresponding to formula I, more particularly the amphoteric derivatives of alkyl polyamines such as s the amphionic XL ~, the Mirataine H2C-HA ~ marketed by Rhodia Chimie as well that fAmpholac 7T / X ~ marketed by Berol Nobel.
It is also possible to use a non-main surfactant.
ionic whose hydrophilic part contains one or more units) saccharide (s).
Said saccharide units generally contain from 5 to 6 atoms of ~ o carbon. These can be derived from sugars like fructose, glucose, the mannose, galactose, talose, gulose, allose, altose, fidose, farabinose, xylose, lyxose and / or ribose.
Among these surfactants with a saccharide structure, it is possible to mention the alkylpolyglycosides. These can be obtained by ls condensation (for example by acid catalysis) of glucose with alcohols primary fats (US-A-3,598,865; US-A-4,565,647; EP-A-132,043; EP-A-132 046; Tenside Surf. Det. 28, 419, 1991, 3; Langmuir 1993, 9, 3375-3384) having a C4-C2o alkyl group, preferably of the order of 1.1 to 1.8 through mole of alkylpolyglycoside (APG); we can mention in particular those 2o marketed respectively under the names GLUCOPON 600 EC ~, GLUCOPON 650 ECm, GLUCOPON 225 CSUP ~, by HENKEL.
As an illustration, the concentration of amphiphilic surfactant system can be between approximately 1% and 10% by weight relative to the phase organosoluble.
2s According to a preferred mode of (invention, the surfactant incorporated at the level of the generally organosoluble second phase, is an ester of sorbitan and more preferably sorbitan sesquioleate. As to compound incorporated in the liquid medium, it is preferably a derivative cellulose and more particularly hydroxyethyl cellulose.
3o According to a preferred embodiment of the invention, the material of (mineral bark derives from hydrolysis and polycondensation of one or many alkoxides of formula II.

M (R) ~ (P ~ "II
in which - M represents an element chosen from titanium, manganese, iron, cobalt, nickel, silicon, aluminum or zirconium, s - R is a hydrolyzable substituent, - n is an integer between 1 and 6, - P is a non-hydrolyzable substituent and - m is an integer between 0 and 6.
According to a preferred embodiment of the invention lo - M is chosen from silica, aluminum, titanium and zirconium, - R is a group chosen from alkoxy and / or aryloxy groups in C ~ to C ~ s and preferably in Cz to C8 and n is an integer between 2 and 4 and P is a group chosen from C 1 to C 6 alkyl groups, ls C2 to C8 aryls or alkenyls.
Regarding R, it is preferably a group C ~ to Cg alkoxy and more preferably C2 to C4. This alkoxy group may optionally be substituted by a C ~ alkoxy or alkoxy group C4 or a halogen atom. In general formula II, R can represent 2o identical or different alkoxy groups.
Of course, it is possible to use several compounds of formula II.
As previously discussed, it turns out to be possible through the 2nd choice of this mineral hydrolyzable and polycondensable compound to adjust the porosity and size of capsules.
Likewise, we can confer a more or less character hydrophobic to the capsule by playing on nature and for example the length of alkyl chains and / or alkoxy constituting this hydrolyzable compound and 3o mineral polycondensable.

Generally, the hydrolysis and polycondensation of this mineral precursor occurs either spontaneously by bringing together this with the emulsion either are initiated by adjusting the pH and / or the temperature of the emulsion at a value conducive to their manifestation. This s adjustment may in particular arise from the presence in the ion emulsion water-soluble like NH40H, NaOH or HCI or organosoluble type amines. These adjustments fall within the competence of a person skilled in the art.
According to a preferred variant of the present invention, the bark mineral obtained according to the invention is based on silicon oxide. She derives of lo the precipitation of at least one silicate.
As the silicate suitable for the present invention, there can be more particularly mention tetramethylorthosilicate, TMOS, tetraethylorthosilicate, TEOS, tetrapropylorthosilicate, TPOS, alkylalkoxysilanes and haloalkylsilanes.
ls According to a particular embodiment of (invention, the capsule mineral is obtained by formation of a mineral precipitate in the presence of a agent for hydrolysis and condensation of said compound.
The hydrolysis of these silicon alkoxides can be done as well 2o in acid catalysis than in basic catalysis provided that the oxides and / or corresponding hydroxides are obtained in pulverulent form.
Preferably, a silicon alkoxide such as tetraethylorthosilicate, TEOS, in the presence of ammonia, as an agent hydrolysis and polycondensation.
2s The second phase is generally an oily phase not miscible with the generally aqueous liquid medium and is preferably composed of an oil chosen from vegetable, animal and mineral. It can for example be a parrafinic oil or an oil of 3o silicone.
However, one can also consider implementing other organic solvents such as perfluorinated solvents provided that these solvents are used under appropriate conditions, for example under form of a mixture to lead to an emulsion with the liquid medium.
As a second phase particularly suitable for the invention, mention may in particular be made of the solvent Isopar ~ which is a isoparrafine s sold by Exxon Chemicals.
This second phase comprises at least one surfactant generally organosoluble which is preferably chosen from esters of sorbitan and more preferably is represented by the sesquioleate of sorbitan.
lo As regards the generally aqueous liquid medium, it comprises at least one hydrocolloid, optionally the hydrolysis agent and polycondensation of the mineral hydrolyzable and polycondensable precursor.
As regards the hydrocolloid, it is preferably a ls derivative of cellulose and more preferably of hydroxyethylcellulose.
The mineral capsules according to the invention are particularly interesting for uses in fermentation fields biomedical, food and chemical industry.
2o We can thus consider immobilizing, within the capsules claimed, cells possessing an activity which is interesting for the production of pharmaceuticals, metabolites and / or reagents as chemical or pharmaceutical synthesis intermediates or still biodegradable polymers.
2s The immobilization according to the invention of microorganisms of the type yeast or bacteria is also particularly interesting for industry food and especially for the dairy and wine industries.
Immobilized enzymes according to (invention can represent the reagents of choice in many manufacturing processes 3o industrial for catalytic or analytical methods.
Likewise we can consider using capsules according to the invention based on living cells or enzymes in the treatment sewage or waste.

WO 00/25761 PCT / FR99 / 02ô14 The following examples and figure are presented as illustrative and not limiting of the object of the present invention.
s Fjg ~
- Figure 1: Photograph by scanning microscopy (SEM) of capsules according to the invention incorporating E. coli.
- Figure 2: Visualization of E. coli encapsulated by transmission electron microscopy (TEM). , io ati r ~ emières Isopar M ~ (EXXON) Density at 15 ° C: 0.786 Arlacel 83 ~ (HERE) Sorbitan sesquioleate HEC (SIGMA ALDRICH) Hydroxyethylcellulose ls Aqueous ammonia solution (NH40H) Density at 20 ° C: 0.880 NH3 concentration: 20 Methyl silicate: Si (OMe) 4 Molar mass: 156 g 2o Density at 20 ° C: 1.032 Sodium phosphate buffer at pH 7.
Escherichia Coli K12 expressing an ~ i-galactosidase.
zs x mil 1 ~ Enca ~ sulation by E. Coli Aqueous phase: H20 43.40 g 3o HEC 2.61 g (6% water) NH3 5.00 g (1 mol / l) E. Coli 4 g (i.e. 1 g of dry cells) WO 00/25761 PCT / FR99 / 02'614 Organic phase: Arlacel 83 ~ 17.35 g Isopar M ~ 850 g tetramethylorthosilane ~ TMOS 28.5 g s The HEC is homogenized in purified water in a water bath at 40 ° C.
for about 20 minutes. A yellow viscous mixture is thus obtained io clear. Then add the cells and then the aqueous solution ammonia.
Per haperation of the hap is organized We solubilize fArcacel 83 ~ in flsopar M ~.
ls Preparation of the emulsion The organic phase and the aqueous phase are emulsified using of an Ultraturrax ~, a water / oil emulsion having a 2o stability of several hours. The size of the droplets is close to the ten microns.
2s In a 2 liter knitted fabric fitted with a magnetic bar, we introduce the emulsion previously prepared.
Tetramethylorthosilane TMOS (28.5 g) is added thereto with a flow rate 0.5 ml / min. (duration of introduction of TMOS = 1 hour) at 25 ° C.
3o The particles obtained are separated and washed with methanol then 2 times in phosphate buffer by centrifugation then dried at temperature room overnight.

WO 00/25761 PC'T / FR99 / 02514 The size of the silica particles which constitute the bark is close to a few nanometers.
s The capsules have a size of around ten Nm (MEB). The encapsulation of bacteria is perfectly visualized by MET
(transmission electron microscopy), as well as the porosity of the capsule.
The photographs presented in Figures 1 and 2 show lo the appearance of these capsules.
xem; ple 2 ~ determination of the enzymatic activity of the bioca ~ capsules is The enzymatic activity of the ~ i-galactosidase of E. Coli is determined after enzymatic hydrolysis of para-nitrophenyl- ~ iD-galactoside (p-NPG) to p-nitrophenol. Quantitative measurement of p-nitrophenol by spectrophotometry allows to deduce the enzymatic activity of biocapsules.
2o The enzymatic activity of the biocapsules of Example 1 is expressed in Nmolelhlmg of CS (dry cells), this compared to the bioactivity of the starting cells. The enzymatic activity of the cells of departure is 0.2 Nmolelhlmg CS, the activity yield of the biocapsules is about 50%. The activity of the cells is therefore well preserved.
2s Y m ~, [g 3 ~ Obtaining ca silica osules, with a size of the joints ~ onstit ~ ant the bark of au_ nanometer algae.
3o Global con ~ nition of the reaction medium Aqueous phase: H20 43.40 g HEC 2.61 g (6% / water) NH3 5.0 g (1 molli) E. Coli 4 g (i.e. 1 g of dry cells) Organic phase: Arlacel 83 ~ 17.35 g (2.04% / lsopar) Isopar M ~ 850 g TEOS 39 g s The HEC is homogenized in purified water in a water bath at 40 ° C.
for about 20 minutes. A yellow viscous mixture is thus obtained lo clear. Then add the cells and then the aqueous solution ammonia.
The Arcacel 83 ~ is dissolved in Isopar M ~.
ls emulsion pro arp ation The organic phase and the aqueous phase are emulsified using of an ultraturrax, an oil-oil dispersion is thus obtained 2o stability of several hours. The size of the droplets is close to the ten microns.
2s In a knitting of 2 liters of a magnetic bar, we introduce the emulsion previously prepared.
Ethyl silicate (39 g) is added thereto with a flow rate of 0.8 ml / min (duration of introduction of TEOS = 1 hour) at 25 ° C.
The capsules obtained are separated and washed 1 time with ethanol 3o then 2 times in phosphate buffer and then dried at room temperature for a night.

The size of the capsules is between 1 and ten Nm (MEB).
s The size of the silica particles constituting the bark is a few nanometers. The observations made by MET clearly highlight evidence of the encapsulation of bacteria by the silica capsule.
to -Rytl-e 4 ~ Obtaining amac TMOS caRsules and co-alkoxide (fNH ~
Q, 1 molli).
is Aqueous phase: H20 43.40 g HEC 2.61 (6% water) g NH3 0.37 or [NH3] = 0.1 mol / l g E. Coli 4 g (i.e. 1 g of cells sches) Organic phase: Arlacel (2.04% / lsopar) 83 ~ 17.35 g 2o Isopar M ~ 850 g Organic phase 2: TMOS 22.8 g O-TMOS 5.7 g 2s The HEC is homogenized in purified water in a water bath at 40 ° C.
for about 20 minutes. A yellow viscous mixture is thus obtained clear. Then add the cells and then the aqueous ammonia solution (0.37 g).
We solubilize fArcacel 83 ~ in flsopar M ~.

WO 00/25761 PCT / FR99 / OZÖ14 Preparation of the emulsion The organic phase 1 and the aqueous phase are emulsified at s using an ultraturrax, a water / oil dispersion is thus obtained presenting a stability for several hours. The size of the droplets is close to the ten microns.
io In a 2 liter knitted fabric fitted with a magnetic bar, we introduce the emulsion previously prepared.
The mixture of alkoxides (organic phase 2) is added with a flow rate of 0.5 ml / min (the duration of the introduction is 1 hour) at 25 ° C.
is The particles obtained are separated and washed with methanol then dried at room temperature overnight. The particles as well obtained are hydrophobic.
The particle size is between 1 and ten Nm (MEB).
The size of the silica particles constituting the bark is a few nanometers (MET).

Claims

1. Mineral capsule consisting of a mineral shell and a liquid core in which at least one active ingredient is immobilized organic.

2. Capsule according to claim 1, characterized in that the mineral shell consists of at least one oxide and/or hydroxide aluminum, silicon, zirconium and/or a transition metal.

3. Capsule according to claim 1 or 2, characterized in that that the mineral shell consists of at least one oxide and/or hydroxide of silicon, aluminum, titanium and zirconium.

4. Capsule according to claim 3, characterized in that the mineral shell comprises at least one silicon oxide.

5. Capsule according to one of the preceding claims, characterized in that the liquid medium constituting the core of said capsule corresponds to the natural biological environment of the biological active ingredient immobilized.

6. Capsule according to one of the preceding claims, characterized in that the liquid medium constituting the core of said capsule is conducive to the conservation of the structure and activity of matter active biological immobilized.

7. Capsule according to one of claims 1 to 6, characterized in that the liquid medium constituting the core of said capsule is conducive to internal development of the immobilized biological active ingredient.

8. Capsule according to one of the preceding claims, characterized in that the biological active ingredient is chosen from cellular organisms such as microorganisms such as bacteria, yeasts, fungi, algae, cells of animal or plant origin, enzymes or proteins.

9. Capsule according to claim 8, characterized in that it are living cells or organisms.

10. Capsule according to one of the preceding claims, characterized in that it has a size between 1 and several ten micrometers.

11. Capsule according to one of the preceding claims, characterized in that its mineral shell has a thickness varying between 1 and 200 nm.

12. Process for the preparation of capsules according to one of claims 1 to 11, said method comprising 1) the emulsification of a liquid medium containing at least one biological active material within a second phase immiscible with said liquid medium so as to disperse it therein in the form of droplets, 2) bringing into contact, within the emulsion thus obtained, with at least one hydrolyzable and polycondensable compound of zirconium, silicon, aluminum and/or a transition metal under temperature conditions and pH favorable to the formation of a precipitate consisting of the oxide or hydroxide corresponding and 3) the recovery of the mineral capsules thus formed and the case their purification, said method being characterized in that the formation of the mineral precipitate in the second step is carried out in the presence of an amphiphilic surfactant system, present at the level of the emulsion and capable of concentrating the deposit of mineral particles of said precipitate formed at the interface of the droplets and of the second phase and to effectively block their dissemination within the said droplets.

13. Method according to claim 12, characterized in that the amphiphilic surfactant system results from the in situ interaction between a first compound present in the second phase and a compound present in the medium liquid.

14. Method according to claim 12 or 13, characterized in that that the surfactant system comprises at least one surfactant with a value HLB less than 7.

15. Method according to one of claims 12 to 14, characterized in that the surfactant present in the second phase is an ester of sorbitan.

16. Method according to one of claims 12 to 15, characterized in that the compound present in the liquid medium is a derivative of cellulose.

17. Method according to one of claims 12 to 16, characterized in that the emulsion is obtained mechanically and/or by sonication.

18. Method according to one of claims 12 to 17, characterized in that the hydrolyzable and polycondensable compound corresponds to the formula General II:

M(R)n(P)m II

in which :
- M represents an element chosen from titanium, manganese, iron, cobalt, nickel, silicon, aluminum or zirconium, - R is a hydrolyzable substituent, - n is an integer between 1 and 6, - P is a non-hydrolyzable substituent and - m is an integer between 0 and 6.

19. Method according to claim 18, characterized in that it it is preferably a silicon alkoxide.

20. Process according to claim 19, characterized in that the silicon alkoxide is chosen from tetramethylorthosilicate, tetraethylorthosilicate and tetrapropylorthosilicate.

21. Method according to one of claims 12 to 20, characterized in that the formation of the precipitate is carried out in the presence of an agent hydrolysis and condensation of said compound.

22. Method according to claim 21, characterized in that the hydrolysis and polycondensation agent is ammonia.

23. Use of the capsules according to one of claims 1 to 11 in fermentation, biomedical, food and chemical industry.