CA2298062A1

CA2298062A1 - Genetic and protein therapy products for treating cystic fibrosis and inducing a glutathione-s-transferase function

Info

Publication number: CA2298062A1
Application number: CA002298062A
Authority: CA
Inventors: Gerard Lenoir; Joel Barthe; Jean-Yves Lallemand; Veronique Stoven; Jean-Philippe Annereau
Original assignee: Individual
Current assignee: Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date: 1997-07-31
Filing date: 1998-07-30
Publication date: 1999-02-11
Also published as: EP1025222A1; WO1999006547A3; WO1999006547A2; PL338852A1; JP2001512010A; AU8986198A; FR2766841A1

Abstract

The invention concerns a DNA molecule containing a DNA sequence whereof the expression product has a common peptide sequence with part of that of CFTR, in particular the one extending from the 430<th> to the 660<th> residue of the latter and having a glutathione carrier function. Said DNA molecule is useful for constructing vectors useful in gene therapy for treating cystic fibrosis.

Description

WO 99/06547 PC'T/FR98/Ot704 PRODUITS DE TfIERAPIE GÉNIQUE ET PROTÉIQUE DE LA MUCOVISCIDOSE ET INDUCTEURS
D'UNE FONCTION
DE GLUTATHION-S-TRANSFERASE
La mucoviscidose, aussi parfois dénommée fibrose kystique, est réputée causée par des mutations dans le gène codant pour la protéine dite CFTR, selon l'abréviation de l'expression anglaise « Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator » (Régulateur de la conductance transmembra-paire de la Fibrose Kystique).
io La séquence nucléique codant pour cette protéine CFTR qui comporte 1480 résidus d'acides aminés, a été clonée et identifiée par Riordan J.R. et al., « identification of the Cystic Fibrosis Gene: Cloning and Characterization of Complementary DNA » (1989) Science 245:1066-1072.
La séquence codante pour la protéine CFTR est également reproduite dans la figure 1 de la demande PCT W0/9102796 rendue publique le 7 mars 1981 et dont Riordan lui-même est aussi l'un des co-inventeurs. Cette demande PCT -et d'autres qui ont suivi- décrivent effectivement le clonage de la séquence codante et son expression dans un certain nombre d'organismes.
2o Selon une hypothèse récurrente dans fa littérature scientifique, la protéine CFTR normale posséderait une fonction dite « canal chlore » ou « canai à ions chlorure », en d'autres termes réglerait des transferts d'anions, plus particulièrement d'ions chlorure (CI-), hors des cellules épithéliales, vers l'extérieur, sous l'effet de sa phosphoryiation par une ?s protéine kinase dépendant de l'AMP cyclique (CAMP) ou protéine-kinase C
. (Riordan, J.R. et al. (1989) Science 245:1066-1073 ; Frizzell, R.A. et al.
(1986) Science 233:558-560 ; Welsh, M.J. and Liedtke, C.M. (1986) Nature 322:467 ; Li, M. et aI. {1988) Nature 331:358-360 ; Hwang, T-C. et al.
{7989) Science 244:1351-1353).
3o A 37°C, la protéine CFTR passerait aussi du réticulum endoplasmique à l'appareil de Golgi, et de là dans la membrane plasmique comme rappelé par Ko et al., (1997) Biochemistry 36:5053-5064, qui renvoient eux-mémes à des auteurs antérieurs.
De nombreuses mutations de la CFTR ont été observées chez des patients atteints de mucoviscidose.
s Des études épidémiologiques effectuées dans des populations atteintes ont révélé dans approximativement 70% des cas une mutation CF
(abréviation de l'expression anglaise « Cystic Fibrosis ») ou délétion des 3 nucléotides codant pour le résidu phénylatanine à ta position 508 de la séquence en acides aminés de la CFTR. Le site de cette mutation se io trouverait localisé plus particulièrement dans la région dite NBF1 (abréviation de l'expression anglaise « Nucleotide Binding Fold I » (ou Région repliée de nuciéotides)) qui contiendrait le premier domaine de fixation de l'ATP dans CFTR et qui, selon Ko et al. déjà cité s'étendrait du résidu Phénylalamine 433 (P433) au résidu Sérine 589 (S~gg). Cette is mutation est souvent tenue pour responsable d'un défaut de repliement du domaine NBF1 dans les cellules alors CF-défectives des patients, défaut qui entraînerait un blocage de la CFTR ainsi mutée (dénommée OF508) dans les organelles intracellulaires (golgi, reticulum endoplasmique), puis sa destruction avant qu'elle ait pu achever sa maturation post-2o traductionnelle. Et c'est bien la déficience de la fonction « canal à ions chlorure » que vise à détecter le test dit « de la sueur », qui mesure la sécrétion du chlore dans un liquide biologique issu du patient concerné, à
l'appui d'un diagnostic de la mucoviscidose.
La corrélation souvent faite entre des phénomènes cliniques 2s observés chez nombres de malades et les mutations observées dans le gène codant pour la CFTR, est à l'origine de l'une des voies déjà
proposées pour le traitement de ta mucoviscidose, en l'occurrence la voie fondée sur la thérapie génique, aux fins de transférer un ADN codant pour une CFTR « intacte » dans les cellules sous une forme permettant alors son expression r~éme dans des cellules CF-défectives, en particulier dans les cellules épithéliales des voies respiratoires des patients.
Ainsi des essais mettant en oeuvre un complexe d'ADN codant pour la CFTR et de lipides cationiques ont-ils été administrés à des souris a par voie intra-trachéale aux fins d'obtenir leur admission directe dans les poumons {Yoshimura et al. « Nucleic Acid Research, 20:3233-3240, 1992) ou encore par aérosol, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89:11277-11281, 1992). On a égaiement constaté que l'administration du gène codant pour la CFTR complexé avec des lipides cationiques à une souris io modèle souffrant de mucoviscidose, avait pour effet la correction du défaut de la fonction du canal à ions chlorure (Hyde et al., Nature 362:250-255, 1993).
II a aussi été proposé, par exemple dans les demandes internationales WO 95/13365 et WO 96/13598 d'induire l'expression dans i~ les cellules CF- des patients à traiter, d'un gène CFTR entier apporté de l'extérieur, ce gène ayant au préalable été incorporé sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés dans des vecteurs, par exemple des adénovirus ou rétrovirus génétiquement modifiés, de préférence défectifs mais encore capables d'infecter ces cellules, d'y transférer le gène CFTR, Zo celui-ci étant alors apte à s'y exprimer sous le contrôle des susdits éléments de régulation.
Ces méthodes se révèlent en général sinon inefficaces, à tout le moins insuffisantes. Mais comme le remarquent les auteurs de ia demande PCT WO 95/25796, les vecteurs viraux de ce type ne peuvent héberger ou 2s empaqueter que des gènes étrangers ou exogènes de tailles restreintes, au plus 4,5 Kb. Or l'ADN codant pour la CFTR naturelle atteint cette taille limite, ce qui en rend l'expression aléatoire dans les cellules infectées, sous le contrôle des promoteurs viraux correspondants.
A cette difficulté s'en ajoute une autre apparemment majeure, à
3o savoir la faible solubilité du produit d'expression dans le milieu cytoplasmique des cellules en cause. S'y ajoute enfin le caractère wo ~io6sa~ Pcr~9sromo4 vraisemblablement immunogénique des produits d'expression à hauts poids moléculaires éventuellement formés.
Aussi, les auteurs de la demande WO 95/26796 ont-ils proposé
de remplacer le gène entier par un gène tronqué d'une partie significative de ia région C-terminale de la CFTR, sous réserve cependant, que la suppression de cette région C-terminale ne s'accompagne pas de la perte des propriétés biologiques du type canal à ions chlorure, caractéristiques de la CFTR humaine naturelle, ou encore des propriétés fonctionnellement analogues de la CFTR entière recombinante.
io Selon les auteurs de La demande, une protéine tronquée recombinante encore susceptible d'exercer ses fonctions doit normalement comprendre - la séquence MSD (abréviation de l'expression anglaise « Membrane Spanning Domain » ou « Domaine s'étendant à travers la membrane ») n qui s'étend approximativement entre les résidus acides aminés 76 à 360 (à compter du résidu N-terminal de la protéine CFTR), - le domaine MBD1 (abréviation anglaise de l'expression « Nucleotide Binding Domain-1 » ou « domaine nucléotidique de fixation-1 ) -ou NBF1- qui s'étend approximativement du résidu 360 au résidu 708 de la zo CFTR entière, et enfin - le domaine régulateur R qui s'étend approximativement des résidus aminoacides 590 à 830 de ia CFTR, ce domaine étant réputé assurer, au repos, la fermeture du canal à ions chlorure et son ouverture sous ('effet d'une phosphorylation par la protéine kinase cAMP-dépendante ou protéine kinase C.
En particulier une protéine recombinante comportant les 884 aminoacides N-terminaux de la CFTR exercerait encore les fonctions requises de canal à ions chlorure et de régulateur de l'ouverture et de la fermeture de ce canal.

Mais à supposer que l'on puisse effectivement obtenir une meilleure expression avec de telles CFTR amputées de leurs régions C-terminales, on ne peut manquer de constater la taille encore importante des produits d'expression susceptibles d'être obtenus, et par conséquent s d'anticiper la persistance d'un caractère immunogène rendant son utilisation plus qu'aléatoire dans des essais de thérapie génique.
On remarquera aussi que cette proposition de thérapie génique, Qui ne mettrait en oeuvre que le gène tronqué de la CFTR répondant aux conditions décrites dans ie brevet WO 95125796, lie encore l'efficacité du ~o traitement au rétablissement de la seule fonction de canal à ions chlorure exercée chez des sujets sains par une protéine CFTR fonctionnelle.
C'était cependant omettre que si te défaut de transport des ions chlorure constitue effectivement une manifestation clinique souvent observée chez des patients atteints de mucoviscidose, d'autres is manifestations également observées restent à ce jour inexpliquées.
L'invention découle précisément de la constatation que le traitement de la mucoviscidose passerait en grande partie par une approche thérapeutique différente, car, comme cela a été mis en évidence par les inventeurs, la CFTR jouerait elle-même un rôle particulièrement 2o important dans le transport actif du glutathion (GSH), de sorte que la mucoviscidose pourrait aussi être liée de façon importante à des mutations ou autres causes qui perturberaient la capacité de la CFTR à exercer une fonction de transporteur du giutathion.
L'invention concerne donc des fragments d'ADN dont les 2s séquences, incluant des séquences issues du gène codant pour ta CFTR, sont choisies parmi celles qui codent pour une fonction de transport actif de glutathion. Et l'invention s'intéresse tout particulièrement à des fragments de tailles plus réduites que celles des fragments d'ADN dont l'utilisation en thérapie génique pour le traitement de la mucoviscidose a déjà été
3o évoquée dans la littérature technique ou scientifique.
C'est en effet à la faveur wo mo6s4~ rcr~t9aromoa - d'une part, de fa découverte de propriétés particulières d'un polypeptide de fusion contenant une partie de la séquence de la CFTR, qui avait été
produit dans le cadre d'études visant à l'étude de la structure tridimensionnelle de la séquence codant pour le domaine NBF-1, et - d'autre part, d'observations relatives à une amélioration clinique durable des symptômes liés à ia mucoviscidose chez un patient également cancéreux traité par une chimiothérapie, qui s'était accompagnée d'une surexpression de fa protéine dite MRP (abréviation anglaise de Multidrug Resistance Associated Protein » (Protéine associée à une ~o résistance aux drogues multiples)), que les inventeurs ont été conduits à la découverte, qui est à la base même de l'invention.
L'étude de la structure tridimensionnelle de la séquence codant pour le domaine NBF1 -en particulier aux fins d'étudier l'effet de la mutation is oF508 présumée responsable du défaut de repliement de la CFTR dans le domaine NBF1- impliquait l'obtention préalable de quantités importantes de protéine pure, soluble et stable (quelques dizaines de mg). De telles quantités n'étant pas accessibles par purification de la protéine naturelle, les inventeurs avaient donc entrepris de produire NBF1 (dans sa définition 2o initiale) par clonage dans un système d'expression vivant (E-colis, sous forme d'une protéine de fusion avec la GST (Glutathion-S-Transférase). Ce WO 99/06547 PC'T / FR98 / Ot704 GENE AND PROTECTIVE MUCOVISCIDOSIS PRODUCTS AND INDUCERS
OF A FUNCTION
GLUTATHION-S-TRANSFERASE
Cystic fibrosis, also sometimes called cystic fibrosis, is believed to be caused by mutations in the gene encoding the protein called CFTR, according to the abbreviation of the English expression "Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator ”
transmembra-pair of Cystic Fibrosis).
io The nucleic sequence coding for this CFTR protein which contains 1480 amino acid residues, has been cloned and identified by Riordan JR et al., “Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Cloning and Characterization of Complementary DNA ”(1989) Science 245: 1066-1072.
The coding sequence for the CFTR protein is also reproduced in Figure 1 of PCT application W0 / 9102796 made public on 7 March 1981 and of which Riordan himself is also one of the co-inventors. This PCT application - and others that followed - actually describe the cloning of the coding sequence and its expression in a number of organisms.
2o According to a recurrent hypothesis in the scientific literature, the normal CFTR protein would have a function called "chlorine channel" or "Chloride ion canai", in other words would regulate transfers anions, more particularly chloride ions (CI-), outside cells epithelial, outwards, under the effect of its phosphoryiation by a ? s cyclic AMP-dependent protein kinase (CAMP) or protein kinase C
. (Riordan, JR et al. (1989) Science 245: 1066-1073; Frizzell, RA et al.
(1986) Science 233: 558-560; Welsh, MJ and Liedtke, CM (1986) Nature 322: 467; Li, M. and aI. {1988) Nature 331: 358-360; Hwang, TC. et al.
{7989) Science 244: 1351-1353).
3o At 37 ° C, the CFTR protein would also pass from the reticulum endoplasmic to the Golgi apparatus, and thence into the plasma membrane as recalled by Ko et al., (1997) Biochemistry 36: 5053-5064, which themselves refer to previous authors.
Many mutations in CFTR have been observed in patients with cystic fibrosis.
s Epidemiological studies carried out in affected populations revealed in approximately 70% of cases a CF mutation (abbreviation of the English expression "Cystic Fibrosis") or deletion of the 3 nucleotides encoding the phenylatanine residue at position 508 of the amino acid sequence of CFTR. The site of this mutation is io would be located more particularly in the region called NBF1 (abbreviation of the English expression "Nucleotide Binding Fold I" (or Folded region of nuciéotides)) which would contain the first domain of fixation of ATP in CFTR and which, according to Ko et al. already cited would extend from Phenylalamine residue 433 (P433) to Serine residue 589 (S ~ gg). This is mutation is often held responsible for a failure to fold the NBF1 domain in then CF-defective cells of patients, defect which would block the mutated CFTR (called OF508) in the intracellular organelles (golgi, endoplasmic reticulum), then its destruction before it could complete its post-2o translational. And that is the deficiency of the "ion channel" function chloride ”that the so-called“ sweat ”test, which measures the secretion of chlorine in a biological liquid from the patient concerned, supporting a diagnosis of cystic fibrosis.
The correlation often made between clinical phenomena 2s observed in numbers of patients and the mutations observed in the gene coding for CFTR, is at the origin of one of the pathways already suggested for the treatment of your cystic fibrosis, in this case the based on gene therapy, for the purpose of transferring DNA encoding an “intact” CFTR in the cells in a form allowing then its expression r ~ th in CF-defective cells, in particular in the epithelial cells of the respiratory tract of patients.
Thus tests using a DNA complex coding for CFTR and cationic lipids were administered to mice a intratracheally for the purpose of obtaining their direct admission to the lungs {Yoshimura et al. "Nucleic Acid Research, 20: 3233-3240, 1992) or by aerosol, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 11277-11281, 1992). It has also been found that administration of the gene coding for CFTR complexed with cationic lipids in a mouse io model suffering from cystic fibrosis, had the effect of correcting the defect the function of the chloride ion channel (Hyde et al., Nature 362: 250-255, 1993).
It has also been proposed, for example in the requests WO 95/13365 and WO 96/13598 to induce expression in i ~ the CF cells of the patients to be treated, of a whole CFTR gene brought from externally, this gene having previously been incorporated under the control suitable regulatory elements in vectors, for example genetically modified adenovirus or retrovirus, preferably defective but still capable of infecting these cells, of transferring the CFTR gene there, Zo this being then able to express itself there under the control of the above regulatory elements.
These methods generally prove to be, if not ineffective, at all less insufficient. But as the authors of the request note PCT WO 95/25796, viral vectors of this type cannot host or 2s to package only foreign or exogenous genes of restricted sizes, at most 4.5 Kb. Now the DNA coding for natural CFTR reaches this size limit, making it random expression in infected cells, under the control of the corresponding viral promoters.
To this difficulty is added another apparently major, to 3o know the low solubility of the expression product in the medium cytoplasm of the cells involved. Finally there is the character wo ~ io6sa ~ Pcr ~ 9sromo4 presumably immunogenic high expression products molecular weights possibly formed.
Therefore, the authors of application WO 95/26796 proposed to replace the whole gene with a truncated gene of a significant part of the C-terminal region of the CFTR, provided, however, that the deletion of this C-terminal region is not accompanied by loss biological properties of the chloride ion channel type, characteristics natural human CFTR, or functionally properties analogs of the whole recombinant CFTR.
io According to the authors of The Application, a truncated protein recombinant still capable of performing its functions should normally understand - the sequence MSD (abbreviation of the English expression “Membrane Spanning Domain "or" Domain spanning across the membrane ") n which extends approximately between amino acid residues 76 to 360 (from the N-terminal residue of the CFTR protein), - the MBD1 domain (English abbreviation of the expression "Nucleotide Binding Domain-1 "or" nucleotide binding domain-1) -or NBF1- which extends approximately from residue 360 to residue 708 of the zo CFTR whole, and finally - the regulatory domain R which extends approximately from the residues amino acids 590 to 830 of ia CFTR, this domain being deemed to ensure, at rest, closing the chloride ion channel and opening it under (effect of phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase or protein kinase C.
In particular a recombinant protein comprising the 884 CFTR's N-terminal amino acids would still perform the functions chloride ion channel and regulator for opening and closing of this channel.

But assuming we can actually get a better expression with such CFTR amputated from their C- regions we cannot fail to note the still large size expression products obtainable, and therefore s to anticipate the persistence of an immunogenic character making its more than random use in gene therapy trials.
We will also note that this proposal for gene therapy, Who would only use the truncated CFTR gene responding to conditions described in the patent WO 95125796, further binds the effectiveness of the ~ o treatment to restore the only function of chloride ion channel exercised in healthy subjects by a functional CFTR protein.
It was however to omit that if the lack of transport of the ions chloride actually constitutes a clinical manifestation often observed in patients with cystic fibrosis, others The manifestations also observed remain unexplained to date.
The invention follows precisely from the observation that the treatment for cystic fibrosis would largely go through a different therapeutic approach because, as has been highlighted by the inventors, the CFTR itself would play a particularly 2o important in the active transport of glutathione (GSH), so that the cystic fibrosis may also be significantly linked to mutations or other causes that would interfere with the CFTR's ability to exercise transporter function of giutathione.
The invention therefore relates to DNA fragments whose 2s sequences, including sequences from the gene coding for your CFTR, are chosen from among those which code for an active transport function of glutathione. And the invention is particularly interested in fragments smaller in size than DNA fragments, the use of which gene therapy for the treatment of cystic fibrosis has already been 3o mentioned in the technical or scientific literature.
It is indeed in favor wo mo6s4 ~ rcr ~ t9aromoa - on the one hand, the discovery of particular properties of a polypeptide fusion containing part of the CFTR sequence, which had been produced as part of studies aimed at studying the structure three-dimensional sequence encoding the NBF-1 domain, and - secondly, observations relating to lasting clinical improvement symptoms related to cystic fibrosis in a patient as well cancer treated with chemotherapy, which was accompanied by overexpression of the protein known as MRP (English abbreviation for Multidrug Resistance Associated Protein "
~ o resistance to multiple drugs)), that the inventors were led to the discovery, which is the basis even of the invention.
The study of the three-dimensional structure of the sequence coding for the NBF1 domain - in particular for the purpose of studying the effect of the mutation is oF508 presumed responsible for the CFTR's failure to fold in the NBF1- domain involved obtaining large quantities beforehand pure, soluble and stable protein (a few tens of mg). Such quantities not accessible by purification of the natural protein, the inventors had therefore undertaken to produce NBF1 (in its definition 2o initial) by cloning into a living expression system (E-package, under form of a fusion protein with GST (Glutathione-S-Transferor). This

2~
choix avait initialement pour but d'utiliser la capacité de reconnaissance spécifique de glutathion S-transférase par le glutathion pour purifier la protéine recherchée (GST-NBF1 ) de l'ensemble des protéines bactériennes. A cette fin, une séquence issue du gène de la CFTR
(séquence 8450-1586) et contenant la séquence de nuciéotides codant pour la séquence NBF1 a été insérée dans un plasmide Dermettant ia transformation de bactéries E.coli et l'expression dans celles-ci de ia séquence d'insertion dans les bactéries transformées, par exemple un 3o plasmide du type pGEX-I<'T. La mise en culture de la souche de E.coli ainsi transformée a effectivement conduit à une surproduction d'une protéine de fusion de la NBF1 et de la glutathion-S-transférase (GST). Les rendements obtenus étaient de 5 mg/l de culture. La protéine soluble obtenue a été
séquencée. Elle a été reconnue par les anticorps anti-NBF1 et fixait également l'ATP. Une coupure à la thrombine a permis de préparer les domaines NBF1 libres qui présentaient les mémes caractéristiques.
Cependant, il n'est pas possible de séparer la GST et le domaine NBF1 sur colonne d'affinité greffée avec du glutathion (GSH) : bien que parfaitement séparées sur gel d'électrophorèse, les deux protéines NBF1 ~o et GST co-éluaient sur colonne de GSH immobilisée.
L'activité de la protéine de fusion a été vérifiée par fluorescence:
une affinité pour un dérivé fluorescent de l'ATP (le TNP-ATP) a en effet été
observée.
Cependant, de multiples essais de purification du domaine m NBF1, isolé de la GST, par clivage à la thrombine sont:restés infructueux.
Par ailleurs, la protéine GST-NBF1 a pu être clivée sélectivement et quantitativement, mais le domaine NBF1 seul s'est alors révélé être instable. il avait une forte tendance à former des agrégats.
Ces résultats ont conduit les inventeurs à reconsidérer ou 2o réévaluer la définition du domaine NBF1, tel qu'il avait été décrit par Riordan. En effet, la définition d'un domaine doit correspondre à une entité
stable, caractérisée par un repliement propre codant pour sa fonction, et dont la stabilité est indépendante de la protéine complète (ici CFTR) à
laquelle ce domaine appartient. Pour assurer ce repliement, les limites Zs choisies pour NBF1 doivent contenir l'ensemble des éléments de structure secondaire (hélices et feuillets) nécessaires à la stabilisation du domaine dans sa conformation native.
Cr, la CFTR appartient à la famille des transporteurs ABC (ATP
Binding Cassette) qui forment l'une des plus grandes familles de protéines 3o membranaires (A11.96), retrouvées tant chez les eucaryotes que chez les procaryotes. Ces protéines sont en général des transporteurs actifs qui hydrolysent l'ATP pour fournir le potentiel chimique nécessaire au transport. Chez ies eucaryotes elles transportent des molécules (ions, vitamines, peptides, sucres, drogues, etc... ) à travers toutes les membranes. Leurs organisations globales présentent des caractères communs : régions (TM) qui participent à la sélection de l'entité chimique à
transporter, et domaines de fixation des nucléotides. Ces gènes sont souvent issus de la fusion entre deux c< demi gènes ». La topologie globale est alors: (TM1 )-(NBF1 r(TM2}-NBF2). Et de fait, la CFTR appartient plus particulièrement à la sous famille CFTR/MRP, et possède une similarité de lo séquence d'environ b0 % avec la protéine MRP humaine (Multi-drag Resistance associated Protein). Elle est égaiement très proche de la protéine YCF1 (Yeast Cadmium resistance Factor 1 ) qui confère à la levure Saccharomyces cerevisiae la résistance aux ions cadmium (Tom.96). Dans une moins grande mesure elle est également proche de STE6 (de la sous is famille MDR/TAP) et qui transporte la phéromone «'facteur a » chez .la levure Saccharomyces cerevisiae (Tom.93), et de MDR humain (Mufti-drag Resistance protein), ou encore l'ATPase-F1 de boeuf, seule protéine de structure connue dans la famille des ABC protéines (Abr.94).
Et c'est parce que la structure de l'ATPase de boeuf est connue 2o que les inventeurs ont choisi ses domaines NBF en tant que structure de référence pour la réévaluation également du domaine de la NBF1 de la CFTR. II est découlé de ce choix, discuté dans deux publications récentes (Ann.97a, Ann.97b), un modèle de structure 3D pour NBF1, construit par homologie avec la structure de l'ATPase-F1 de boeuf, méthode 2s développée dans (Pat.96), permettant entre autre _ 1. de rendre compte du phénotype lié à la mutation OFb08, contrairement aux modèles précédents (Hyd.90, Mim.91 ) ;
2. de rendre compte du rôle clé de la séquence consensus i_SGGQ, très conservée dans fes protéines ABC ;

wo ~io6sa~ rcrrnR9sromoe 2 ~
choice was originally intended to use the recognition ability specific glutathione S-transferase by glutathione to purify the required protein (GST-NBF1) of all proteins bacterial. To this end, a sequence derived from the CFTR gene (sequence 8450-1586) and containing the nucleotide sequence coding for the sequence NBF1 was inserted into a Dermettant ia plasmid transformation of E. coli bacteria and expression of ia therein insertion sequence in transformed bacteria, for example a 3o plasmid of the pGEX-I <'T type. The cultivation of the E. coli strain as well transformed actually led to an overproduction of a protein NBF1 and glutathione-S-transferase (GST) fusion. Returns obtained were 5 mg / l of culture. The soluble protein obtained was sequenced. It was recognized by anti-NBF1 antibodies and fixed also ATP. A thrombin cut made it possible to prepare the free NBF1 domains which had the same characteristics.
However, it is not possible to separate the GST and the NBF1 domain on affinity column grafted with glutathione (GSH): although perfectly separated on electrophoresis gel, the two NBF1 proteins ~ o and GST co-elected on immobilized GSH column.
The activity of the fusion protein was verified by fluorescence:
an affinity for a fluorescent derivative of ATP (TNP-ATP) has indeed been observed.
However, multiple field purification attempts m NBF1, isolated from GST, by cleavage with thrombin: remained unsuccessful.
Furthermore, the GST-NBF1 protein could be selectively cleaved and quantitatively, but the NBF1 domain alone proved to be unstable. it had a strong tendency to form aggregates.
These results led the inventors to reconsider or 2o reassess the definition of the NBF1 domain, as it had been described by Riordan. Indeed, the definition of a domain must correspond to an entity stable, characterized by its own folding coding for its function, and whose stability is independent of the complete protein (here CFTR) at which this domain belongs to. To ensure this folding, the limits Zs chosen for NBF1 must contain all the structural elements secondary (propellers and sheets) necessary to stabilize the domain in its native conformation.
Cr, the CFTR belongs to the family of carriers ABC (ATP
Binding Cassette) which form one of the largest families of proteins 3o membranes (A11.96), found both in eukaryotes and in prokaryotes. These proteins are generally active transporters which hydrolyze ATP to provide the necessary chemical potential for transport. In eukaryotes they carry molecules (ions, vitamins, peptides, sugars, drugs, etc.) across all membranes. Their global organizations have characters common: regions (TM) which participate in the selection of the chemical entity to transport, and nucleotide binding domains. These genes are often resulting from the fusion between two c <half genes ». Global topology is then: (TM1) - (NBF1 r (TM2} -NBF2). And in fact, the CFTR belongs more particularly to the CFTR / MRP subfamily, and has a similarity of lo sequence of approximately b0% with human MRP protein (Multi-drag Resistance associated Protein). It is also very close to the protein YCF1 (Yeast Cadmium resistance Factor 1) which confers on yeast Saccharomyces cerevisiae resistance to cadmium ions (Tom. 96). In to a lesser extent it is also close to STE6 (from the sub is family MDR / TAP) and which transports the pheromone "factor a" in .la yeast Saccharomyces cerevisiae (Tom. 93), and human MDR (Mufti-drag Resistance protein), or beef ATPase-F1, the only protein structure known from the ABC protein family (Abr. 94).
And that's because the structure of the beef ATPase is known 2o that the inventors chose its NBF domains as a structure for reference for the re-evaluation also of the NBF1 domain of the CFTR. It arose from this choice, discussed in two recent publications (Ann.97a, Ann.97b), a 3D structure model for NBF1, built by homology with the structure of beef ATPase-F1, method 2s developed in (Pat. 96), allowing among other things _ 1. to account for the phenotype linked to the OFb08 mutation, unlike previous models (Hyd.90, Mim.91);
2. to report on the key role of the consensus sequence i_SGGQ, very stored in ABC proteins;

wo ~ io6sa ~ rcrrnR9sromoe

3. de redéfinir les limites du domaine NBF1 -ci-après « NBF1 revisité »-qui est désormais considéré comme s'étendant approximativement du 430e résidu d'acide aminé jusqu'à approximativement le résidu 650 (empiétant d'environ 70 résidus sur le domaine R, dans sa définition s initiale) de la séquence de la CFTR.
Ce dernier point découle directement de l'hypothèse d'un repliement comparable pour les régions NBF de l'ATPase-F1 de boeuf et de la CFTR. L'argument principal est que la famille des transporteurs ABC
forme un groupe homogène bien distinct des autres protéines liant l'ATP, io dont les membres sont issus d'une évolution divergente. Dans ce cadre, ces protéines doivent présenter un repliement comparable dans leurs régions conservées (typiquement, dans les « briques élémentaires » NBF).
II est alors licite de modéliser la structure d'une de ces protéines à partir de la structure connue d'une autre.
is Le modèle de structure ainsi construit pour le domaine NBF1 de CFTR, par homologie avec la structure connu des domaines de fixation des nuciéotides de l'ATPase-F1 de boeuf (Abrahams J.P., Jeslie A.G.W., Lutter R., Walker J.F. (1994) Nature 370:621-628), selon la méthode décrite par Annereau et al. (FEBS Letters, (1997) 407:303-308), comprend un coeur 2o hydrophobe constitué d'un feuillet ~ à 6 brins parallèles, respectivement L453-5456 N505-5511 ~ N538-G542~ D567-D572~ R600-V603)~ Ces feuillets alternent avec 6 hélices a s'organisent de part et d'autre du plan moyen du feuillet ~i central, comme montré dans l'article de FEBS Letters, Vol. 407, pp.:303-308, 1997. Des boucles situées en surface du domaine relient les 2s hélices aux feuillets.
Et de fait le produit d'expression du fragment correspondant au gène codant pocir ta CFTR (fragment qui tait lui-même partie de l'invention) s'est avéré stable, ce qu'accrédite les résultats du clonage dans E.coli du nouveau » domaine NBF1 (ou domaine NBF1 revisité),_ dans F.coli en 3o système polyhistidine, c'est-à-dire d'un ADN de fusion codant pour le WO 99/06547 PCTlFR98/01704 domaine « NBF1 revisité » (c'est du fragment codant pour ie polypeptide s'étendant de 448e au fi50e résidus d'acides aminés de la CFTR) et une queue ne comportant que 6 résidus histidine (on peut considérer alors qu'il est produit « seul »). Les taux de production obtenus sont notoirement plus s grands que sur le fragment précédent, atteignant pour le système polyhistidine environ 200 mg par titre de culture (dès le premier essai, avant toute optimisation). Ce fragment purifié « NBF1 revisité » a été purifié
en quantités massives, sous forme d'une protéine soluble et stable.
L'existence potentielle d'un site de fixation du gfutathion dans lo NBF1 de CFTR pratiquement superposable au site de fixation du glutathion dans la GST est mise en évidence par comparaison de ce modèle avec la structure connue de ia GST (Glutathion-S-Transférase), protéine qui présente un site de fixation du glutathion et qui catalyse les réactions d'attaques nucléophiles du glutathion. Les résidus de NBF1 is potentiellement impliqués dans la fixation du glutathion se situent dans une région formant une crevasse aux extrémités de brins impliqués dans un feuillet ~ (voir l'article de FEBS letter). Ces résidus sont situés plus précisément dans des boucles, aux extrémités N-terminales des feuillets 1 à 4 de la structure de NBF1. Ces boucles contiennent les résidus I~g-Q4~2 (IERGQ), S4~g-K4g~ (SEGK), M4gg-1506 (MPGTIKENI), A~ss-L5sa (ADLVL), A5gg-T~gg (ANKT).
La nouvelle définition de NBF1 et le modèle de structure 3D
construit, ont permis aux inventeurs de proposer une nouvelle fonction pour CFTR, suggérée par le fait inattendu que NBF1 est retenu sur colonne de 2s glutathion, même après clivage de ia protéine de fusion GST-NF1. En effet, la comparaison de ce modèle avec la structure 3D connue de la GST, protéine qui présente un site de fixation du glutathion et qui catalyse les réactions d'attaques nucléophiles du glutathion (Lim.94), rnet en évidence la présence d'un site de fixation potentiel du glutathion.

Des informations fonctionnelles portant sur tes deux protéines ABC les plus proches de CFTR (MRP humaine et YCF1 de la levure) semblent conforter cette hypothèse. En effet, il est maintenant établi que t~IRP exporte les drogues par l'intermédiaire du glutathion, soit sous forme d'adduits directs « glutathion-drogue », sait par fixation simultanée ou séquentielle du glutathion et de la drogue (Zam.95). De même, YCF1 transporte les ions cadmium sous la forme de doubles adduits du glutathion. Ainsi, il semble que CFTR puisse être une « pompe à
glutathion », comme MRP et YCF1.
lo Or les protéines MRP et MDR humaines sont impliquées dans les phénomènes de mufti-résistance aux drogues anti-tumorales (Dean et al., Current Opinion in Genetic & Development 5, 779-785, 1995). Ces protéines sont capables de transporter activement ces drogues, participant ainsi aux mécanismes de détoxification de la cellule. Leur surexpression 1~ est induite par les drogues elles-mêmes, ce qui constitue la principale cause d'échec des traitements des cancers par chimiothérapie. Or il a été
montré récemment que la surexpression de CFTR pouvait également être déclenchée par des drogues anti-tumorales, et qu'elle conférait le phénotype de multi-résistance (L1.95).
?o De là découle aussi l'hypothèse formulée par les inventeurs que la fonction de transporteur du glutathion pourrait être importante et que des mutations susceptibies de la perturber expliqueraient également nombre de symptômes de la mucoviscidose. Le rôle de CFTR comme « pompe à
glutathion » (en plus de son rôle connu de canal chlore) permet aussi une 2s compréhension plus globale de la mucoviscidose (Sto.97).
Un déficit de la fonction de transport du glutathion rendrait aussi mieux compte des réactions inflammatoires chroniques et/ou le nombre très élevé de polynucléaires Que l'on rencontre souvent dans les voies respiratoires des patients atteints de mucoviscidose, puisque l'on sait que 30 le glutathion joue un rôle central dans le contrôle de la réaction inflammatoire en protégeant les cellules de l'agression des radicaux fibres par les poiynuc'éaires neutrophiles et, en outre, qu'if intervient dans la protection vis-à-vis des oxydants tels que les radicaux libres ou les hyper-oxydes.
De la même façon, ce sont les organes dans lesquels le s glutathion est normalement sécrété et dans lesquels il exerce une fonction de détoxification (poumons, intestins, colon) qui sont en général gravement affectés par la mucoviscidose.
Un certain nombre d'observations cliniques concordent avec l'hypothèse qui est à ia base de l'invention. Le taux de GSH est en effet io abaissé dans le sérum et le mucus bronchique des sujets atteints de mucoviscidose. Les organes où CFTR est exprimée ie mieux sont ceux où_ la GSH joue un rôle important et est transportée activement : pancréas, poumon, foie, rein. La fonction hépatique détoxifiante apparaît altérée, fonction dans laquelle la GSH pourrait jouer un rôle central. Ceci se traduit is par exemple par une sensibilité particulière des malades à un métal lourd comme le mercure. Des phénomènes de stress oxydatif sont également observés depuis longtemps au niveau pulmonaire. La N-acétyl cystéine, médicament utilisé avec profit pour les patients, est désacétylée en pénétrant dans la cellule, fournissant ia cystéine (acide aminé semi 2o indispensable chez l'homme).
Et de fait ia validité de l'hypothèse trouve d'ores et déjà une confirmation dans l'amélioration durable qui a été constatée au plan de la mucoviscidose chez un malade, âgé de 29 ans, porteur de mucoviscidose (avec signes cliniques depuis la naissance). Le malade traité présentait 2s l'exon 12 de CFTR sur un allèle et, G673X, située dans l'exon 13 sur l'autre allèle. Ce malade présentait, depuis sa naissance en 1968, tous les signes cliniques associés à la mafadie : tests de la sueur positifs, sinusites répétées, bronchites répétées, polypes de la fosse nasale etc... En 1989 il a présenté une infection à Pseudomonas aeruginosa, classique dans la 3o mucoviscidose et habituellement pratiquement définitive chez ces malades.
En outre, en avril 1993, un fibrosarcome de la cuisse gauche a été

diagnostiqué. Le malade a subi un traitement chirurgical et radiothérapique puis une chimiothérapie de juillet à octobre 1993, suivis d'un nouveau traitement en janvier 1994.
Plus particulièrement le traitement anti-tumoral a été le suivant - épirubicine, 110 mg pendant deux jours (J1 et J2) ;
- ifosfamide, 3,3 g pendant cinq jours (J1 à J5) ;
- Filgrastime, 300 p.g par jour pendant huit jours (J8 à J15) ;
sous couvert de - granisétron, pour la prévention des nausées ;
lo - Méthylprednisolone ;
- Mesna.
Trois mois plus tard, le malade a reçu à nouveau six cycles épirubicine et ifosfamide.
Le traitement anticancéreux a été efficace. Concernant aussi le ls tableau clinique de ~ la mucoviscidose, à la suité du traitement chimiothérapique, on a observé les améliorations suivantes - l'état respiratoire du malade s'est amélioré considérable-ment ;
- son infection par Pseudomonas aeruginosa a disparu 20 - ses paramètres respiratoires atteignent environ 75 % des valeurs théoriques ;
- il a recouvré un état respiratoire à peu près équivalent à celui qu'il présentait au début de son adolescence ;
- il se déclare lui-même guéri de la mucoviscidose.
2s Un test de sueur effectué chez lui au début de l'année 1997 s'est révélé toujours très positif, ce qui signifie que la fonction de canal à
ions. chlon.ire n'a pas été rétabtie chez ce patient. Cette constatation, liée au fait que le malade se déclare lui-même guéri de la mucoviscidose permet de conclure qu'une autre fonction essentielle a été rétablie par le 3o traitement chimiothérapique. On peut présumer au vu de ce qui précède, W O 99/06547 PCTIFR98/0170d que c'est en l'occurrence la fonction de transport du glutathion qui a été
considérablement accrue.
Comme cela a déjà été indiqué, l'invention vise donc plus s particulièrement des fragments d'ADN correspondant à des parties du gène codant pour la CFTR, ces parties codant aussi pour un polypeptide possédant une fonction de transport actif de glutathion. Dans ce qui suit, les séquences d'ADN sont en général définies par référence aux séquences peptidiques qui leurs correspondent, ces séquences io peptidiques étant chaque fois, pour fa commodité du langage, généralement désignées par l'expression « produit d'expression » des séquences d'ADN de l'invention. Ces séquences d'ADN peuvent naturellement être reconstituées pair le lecteur, notamment en se fondant sur la figuré 1 qui, pour l'essentiel, est une reproduction de la séquence du m gène codant pour la CFTR qui a été publiée dans l'article de Riordan et al.
déjà mentionné ou encore dans la demande PCT WO 91102796.
Dans les définitions des séquences d'ADN -ou de leur produit d'expression- qui suivent, il sera fréquemment fait référence à des régions « en aval » ou « en amont » de la séquence d'ADN ou de son produit 2o d'expression auquel l'invention se rapporte. II apparaitra de façon immédiate qu'une région « en amont » d'une séquence d'ADN donnée au sein du gène codant pour la CFTR représentée à la figure 1 ou du produit d'expression correspondant est située en amont de l'extrémité 5' de cette séquence d'ADN ou de l'extrémité N-terminale de la séquence en acides 2s aminés du produit d'expression correspondant. A l'inverse, les régions « en aval » sont celles qui sont situées au-delà de l'extrémité 3' de cette séquence d'ADN ou de l'extrémité C'-terminale de la séquence en acides aminës du produit d'expression correspondant.
Également de toute évidence, l'indication d'une lettre (dans le 3o système d'identification symbolique des acides aminés mettant en oeuvre une lettre unique pour chacun d'entre eux) suivie d'un indice « n » fait ' 15 référence au « n~sme » acide aminé qui découle de l'examen de la figure 1 jointe, à compter du premier résidu d'acide aminé de la CFTR.
D'une façon générale, la molécule d'ADN conforme à l'invention la plus longue contient une séquence d'ADN dont le produit d'expression a s une séquence peptidique en commun avec une partie de celle de la CFTR, cette partie étant essentiellement exempte au moins de la région N-terminale de la CFTR qui s'étend nom~alement en amont de la région MSD
de cette demiére et qui comprend, en particulier, les 360 acides aminés N-terminaux de la CFTR, ou, en variante, toute séquence d'ADN résultant de io fa modifcation de la précédente par délétion, substitution ou addition de nucléotides, sous réserve que soit conservée au moins en partie ta capacité du produit d'expression correspondant à exercer une fonction de transporteur de glutathion.
Par « composé transporteur de glutathion », on entend selon is l'invention, un composé qui appartient à la famille déjà répertoriée des transporteurs ABC qui exercent leur fonction de transport par l'intermédiaire du giutathion. On entend égaiement tout fragment ou analogue d'un tel transporteur résultant d'une ou plusieurs mutations, qui conserve fa propriété de transport par l'intermédiaire du glutathion.
2o On entend par glutathion, le gfutathion lui-même ou ses adduits avec d'autres composés. II peut s'agir d'adduits naturels, tels que les leukotriènes, ou encore d'adduits de détoxification, avec les métaux lourds, les oxydants puissants (radicaux libres, peroxydes...); ou les drogues.
En particulier, les capacités des produits d'expression des 2s séquences d'ADN conformes à l'invention à exercer une fonction de transporteur de glutathion peut s'apprécier par leur capacité à induire in vitro une production de CFTR dans des cellules épithéliales, ~ par exemple ir vitro, en mettant en oeuvre les techniques expérimentales déjà utilisées pour apprécier le même type d'induction sous l'effet de drogues 3o antitumorales, telles qu'elles ont été décrites et utilisées par Wey L.Y.
et aI.
dans l'article intitulé « Overexpression of the cystic fibrosis transmembrane regulator in NIH 3T3 cells lowers membrane potential and intracellular pH
and confers a multidrug resistance phenotype » (La surexpression du régulateur transmembranaire de la fibrose cystique dans des cellules NIH 3T3 réduit le potentiel de membrane et le pH intracellulaire et confère un phénotype de résistance à des médicaments multiples) ; Biophysical Journal (1995) 69:883-898.
On peut aussi avoir recours à la mesure des proportions d'ARNm correspondant à la CFTR dans les cellules épithéüales préalablement prélevées dans un mammifère d'épreuve souffrant de lo mucoviscidose, telle que la souris, à laquelle avait au préalable été
administrée la molécule d'ADN conforme à l'invention à tester, sous le contrôle d'éléments de régulation autorisant la transcription et la traduction de sa séquence d'ADN dans les cellules épithéliales, en particulier dans les conditions décrites par Yoshimura et al., dans l'article identifié plus haut.
ls Les souris de type TgH (Unc), obtenues à partir de recombinaison homologue au niveau de l'exon 10 du gène Cftr (insertion du gène de résistance à fa néomycine) représentent un modèle intéressant pour cette étude. Les animaux hétérozygotes ne présentent aucune modification du phénotype. Les mutants homozygotes montrent des 2o anomalies semblables à la mucoviscidose humaine chez les jeunes souris (Kolier B.H. et al, Science, 248 , 1227-1229). Ces souris sont des modèles adéquats étant donné qu'elfes souffrent et meurent d'obstruction intestinale avant mëme d'arriver à l'âge adulte, soulignant ainsi un modèle d'étude d'exacerbation inflammatoire au niveau de cet organe.
2s Un vecteur d'expression utilisable dans ce test et adrninistrable par voie générale, serait par exemple formé par un adénovirus de type Av1 CF2 (Genetic Therapy inc, Gaithersbourg, MD, USA) dans lequel la séquence codante à étudier remplacerait la séquence codante pour CFTR
entier.
3o La mise en évidence d'une expression de la fonction de transporteur de giutathion est alors appréciés par l'accroissement des WO 99/06547 PCTlFR9810I704 quantités d'ARNm induites dans les souris traitées par rapport à ce qui est observé dans des souris mucoviscidosiques témoins non traitées, par exemple après quantification des ARNm par rapport à une référence interne de RT-PCR mettant en jeu le taux d'ARNm de la ~2-microgfobuüne.
s selon la méthode de Lechapt-Zaicman E. et al. décrite dans Resp. J. 1997, « M. MDR1-PgP 170 expression in human Bronchas o (L'expression de F.MDR-1-PgP 170 dans l'appareil bronchique humain »). De plus, les quantités de protéines MDR étant élevées dans l'épithélium intestinal, la transfection des mammifères épreuves cités ci-dessus par le fragment de lo CFTR étudié devrait provoquer une résorption de l'état inflammatoire exacerbé au niveau intestinal.
En variante, on peut également avoir recours pour définir les molécules d'ADN de l'invention au test dont il a déjà été question plus haut.
Entre dans ie cadre de l'invention, toute molécule d'ADN répondant aux ls conditions sus-indiquées et qui se caractérise par une conservation de l'affinité du produit d'expression correspondant pour le glutathion, cette affinité pouvant étre mise en évidence par la mise en oeuvre du test consistant à cliver le produit d'expression de la molécule d'ADN en cause à
l'aide de thrombine en un fragment C-terminal et en un fragment N-zo terminal, à recueillir le fragment N-terminal et à le mettre en contact avec une colonne d'affinité sur laquelle est greffée du glutathion, l'affinité
dudit produit d'expression pour le glutathion découlant alors de ses capacités, analogues à celles de la glutathion-S-transférase, à ëtre fixée sur cette colonne d'activité et à en être éluée.
zs Cependant de préférence, cette molécule d'ADN est plus courte, en particulier caractérisée en ce que son produit d'expression est également essentiellement exempt du côté de son extrémité C-terminale de la séquence en acides aminés de ia région de la CFTR qui s'étend normalement en aval de la région R de cette dernière.

WO 99/06547 PCTlFR98/01704 II suffit même que la séquence en acides aminés du produit d'expression de ia susdite séquence d'ADN comprenne elle-même, d'une part et du côté de son extrémité C-terminale, la sous-séquence d'approximativement 80 résidus d'acides aminés {qui étaient auparavant s considérés comme appartenant à la région R et Qui désormais font partie de la région « NBF1 revisitée ») qui, dans la CFTR, s'étend en aval de son ~70e résidu d'acide aminé et, d'autre part et dans ia direction de son extrémité N-terminale, la région NBF1 de la CFTR, voire seulement d'une partie de celle-ci, pour que soit retenue la capacité du produit d'expression lo de la susdite séquence d'ADN à exercer ladite fonction de transporteur de glutathion.
D'une façon générale, la séquence d'ADN selon l'invention comprend donc pour l'essentiel la région de la séquence codant pour tout ou partie de la région « NBF1 revisitée » de la CFTR qui s'étend de son is extrémité C-terminale jusqu'au delà du site de fixation présumé du glutathion (naturellement dans la direction de lecture inverse de fa séquence en acides aminés de cette « NBF1 revisitée », c'est-à-dire de son extrémité C-terminale vers son extrémité N-terminale.
Une molécule d'ADN préférée est celle dont le produit 2o d'expression possède lui-même une séquence en acides aminés qui s'étend entre approximativement le 430e et le 660e résidu d'acide aminé de ia CFTR.
Parmi les molécules d'ADN préférées selon l'invention, on citera celles qui sont caractérisées en ce que les séquences en acides aminés de 's leur produits d'expression respectifs contiennent eux-mêmes, d'une part et du côté de leur extrémité C-terminale, la séquence NLQPDFSSKLMGCDS
{N635 à S64g) de la CFTR et, d'autre part et dans la direction de leur extrémité N-terminale, un ou plusieurs des sites peptidiques suivants - ANKT (ASgs à T599) 30 - ADLYL (ASgg à LS~p), - MPGTIKENI (M4gg à l5pg), - SEGK (S4~g à K4g~ ), - (ERGQ (I~g à Q452) de la CFTR.
s En particulier, la molécule d'ADN selon l'invention peut être choisie parmi celles possédant une séquence d'ADN caractérisée en ce que la séquence en acides aminés de son produit d'expression inclut, d'une part et à proximité de son extrémité C-terminale, la séquence NLQPDFSSKLMGCDS (Ng35 à S~g) et, d'autre part et à proximité de son io extrémité N-terminale - soit le site peptidique ANKT (ASgg à TSgg), - soit le site peptidique ADLYL (ASgg à L5~0), - soit le site peptidique MPGTIKENI (M4gg à ~~15p6), - soit le site peptidique SEGK (S4~g à K4g~ ), m - soit le site peptidique IERGQ (I~g à Q452) de la CFTR.
Cela étant, la séquence en acides aminés du produit d'expression de la susdite séquence d'ADN peut encore inclure, en aval du site NLQPDFSSKLMGCDS (Ng35 à 5649) un segment de 10 à 20 résidus 2o d'acides aminés dont la séquence correspond à celle qui suit ce rnëme site aussi dans la CFTR ou encore, à l'amont du susdit site à proximité de son extrémité N-terminale, un segment de 10 à 20 résidus d'acides aminés qui précède ce même site aussi dans la CFTR, ou les deux segments à la fois.
Ces segments peuvent aussi être remplacés par des ofigonucléotides de 2s (iaïson (linkers) contenant des sites de restriction facilitant leur incorporation dans un vecteur destiné à les transférer dans des cellules compétentes appropriées.

wo 99io6sa~ rcr~9sromo4 D'une façon générale les ADNs préférés de l'invention sont ceux dont les produits d'expression sont solubles dans l'eau ou dans un sénrm physiologique, en particulier à raison d'au moins 0,5, de préférence d'au moins 1 mglml d'eau, notamment sous forme de soluté physiologique.
s L'invention concerne naturellement aussi toute molécule d'ADN
de recombinaison, dans laquelle la séquence d'ADN telle qu'elle a été
définie ci-dessus se trouve recombinée avec des éléments d'acides nucléiques exogènes, en particulier des molécules recombinantes codant pour une protéine de fusion présentant néanmoins les propriétés io biologiques essentielles, telles qu'elles ont été définies plus haut, du produit d'expression de ia séquence d'ADN caractéristique des molécules selon l'invention.
Une autre catégorie de molécules d'ADN conformes à l'invention sont celles dans lesquelles les éléments d'acide nucléique exogènes sont is constitutifs d'un vecteur d'expression, comprenant' ~ des éléments de régulations appropriés, ladite séquence d'acide nucléique s'y trouvant à
l'état de séquence d'insertion placée sous le contrôle de ces éléments de régulation, ceux-ci autorisant alors l'expression de ladite séquence d'acide nucléique dans un organisme cellulaire compétent.
20 ll s'agit en particulier de vecteurs d'expression aptes à
transformer des organismes cellulaires compétents aux fins d'assurer l'expression de la séquence d'ADN caractéristique de l'invention, le produit d'expression pouvant ensuite, la cas échéant, être récupéré à partir des cellules en culture, voire même à partir du milieu de culture. II va de soi que 2s l'invention ne saurait être limitée à des vecteurs modifiés par la séquence d'ADN selon l'invention qui ne seraient utilisables qu'à des fins de thérapie génique. Elle étend également ses effets à tout autre forme de vecteurs susceptibles d'ëtre utilisés pour fa production du produit d'expression correspondant dans des cellules en culture, en particulier aux fins de 3o produire le produit d'expression recombinant qui pourrait lui-même être directement utilisé, comme cela est envisagé plus loin.

WO 99/06547 PGT/FR98~01704 II est renvoyé aux descriptions des demandes internationales WO 91 /02796 déjà citée, WO 91110374, WO 92/05273 et WO 93117040 pour ce qui est d'exemples de vecteurs d'expression qui ont déjà été
décrits pour l'expression gène CFTR entier, et à ta demande WO 95!25796 s déjà mentionnée dans laquelle sont décrits des vecteurs utilisables pour l'expression d'une CFTR dont ia région C-terminale avait été tronquée. Ces différents vecteurs sont naturellement également utilisables pour l'expression des séquences d'ADN conformes à la présente invention. Les descriptions de ces demandes de brevet doivent être considérées comme io faisant partie de la description de la présente demande pour ce qui est des variantes de vecteurs d'expression utilisables pour la production des produits d'expression des molécules d'ADN conformes à l'invention.
Sont d'un intérêt particulier, les vecteurs permettant la transformation de cellules humaines, en particulier de cellules épithéliales.
is Des vecteurs d'expression particulièrement préférés sont des vecteurs dérivés de virus du type adénovirus ou rétrovirus ou encore de virus apparentés à ceux-ci (virus AAV), dont l'utilisation a déjà été envisagée pour ia réalisation de thérapies géniques appliquées au traitement de la mucoviscidose. On mentionnera aussi les demandes internationales 2o WO 95113365 et WO 96/13598 qui décrivent des vecteurs et plus généralement des techniques applicables à l'expression du gène codant pour la CFTR, à des fins d'application en thérapie génique sous forme de cassettes de transcription et d'expression comprenant la séquence codant pour la CFTR, recombinées avec des séquences régulatrices 2s fonctionnelles in-vivo dans des cellules de mammifères. A nouveau ces techniques sont applicables à l'expression des séquences d'ADN
conformes à l'invention (en lieu et place des séquences d'ADN codant pour la CFTR entière) de sorte que les descriptions de ces demandes doivent aussi être considérées comme faisant partie de ia description de la 3o présente demande, pour ce qui est de la description de techniques et de vecteurs utilisables à cet effet.

wo moss4~ pcr~9eromoa Tout indique que l'expression induite in-vivo des molécules d'ADN selon l'invention, qui ont toutes vocation à coder pour un polypeptide ayant une fonction de transporteur de giutathion, peut remédier à une insuffisance à cet égard d'une CFTR endogène en raison des s mutations qu'elle porterait et auxquelles semblent devoir être imputés au moins une partie des signes cliniques de la mucoviscidose et, plus généralement, de stimuler une expression endogène de CFTR et, ce faisant, même de rétablir en partie la fonction de canal à ions chlorure, dès lors que celle-ci ne serait pas totalement annihilée par d'autres mutations lo affectant cette CFTR endogène.
L'effet thérapeutique attendu d'une thérapie génique mettant en oeuvre des séquences d'ADN répondant aux définitions sus-indiquées, peut être d'autant plus grand que les produits d'expression de ces séquences d'ADN sont plus petits, solubles, stables, et d'une i s immunogénicité propre réduite, voire inexistante dans la pratique.
D'une façon générale l'invention concerne aussi toute composition pharmaceutique associant les molécules d'ADN conformes à
l'invention, le cas échéant déjà sous forme « vectorisée » avec des véhicules pharmaceutiques favorisant leur pénétration au sein de cellules 2o humaines et leur expression dans celles-ci.
II s'agit de tous types de cellules susceptibles d'être ciblées par des molécules mises en oeuvre directement ou indirectement (par exemple lorsqu'il s'agit de polypeptides générés in situ comme dans le cas de la thérapie génique) dans une thérapie anti-mucoviscidose. II s'agit par 2s exemple des cellules épithéliales, en particulier dans les traitements focaux, par exempte au plan pulmonaire, ou de toutes autres cellules, .par exemple les cellules hépatiques, Qui sont susceptibles d'intervenir dans l'effet bénéfique du traitement, en particulier lorsqu'il résulte d'un traitement par la voie générale. Celui-ci revêt un intérêt tout particulier dans le cadre 3o de l'invention, compte tenu du mode d'action préféré dont elle tire profit, à
savoir l'amélioration de la fonction de transporteur de glutathion.

~3 L'invention concerne donc aussi toutes fomles de compositions pharmaceutiques appropriées au traitement de la mucoviscidose, permettant le cibiage des cellules choisies et contenant, associée à un véhicule pharmaceutiquement acceptable approprié, une cassette d'ADN
comprenant la molécule d'ADN selon l'invention, sous le contrble d'éléments de régulation aptes à contrbler la transcription et la traduction de sa séquence codante dans des cellules de mammifères, de préférence humaines.
Un premier type de compositions préférées sont des io compositions pharmaceutiques adaptées à l'administration par voie générale pour les raisons évoquées ci-dessus. D'autres formes de compositions sont adaptées à l'administration par l'intermédiaire des voies respiratoires, des compositions préférées selon ('invention étant alors celles qui peuvent étre mises sous forme d'aérosols, nébulisats ou is analogues autorisant l'absorption de la composition notamment par inhalation, et l'amenée de ces compositions au contact direct des cellules pulmonaires ciblées.
Des exemples de véhicules pharmaceutiques, notamment du type lipides cationiques, particulièrement appropriés à ce mode 2o d'administration et à des fins semblables (en rapport avec des thérapies géniques mettant en oeuvre la CFTR entière) ont déjà été décrits, par exemple dans les demandes intemationafes WO 93!12240, WO 93/12756 ou WO 93/24640. Il va sans dire qu'ils sont également applicables à fa constitution de compositions pharmaceutiques mettant en oeuvre la 2s molécule d'ADN selon l'invention.
L'invention concerne enfin aussi les poiypeptides eux-mêmes qui sont caractérisés par des séquences en acides aminés .telles qu'elles ont été définies plus haut en rapport avec les séquences d'ADN
caractéristiques des molécules d'ADN selon l'invention. Ces polypeptides 3o sont en particulier ceux qui ont été produits dans des cellules en culture, après transformation de celles-ci par des vecteurs appropriés contenant WO 99/06547 PCT/P'R98/01704 des séquences d'ADN codant pour ces polypeptides sous le contrôle d'éléments de régulation appropriés, et récupération des pofypeptides d'expression obtenus à partir de ces cultures cellulaires.
II a déjà été fait référence plus haut et à titre d'exemples à un s certain nombre de demandes de brevet déjà publiées relatives à des systèmes de culture dont l'utilisation a déjà été décrite en rapport avec la production de CFTR recombinante. Les mêmes systèmes peuvent être utilisés avec avantage pour la production des polypeptides définis dans la présente demande.
io De la même façon, l'invention concerne des compositions pharmaceutiques associant aux susdits polypeptides des véhicules pharmaceutiques appropriés, en particulier du même type que ceux envisagés ci-dessus pour les compositions pharmaceutiques à base de molécules d'ADN.
is L'invention ne se limite pas à la seule utilisation d'une molécule d'ADN telle qu'elle a été définie ci-dessus, en particulier pour ce qui est de la séquence peptidique qu'elle possède en commun avec le gène de la CFTR. Elle concerne aussi des compositions dans lesquelles à cette molécule d'ADN serait substituée -ou aussi ajoutée-une molécule d'ADN
2o distincte dont le produit d'expression, structurellement différent de celui de la molécule d'ADN, telle qu'elle a été définie plus haut, présenterait lui aussi une fonction de transporteur de glutathion. En particulier seraient utilisables à cet effet des ADNs contenant une région NBF-1 de protéines du type protéine MRP ou MDR humaine, qui porte aussi une telle Zs information génétique. A titre d'exemple, on mentionnera la séquence d'ADN codant pour la MRP-1 humaine décrite par Cole S.P.C. et al., Science 2~8: 1fi50-1ô54 (1992). De la même façon la protéine MRP
humaine ou la région utile à cette fin peut-elfe être substituée -ou aussi ajoutée- au produit d'expression de la molécule d'ADN conforme à
30 l'invention, telle qu'elle a été définie plus haut.

WO 99/06547 PCT/F'R98I01704 >>
L'invention n'est finalement limitée, ni à des compositions dont le principe actif serait constitué seulement par une molécule d'ADN conforme à l'invention ou plus généralement par une molécule d'ADN codant pour un polypeptide doté d'une activité de transporteur d'ions giutathion, ou encore s des produits d'expression correspondants. Elle concerne aussi des compositions dans IesqueNes ce principe actif serait également associé à
d'autres, par exemple à une molécule d'ADN distincte ou, selon le cas, à
son produit d'expression. 11 s'agit, par exemple, de l'ADN entier codant pour la CFTR ou l'ADN tronqué de la demande internationale WO 9512b796, ou io le produit d'expression correspondant, aux fins de restaurer une fonction canal à ions chlorure déficiente chez le patient traité de façon peut-être plus marquée Que ne l'autoriserait ~ la seule molécule d'ADN selon l'invention. On peut alors de cette façon assurer dans les conditions les plus favorables les restaurations simultanées de la fonction transporteur de na glutathion et de la fonction canal à ions chlorure chez les patients concernés.
De la mëme façon l'invention concerne des compositions du type sus-indiqué, par exemple celles dans lesquelles la molécule d'ADN
selon l'invention, en particulier celle dérivée du gène codant pour la CFTR, 2o serait associée à une séquence d'ADN codant pour la glutathion-S-transférase, tel que celle portée par le gène GSTM1 humain (Zhong S. et al., Biochem. J. 291:41-50 (1993)), en particulier aux fins de potentialiser la fonction transporteur de glutathion de la composition selon l'invention.
S'agissant des compositions à base de peptides, l'invention 2s étend donc aussi ses effets à celles qui contiendraient, aux mêmes fins, de la glutathion-S-transférase.
Enfin les indications cliniques de l'invention ne sont pas limitées au traitement de la mucovisci~os-e. Les compositions pharmaceutiques de l'invention sont également applicables à d'autres affections fréquemment 30 observées chez des patients CF-hétérozygotes, par exemple de l'asthme WO 99/06547 PCT/P'R98/01704 WO 99/06547 PC'T/FR98/01704 et des polyarthrites et, plus généralement encore au traitement d'affections attribuables à un déficit de la fonction de transporteur de glutathion.
Enfin les molécules d'ADN selon ('invention sont utilisables pour induire une fonction de transporteur de glutathion chez l'animal, par s exemple la souris, aux fins de créer des modèles animaux exprimant cette fonction et pour étudier l'effet de composés tiers administrés à ces modèles animaux, que ce soit pour stimuler davantage encore cette fonction de transporteur de glutathion de leurs produits d'expression ou, au contraire, pour apprécier dans quelle mesure ces composés interfèrent avec les io fonctions de transporteur de giutathion de ces produits d'expression. 3. to redefine the limits of the NBF1 domain - hereinafter "NBF1 revisited" -which is now considered to be approximately from 430th amino acid residue to approximately residue 650 (encroaching around 70 residues on the R domain, in its definition s initial) of the CFTR sequence.
This last point follows directly from the hypothesis of a comparable folding for the NBF regions of beef ATPase-F1 and of the CFTR. The main argument is that the ABC carrier family forms a homogeneous group very distinct from the other ATP-binding proteins, io whose members come from a divergent evolution. In this context, these proteins must show a comparable folding in their conserved regions (typically in NBF “elementary bricks”).
It is then lawful to model the structure of one of these proteins from of another's known structure.
is The structure model thus constructed for the NBF1 domain of CFTR, by homology with the known structure of the domains of fixation of beef ATPase-F1 nucieotides (Abrahams JP, Jeslie AGW, Lutter R., Walker JF (1994) Nature 370: 621-628), according to the method described by Annereau et al. (FEBS Letters, (1997) 407: 303-308), includes a heart 2o hydrophobic consisting of a sheet ~ with 6 parallel strands, respectively L453-5456 N505-5511 ~ N538-G542 ~ D567-D572 ~ R600-V603) ~ These sheets alternate with 6 propellers a are organized on either side of the mean plane of the ~ i central sheet, as shown in FEBS Letters, Vol. 407, pp.:303-308, 1997. Loops located on the surface of the domain connect the 2s sheet propellers.
And in fact the expression product of the fragment corresponding to gene coding for your CFTR (fragment which was itself part of the invention) proved to be stable, which is credited by the results of cloning in E. coli from new »NBF1 domain (or revisited NBF1 domain), _ in F.coli in 3o polyhistidine system, that is to say a fusion DNA coding for the WO 99/06547 PCTlFR98 / 01704 "NBF1 revisited" domain (this is a fragment coding for the polypeptide ranging from 448th to fi50th amino acid residues of CFTR) and a tail containing only 6 histidine residues (we can then consider that is produced "alone"). The production rates obtained are notoriously higher s larger than on the previous fragment, reaching for the system polyhistidine around 200 mg per culture titer (from the first test, before any optimization). This purified fragment "revisited NBF1" has been purified in massive quantities, as a soluble and stable protein.
The potential existence of a gfutathion binding site in lo CFTR NBF1 practically superimposable on the glutathione binding site in the GST is highlighted by comparison of this model with the known structure of ia GST (Glutathione-S-Transferor), protein which has a glutathione binding site that catalyzes reactions glutathione nucleophilic attacks. NBF1 residues is potentially involved in glutathione fixation lie in a region forming a crevice at the ends of strands involved in a leaf ~ (see FEBS letter article). These residues are located more precisely in loops, at the N-terminal ends of the sheets 1 to 4 of the structure of NBF1. These loops contain residues I ~ g-Q4 ~ 2 (IERGQ), S4 ~ g-K4g ~ (SEGK), M4gg-1506 (MPGTIKENI), A ~ ss-L5sa (ADLVL), A5gg-T ~ gg (ANKT).
The new definition of NBF1 and the 3D structure model built, allowed the inventors to propose a new function for CFTR, suggested by the unexpected fact that NBF1 is retained on column of 2s glutathione, even after cleavage of the fusion protein GST-NF1. Indeed, the comparison of this model with the known 3D structure of the GST, protein which has a glutathione binding site and which catalyzes reactions of nucleophilic attacks of glutathione (Lim. 94), evidence in evidence the presence of a potential glutathione binding site.

Functional information about your two proteins ABCs closest to CFTR (human MRP and yeast YCF1) seem to support this hypothesis. Indeed, it is now established that t ~ IRP exports drugs via glutathione, either in the form direct adducts "glutathione-drug", known by simultaneous fixation or sequential glutathione and the drug (Zam.95). Likewise, YCF1 transports cadmium ions in the form of double adducts of the glutathione. Thus, it seems that CFTR can be a "pump to glutathione ”, such as MRP and YCF1.
lo Now the human MRP and MDR proteins are involved in the phenomena of mufti-resistance to anti-tumor drugs (Dean and al., Current Opinion in Genetic & Development 5, 779-785, 1995). These proteins are able to actively transport these drugs, participating thus to the detoxification mechanisms of the cell. Their overexpression 1 ~ is induced by the drugs themselves, which is the main cause of failure of cancer treatments with chemotherapy. Now he was recently shown that overexpression of CFTR could also be triggered by anti-tumor drugs, and that it conferred multi-resistance phenotype (L1.95).
? o From there also follows the hypothesis formulated by the inventors that the transporter function of glutathione could be important and that mutations likely to disrupt it would also explain a number of symptoms of cystic fibrosis. CFTR's role as a glutathione ”(in addition to its known role of chlorine channel) also allows a 2s more comprehensive understanding of cystic fibrosis (Sto.97).
A deficiency in the transport function of glutathione would also make better account for chronic inflammatory reactions and / or the number very high number of polymorphonuclear cells that are often encountered in the pathways of patients with cystic fibrosis, since we know that 30 glutathione plays a central role in controlling the reaction inflammatory by protecting cells from the aggression of fiber radicals by the neutrophilic polymers and, moreover, that it intervenes in the protection against oxidants such as free radicals or hyper-oxides.
Likewise, these are the organs in which the s glutathione is normally secreted and in which it performs a function detoxification (lungs, intestines, colon) which are usually severely affected by cystic fibrosis.
A number of clinical observations are consistent with the hypothesis which is the basis of the invention. The GSH level is indeed io lowered in the serum and bronchial mucus of subjects with cystic fibrosis. The organs where CFTR is expressed, ie better are those where_ GSH plays an important role and is actively transported: pancreas, lung, liver, kidney. Detoxifying liver function appears impaired, a function in which GSH could play a central role. This translates is for example by a particular sensitivity of patients to a heavy metal like mercury. Oxidative stress phenomena are also long observed in the lungs. N-acetyl cysteine, drug used profitably for patients, is deacetylated to entering the cell, providing ia cysteine (semi amino acid 2o essential in humans).
And in fact the validity of the hypothesis already finds a confirmation of the sustainable improvement that has been noted in terms of cystic fibrosis in a 29 year old patient with cystic fibrosis (with clinical signs from birth). The patient treated presented 2s CFTR exon 12 on an allele and, G673X, located in exon 13 on the other allele. This patient had, since his birth in 1968, all the signs mafadia-related clinics: positive sweat tests, sinusitis repeated, repeated bronchitis, nasal cavity polyps etc ... In 1989 there presented with Pseudomonas aeruginosa infection, classic in 3o cystic fibrosis and usually almost definitive in these patients.
In addition, in April 1993, left thigh fibrosarcoma was diagnostic. The patient underwent surgical and radiotherapy treatment then chemotherapy from July to October 1993, followed by another treatment in January 1994.
More specifically, the anti-tumor treatment was as follows - epirubicin, 110 mg for two days (D1 and D2);
- ifosfamide, 3.3 g for five days (D1 to D5);
- Filgrastime, 300 pg per day for eight days (D8 to D15);
under cover - granisetron, for the prevention of nausea;
lo - Methylprednisolone;
- Mesna.
Three months later, the patient received six cycles again epirubicin and ifosfamide.
The cancer treatment has been effective. Also concerning the The clinical picture of cystic fibrosis, following treatment chemotherapy, the following improvements were observed - the patient's respiratory condition has improved considerably-is lying ;
- his Pseudomonas aeruginosa infection has disappeared 20 - his respiratory parameters reach around 75% of theoretical values;
- he recovered a respiratory state roughly equivalent to that that he presented at the beginning of his adolescence;
- he declares himself cured of cystic fibrosis.
2s A sweat test carried out at his home in early 1997 has always been very positive, which means that the channel function at ions. chlon.ire was not restored in this patient. This finding, linked to the fact that the patient declares himself cured of cystic fibrosis leads to the conclusion that another essential function has been restored by the 3o chemotherapy treatment. We can presume in view of the above, WO 99/06547 PCTIFR98 / 0170d that this is the transport function of glutathione which has been considerably increased.
As already indicated, the invention therefore aims more s particularly DNA fragments corresponding to parts of the gene coding for CFTR, these parts also coding for a polypeptide having an active transport function of glutathione. In the following, DNA sequences are generally defined by reference to corresponding peptide sequences, these sequences io being peptides each time, for the convenience of language, generally designated by the expression "product of expression" of DNA sequences of the invention. These DNA sequences can naturally be reconstructed by the reader, in particular based on in FIG. 1 which, essentially, is a reproduction of the sequence of m gene coding for CFTR which was published in the article by Riordan et al.
already mentioned or also in PCT application WO 91102796.
In the definitions of DNA sequences - or their product of expression- which follow, reference will frequently be made to regions "Downstream" or "upstream" of the DNA sequence or its product 2o of expression to which the invention relates. It will appear so immediate that a region "upstream" of a DNA sequence given to the within the gene coding for CFTR represented in FIG. 1 or of the product corresponding expression is located upstream of the 5 'end of this DNA sequence or the N-terminus of the acid sequence 2s amines of the corresponding expression product. Conversely, the regions “in downstream 'are those located beyond the 3' end of this DNA sequence or C'-terminus of the acid sequence amines of the corresponding expression product.
Also obviously, the indication of a letter (in the 3o system of symbolic identification of amino acids using a unique letter for each of them) followed by a subscript "n" made '15 reference to the “n ~ sme” amino acid which follows from the examination of FIG. 1 attached, beginning with the first amino acid residue from CFTR.
In general, the DNA molecule according to the invention the longest contains a DNA sequence whose expression product has s a peptide sequence in common with part of that of CFTR, this part being essentially free at least from the region N-terminal of the CFTR which extends nom ~ ally upstream of the MSD region of this latter and which comprises, in particular, the 360 amino acids N-CFTR terminals, or, alternatively, any DNA sequence resulting from io fa modification of the previous one by deletion, substitution or addition of nucleotides, provided that at least part of your data is kept ability of the corresponding expression product to exercise a function of glutathione transporter.
The term “glutathione-carrying compound” means, according to is the invention, a compound which belongs to the family already listed of ABC transporters who perform their transport function by through giutathione. We also hear any fragment or analog of such a carrier resulting from one or more mutations, which retains its transport property via glutathione.
2o Glutathione means gfutathion itself or its adducts with other compounds. They can be natural adducts, such as leukotrienes, or detoxification adducts, with heavy metals, strong oxidants (free radicals, peroxides, etc.); or drugs.
In particular, the capabilities of the expression products of 2s DNA sequences according to the invention to exercise a function of glutathione carrier can be assessed by their ability to induce in in vitro production of CFTR in epithelial cells, ~ for example ir vitro, using the experimental techniques already used to appreciate the same type of drug induction 3o antitumorales, as they have been described and used by Wey LY
and aI.
in the article entitled "Overexpression of the cystic fibrosis transmembrane regulator in NIH 3T3 cells lowers membrane potential and intracellular pH
and confers a multidrug resistance phenotype "(The overexpression of transmembrane regulator of cystic fibrosis in cells NIH 3T3 reduces membrane potential and intracellular pH and provides a multiple drug resistance phenotype); Biophysical Journal (1995) 69: 883-898.
We can also use the measurement of proportions of mRNA corresponding to CFTR in epitheal cells previously taken from a test mammal suffering from lo cystic fibrosis, such as the mouse, which had previously been administered the DNA molecule according to the invention to be tested, under the control of regulatory elements authorizing transcription and translation of its DNA sequence in epithelial cells, especially in conditions described by Yoshimura et al., in the article identified above.
ls TgH type mice (Unc), obtained from homologous recombination at exon 10 of the Cftr gene (insertion of the resistance gene to neomycin) represent an interesting model for this study. Heterozygous animals show no modification of the phenotype. Homozygous mutants show 2o anomalies similar to human cystic fibrosis in young mice (Kolier BH et al, Science, 248, 1227-1229). These mice are models adequate since elves suffer and die from intestinal obstruction even before reaching adulthood, thus highlighting a model of study inflammatory exacerbation in this organ.
2s An expression vector usable in this test and administrable generally, would for example be formed by an adenovirus of the type Av1 CF2 (Genetic Therapy inc, Gaithersbourg, MD, USA) in which the coding sequence to be studied would replace the coding sequence for CFTR
whole.
3o The highlighting of an expression of the function of giutathion transporter is then appreciated by the increase in WO 99/06547 PCTlFR9810I704 amounts of mRNA induced in the treated mice compared to what is observed in untreated cystic fibrosis mice, by example after quantification of mRNA compared to a reference internal RT-PCR involving the mRNA level of ~ 2-microgfobuüne.
s according to the method of Lechapt-Zaicman E. et al. described in Resp. J. 1997, "M. MDR1-PgP 170 expression in human Bronchas o (The expression of F.MDR-1-PgP 170 in the human bronchial system ”). Moreover, the as amounts of MDR protein are high in the intestinal epithelium, the mammalian transfection tests cited above by the fragment of lo CFTR studied should cause resorption of the inflammatory condition exacerbated in the intestine.
Alternatively, one can also have recourse to define the DNA molecules from the invention to the test already discussed above.
Within the scope of the invention, any DNA molecule corresponding to the ls conditions indicated above and which is characterized by a conservation of the affinity of the corresponding expression product for glutathione, this affinity that can be demonstrated by the implementation of the test consisting in cleaving the expression product of the DNA molecule in question at using thrombin into a C-terminal fragment and into an N- fragment zo terminal, to collect the N-terminal fragment and to put it in contact with an affinity column to which glutathione is grafted, the affinity of said expression product for glutathione then arising from its capacities, analogous to those of glutathione-S-transferase, to be fixed on this column of activity and to be eluted.
zs However, preferably this DNA molecule is shorter, in particular characterized in that its expression product is also essentially free from the side of its C-terminal end of the amino acid sequence of the region of the CFTR which extends normally downstream of the R region of the latter.

WO 99/06547 PCTlFR98 / 01704 It is even enough that the amino acid sequence of the product expression of the above DNA sequence comprises itself, from a part and on the side of its C-terminal end, the subsequence approximately 80 amino acid residues {which were previously s considered to belong to the R region and which are now part of of the region “NBF1 revisited”) which, in the CFTR, extends downstream of its ~ 70th amino acid residue and, on the other hand and in the direction of its N-terminal end, the NBF1 region of the CFTR, or even only of a part of it, so that the capacity of the expression product is retained lo of the above DNA sequence to exercise said transporter function glutathione.
In general, the DNA sequence according to the invention therefore essentially comprises the region of the sequence coding for all or part of the “NBF1 revisited” region of the CFTR which extends from its is C-terminal end to beyond the presumed site of fixation of the glutathione (naturally in the reverse reading direction of fa amino acid sequence of this "revisited NBF1", that is to say of its C-terminus towards its N-terminus.
A preferred DNA molecule is one whose product 2o expression itself has an amino acid sequence which ranges from approximately the 430th to the 660th amino acid residue of ia CFTR.
Among the preferred DNA molecules according to the invention, mention will be made those which are characterized in that the amino acid sequences of 's their respective expression products contain themselves, on the one hand and on the side of their C-terminal end, the sequence NLQPDFSSKLMGCDS
{N635 to S64g) of the CFTR and, on the other hand and in the direction of their N-terminus, one or more of the following peptide sites - ANKT (ASgs to T599) 30 - ADLYL (ASgg to LS ~ p), - MPGTIKENI (M4gg to l5pg), - SEGK (S4 ~ g to K4g ~), - (ERGQ (I ~ g to Q452) of the CFTR.
s In particular, the DNA molecule according to the invention can be chosen from those having a DNA sequence characterized in that the amino acid sequence of its expression product includes, on the one hand and close to its C-terminal end, the sequence NLQPDFSSKLMGCDS (Ng35 to S ~ g) and, on the other hand and close to its io N-terminal end - either the ANKT peptide site (ASgg to TSgg), - either the ADLYL peptide site (ASgg at L5 ~ 0), - either the MPGTIKENI peptide site (M4gg at ~~ 15p6), - either the SEGK peptide site (S4 ~ g to K4g ~), m - or the IERGQ peptide site (I ~ g to Q452) of the CFTR.
However, the amino acid sequence of the product expression of the above DNA sequence may still include, downstream of the NLQPDFSSKLMGCDS site (Ng35 to 5649) a segment of 10 to 20 residues 2o of amino acids whose sequence corresponds to that which follows this same site also in the CFTR or, upstream from the above site near its N-terminus, a segment of 10 to 20 amino acid residues that precedes this same site also in CFTR, or both segments at the same time.
These segments can also be replaced by ofigonucleotides of 2s (iaïson (linkers) containing restriction sites facilitating their incorporation into a vector intended to transfer them into cells appropriate authorities.

wo 99io6sa ~ rcr ~ 9sromo4 In general, the preferred DNAs of the invention are those whose expression products are soluble in water or in a senrm physiological, in particular at least 0.5, preferably at least minus 1 ml of water, especially in the form of physiological solution.
s The invention naturally also relates to any DNA molecule recombination, in which the DNA sequence as it was defined above is recombined with elements of acids exogenous nucleic acids, in particular recombinant molecules encoding for a fusion protein nevertheless exhibiting the properties io essential biological, as defined above, from expression product of the DNA sequence characteristic of the molecules according to the invention.
Another category of DNA molecules in accordance with the invention are those in which the exogenous nucleic acid elements are is constitutive of an expression vector, comprising '~ elements of appropriate regulations, said nucleic acid sequence being therein the insertion sequence state placed under the control of these elements of regulation, these then authorizing the expression of said acid sequence nucleic acid in a competent cellular organism.
These are in particular expression vectors capable of transform competent cellular organisms to ensure the expression of the DNA sequence characteristic of the invention, the product expression can then, if necessary, be recovered from cells in culture, or even from the culture medium. It goes without saying than 2s the invention cannot be limited to vectors modified by the sequence of DNA according to the invention which could only be used for therapeutic purposes gene. It also extends its effects to all other forms of vectors likely to be used for the production of the expression product corresponding in cultured cells, especially for the purpose of 3o produce the recombinant expression product which could itself be directly used, as discussed below.

WO 99/06547 PGT / FR98 ~ 01704 Reference is made to the descriptions of international applications WO 91/02796 already cited, WO 91110374, WO 92/05273 and WO 93117040 for examples of expression vectors that have already been described for the expression CFTR whole gene, and at your request WO 95! 25796 s already mentioned in which are described vectors usable for the expression of a CFTR whose C-terminal region had been truncated. These different vectors are naturally also usable for the expression of the DNA sequences in accordance with the present invention. The descriptions of these patent applications should be considered io forming part of the description of the present application with regard to variants of expression vectors which can be used for the production of expression products of DNA molecules according to the invention.
Of particular interest, the vectors allowing the transformation of human cells, in particular epithelial cells.
is Particularly preferred expression vectors are vectors derived from adenovirus or retrovirus type viruses or from viruses related to these (AAV virus), the use of which has already been envisaged for the realization of gene therapies applied to the treatment of cystic fibrosis. International applications will also be mentioned 2o WO 95113365 and WO 96/13598 which describe vectors and more generally techniques applicable to the expression of the coding gene for CFTR, for application in gene therapy in the form of transcription and expression cassettes comprising the coding sequence for CFTR, recombined with regulatory sequences 2s functional in vivo in mammalian cells. Again these techniques are applicable to the expression of DNA sequences in accordance with the invention (instead of DNA sequences coding for the entire CFTR) so the descriptions of these requests should also be considered part of the description of the 3o this request, with regard to the description of techniques and vectors usable for this purpose.

wo moss4 ~ pcr ~ 9eromoa Everything indicates that the in-vivo induced expression of molecules of DNA according to the invention, all of which are intended to code for a polypeptide having a giutathione transporter function, can remedy to an insufficiency in this respect of an endogenous CFTR due to the s changes that it would bring about and which seem to be attributable to the minus some of the clinical signs of cystic fibrosis and, more generally, to stimulate an endogenous expression of CFTR and, this even partially restoring the chloride ion channel function, as soon as when this would not be completely annihilated by other mutations lo affecting this endogenous CFTR.
The expected therapeutic effect of gene therapy using work with DNA sequences corresponding to the above-mentioned definitions, may be all the greater as the expression products of these DNA sequences are smaller, soluble, stable, and of a is own immunogenicity reduced, even nonexistent in practice.
In general, the invention also relates to any pharmaceutical composition combining DNA molecules conforming to the invention, if necessary already in "vectorized" form with pharmaceutical vehicles promoting their penetration into cells 2o human and their expression in them.
These are all types of cells likely to be targeted by molecules used directly or indirectly (for example in the case of polypeptides generated in situ as in the case of gene therapy) in anti-cystic fibrosis therapy. It is by 2s example of epithelial cells, in particular in treatments focal, e.g. pulmonary, or any other cell, .by example liver cells, which are likely to be involved in the beneficial effect of the treatment, in particular when it results from a treatment by the general way. This is of particular interest in the context 3o of the invention, taking into account the preferred mode of action from which it takes advantage, at know the improvement of the glutathione transporter function.

~ 3 The invention therefore also relates to all forms of compositions pharmaceuticals suitable for the treatment of cystic fibrosis, allowing the cibiage of the selected cells and containing, associated with a suitable pharmaceutically acceptable vehicle, a DNA cassette comprising the DNA molecule according to the invention, under the control regulatory elements capable of controlling transcription and translation of its coding sequence in mammalian cells, preferably human.
A first type of preferred compositions are pharmaceutical compositions suitable for administration by route general for the reasons mentioned above. Other forms of compositions are suitable for administration via the routes respiratory, preferred compositions according to the invention then being those which can be put in the form of aerosols, nebulisates or is analogs authorizing the absorption of the composition in particular by inhalation, and bringing these compositions into direct contact with cells targeted lungs.
Examples of pharmaceutical vehicles, including cationic lipids type, particularly suitable for this mode 2o administration and similar purposes (in connection with therapies genes implementing the entire CFTR) have already been described, by example in international requests WO 93! 12240, WO 93/12756 or WO 93/24640. It goes without saying that they are also applicable to fa constitution of pharmaceutical compositions using 2s DNA molecule according to the invention.
Finally, the invention also relates to the polypeptides themselves which are characterized by amino acid sequences such as have been defined above in relation to DNA sequences characteristics of the DNA molecules according to the invention. These polypeptides 3o are in particular those which have been produced in cells in culture, after transformation of these by appropriate vectors containing WO 99/06547 PCT / P'R98 / 01704 DNA sequences encoding these polypeptides under control of appropriate regulatory elements, and recovery of pofypeptides of expression obtained from these cell cultures.
Reference has already been made above and by way of example to a s a number of previously published patent applications relating to cultivation systems whose use has already been described in connection with the production of recombinant CFTR. The same systems can be advantageously used for the production of the polypeptides defined in the this request.
In the same way, the invention relates to compositions pharmaceuticals combining the above polypeptides with vehicles appropriate pharmaceuticals, in particular of the same type as those contemplated above for pharmaceutical compositions based on DNA molecules.
is The invention is not limited to the sole use of a molecule DNA as defined above, particularly with respect to the peptide sequence that it has in common with the gene for CFTR. It also relates to compositions in which at this DNA molecule would be substituted - or also added - a DNA molecule 2o distinct including the expression product, structurally different from that of the DNA molecule, as defined above, would present to him also a glutathione transporter function. In particular would DNAs containing an NBF-1 region of proteins can be used for this purpose of the human MRP or MDR protein type, which also carries such a Zs genetic information. As an example, we will mention the sequence of DNA encoding human MRP-1 described by Cole SPC et al., Science 2 ~ 8: 1fi50-1ô54 (1992). In the same way the protein MRP
human or the region useful for this purpose can be elf substituted -or also added to the expression product of the DNA molecule conforming to 30 the invention, as defined above.

WO 99/06547 PCT / F'R98I01704 >>
The invention is ultimately not limited to compositions whose active ingredient would consist only of a conforming DNA molecule to the invention or more generally by a DNA molecule coding for a polypeptide with giutathione ion transporter activity, or s corresponding expression products. It also concerns compositions in IesqueNes this active ingredient would also be associated with others, for example to a separate DNA molecule or, as the case may be, to its expression product. This is, for example, whole DNA coding for CFTR or truncated DNA from international application WO 9512b796, or io the corresponding expression product, in order to restore a function chloride ion channel deficient in patient possibly treated more marked than would be authorized ~ the only DNA molecule according to the invention. We can then in this way ensure under the conditions more favorable the simultaneous restorations of the transporter function of na glutathione and chloride ion channel function in patients concerned.
Similarly, the invention relates to compositions of type indicated above, for example those in which the DNA molecule according to the invention, in particular that derived from the gene coding for CFTR, 2o would be associated with a DNA sequence coding for glutathione-S-transferase, such as that carried by the human GSTM1 gene (Zhong S. and al., Biochem. J. 291: 41-50 (1993)), in particular for the purpose of potentiating the glutathione transporter function of the composition according to the invention.
As regards compositions based on peptides, the invention 2s therefore also extends its effects to those which would contain, for the same purposes, glutathione-S-transferase.
Finally, the clinical indications of the invention are not limited to the treatment of cystic fibrosis. The pharmaceutical compositions of the invention are also applicable to other conditions frequently 30 observed in CF-heterozygous patients, for example asthma WO 99/06547 PCT / P'R98 / 01704 WO 99/06547 PC'T / FR98 / 01704 and polyarthritis and, more generally still in the treatment of ailments attributable to a deficiency in the glutathione transporter function.
Finally, the DNA molecules according to the invention can be used for induce a glutathione transporter function in animals, by s example the mouse, for the purpose of creating animal models expressing this function and to study the effect of third-party compounds administered to these models animals, whether to further stimulate this function of glutathione transporter of their expression products or, on the contrary, to assess the extent to which these compounds interfere with io functions of giutathione transporter of these expression products.

Claims

1. DNA molecule containing:
- either a DNA sequence whose expression product has a sequence peptide in common with part of that of the CFTR, this part being essentially free of at least the N-terminal region of the CFTR which normally extends upstream of the MSD region of this last and which includes, in particular the 360 amino acids N-terminals of CFTR, this expression product being endowed with a function glutathione transporter, - either a DNA sequence resulting from the modification of the previous one by deletion, substitution or addition of nucleotides, provided that is retained at least in part the capacity of the expression product corresponding to exert a function of transporter of glutathione.

2. DNA molecule according to claim 1, characterized in that that the expression product of said DNA sequence is also essentially free on the side of its C-terminal end, of the region in amino acids from the region of the CFTR which normally extends downstream of region R of the latter, and which includes in particular the 650 C-terminal amino acids of the CFTR.

3. DNA molecule according to claim 1 or claim 2, characterized in that the amino acid sequence of the product of expression of the aforesaid DNA sequence itself comprises, on the one hand part and on the side of its C-terminal end, the subsequence of approximately 80 or more amino acid residues which, in the CFTR, extends downstream from its 570th amino acid residue and, on the other hand and on the side of its N-terminal end, a sufficient part of the region NBF1 of the CFTR, or even of a part upstream of it, so that either retained the ability of the expression product of said DNA sequence to perform said glutathione transporter function.

4. DNA molecule containing:
- either a DNA sequence whose expression product has a sequence peptide in common with part of that of the CFTR, this part being essentially free of at least the N-terminal region of the CFTR which normally extends upstream of the MSD region of this last and which includes, in particular the 360 amino acids N-terminal of the CFTR, this expression product exhibiting an affinity for glutathione;
- either a DNA sequence resulting from the modification of the previous one by deletion, substitution or addition of nucleotides, provided that the affinity of the expression product is preserved at least in part corresponding to glutathione.

5. DNA molecule according to claim 4, characterized in that that the expression product of said DNA sequence is also essentially free on the side of its C-terminal end, of the region in amino acids from the region of the CFTR which extends downstream from the region R of the latter, and which comprises in particular the 650 amino acids C-terminals of the CFTR.

6. DNA molecule according to claim 4 or claim 5, characterized in that the amino acid sequence of the product of expression of the aforesaid DNA sequence, itself comprises, on the one hand part and on the side of its C-terminal end, the subsequence of approximately 80 or more amino acid residues which, in the CFTR, extends downstream from its 570th amino acid residue and, on the other hand and on the side of its N-terminal end, a sufficient part of the region NBF1 of CFTR, so that the affinity of said product is preserved expression for glutathione.

7. DNA molecule according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the amino acid sequence of the polypeptide of expression of the aforesaid DNA sequence itself contains, on the one hand and on the side of its C-terminal end, the sequence NLQPDFSSKLMGCDS (N635 to S649) of the CFTR and, on the other hand and in the direction of its N-terminal end, one or more of the sites following peptides:
- ANKT (A596 to T599), - ADLYL (A566 to L570), - MPGTIKENI (M498 to I506), - SEGK (S478 to K481), - IERGQ (I448 to Q452), of the CFTR.

8. DNA molecule according to claim 7, characterized in that that the amino acid sequence of the expression polypeptide of the said sequence includes, on the one hand and near its end C-terminal, the sequence NLQPDFSSKLMGCDS (N635 to S649) and, on the other apart and close to its N-terminus:
- either the ANKT peptide site (A596 to T599), - either the ADLYL peptide site (A566 to L570), - either the MPGTIKENI peptide site (M498 to I506), - either the SEGK peptide site (S478 to K481), - either the IERGQ peptide site (I448 to Q452), of the CFTR.

9. DNA molecule according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the bulk of the sequence is essentially delimited by the codons of nucleotides which code respectively for the 430th and 660th amino acid residues of the CFTR.

10. DNA molecule according to claim 8 or claim 9, characterized in that the amino acid sequence of the product expression of said DNA sequence still includes downstream of the site NLQPDFSSKLMGCDS (N635 to S649) a segment of 10 to 20 residues of amino acids whose sequence corresponds to that which follows this same site also in the CFTR or even upstream of the aforementioned site near its N-terminal end, a segment of 10 to 20 amino acid residues which precedes this same site also in the CFTR, or both segments at the same time.

11. DNA molecule whose nucleotide sequence coincides with the DNA sequence, as defined in any of claims 1 to 10.

12. DNA molecule according to any one of claims 1 to 11, characterized in that its expression product is soluble, in particular at a rate of at least 0.6 mg/ml of water, for example of solute physiological solution, preferably at least 1 mg/ml of physiological solution.

13. DNA molecule according to any one of claims 1 to 12, characterized in that it is formed from a recombinant DNA

between the aforesaid DNA sequence and a distinct sequence, the set encoding a fusion molecule retaining biological properties of the expression product of the first.

14. DNA molecule according to any one of claims 1 to 12, characterized in that it consists of an expression vector comprising appropriate regulatory elements, said sequence of nucleic acid found therein as an insertion sequence placed under the control of these regulatory elements, these then authorizing expressing said nucleic acid sequence in an organism competent cell.

15. DNA molecule according to claim 14, characterized in that that the competent cellular organism includes human cells, in particular epithelial or hepatic cells.

16. DNA molecule according to claim 14 or claim 15, characterized in that the expression vector is a vector of the type adenovirus, or retrovirus, or viruses related to them and functionally analogous to these.

17. DNA molecule according to any one of claims 1 to 16 for application in gene therapy.

18. Host cell, characterized in that it contains the molecule DNA according to any one of claims 1 to 17 in a form allowing its expression within this cellular host.

19. Composition containing the DNA molecule according to one any one of claims 1 to 17, associated with a vehicle authorizing its penetration into human cells and its expression in them.

20. Composition according to claim 19, characterized in that that the DNA molecule is associated with a cationic lipid carrier favoring this expression.

21. Composition according to claim 19 or claim 20, characterized in that said DNA molecule is associated with a carrier pharmaceutically acceptable authorizing its administration in vivo by the general way.

22. Composition according to claim 19 or claim 20, characterized in that the aforesaid DNA molecule is associated with a vehicle pharmaceutically acceptable authorizing its administration in vivo by the general route via the respiratory tract.

23. Composition according to any one of claims 19 to 22, characterized in that it further comprises a DNA molecule coding for glutathione-S-transferase, and this in a form allowing its expression in vivo.

24. Use of the DNA molecule according to any of the claims 1 to 17 or of the composition according to any one of claims 19 to 23, for the production of a composition drug suitable for the treatment of cystic fibrosis.

25. Polypeptide whose sequence coincides with that of the product of expression of the DNA sequence as it has been defined in one any of claims 1 to 14.

26. Composition containing the polypeptide of claim 25 in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.

27. Composition according to claim 26, characterized in that that the pharmaceutically acceptable vehicle which allows the administration through the general route.

28. Composition according to claim 26, characterized in that that the pharmaceutically acceptable vehicle is of a type which allows administration through the respiratory tract.

29. Composition according to claim 28, characterized in that that it is releasable in the form of aerosols or other form of product administered by inhalation.

30. Composition according to any one of claims 26 to 29, characterized in that it also contains glutathione-S-transferase.

31. Use of the composition of the polypeptide according to claim 25 or any of claims 26 to 29 for the production of drugs for the treatment of cystic fibrosis.