EP0984784B1

EP0984784B1 - Anti-cancer products for treating cystic fibrosis

Info

Publication number: EP0984784B1
Application number: EP98928381A
Authority: EP
Inventors: Véronique STOVEN; Gérard LENOIR; Jean-Yves Lallemand; Jean-Philippe Annereau; Joel Barthe; Sylvain Blanquet
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-05-30
Filing date: 1998-05-28
Publication date: 2002-11-20
Anticipated expiration: 2018-05-28
Also published as: FR2763845A1; US6635627B1; DE69809546T2; CA2291928A1; ATE227994T1; AU8023298A; DE69809546D1; EP0984784A2; FR2763845B1; WO1998053839A2; CA2291928C; JP2002502389A; WO1998053839A3

Abstract

The invention concerns a novel approach for treating cystic fibrosis using, in particular, anti-cancer chemotherapy. For the treatment of cystic fibrosis it proposes the use of at least one product which when administered to a patient brings about the expression or overexpression of an ABC carrier compound, in particular glutathione carrier. Preferably, the products used are anti-cancer products whose administration brings about the expression of MRP and/or MDR protein. The invention is also applicable to the treatment of rheumatoid polyarthritis or asthma. More specifically, the compounds are selected among cyclophosphamide, aclarubicin, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, zorubicin, pirabucin, colchicine, videsine, vinorelbine, vincristine, binblasine, azithromycin, erythromycin, ifosmamide, N-acetyl cysteine, N-acetyl lysine and/or a CFTR protein fragment comprising the NBF1 domain.

Description

La présente invention concerne une nouvelle approche pour le traitement de la mucoviscidose, qui fait intervenir la chimiothérapie, notamment anti-cancéreuse.The present invention relates to a new approach for the treatment of cystic fibrosis, which involves chemotherapy, in particular anti-cancer.

La mucoviscidose est une maladie génétique d'expression surtout pulmonaire qui relève d'un défaut dans le gène codant pour la protéine CFTR (pour « Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator »), protéine capable de participer directement ou indirectement au transport des ions chlorures à travers les membranes cellulaires.Cystic fibrosis is a genetic expression disease especially pulmonary which is due to a defect in the gene encoding for the protein CFTR (for “Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator "), protein capable of participating directly or indirectly to the transport of chloride ions to across cell membranes.

D'une manière générale, la protéine CFTR appartient à la famille des transporteurs ABC (pour « ATP Binding Cassette »), une famille très large de protéines dont les membres se retrouvent tant chez les eucaryotes que chez les procaryotes. Ce sont en général des transporteurs actifs qui hydrolysent l'ATP pour fournir le potentiel chimique nécessaire à leur fonction de transport. Ainsi, chez les eucaryotes, elles transportent différents types de molécules à travers les membranes cellulaires. Parmi les molécules susceptibles d'être transportées, on peut citer les ions, les vitamines, les peptides, les sucres ainsi que les substances médicamenteuses ou autres drogues. Leur organisation globale présente des caractères communs : elles comprennent généralement une région transmembranaire (TM) qui participe à la sélection de l'entité chimique à transporter, et un domaine de fixation des nucléotides qui hydrolyse l'ATP pour fournir le potentiel chimique nécessaire au transport (NBF pour « Nucleotide Binding Fold »).Generally, the CFTR protein belongs to the ABC transporter family (for “ATP Binding Cassette”), a very large family of proteins whose members are found in both eukaryotes and prokaryotes. This are generally active transporters which hydrolyze ATP to provide the chemical potential necessary for their function of transport. So, in eukaryotes, they carry different types of molecules across membranes cell. Among the molecules likely to be transported, mention may be made of ions, vitamins, peptides, sugars as well as drug substances or other drugs. Their overall organization presents common characteristics: they generally include a region transmembrane (TM) which participates in the selection of the entity chemical to be transported, and an area for fixing nucleotides which hydrolyzes ATP to provide the potential chemical necessary for transport (NBF for "Nucleotide Binding Fold ”).

Les gènes codant pour ces protéines sont souvent issus de la fusion de deux gènes de structure analogue.The genes encoding these proteins are often derived from the fusion of two genes of similar structure.

La structure des protéines correspondantes est, alors généralement la suivante : (TM1)-(NBF1)-(TM2)-(NBF2) The structure of the corresponding proteins is then generally as follows: (TM1) - (NBF1) - (TM2) - (NBF2)

La protéine CFTR représente un élément de 1480 acides aminés d'une sous-famille de la famille des transporteurs ABC appelée sous-famille MRP/CFTR. Outre la protéine CFTR, cette sous-famille comprend la protéine MRP humaine. Les deux protéines présentent en effet une similarité de séquence d'environ 50 %. La protéine MRP (pour « Multi-drug Resistance associated Protein »), est connue pour être impliquée dans des phénomènes de multi-résistance aux médicaments utilisés en chimiothérapie du cancer (M. Dean, R. Allikmets, Current Opinion in Genetics & Development, 5, 779-785, 1995). La protéine CFTR est également très proche structurellement d'un autre membre de la sous-famille MRP/CFTR, la protéine YCF1 (pour « Yeast Cadmium Resistance Factor 1 ») qui confère à la levure Saccharomyces cerevisiae le phénotype de résistance aux ions cadmium (Tommasini et al., PNAS, 93, 6743-6748, 1996). Outre leur similarité de structure, les protéines MRP et YCF1 présentent un mode de fonctionnement analogue : elles exportent les molécules et les ions sous la forme de leurs adduits avec le glutathion (G.J. Zaman et al., PNAS, 92, 7690-7694, 1995).The CFTR protein represents an element of 1480 acids amines of a subfamily of the ABC transporter family called the MRP / CFTR subfamily. In addition to the CFTR protein, this subfamily includes the human MRP protein. Both proteins show sequence similarity about 50%. The protein MRP (for “Multi-drug Resistance associated Protein ”), is known to be involved in multi-resistance phenomena to drugs used in cancer chemotherapy (M. Dean, R. Allikmets, Current Opinion in Genetics & Development, 5, 779-785, 1995). CFTR protein is also structurally very close to another member of the MRP / CFTR subfamily, the protein YCF1 (for "Yeast Cadmium Resistance Factor 1 ") which gives the yeast Saccharomyces cerevisiae the phenotype of resistance to cadmium ions (Tommasini et al., PNAS, 93, 6743-6748, 1996). Besides their similarity of structure, the proteins MRP and YCF1 present a analogous operating mode: they export the molecules and the ions in the form of their adducts with glutathione (G.J. Zaman et al., PNAS, 92, 7690-7694, 1995).

La protéine CFTR présente également des analogies de structure non négligeables avec la protéine STE6 de levure, qui transporte la phéromone « facteur a » chez la levure Saccharomyces cerevisiae (J.L. Teem et al., Cell, 73, 335-346, 1993) ainsi qu'avec la protéine MDR humaine (pour « Multi-drug Resistance Protein ») connue comme MRP, pour être impliquée dans les phénomènes de multi-résistance aux médicaments anti-cancéreux. La protéine MDR humaine et la protéine STE6 appartiennent à une autre sous-famille des transporteurs ABC, appelée MDR/TAP.The CFTR protein also presents analogies of significant structure with the yeast protein STE6, which carries the "factor a" pheromone in yeast Saccharomyces cerevisiae (J.L. Teem et al., Cell, 73, 335-346, 1993) as well as with the human MDR protein (for “Multi-drug Resistance Protein ") known as MRP, to be involved in the phenomena of multi-resistance to anti-cancer drugs. Human MDR protein and STE6 protein belong to another ABC transport subfamily, called MDR / TAP.

Ainsi l'appartenance générale de la protéine CFTR à la famille des transporteurs ABC ainsi que sa fonction de transporteur des ions chlorure sont maintenant bien connues.Thus the general membership of the CFTR protein in the family of ABC carriers as well as its function of chloride ion transporter are now well known.

Chez un malade atteint de la mucoviscidose, la protéine CFTR est mutée. Plus de 600 mutations ont été inventoriées mais dans environ 70 % des cas, la mutation en cause est une délétion d'une phénylalanine en position 508, dans la partie NBF1 (ΔF508) de la structure globale de la protéine. Il semble que cette mutation entraíne un défaut de repliement de la protéine qui est alors détruite à l'intérieur de la cellule sans achever sa maturation post-traductionnelle (Riordan J.R., Rommens J.M., Kerem B.S., Alon N., Rozmahel R., Grzelczack Z., Zielenski J., Lok S., Plavic N., Chou J.L., Drumm M.L., Iannuzzi M.C., Collins F.S., Tsui L.C. (1989) Science. 245, 1066-1072). L'absence d'une protéine CFTR mature ou fonctionnelle conduit à un défaut de sécrétion des ions chlorures. Le test dit « de la sueur », qui mesure la sécrétion des ions chlorures, a d'ailleurs été mis au point dès 1953, et reste indispensable pour diagnostiquer la mucoviscidose.In a patient with cystic fibrosis, the protein CFTR is transferred. More than 600 mutations have been inventoried, but in approximately 70% of cases, the mutation in question is a deletion a phenylalanine in position 508, in the NBF1 part (ΔF508) of the overall structure of the protein. It seems that this mutation results in a protein folding defect which is then destroyed inside the cell without completing its post-translational maturation (Riordan J.R., Rommens J.M., Kerem B.S., Alon N., Rozmahel R., Grzelczack Z., Zielenski J., Lok S., Plavic N., Chou J.L., Drumm M.L., Iannuzzi M.C., Collins F.S., Tsui L.C. (1989) Science. 245, 1066-1072). The absence of a mature or functional CFTR protein leads to a defect in secretion of chloride ions. The test says "sweat", which measures the secretion of chloride ions, has also been put point in 1953, and remains essential to diagnose cystic fibrosis.

Jusqu'à présent des tentatives ont été faites pour traiter la mucoviscidose par la thérapie génique, en développant des systèmes d'administration aux malades d'un acide nucléique codant pour la protéine CFTR sauvage, vectorisé soit par des virus, soit par des lipides cationiques. Des essais d'administration d'un tel complexe ADN/lipides cationiques ont été faits à des poumons de souris par voie intra-trachéale (Yoshimura et al. « Nucleic Acid Research, 20 :3233-3240, 1992) ou encore par aérosol (Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89 : 11277-11281, 1992). On a également constaté que l'administration du gène codant pour la CFTR complexé avec des lipides cationiques à une souris modèle souffrant de mucoviscidose, avait pour effet la correction du défaut de la fonction de canal à ion chlorure (Hyde et al., Nature 362 : 250-255, 1993).So far attempts have been made to treat cystic fibrosis through gene therapy, by developing delivery systems to patients with nucleic acid encoding the wild-type CFTR protein, vectorized either by virus, either by cationic lipids. Tests administration of such a DNA / cationic lipid complex have been made to mouse lungs intratracheally (Yoshimura et al. "Nucleic Acid Research, 20: 3233-3240, 1992) or by aerosol (Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 11277-11281, 1992). We also found that administration of the gene coding for CFTR complexed with cationic lipids in a model mouse suffering from cystic fibrosis, had the effect of correcting the defect of the chloride ion channel function (Hyde et al., Nature 362: 250-255, 1993).

Ainsi, les approches thérapeutiques envisagées à l'heure actuelle pour la mucoviscidose, visent uniquement le défaut génétique (mutation dans le gène codant pour la protéine CFTR) qu'elles s'efforcent de corriger. Elles lient l'efficacité du traitement au rétablissement de la seule fonction de canal à ion chlorure exercée par une protéine CFTR fonctionnelle.Thus, the therapeutic approaches envisaged at the time current for cystic fibrosis, target only the defect genetics (mutation in the gene encoding the CFTR protein) that they are trying to correct. They link the effectiveness of treatment to restore the only ion channel function chloride exerted by a functional CFTR protein.

Cependant, bien que le défaut de transport des ions chlorure constitue effectivement une manifestation clinique de la mucoviscidose, d'autres manifestations ne sont pas encore totalement expliquées.However, although the lack of ion transport chloride actually constitutes a clinical manifestation of cystic fibrosis, other manifestations have not yet fully explained.

Ainsi par exemple, les organes principalement atteints dans la mucoviscidose sont ceux dans lesquels le glutathion est sécrèté, notamment le foie, ou ceux dans lesquels des mécanismes de détoxification sont susceptibles de faire intervenir le glutathion (poumons, intestin, colon).So for example, the organs primarily affected in cystic fibrosis are those in which glutathione is secreted, especially the liver, or those in which mechanisms detoxification are likely to involve the glutathione (lungs, intestine, colon).

Par ailleurs, on a constaté que chez les patients atteints de mucoviscidose, la réaction inflammatoire est excessive. On constate souvent chez ces patients une inflammation chronique des voies respiratoires. Dans ce cas, un nombre très élevé de polynucléaires neutrophiles est présent dans les voies respiratoires des malades, y compris en l'absence d'infection détectable. Il est possible que cette inflammation précède l'apparition de l'infection chronique. Cet afflux de polynucléaires neutrophiles engendre la libération massive de radicaux libres et d'hyper oxydes dans les cellules des voies respiratoires des malades. Or, on sait que le glutathion extra et intra cellulaire joue un rôle central dans le contrôle de la réaction inflammatoire en protégeant les cellules de l'agression de ces oxydants. Or cette protection semble altérée chez les malades atteints de mucoviscidose. Il semblerait donc que la mucoviscidose empêche le glutathion de jouer son rôle habituel.Furthermore, it has been found that in patients with cystic fibrosis, the inflammatory reaction is excessive. We often finds chronic inflammation in these patients respiratory tract. In this case, a very high number of polymorphonuclear neutrophils is present in pathways respiratory tract of patients, including in the absence of infection detectable. This inflammation may precede the onset of chronic infection. This influx of polymorphonuclear neutrophils generates the massive release of free radicals and hyper oxides in pathway cells respiratory tract of patients. However, we know that extra glutathione and intra cellular plays a central role in the control of inflammatory reaction by protecting cells from attack of these oxidants. However, this protection seems to be impaired in patients with cystic fibrosis. So it would seem that the cystic fibrosis prevents glutathione from playing its usual role.

Des études menées sur la famille des protéines transporteur ABC ont mis en évidence leur relative versatilité. Bien que possédant chacune une fonction propre, elles semblent présenter un mode de fonctionnement commun qui leur permet d'assurer des fonctions communes. Par exemple, il a été démontré in vitro que la protéine MRP humaine pouvait se substituer à YCF1 chez la levure et y assurer la fonction de détoxification du cadmium (Tommasini et al., PNAS, 93, 6743-6748, 1996). Elle peut également se substituer à la protéine STE6 chez la levure pour y assurer le transport du facteur a (J.L. Teem et al., Cell, 73, 335-346, 1993). De même, une protéine chimère de STE6, dans laquelle le domaine NBF1 de CFTR a été substitué au domaine NBF1 de STE6 est fonctionnelle et transporte effectivement le facteur a (J.L. Teem et al., Cell, 73, 335-346, 1993). Enfin, in vivo il semblerait que les gènes codant pour les protéines CFTR, MDR et MRP soient sous des contrôles transcriptionnels couplés (Trezise A.E., Romano P.R., Gill D.R., Hyde S.C., Sepulveda F.V., Buchwald M., Higgins C.F., EMBO J., 11, 4291-4303, 1992 & M.A. Izquierdo, J.J. Neezfjes, A.E.L. Mathari, M.J. Flens, G.L. Scheffer, R.J. Scheper, British Journal of Cancer, 74, 1961-1967, 1996).Studies on the family of transporter proteins ABC have highlighted their relative versatility. Although each with its own function, they seem to present a common operating mode which allows them to ensure common functions. For example, it has been shown in vitro that the human MRP protein could replace YCF1 in yeast and ensure the cadmium detoxification function there (Tommasini et al., PNAS, 93, 6743-6748, 1996). She can also substitute for the STE6 protein in yeast to ensure the transport of factor a (J.L. Teem et al., Cell, 73, 335-346, 1993). Similarly, a chimeric protein from STE6, in which the NBF1 domain of CFTR has been substituted for the NBF1 domain of STE6 is functional and effectively transports the factor a (J.L. Teem et al., Cell, 73, 335-346, 1993). Finally, in vivo it the genes coding for the proteins CFTR, MDR and MRP are under coupled transcriptional controls (Trezise A.E., Romano P.R., Gill D.R., Hyde S.C., Sepulveda F.V., Buchwald M., Higgins C.F., EMBO J., 11, 4291-4303, 1992 & M.A. Izquierdo, J.J. Neezfjes, A.E.L. Mathari, M.J. Flens, G.L. Scheffer, R.J. Scheper, British Journal of Cancer, 74, 1961-1967, 1996).

Les inventeurs ont maintenant trouvé que de façon surprenante, cette versatilité des protéines transporteur ABC pouvait être utilisée pour envisager un traitement de la mucoviscidose par chimiothérapie, en administrant au patient certains types de produits. Ladite administration conduirait à l'expression ou à la surexpression d'un composé qui peut jouer le rôle d'une protéine CFTR fonctionnelle et donc pallier les déficiences de la protéine CFTR mutée.The inventors have now found that in a way surprisingly, this versatility of ABC transporter proteins could be used to consider treatment for cystic fibrosis by chemotherapy, giving the patient certain types of products. Said administration would lead to expression or overexpression of a compound that can play the role of a functional CFTR protein and therefore overcome the deficiencies of the mutated CFTR protein.

C'est pourquoi l'invention a pour objet l'utilisation, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de la mucovisidose, d'au moins un produit dont l'administration à un patient atteint de mucovisidose, conduit chez ledit patient à l'expression ou à la surexpression d'au moins un composé transporteur ABC.This is why the invention relates to the use, for the preparation of a drug intended for the prevention and / or the treatment of mucovisidosis, of at least one product of which administration to a patient with mucovisidosis, leads in said patient to the expression or overexpression of at minus an ABC carrier compound.

On suppose que pour le traitement de la mucoviscidose, le mécanisme d'action du composé exprimé ou surexprimé est tel qu'il peut se substituer à la protéine CFTR déficiente chez le malade. On suppose que le composé exerce alors une fonction normalement remplie par la protéine CFTR sauvage et que la protéine CFTR déficiente ne sait pas remplir chez le patient atteint de mucoviscidose.It is assumed that for the treatment of cystic fibrosis, the mechanism of action of the expressed or overexpressed compound is such that it can replace the deficient CFTR protein in sick. It is assumed that the compound then performs a function normally filled with wild-type CFTR protein and the deficient CFTR protein cannot fill in patient suffering from cystic fibrosis.

Ainsi, des produits utilisables pour le traitement de la mucoviscidose sont ceux qui peuvent induire dans l'organisme du patient l'expression ou la surexpression d'un composé transporteur ABC, lequel se substitue à la protéine CFTR déficiente.Thus, products usable for the treatment of cystic fibrosis are the ones that can induce in the body the patient expression or overexpression of a compound ABC transporter, which replaces the CFTR protein deficient.

Différents modes de réalisation sont envisageables. Selon un premier mode de réalisation, on peut envisager d'administrer des produits qui induisent l'expression ou la surexpression de la protéine CFTR mutée du malade. Elle serait alors exprimée à un niveau tel que, malgré la présence d'une mutation, elle retrouverait sa fonctionnalité.Different embodiments are possible. according to a first embodiment, one can consider administering products that induce expression or overexpression of the patient's mutated CFTR protein. It would then be expressed to a level such that, despite the presence of a mutation, it would regain its functionality.

Selon un autre mode de réalisation, on sélectionnera des produits conduisant à l'expression ou à la surexpression de la protéine MDR.According to another embodiment, we will select products leading to the expression or overexpression of the MDR protein.

Par ailleurs, les travaux menés par les inventeurs suggèrent que la protéine CFTR joue en plus de son rôle de canal à ions chlorures, un rôle de pompe à glutathion. Cette hypothèse pourrait rendre compte de certaines manifestations cliniques présentées par les malades atteints de mucoviscidose, chez qui la protéine CFTR n'est pas fonctionnelle.In addition, the work carried out by the inventors suggest that the CFTR protein plays in addition to its role as a channel with chloride ions, a glutathione pump role. This assumption could account for certain clinical manifestations presented by patients with cystic fibrosis, in whom the CFTR protein is not functional.

De plus, les inventeurs ont mis en évidence, dans le domaine NBF1 de la protéine CFTR, l'existence d'un site potentiel de fixation du glutathion, ce qui peut rendre compte du rôle joué par le glutathion dans la fonction de transporteur exercée par la protéine CFTR. Le rôle de pompe à glutathion de la protéine CFTR permettrait notamment de mieux comprendre l'inflammation chronique caractéristique de la mucoviscidose. En effet, le glutathion est une molécule clé dans le déclenchement et le contrôle de la réaction inflammatoire. Il intervient dans le métabolisme de composés pro-inflammatoires tels que les leukotriènes mais également dans le contrôle de ces réactions en tant qu'agent protecteur vis à vis des oxydants libérés par les polynucléaires neutrophiles (radicaux, hydroperoxydes...).In addition, the inventors have highlighted, in the NBF1 domain of the CFTR protein, the existence of a site glutathione binding potential, which may account for of the role played by glutathione in the transporter function exerted by the protein CFTR. The glutathione pump role of the CFTR protein would notably help to better understand the chronic inflammation characteristic of cystic fibrosis. In effect, glutathione is a key molecule in triggering and control of the inflammatory response. He intervenes in the metabolism of pro-inflammatory compounds such as leukotrienes but also in the control of these reactions in as a protective agent with respect to the oxidants released by the neutrophils (radicals, hydroperoxides ...).

C'est pourquoi, l'invention concerne plus particulièrement l'utilisation, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de la mucoviscidose d'au moins un produit dont l'administration à un patient atteint de mucoviscidose, conduit chez ledit patient à l'expression ou à la surexpression d'un composé ABC transporteur de glutathion.This is why, the invention relates more particularly the use, for the preparation of a medicament intended for the prevention and / or treatment of cystic fibrosis of at least one product the administration of which to a patient with cystic fibrosis, leads in said patient to expression or overexpression of an ABC compound carrying glutathione.

Par « composé transporteur de glutathion », on entend selon l'invention, un composé qui appartient à la famille déjà répertoriée des transporteurs ABC qui exercent leur fonction de transport par l'intermédiaire du glutathion. On entend également tout fragment ou analogue d'un tel transporteur résultant d'une ou plusieurs mutations, qui conserve la propriété de transport par l'intermédiaire du glutathion.The term “glutathione-carrying compound” means, according to the invention, a compound that already belongs to the family listed of ABC carriers who perform their function of transport via glutathione. We also hear any fragment or the like of such a carrier resulting from a or more mutations, which retains ownership of transportation via glutathione.

On entend par glutathion, le glutathion lui-même ou ses adduits avec d'autres composés. Il peut s'agir d'adduits naturels, tels que les leukotriènes, ou encore d'adduits de détoxification, avec les métaux lourds, les oxydants puissants (radicaux libres, peroxydes...), ou les drogues.Glutathione means glutathione itself or its adducts with other compounds. They can be adducts natural, such as leukotrienes, or adducts of detoxification, with heavy metals, strong oxidants (free radicals, peroxides ...), or drugs.

Il est en effet, déjà établi qu'un certain nombre de protéines, notamment la protéine MRP humaine, exportent les drogues et médicaments, notamment les produits anti-cancéreux, par l'intermédiaire du glutathion, soit sous forme d'adduits directs glutathion-drogue, soit par fixation simultanée ou séquentielle du glutathion et de la drogue (G.J. Zaman et al., PNAS, 92, 7690-7694, 1995).It is indeed already established that a certain number of proteins, including human MRP protein, export drugs and medicines, especially anti-cancer products, via glutathione, either in the form of adducts direct glutathione-drug, either by simultaneous fixation or glutathione and drug sequence (G.J. Zaman et al., PNAS, 92, 7690-7694, 1995).

Selon un mode particulièrement préféré, on cherchera à exprimer ou à surexprimer la protéine MRP. Dans ce cas, mais également dans le cas plus général où le composé exprimé ou surexprimé est un transporteur ABC, notamment la protéine MDR, les produits utilisables selon l'invention sont de préférence des produits anti-cancéreux de type antinéoplasiques, c'est-à-dire des agents anti-cancéreux cytotoxiques qui, pour le traitement du cancer, doivent tuer aussi sélectivement que possible, les cellules cancéreuses cibles. En effet, il est connu que l'administration de ces agents anti-cancéreux chez des patients atteints de cancer a souvent tendance à générer des phénomènes de résistance aux anti- cancéreux de type pharmacocinétique et causés par la surexpression de protéines de type MRP ou MDR (M. Dean, R. Allikmets, Current Opinion in Genetics & Development, 5, 779-785, 1995 ; Jedlitschky et al., Cancer Research, vol. 56, 1^er mars 1996, 988-994 ; Akimaru, Cytotechnology, vol. 19, n° 3, 196, 221-227 ; Jedlitschky, Cancer Research., vol. 54, n° 18, 1994, 4833-4836 ; Jedlitschky et al., Anti-cancer drugs, vol. 5 suppl. 01, septembre 1994, 4 ; Mueller et al., PNAS, vol. 91, 1994, 13033-13037 ; Ishikawa, J. Natl. Cancer Inst., vol 87, n° 21, 1995, 1639-1640 ; Leier et al. Biochemical Journal, vol. 314, n° 2, 1996, 433-437).According to a particularly preferred mode, it will be sought to express or overexpress the protein MRP. In this case, but also in the more general case where the expressed or overexpressed compound is an ABC transporter, in particular the MDR protein, the products which can be used according to the invention are preferably anti-cancer products of antineoplastic type, that is to say that is, cytotoxic anti-cancer agents which, for the treatment of cancer, should kill target cancer cells as selectively as possible. Indeed, it is known that the administration of these anti-cancer agents in cancer patients often tends to generate phenomena of resistance to anti-cancer drugs of the pharmacokinetic type and caused by the overexpression of proteins of the MRP or MDR type. (Dean, R. Allikmets, Current Opinion in Genetics & Development, 5, 779-785, 1995; Jedlitschky et al, Cancer Research, vol 56, March ^1, 1996, 988-994;.. Akimaru, Cytotechnology, flight . 19, No. 3, 196, 221-227; Jedlitschky, Cancer Research., Vol. 54, No. 18, 1994, 4833-4836; Jedlitschky et al., Anti-cancer drugs, vol. 5 suppl. 01, September 1994, 4; Mueller et al., PNAS, vol. 91, 1994, 13033-13037; Ishikawa, J. Natl. Cancer Inst., vol 87, n ° 21, 1995, 1639-1640; Leier et al. Biochemical Journal, vol. 314, n ° 2, 1996, 433-437).

L'invention vise donc l'utilisation pour le traitement de la mucoviscidose des quatre grandes familles d'antinéoplasiques utilisées dans le traitement du cancer : les agents alkylants, les agents intercalants, les antimétabolites et les poisons du fuseau.The invention therefore relates to the use for the treatment of cystic fibrosis of the four major families of antineoplastics used in the treatment of cancer: alkylating agents, intercalating agents, antimetabolites and poisons of time.

Les agents alkylants sont des agents capables de remplacer un proton d'une molécule par un groupe alkyle. Ils modifient la structure de l'ADN de façon significative au moment des mitoses dont ils perturbent le déroulement. Parmi les grandes familles d'agents alkylants utilisables selon l'invention, on peut citer les moutardes azotées, les nitroso-urées, les dérivés du platine, les dérivés de l'éthylène-imine, les diméthane sulfonoxy-alkanes, les dérivés de pipérazine, les dérivés de la méthylhydrazine. Des exemples représentatifs des moutardes azotées sont le chlorambucil, le cyclophosphamide, l'ifosfamide, l'estramustine, le melphalan, le chlorméthine. Avantageusement, on utilise l'ifosfamide, notamment en combinaison avec un agent intercalant. Alkylating agents are agents capable of replacing a proton of a molecule by an alkyl group. They modify the DNA structure significantly at the time of mitosis which they disrupt the unfolding. Among the big families alkylating agents which can be used according to the invention, mention may be made of nitrogen mustards, nitrosoureas, derivatives of platinum, ethylene imine derivatives, dimethane sulfonoxy-alkanes, piperazine derivatives, derivatives of methylhydrazine. Representative examples of mustards nitrogen are chlorambucil, cyclophosphamide, ifosfamide, estramustine, melphalan, chlormethine. advantageously, ifosfamide is used, especially in combination with an agent interposing.

Les agents intercalants, sont des agents qui s'intercalent entre les deux bras complémentaires de l'ADN, bloquant ainsi la réplication de l'ADN, la transcription en ARNm et la synthèse protéique. Les grandes familles utilisables selon l'invention comprennent, de façon non limitative, les anthracyclines, les anthracérédiones, les anthracènes, les dérivés de l'acridine, les ellipticines et les actinomycines. De façon préférée, on utilise les anthracyclines, parmi lesquelles on peut citer de façon non limitative la clarubicine, la doxorubicine, la daunorubicine, l'épirubicine, l'idarubicine, la zorubicine et la pirabucine. De façon préférée, on utilisera l'épirubicine, notamment en combinaison avec l'ifosfamide.The intercalating agents, are agents which are intercalated between the two complementary arms of DNA, thus blocking the DNA replication, transcription into mRNA and synthesis protein. The large families usable according to the invention include, without limitation, anthracyclines, anthracérédiones, anthracènes, acridine derivatives, ellipticines and actinomycins. Preferably, we uses anthracyclines, among which mention may be made of without limitation clarubicin, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, zorubicin and pirabucine. Preferably, epirubicin will be used, especially in combination with ifosfamide.

Une troisième famille de composés utilisables selon l'invention est représentée par les antimétabolites, ou antogonistes, ou analogues structuraux qui inhibent habituellement une ou plusieurs étapes de la synthèse des acides nucléiques. Ses composés sont représentés de façon non limitative par les antifoliques, les antipuriques et les antipyrimidiques. On peut citer en particulier, l'améthoptérine (méthotrexate), la mercaptopurine, le 5 fluoro-uracile ou encore la cytarabine.A third family of compounds which can be used according to the invention is represented by antimetabolites, or antogonists, or structural analogs that inhibit usually one or more stages of acid synthesis Nucleic. Its compounds are not represented limiting by antifolics, antipurics and antipyrimidiques. Mention may in particular be made of amethopterin (methotrexate), mercaptopurine, 5 fluorouracil or cytarabine.

Une autre catégorie d'agents anti-cancéreux est représentée par les poisons du fuseau qui bloquent la mitose cellulaire. Ce sont les anti-mitotiques dont les familles représentatives sont les épipodophyllotoxines et les vinca-alcaloïdes. On peut citer parmi les épipodophylotoxines le téniposide ou encore l'étoposide. Parmi les dérivés de vinca, on peut citer par exemple, la vindésine, la vinorébine, la vincristine ou encore la vinblastine. On citera de préférence la colchicine et ses dérivés. Des résultats particulièrement satisfaisants ont été obtenus avec la colchicine, ce qui est d'autant plus avantageux que ce produit est connu pour être peu toxique.Another category of anti-cancer agents is represented by spindle poisons that block cell mitosis. This are the anti-mitotics whose representative families are epipodophyllotoxins and vinca alkaloids. We can cite among epipodophylotoxins teniposide or etoposide. Among the vinca derivatives, mention may be made of: example, vindésine, vinorebine, vincristine or vinblastine. Colchicine and its derivatives. Particularly satisfactory results have been obtained with colchicine, which is all the more advantageous that this product is known to be slightly toxic.

Enfin, il faut également citer la famille des taxoïdes (taxol, taxotère...). Finally, we must also mention the family of taxoids (taxol, taxotere ...).

Selon un autre mode de réalisation, on peut également utiliser des agents cytolytiques divers tels que par exemple la bléomycine, la dacarbazine, l'hydroxycarbamide l'asparaginase, la mitoguazone ou encore la plicamycine.According to another embodiment, it is also possible use various cytolytic agents such as for example bleomycin, dacarbazine, hydroxycarbamide asparaginase, mitoguazone or plicamycin.

On citera plus particulièrement le phénylbutyrate de sodium, un agent cytostatique utilisé dans les maladies du cycle de l'urée avec manifestations hépatiques.Mention will be made more particularly of phenylbutyrate of sodium, a cytostatic agent used in cycle diseases urea with hepatic manifestations.

On citera également à titre de produits utilisables selon l'invention, les produits de la famille des macrolides qui sont connus pour leurs propriétés d'induction de la surexpression de la protéine MDR conduisant au phénomène de résistance aux médicaments (MDR). Des exemples de ces inducteurs sont ceux cités dans la publication Seelig Eur. J. Biochem., 25, 252-261 (1998).Mention will also be made, as products which can be used according to the invention, the products of the macrolide family which are known for their properties of inducing the overexpression of the MDR protein leading to the phenomenon of resistance to drugs (MDR). Examples of these inducers are those cited in the publication Seelig Eur. J. Biochem., 25, 252-261 (1998).

Certains ont déjà été cités comme faisant partie des agents anti-cancéreux. Ces inducteurs comprennent en particulier, l'actinomycine D, le clotrimazole, la colchicine, la daunorubicine, la doxorubicine, l'epothilone A, l'erythromycine, l'eroposide, l'isosafrole, le midazolame, la nifedipine, le phenobarbital, la puromycine, la reserpine, la rifampicine, le taxol, la vinblastine, la vincristine, la cysteine methylester, l'epinephrine le farnosol.Some have already been cited as agents anti-cancer. These inducers include in particular, actinomycin D, clotrimazole, colchicine, daunorubicin, doxorubicin, epothilone A, erythromycin, eroposide, isosafrole, midazolame, nifedipine, phenobarbital, puromycin, reserpine, rifampicin, taxol, vinblastine, vincristine, cysteine methylester, epinephrine farnosol.

A titre d'exemple, on citera préférentiellement l'azithromycine, administrée à des doses inférieures à celles nécessaires pour obtenir une activité anti-bactérienne (Jaffé et al., Lancet 1998 ; 351:420).By way of example, there will preferably be mentioned azithromycin, given at doses lower than those necessary to obtain anti-bacterial activity (Jaffé and al., Lancet 1998; 351: 420).

Un autre exemple de macrolide inducteur de la protéine MDR utilisable selon l'invention est l'erythromycine (Grant et al;, Toxicol. Appl. Pharmacol., 1995 ; 133:269-76)Another example of a macrolide inducing the MDR protein usable according to the invention is erythromycin (Grant et al ;, Toxicol. Appl. Pharmacol., 1995; 133: 269-76)

D'une façon plus générale, les travaux menés par les inventeurs permettent de procéder à une sélection de produits susceptibles d'être utiles dans la prévention et/ou le traitement de la mucoviscidose, en dosant les ARNm des protéines CFTR, MRP et MDR dans les cellules des patients. Selon un mode de réalisation préféré, les produits utiles sont donc ceux dont l'administration conduit à l'apparition ou à une augmentation des ARNm correspondant à ces protéines, et donc en particulier, à une expression ou surexpression de la protéine MRP et/ou MDR et/ou éventuellement CFTR elle-même.More generally, the work carried out by inventors allow to select products likely to be useful in preventing and / or treatment of cystic fibrosis, by measuring protein mRNA CFTR, MRP and MDR in patient cells. According to a mode of preferred embodiment, the useful products are therefore those of which administration leads to the appearance or increase mRNAs corresponding to these proteins, and therefore in particular, to expression or overexpression of the protein MRP and / or MDR and / or possibly CFTR itself.

Il peut être particulièrement intéressant de tester par exemple des produits qui ne sont pas suffisamment toxiques pour les cellules, pour être actifs en thérapie anti-cancéreuse, mais cependant suffisamment actifs pour générer un phénomène de "multi drug resistance" (MDR), mis à profit dans le cadre de la présente invention.It can be particularly interesting to test by example of products that are not toxic enough to cells, to be active in cancer therapy, but however active enough to generate a phenomenon of "multi drug resistance" (MDR), used as part of the present invention.

Tous ces composés peuvent être utilisés dans des conditions qui suffisent à déclencher l'expression ou la surexpression de la protéine MRP et/ou MDR et/ou CFTR.All of these compounds can be used under conditions sufficient to trigger expression or overexpression of the protein MRP and / or MDR and / or CFTR.

La polychimiothérapie par voie générale, intermittente et séquentielle est couramment utilisée pour la thérapie du cancer. On peut également envisager d'utiliser ce type de traitement selon l'invention.Multi-drug therapy by general, intermittent and sequential is commonly used for cancer therapy. We can also consider using this type of treatment according to the invention.

L'invention a donc également pour objet l'utilisation pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention et/ou au traitement de la mucoviscidose d'un produit contenant au moins un agent anti-cancéreux et/ou un macrolide, comme produit de combinaison pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps.The invention therefore also relates to the use for the preparation of a drug intended for the prevention and / or the treatment of cystic fibrosis of a product containing at least an anti-cancer agent and / or a macrolide, as a product of combination for simultaneous, separate or spread use in time.

De préférence, ledit produit de combinaison comprendra un agent alkylant et un agent intercalant et de façon encore préférée l'agent alkylant est l'ifosfamide et l'agent intercalant est l'épirubicine.Preferably, said combination product will comprise a alkylating agent and an intercalating agent and so again preferred alkylating agent is ifosfamide and the agent intercalating is epirubicin.

Les produits utilisables selon l'invention sont de façon préférée administrés avec un précurseur de glutathion, pour une utilisation simultanée, séparée ou étalée dans le temps. On a en effet souvent constaté que les malades atteints de mucoviscidose sont déficients en glutathion et l'administration d'un précurseur de glutathion permet de favoriser une augmentation du taux de glutathion. Lorsque les produits administrés sont des produits anti-cancéreux qui induisent l'expression ou la surexpression de la protéine MRP, l'administration conjointe d'un précurseur de glutathion est particulièrement souhaitable, puisque l'activité de la protéine MRP dépend du glutathion. Parmi les précurseurs de glutathion, on peut citer par exemple le N-acétyle cystéine (par exemple celle commercialisée sous l'appellation Mucomyst) ou encore la N-acétyle lysine.The products which can be used according to the invention are so preferred administered with a glutathione precursor, for a simultaneous, separate or spread over time. We have in effect often found that patients with cystic fibrosis are deficient in glutathione and the administration of a glutathione precursor promotes an increase in glutathione levels. When the products administered are anti-cancer products that induce expression or overexpression of the MRP protein, joint administration a glutathione precursor is particularly desirable, since the activity of the MRP protein depends on glutathione. Among the precursors of glutathione, there may be mentioned for example N-acetyl cysteine (for example that sold under the name Mucomyst) or N-acetyl lysine.

Par ailleurs on peut administrer au patient un composé qui remplace directement la protéine CFTR déficiente en jouant le rôle de transporteur de glutathion.Furthermore, the patient can be administered a compound which directly replaces the deficient CFTR protein by playing the role of glutathione transporter.

On peut ainsi utiliser un composé transporteur de glutathion, à titre de médicament pour la prévention secondaire et/ou le traitement de la mucoviscidose. Le clonage d'un composé transporteur de glutathion dans le foie du rat a déjà été réalisé par certains auteurs (Yi et al., PNAS vol. 92, n° 5, 1995, 1495-1499). Cependant l'éventualité d'un lien avec la mucoviscidose n'a jamais été envisagée.We can thus use a compound carrier of glutathione as a medicine for secondary prevention and / or treatment of cystic fibrosis. Cloning of a glutathione transporter compound in the liver of the rat has already been carried out by certain authors (Yi et al., PNAS flight. 92, no.5, 1995, 1495-1499). However the possibility of a link with cystic fibrosis has never been considered.

De préférence, ce composé sera un fragment d'un composé ABC transporteur de glutathion, notamment un fragment de la protéine CFTR comprenant le domaine NBF1 et plus particulièrement, un fragment comprenant le site potentiel de fixation du glutathion identifié dans les exemples qui suivent par référence à la figure 3. Il s'agit de préférence d'un fragment qui contient les résidus I448-Q452. S478-K481, M498-I506, A566-L568, A596-T599 localisés dans des boucles situées aux extrémités N terminales des feuillets 1 à 4 du domaine NBF1. L'administration conjointe d'un précurseur de glutathion est également avantageuse. Preferably, this compound will be a fragment of an ABC compound glutathione transporter, including a fragment of the protein CFTR including the NBF1 domain and more particularly, a fragment comprising the potential glutathione binding site identified in the following examples with reference to the figure 3. It is preferably a fragment which contains the residues I448-Q452. S478-K481, M498-I506, A566-L568, A596-T599 located in loops located at the N terminal ends sheets 1 to 4 of the NBF1 domain. Joint administration of a glutathione precursor is also advantageous.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaítront au cours de la description détaillée suivante d'exemples de réalisation de l'invention, illustré par les figures 1 à 4 qui représentent la structure du domaine NBF1 de la protéine CFTR et la localisation du site potentiel de fixation du glutathion dans la protéine CFTR.Other characteristics and advantages of the invention will appear during the following detailed description of embodiments of the invention, illustrated by Figures 1 to 4 which represent the structure of the NBF1 domain of the CFTR protein and the location of the potential site of fixation of glutathione in the CFTR protein.

La figure 1 représente la topologie du feuillet central d'un modèle de NBF1. Il comporte un feuillet à six brins parallèles dont l'appariement est donné. Un septième brin est apparié en anti-parallèle (les brins 1 à 6 sont respectivement : L453-G458, N505-S511, N538-G542, D567-D572, R600-V603. Le brin 7 comprend les résidus K643-D648). Les positions des séquences consensus Walker A et B et la signature ABC sont indiquées.Figure 1 shows the topology of the central sheet of a model of NBF1. It has a six-stranded sheet parallels whose pairing is given. A seventh strand is paired in anti-parallel (strands 1 to 6 are respectively: L453-G458, N505-S511, N538-G542, D567-D572, R600-V603. Strand 7 includes residues K643-D648). Sequence positions consensus Walker A and B and the signature ABC are indicated.

La figure 2 représente schématiquement un modèle du domaine NBF1 de la protéine CFTR. Les feuillets 1 à 7 sont notés S1 à S7. Les hélices 1 à 6 sont indiquées H1 à H6. La position de la signature ABC (séquence LSGGQ) est indiquée. La position de la phénylalanine 508 est indiquée par une représentation CPK, sur le brin S2.Figure 2 schematically represents a model of the domain NBF1 of the CFTR protein. Sheets 1 to 7 are denoted S1 to S7. Propellers 1 to 6 are indicated H1 to H6. The position of the signature ABC (sequence LSGGQ) is indicated. The position of the phenylalanine 508 is indicated by a CPK representation, on strand S2.

La figure 3 représente un modèle du domaine NBF1 de la protéine CFTR dans lequel les résidus potentiellement impliqués dans la fixation du glutathion sont représentés en gris foncé.FIG. 3 represents a model of the NBF1 domain of the CFTR protein in which the residues potentially involved in glutathione fixation are shown in dark gray.

EXEMPLE 1 : Etude de la structure de la protéine CFTREXAMPLE 1 Study of the Structure of the CFTR Protein

Experimental method 1. Construction of the plasmid

On introduit le gène codant pour le domaine NBF1 de la protéine CFTR (séquence R450-1586) dans E.coli. Pour ce faire, le cADN de CFTR complet a été fourni par Transgène (Strasbourg, France). Le fragment d'ADN codant pour NBF1 a été amplifié par PCR. Pour la préamplification, les oligonucléotides 5'-GC AGA TCT AGA GGA CAG TTG TT-3' (SEQ ID n° 1) et 3'-TA CAA AAT TGT CTT TTT CTT ATT CTT AAG CG-5' (SEQ IN n° 2) ont été utilisés. Le produit d'amplification a été introduit par les sites de restriction Bam HI et Eco RI dans le plasmide pGEX-KT (Hakes et Dixon, Anal. Biochem., 202, 293-298, 1992). Dans ce plasmide, NBF1 est produit sous forme d'une protéine de fusion avec la Glutathion-S-Transférase (GST). Une séquence de liaison (linker) flexible polyglycine et un site de coupure à la thrombine séparent la GST et NBF1 dans la protéine de fusion. Le gène codant pour cette protéine de fusion a été séquencé et correspond bien au gène attendu. Le plasmide final à cette construction a été introduit dans une souche RecA-E.coli JM101TR.The gene coding for the NBF1 domain of the CFTR protein (sequence R450-1586) in E. coli. To do this, the complete CFTR DNA was provided by Transgène (Strasbourg, France). The DNA fragment coding for NBF1 was amplified by PCR. For preamplification, the oligonucleotides 5'-GC AGA TCT AGA GGA CAG TTG TT-3 '(SEQ ID n ° 1) and 3'-TA CAA AAT TGT CTT TTT CTT ATT CTT AAG CG-5 '(SEQ IN n ° 2) were used. The amplification product was introduced by the sites of Bam HI and Eco RI restriction in the plasmid pGEX-KT (Hakes and Dixon, Anal. Biochem., 202, 293-298, 1992). In this plasmid, NBF1 is produced as a fusion protein with the Glutathione-S-Transferase (GST). A linkage sequence (linker) flexible polyglycine and a thrombin cleavage site separate GST and NBF1 in the fusion protein. The gene coding for this fusion protein has been sequenced and corresponds well to the expected gene. The final plasmid at this construction was introduced into a RecA-E.coli strain JM101TR.

2. Expression and purification of the GST-NBF1 fusion protein :

Les bactéries transformées ont été cultivées à 28°C dans un milieu de culture LB (Tryptone 15g, extrait de levure 5g, NaCL 8g, base Tris 0.52g, Ampiciline 100 mg par litre à pH 7.25). L'expression de la protéine de fusion a été induite par l'IPTG 0.1 mM, d'une DO de 0.8 à 2.5 à 600 nm (fréquence d'absorption des bactéries). Les bactéries ont été centrifugées à 4000 g pendant 25 minutes puis rincées deux fois avec du PBS à froid, avant sonication. Une resolubilisation a été obtenue avec une solution de PBS/0.1 mM et PMSF/Triton X100 1%. Les bactéries ont été soniquées sur un bain de glace pendant 5 minutes à 40W à l'aide d'une petite sonde.The transformed bacteria were grown at 28 ° C in a LB culture medium (Tryptone 15g, yeast extract 5g, NaCL 8g, Tris base 0.52g, Ampicilin 100 mg per liter at pH 7.25). Fusion protein expression was induced by IPTG 0.1 mM, OD 0.8 to 2.5 at 600 nm (absorption frequency bacteria). The bacteria were centrifuged at 4000 g for 25 minutes then rinsed twice with cold PBS, before sonication. Resolubilization was obtained with a solution of PBS / 0.1 mM and PMSF / Triton X100 1%. Bacteria have been sonicated on an ice bath for 5 minutes at 40W at using a small probe.

La suspension a été centrifugée à 17000tr/min pendant 40 minutes à 4°C sur un rotor JA20 (Beckman). Le surnageant a été incubé avec 5ml d'une matrice de glutathion (G4B Pharmacia) à température ambiante pendant 30 minutes. La colonne a été remplie. L'élution de la protéine de fusion a été obtenue avec une solution 10 mM de glutathion et 50 mM de Tris à pH = 8, à une vitesse de passage de 0.05 ml/min. Les fractions absorbant à 280 nm ont été rassemblées et appliquées par portions de 500 µl sur une colonne échangeuse d'ions (MonoQ, Pharmacia). L'élution a été observée pour une solution de 150 mM de NaCl, et une protéine de 42 kD a été identifiée sur gel SDS-PAGE, puis confirmée par spectroscopie de masse. Les rendements de production en protéine de fusion soluble sont de 5mg/l de culture.The suspension was centrifuged at 17000 rpm for 40 minutes at 4 ° C on a JA20 rotor (Beckman). The supernatant was incubated with 5ml of a glutathione matrix (G4B Pharmacia) to room temperature for 30 minutes. The column was filled. Elution of the fusion protein was obtained with a 10 mM solution of glutathione and 50 mM Tris at pH = 8, at a passage speed of 0.05 ml / min. The fractions absorbing at 280 nm were collected and applied in 500 µl portions on an ion exchange column (MonoQ, Pharmacia). The elution was observed for a 150 mM NaCl solution, and a 42 kD protein was identified on SDS-PAGE gel, then confirmed by mass spectroscopy. The yields of production of soluble fusion protein is 5 mg / l culture.

3. Cutting of the GST-NBF1 fusion protein:

Après purification, l'échantillon de protéine de fusion a été dialysé contre un tampon (150 mM NaCl, CaCl2 2.5 mM, Tris/HCl 50 mM) à pH = 8. La thrombine humaine (T7009, Sigma) a été additionnée jusqu'à une concentration finale de 5u par mg de protéine de fusion. Le mélange a été incubé 30 minutes à température ambiante. Les produits de la réaction de coupure ont été caractérisés sur gel SDS-PAGE, et une protéine de poids moléculaire 18kD (correspondant à celui attendu pour NBF1) a été observée.After purification, the fusion protein sample was been dialyzed against a buffer (150 mM NaCl, CaCl2 2.5 mM, Tris / HCl 50 mM) at pH = 8. Human thrombin (T7009, Sigma) has added to a final concentration of 5u per mg of fusion protein. The mixture was incubated for 30 minutes at ambient temperature. The products of the cleavage reaction have were characterized on SDS-PAGE gel, and a weight protein molecular 18kD (corresponding to that expected for NBF1) has been observed.

Results:

La protéine de fusion GST-NBF1 est effectivement reconnue par un anti-corps anti-NBF1 (MATG 1061, distribué par Transgène). L'affinité de cette protéine recombinante pour l'ATP a été vérifiée. Pour ce faire, la reconnaissance d'un dérivé fluorescent de l'ATP (le TNP-ATP) a été mise en évidence. La protéine recombinante a donc été produite sous une forme fonctionnelle. Cependant, après coupure à la thrombine, il n'est pas possible de séparer la GST et le domaine NBF1 sur colonne d'affinité greffée au glutathion (GSH) selon un mode expérimental analogue à celui décrit ci-dessus. Bien que parfaitement séparées sur gel d'électrophorèse, les protéines NBF1 et GST co-éluent sur colonne de GSH immobilisé. Cette observation suppose que (comme prévu pour la GST) NBF1 est retenu sur la colonne de GSH, ce qui concorde avec l'existence d'un site de fixation du glutathion dans NBF1. The fusion protein GST-NBF1 is effectively recognized by an anti-NBF1 body (MATG 1061, distributed by Transgene). The affinity of this recombinant protein for ATP has been verified. To do this, the recognition of a derivative fluorescent ATP (TNP-ATP) has been highlighted. The recombinant protein was therefore produced in a form functional. However, after cutting with thrombin, it is not not possible to separate GST and NBF1 domain on column affinity grafted with glutathione (GSH) according to a mode similar to that described above. Although perfectly separated on electrophoresis gel, the proteins NBF1 and GST co-elute on a column of immobilized GSH. This observation assumes that (as expected for GST) NBF1 is retained on the GSH column, which is consistent with the existence of a glutathione binding site in NBF1.

EXEMPLE 2 : Mise en évidence dans le domaine NBF1 de la présence d'un site potentiel de fixation du glutathionEXAMPLE 2 Demonstration in the NBF1 domain of the presence of a potential glutathione binding site

Un modèle de structure pour le domaine NBF1 de CFTR (Annereau et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie/Life Sciences, 320, 113-121, 1997 et Annereau et al., FEBS Letters, 407, 303-308, 1997) a été construit par homologie avec la structure connue des domaines de fixation des nucléotides de l'ATPase-F1 de boeuf (Abrahams J.P., Leslie A.G.W., Lutter R., Walker J.F., 1994 Nature, 370, 621-628). Ce domaine comprend un coeur hydrophobe constitué d'un feuillet β à 6 brins parallèles, dont l'appariement par rapport à l'ordre dans la séquence primaire est donné figure 1 (les brins 1 à 6 sont respectivement : L453-G458, N505-S511, N538-G542, D567-D572, R600-V603). Ces feuillets alternent avec 6 hélices α (K464-E474, Y517-D529, Q552-Y563, L581-V591, S605-K611, S631-L636). Les hélices α s'organisent de part et d'autre du plan moyen du feuillet β central, comme montré figure 2 (FEBS Letters, vol 407, pp 303-308, 1997). Des boucles situées en surface du domaine relient les hélices aux feuillets.A structure model for the NBF1 domain of CFTR (Annereau et al., C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie / Life Sciences, 320, 113-121, 1997 and Annereau et al., FEBS Letters, 407, 303-308, 1997) was built by homology with the known structure of the nucleotide binding domains of Beef ATPase-F1 (Abrahams J.P., Leslie A.G.W., Lutter R., Walker J.F., 1994 Nature, 370, 621-628). This area includes a hydrophobic core consisting of a β sheet with 6 parallel strands, whose pairing with respect to order in the sequence primary is given figure 1 (strands 1 to 6 are respectively : L453-G458, N505-S511, N538-G542, D567-D572, R600-V603). These sheets alternate with 6 α propellers (K464-E474, Y517-D529, Q552-Y563, L581-V591, S605-K611, S631-L636). Α propellers are organized on either side of the mean plane of the β sheet central, as shown in Figure 2 (FEBS Letters, vol 407, pp 303-308, 1997). Loops located on the surface of the domain connect the sheet propellers.

L'existence potentielle d'un site de fixation du glutathion dans NBF1 de CFTR pratiquement superposable au site de fixation du glutathion dans la GST est mise en évidence par comparaison de ce modèle avec la structure connue de la GST (Glutathion-S-Transférase, protéine qui présente un site de fixation du glutathion et qui catalyse les réactions d'attaques nucléophiles du glutathion). La figure 3 montre les résidus de NBF1 potentiellement impliqués dans la fixation du glutathion. Ils se situent dans une région formant une crevasse aux extrémités de brins impliqués dans un feuillet β Ces résidus sont situés plus précisément dans des boucles, aux extrémités N terminales des feuillets 1 à 4 de la structure de NBF1. Ces boucles contiennent les résidus 1448-Q452, S478-K481, M498-I506, A566-L568, A596-T599. The potential existence of a glutathione binding site in CFTR NBF1 practically superimposable on the fixing site glutathione in GST is highlighted by comparison of this model with the known structure of GST (Glutathione-S-Transferor, protein that has a binding site for the glutathione and which catalyzes the reactions of nucleophilic attacks glutathione). Figure 3 shows the residues of NBF1 potentially involved in glutathione fixation. They lie in a crevice region at the ends of strands involved in a β sheet These residues are located more precisely in loops, at the N terminal ends of sheets 1 to 4 of the structure of NBF1. These loops contain residues 1448-Q452, S478-K481, M498-I506, A566-L568, A596-T599.

EXEMPLE 3 : Traitement de la mucoviscidose par une association d'épirubicine et de cyclophosphamideEXAMPLE 3 Treatment of cystic fibrosis with a combination of epirubicin and cyclophosphamide

Le traitement anti-tumoral suivant a été administré :

épirubicine (Farmorubicine®), 110 mg pendant deux jours (J1 et J2) ;
ifosfamide (Holoxan®), 3,3 g pendant cinq jours (J1 à J5)
Filgrastime (Neupogen®), 300 µg par jour pendant huit jours (J8 à J15) ;

sous couvert de :

granisétron (Kytril®), pour la prévention des nausées ;
Méthylprednisolone (Solumédrol®, corticoïde) ;
Mesna (Mucofluid ®) ;
puis, trois mois plus tard, le malade a reçu à nouveau six cycles épirubicine et ifosfamide.

The following anti-tumor treatment was administered:

epirubicin (Farmorubicin®), 110 mg for two days (D1 and D2);
ifosfamide (Holoxan®), 3.3 g for five days (D1 to D5)
Filgrastime (Neupogen®), 300 µg per day for eight days (D8 to D15);

under cover :

granisetron (Kytril®), for the prevention of nausea;
Methylprednisolone (Solumedrol®, corticosteroid);
Mesna (Mucofluid ®);
then, three months later, the patient again received six cycles of epirubicin and ifosfamide.

Le malade traité présentait un génotype ΔF 508 une mutation correspondant à une délétion d'une phénylalanine en position 508 dans l'exon 12 de CFTR sur un allèle et, une autre mutation G673X, située dans l'exon 13 sur l'autre allèle. Ce malade présentait, depuis sa naissance en 1968, tous les signes cliniques associés à la maladie : tests de la sueur positifs, sinusites répétées, bronchites répétées, polypes de la fosse nasale etc... En 1989 il a présenté une infection à Pseudomonas aeruginosa, classique dans la mucoviscidose et habituellement pratiquement définitive chez ces malades. En outre, en avril 1993, un fibrosarcome de la cuisse gauche a été diagnostiqué. Le malade a subi un traitement chirurgical et radiothérapique puis une chimiothérapie de juillet à octobre 1993, suivis d'un nouveau traitement en janvier 1994. Concernant le tableau clinique de la mucoviscidose, à la suite du traitement chimiothérapique, on a observé les améliorations suivantes :

l'état respiratoire du malade s'est amélioré considérablement ;
son infection par Pseudomonas aeruginosa a disparu ;
ses paramètres respiratoires atteignent environ 75 % des valeurs théoriques ;
il a recouvré un état respiratoire à peu près équivalent à celui qu'il présentait au début de son adolescence ;
il se déclare lui-même guéri de la mucoviscidose.

The patient treated presented a genotype ΔF 508 a mutation corresponding to a deletion of a phenylalanine in position 508 in exon 12 of CFTR on one allele and, another mutation G673X, located in exon 13 on the other allele. This patient had, since his birth in 1968, all the clinical signs associated with the disease: positive sweat tests, repeated sinusitis, repeated bronchitis, nasal cavity polyps etc ... In 1989 he presented an infection with Pseudomonas aeruginosa , classic in cystic fibrosis and usually almost definitive in these patients. In addition, in April 1993, fibrosarcoma of the left thigh was diagnosed. The patient underwent surgical and radiotherapy treatment then chemotherapy from July to October 1993, followed by a new treatment in January 1994. Concerning the clinical picture of cystic fibrosis, following the chemotherapy treatment, the following improvements were observed:

the patient's respiratory condition has improved considerably;
his infection with Pseudomonas aeruginosa has disappeared;
his respiratory parameters reach around 75% of theoretical values;
he regained a respiratory state roughly equivalent to that which he presented at the beginning of his adolescence;
he declares himself cured of cystic fibrosis.

Un test de la sueur effectué chez lui au début de l'année 1997 s'est révélé toujours très positif, ce qui signifie que la fonction de canal à ion chlorure n'a pas été rétablie chez ce patient. Cette constatation, liée au fait que le malade se déclare lui-même guéri de la mucoviscidose permet de conclure qu'une autre fonction essentielle a été rétablie par le traitement chimiothérapique. Grâce aux travaux menés par les inventeurs, on peut maintenant supposer qu'il s'agit d'une fonction de transport au moyen du glutathion.A sweat test carried out at his home at the start of the year 1997 was still very positive, which means that the chloride ion channel function has not been restored in this patient. This observation, linked to the fact that the patient declares himself cured of cystic fibrosis lets conclude that another essential function has been restored by the chemotherapy treatment. Thanks to the work carried out by inventors, we can now assume that it is a transport function by means of glutathione.

EXEMPLE 4 : Mise en évidence de la surexpression des protéines MDR et MRP chez le patient après traitement chimiothérapique conformément à l'exemple 3EXAMPLE 4 Demonstration of the overexpression of proteins MDR and MRP in the patient after chemotherapy treatment according to example 3

L'ARNm des protéines CETR, MDR et MRP a été dosé par RT-PCR sur des cellules éphithéliales collectées et analysées chez le patient de l'exemple 3 (patient A). Le même dosage a été effectué sur un patient atteint de mucoviscidose qui n'a jamais été exposé à des produits anti-cancéreux (patient B).CETR, MDR and MRP protein mRNA was assayed by RT-PCR on ephithelial cells collected and analyzed from patient of Example 3 (patient A). The same dosage was performed on a patient with cystic fibrosis who has never been exposed to anti-cancer products (patient B).

Chez le patient B, les ARNm de CFTR, MDR et MRP étaient indétectables mais ils ont été identifiés sans ambiguité chez le patient A.In patient B, the CFTR, MDR and MRP mRNAs were undetectable but they were unambiguously identified in the patient A.

Ces résultats renforcent l'hypothèse à la base de l'invention selon laquelle l'amélioration de l'état clinique du malade serait due à la substitution de CFTR par MDR et/ou MRP. En effet, même surexprimée, la protéine CFTR mutée n'est a priori pas fonctionnelle. These results reinforce the hypothesis underlying the invention that improving the clinical condition of patient would be due to the substitution of CFTR by MDR and / or MRP. Even when overexpressed, the mutated CFTR protein is not a priori not functional.

EXEMPLE 5 : Traitement de la mucoviscidose par chimiothérapie prescrite pour un lymphome.EXAMPLE 5 Treatment of cystic fibrosis with chemotherapy prescribed for lymphoma.

Le malade, né en 1969, est atteint d'une mucoviscidose, diagnostiquée à l'âge de deux mois par un test de la sueur positif. Son tableau clinique est typique de la mucoviscidose (insuffisance pancréatique externe, polypose des sinus, colonisation chronique à pyocyanique). Il suit un traitement de fond standart pour sa mucoviscidose : kinésithérapie respiratoire, plusieurs cures par an d'antibiothérapie, vitamines. En août 1992, il présente un lymphome de stade IV. Il subit quatre cures associant adriamycine, cyclophosphamide (Endoxan Asta®) cytarabine (Aracytine®), vincristine (Oncovin®), methylprednisolone (Dépa-medrol®), Bléomycine, Méthotrexate en octobre 1992 et novembre 1992. En janvier 1993, il subit un nouveau traitement associant méthotrexate, cytarabine et methylprednisolone. Tout traitement chimiothérapique est arrêté en avril 1993. Sur le plan pulmonaire, le malade est jugé transformé de mars 1993 à décembre 1993, par lui-même et par les médecins qui le suivent ; plus de toux, plus de kinésithérapie respiratoire, il fait des efforts physiques sans problèmes, et il présente plusieurs examens pulmonaires normaux. En l'absence de traitement chimiothérapique d'entretien, certains symptômes ont repris depuis fin 1994, tels que majoration de la toux. Cependant, on a noté une amélioration notable de l'état du patient, sur une période d'un an suivant le traitement d'attaque pour le lymphome.The patient, born in 1969, has cystic fibrosis, diagnosed at two months of age with a sweat test positive. Its clinical picture is typical of cystic fibrosis (external pancreatic insufficiency, polyposis of the sinuses, chronic pyocyanic colonization). He is undergoing treatment standard fund for cystic fibrosis: physiotherapy respiratory, several courses of antibiotic therapy per year, vitamins. In August 1992, he presented with stage IV lymphoma. he undergoes four courses combining adriamycin, cyclophosphamide (Endoxan Asta®) cytarabine (Aracytine®), vincristine (Oncovin®), methylprednisolone (Dépa-medrol®), Bleomycin, Methotrexate en October 1992 and November 1992. In January 1993, he underwent a new treatment combining methotrexate, cytarabine and methylprednisolone. All chemotherapy treatment is stopped in April 1993. On the pulmonary level, the patient was judged transformed from March 1993 to December 1993, by himself and by doctors who follow him; more cough, more physiotherapy respiratory, he makes physical efforts without problems, and he has several normal lung exams. Without maintenance chemotherapy treatment, some symptoms have resumed since late 1994, such as increased cough. However, there has been a noticeable improvement in the condition of the patient, over a period of one year following the attack treatment for lymphoma.

Le malade traité était homozygote pour une mutation dans l'exon 20 au sein du domaine NBF2. The patient treated was homozygous for a mutation in exon 20 within the NBF2 domain.

LIST OF SEQUENCES

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: CENTRE NATIONALE DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE (CNRS)

(B) RUE: 3, RUE MICHEL ANGE

(C) VILLE: PARIS Cedex 16

(E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 75794

(ii) TITRE DE L' INVENTION: PRODUITS ANTI-CANCEREUX POUR LE TRAITEMENT DE LA MUCOVISCIDOSE

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 2

(iv) FORME DECHIFFRABLE PAR ORDINATEUR:

(A) TYPE DE SUPPORT: Floppy disk

(B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (OEB)

(vi) DONNEES DE LA DEMANDE ANTERIEURE:

(A) NUMERO DE LA DEMANDE: FR 9706667

(B) DATE DE DEPOT: 30-MAY-1997

(1) GENERAL INFORMATION:

(i) DEPOSITOR:

(A) NAME: NATIONAL CENTER FOR SCIENTIFIC RESEARCH (CNRS)

(B) STREET: 3, RUE MICHEL ANGE

(C) CITY: PARIS Cedex 16

(E) COUNTRY: FRANCE

(F) POSTAL CODE: 75794

(ii) TITLE OF THE INVENTION: ANTI-CANCER PRODUCTS FOR THE TREATMENT OF MUCOVISCIDOSIS

(iii) NUMBER OF SEQUENCES: 2

(iv) COMPUTER-DETACHABLE FORM:

(A) TYPE OF SUPPORT: Floppy disk

(B) COMPUTER: IBM PC compatible

(C) OPERATING SYSTEM: PC-DOS / MS-DOS

(D) SOFTWARE: PatentIn Release # 1.0, Version # 1.30 (EPO)

(vi) DATA FROM THE PREVIOUS APPLICATION:

(A) REQUEST NUMBER: FR 9706667

(B) DEPOSIT DATE: 30-MAY-1997

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 22 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: oligonucléotide 5'-3'

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 1:

(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) LENGTH: 22 base pairs

(B) TYPE: nucleotide

(C) NUMBER OF STRANDS: single

(D) CONFIGURATION: linear

(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA

(ix) CHARACTERISTIC:

(A) NAME / KEY: 5'-3 'oligonucleotide

(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 31 paires de bases

(B) TYPE: nucléotide

(C) NOMBRE DE BRINS: simple

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADN

(ix) CARACTERISTIQUE:

(A) NOM/CLE: oligonucléotide 3'-5'

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

(2) INFORMATION FOR SEQ ID NO: 2:

(i) CHARACTERISTICS OF THE SEQUENCE:

(A) LENGTH: 31 base pairs

(B) TYPE: nucleotide

(C) NUMBER OF STRANDS: single

(D) CONFIGURATION: linear

(ii) TYPE OF MOLECULE: DNA

(ix) CHARACTERISTIC:

(A) NAME / KEY: 3'-5 'oligonucleotide

(xi) DESCRIPTION OF THE SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

Claims

Use, for preparing a medicament which is intended for preventing and/or treating cystic fibrosis, of at least one product whose administration to a patient suffering from cystic fibrosis leads, in the said patient, to the expression or overexpression of at least one ABC transporter compound.
Use according to Claim 1, characterized in that the said product leads, in the said patient, to the expression or overexpression of the patient's mutated CFTR protein.
Use according to Claim 1, characterized in that the said expressed or overexpressed compound is the MDR protein.
Use according to Claim 1, characterized in that the said expressed or overexpressed compound is an ABC glutathione transporter compound.
Use according to Claim 4, characterized in that the said expressed or overexpressed compound is the MRP protein.
Use according to one of Claims 1 to 5, characterized in that the said expressed or overexpressed compound is the MRP protein and/or the MDR protein and/or the CFTR protein.
Use according to one of Claims 1 to 6, characterized in that the said product is an anticancer product.
Use according to Claim 7, characterized in that the said anticancer product is an alkylating agent.
Use according to Claim 8, characterized in that the said product is selected from nitrogen mustards, nitrosoureas, platinum derivatives, ethyleneimine derivatives, dimethane sulphonoxyalkanes, piperazine derivatives and methylhydrazine derivatives.
Use according to Claim 9, characterized in that the said product is a nitrogen mustard, preferably cyclophosphamide.
Use according to Claim 7, characterized in that the said anticancer product is an intercalating agent.
Use according to Claim 11, characterized in that the said product is selected from anthracyclines, anthracerediones, anthracenes, acridine derivatives, ellipticines and actinomycins.
Use according to Claim 12, characterized in that the said product is an anthracycline.
Use according to Claim 13, characterized in that the said product is selected from aclarubicin, doxorubicin, daunorubicin, epirubicin, idarubicin, zorubicin and pirabucin.
Use according to Claim 14, characterized in that the said product is epirubicin.
Use according to Claim 7, characterized in that the said anticancer product is an antimetabolite.
Use according to Claim 7, characterized in that the said anticancer compound is a spindle poison.
Use according to Claim 17, characterized in that the said spindle poison is colchicine or its derivatives.
Use according to Claim 17, characterized in that the said product is selected from epipodophyllotoxins and vinca alkaloids.
Use according to Claim 19, characterized in that the said product is selected from vindesine, vinorelbine, vincristine and vinblastine.
Use according to one of Claims 1 to 6, characterized in that the said product is an analogue of an anticancer agent.
Use according to one of Claims 1 to 6, characterized in that the said product is a macrolide.
Use according to Claim 22, characterized in that the said product is azithromycin.
Use according to Claim 22, characterized in that the said product is erythromycin.
Use according to one of Claims 7 to 24, characterized in that the said medicament contains at least one anticancer agent and at least one macrolide as a combination product for simultaneous or separate use or use which is staggered over time.
Use according to Claim 25, characterized in that the said combination product contains an alkylating agent and an intercalating agent.
Use according to Claim 26, characterized in that the alkylating agent is ifosfamide and the intercalating agent is epirubicin.
Use according to one of Claims 1 to 27, characterized in that the said product is combined with a glutathione precursor, as a combination product for simultaneous or separate use or use which is staggered over time.
Use according to Claim 28, characterized in that the said glutathione precursor is selected from N-acetylcysteine or N-acetyllysine.