CA2289566A1

CA2289566A1 - Method for couting viable cells

Info

Publication number: CA2289566A1
Application number: CA002289566A
Authority: CA
Inventors: Pascaline Levesque; Jean-Louis Drocourt
Original assignee: Individual
Current assignee: Chemunex SA
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-05-20
Publication date: 1998-12-10
Also published as: WO1998055861A1; EP0986752A1; JP2002505578A; FR2764305B1; FR2764305A1; AU7775498A

Abstract

The invention concerns a method for detecting and counting viable cells in a sample consisting in simultaneously or sequentially contacting the cells with blockers of viability markers and viability markers.

Description

- PROCEDE DE NUMERATION DE CELLULES VIABLES
L'invention porte sur un procédé de détection etlou de numération de cellules viables notamment des microorganismes, comprenant une étape de marquage avec un marqueur de viabilité et une étape de contre-marquage avec un agent de blocage, sur les compositions de marquage et de blocage ainsi que sur un kit pour la mise en oeuvre du procédé.
L'invention porte également sur une composition contenant un ou des agents de blocage capables de marquer spécifiquement des particules ou des cellules mortes, à l'exclusion des cellules vivantes qu'elles soient sous forme cellulaire ou sporulante, permettant une numération 75 différentielle des cellules vivantes des autres particules incluant des cellules mortes.
La détection etlou la numération de cellules viables dans un échantillon a un intérét tant pour s'assurer de la qualité des inoculums pour la production de produits issus de la fermentation tels la bière, ie vin, les produits laitiers, etc... que pour contrôler la stérilité de produits alimentaires ou sanitaires ou pharmaceutiques avant utilisation ou commercialisation.
Par cellules viables, on entend toute matière biologique sous forme unicellulaire, ou de façon plus générale toute matière contenant une information génétique qui est auto-reproductible ou reproductible dans un système biologique. Cela inclut toutes cellules eucaryotes ou procaryotes, y compris les formes sporulantes ; à titre d'exemple, on citera les bactéries, les champignons ou les levures.
Différentes méthodes sont disponibles afin de déterminer la viabilité
cellulaire, incluant la méthode traditionnelle de numération sur boite de pétri. La numération des microorganismes par cette technique est souvent longue à mettre en oeuvre, le résultat n'est observé qu'après 2 jours à - METHOD FOR NUMERATION OF VIABLE CELLS
Disclosed is a method for detecting and / or counting viable cells including microorganisms, comprising a marking step with a viability marker and a counter step labeling with a blocking agent, on the labeling compositions and blocking as well as on a kit for implementing the method.
The invention also relates to a composition containing one or more blocking agents capable of specifically marking particles or dead cells, excluding living cells whether in cellular or sporulating form, allowing a count 75 differential of living cells from other particles including dead cells.
Detection and / or count of viable cells in a sample has so much interest in ensuring the quality of the inocula for the production of fermentation products such as beer, wine, dairy products, etc ... only to control the sterility of products food or sanitary or pharmaceutical before use or marketing.
By viable cells is meant any biological material in the form unicellular, or more generally any material containing a genetic information that is self-reproducing or reproducible in a biological system. This includes any eukaryotic or prokaryotic cells, including sporulating forms; by way of example, mention may be made of bacteria, mushrooms or yeasts.
Different methods are available to determine viability cell, including the traditional method of counting on a box kneaded. The count of microorganisms by this technique is often long to implement, the result is only observed after 2 days at

2 7 jours voire 14 jours d'incubation, délai incompatible avec la commercialisation de denrées périssables, et il est souvent entaché
d'erreurs importantes si le nombre de boîtes ensemencées n'est pas suffisant pour un comptage statistique. Enfin, ces techniques sont inopérantes pour détecter et dénombrer les microorganismes vivants dont les capacités de croissance sur boite de Pétri ou en culture sont limitées ou nulles.
Des techniques de dénombrement direct ont été développées pour palier au long délai de réponse des méthodes traditionnelles. 11 s'agit en particulier de la technique DEFT (direct epifluorescence technic), dénombrement au moyen de marqueurs fluorescents et en particulier de l'acridine orange ; l'utilisation de cette technique ainsi que ses limitations sont décrits dans une récente revue publiée par KENNER et PRATT
(Microbiological Review (1994) 58 603-fi15). Néanmoins, ces techniques ont l'inconvénient de générer de nombreuses adsorptions non spécifiques qui conduisent à une surestimation de la numération par comptage de faux positifs ; en particulier quand ce dénombrement est automatisé à l'aide de systèmes tels que les cytomètres en flux.
Une variante de cette approche consiste à utiliser des marqueurs susceptibles de donner un signal fluorescent après transformation par une enzyme cellulaire. L'émission du signal fluorescent est la conséquence de l'existence d'une activité enzymatique, et révèle ia présence d'une cellule viable. Cette technique présente les avantages de minimiser le nombre de faux positifs, de pouvoir différencier les cellules viables des cellules mortes par la conversion enzymatique du précurseur, et de favoriser l'accumulation intracellulaire des marqueurs grâce au- maintien de l'intégrité
membranaire. Néanmoins, à cette conversion enzymatique intracellulaire est associée une hydrolyse non spécifique due au tampon de marquage, comme tout ester en milieu aqueux. Cette hydrolyse bien que minime peut 2 7 days or even 14 days of incubation, time incompatible with marketing of perishable goods, and it is often tainted significant errors if the number of boxes seeded is not sufficient for a statistical count. Finally, these techniques are inoperative to detect and count living microorganisms including growth capacities on Petri dish or in culture are limited or null.
Direct counting techniques have been developed to to overcome the long response time of traditional methods. It comes in particular of the DEFT technique (direct epifluorescence technic), counting by means of fluorescent markers and in particular of acridine orange; the use of this technique and its limitations are described in a recent review published by KENNER and PRATT
(Microbiological Review (1994) 58 603-fi15). However, these techniques have the disadvantage of generating many non-specific adsorptions which lead to an overestimation of the count by counting false positive; especially when this counting is automated using systems such as flow cytometers.
A variation of this approach is to use markers likely to give a fluorescent signal after transformation by a cellular enzyme. The emission of the fluorescent signal is the consequence of the existence of enzymatic activity, and reveals the presence of a cell viable. This technique has the advantages of minimizing the number of false positive, to be able to differentiate viable cells from cells dead by the enzymatic conversion of the precursor, and to favor the intracellular accumulation of markers thanks to the maintenance of integrity membrane. Nevertheless, to this intracellular enzymatic conversion is associated with non-specific hydrolysis due to the labeling buffer, like any ester in an aqueous medium. This hydrolysis, although minimal, can

3 générer toutefois un peu de marquage non spécifique, pouvant devenir critique, dans l'utilisation de ces marqueurs pour un test de stérilité.
Les méthodes de marquage de souches vivantes de bactéries avec des esters fluorogéniques, comme la fluorescéine diacétate (FDA) ou la carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ont été décrites notamment par J.-P.
DIAPER et al. dans Journal of Applied Bacteriology - (1994) -77 : 221-228 et par J. Porter et al. dans Journal of Applied Bacteriology, (1995) - 79 399-408.
Par ester fluorogénique, on entend toute molécule non fluorescente qui, après action d'une enzyme, donne naissance à une molécule fluorescente après excitation par la lumière.
De manière générale, les marquages fluorescents obtenus directement ou par activation par une enzyme cellulaire ont l'avantage de la rapidité d'obtention des résultats qui est sans commune mesure avec la culture cellulaire, mais ont l'inconvénient d'être moins fiables sur le plan quantitatif du fait de l'existence de faux positifs ou de faux négatifs.
En effet, dans ce type de technique, il existe plusieurs causes de mésestimation du nombre de cellules viables a) lorsque le microorganime se présente sous une forme sporulante, l'entrée d'un composé quelconque et en particulier des marqueurs fluorescents à l'intérieur de fa spore est difficile sinon impossible et conduit donc à sous-estimer le nombre de microorganismes vivants.
b) un marquage parasite de particules en suspension ou de cellules mortes peut entraîner la numération de faux positifs, surtout dans le cas de 2~ marquage fluorescent obtenu directement.
c) après transformation du précurseur fluorogénique par une enzyme caractéristique de la cellule viable, il peut se produire un effiux par un mécanisme actif, lequel efflux diminue bien évidemment le marquage infra cellulaire et pose donc un problème de sensibilité de ia méthode. 3 however, generate some non-specific marking, which can become critical, in the use of these markers for a sterility test.
Methods for labeling live strains of bacteria with fluorogenic esters, such as fluorescein diacetate (FDA) or carboxyfluorescein diacetate (CFDA) have been described in particular by J.-P.
DIAPER et al. in Journal of Applied Bacteriology - (1994) -77: 221-228 and by J. Porter et al. in Journal of Applied Bacteriology, (1995) - 79 399-408.
By fluorogenic ester is meant any non-fluorescent molecule which, after the action of an enzyme, gives rise to a molecule fluorescent after excitation by light.
In general, the fluorescent markings obtained directly or by activation by a cellular enzyme have the advantage of the speed at which results are obtained, which is incomparable with the cell culture but have the disadvantage of being less reliable in terms of quantitative due to the existence of false positives or false negatives.
Indeed, in this type of technique, there are several causes of underestimation of the number of viable cells a) when the microorganism is in a sporulating form, the entry of any compound and in particular markers fluorescent inside fa spore is difficult if not impossible and leads therefore to underestimate the number of living microorganisms.
b) parasitic marking of suspended particles or cells dead women can cause false positive counts, especially in the case of 2 ~ fluorescent marking obtained directly.
c) after transformation of the fluorogenic precursor by a characteristic enzyme of the viable cell, effiux can occur through an active mechanism, which efflux obviously decreases the marking infra-cellular and therefore poses a problem of sensitivity of the method.

4 La présente invention vise à surmonter tous les inconvénients du marquage direct par les esters de fluorescéine qui, rappelons-le, sont essentiellement de trois types - l'efflux actif des produits d'hydrolyse des esters, - l'obtention de faux positifs par le marquage des particules en suspension ou des cellules mortes conduisant à une surestimation, - l'impossibilité de détecter les spores de bactéries, levures ou champignons, conduisant à une sous-estimation de cellules viables.
A cet effet, la présente invention porte sur un procédé de détection et de numération de cellules viables dans une flore totale par détection et mesure sélective du nombre de cellules vivantes, des particules et des cellules mortes dans un échantillon.
Plus particulièrement, la présente invention porte sur un procédé de détection etlou de numération de cellules viables dans un échantillon et caractérisé par une succession d'étapes comprenant au moins a) la mise en contact des cellules avec une composition contenant des agents de blocage des marqueurs de viabilité, b) la mise en contact des cellules avec un ou plusieurs marqueurs de viabilité dans un tampon de viabilité, c) la détection et la numération des ceüules viables dans la flore totale.
Dans le procédé de l'invention, l'étape a) est antérieure ou simultanée à l'étape b).
Le procédé de l'invention comprend avantageusement une étape complémentaire qui est la mise en contact des cellules avec un milieu de gonflement, laquelle étape est préalable ou simultanée à l'étape b). Si elle est simultanée, le milieu de gonflement et le tampon de viabilité peuvent ne constituer qu'un seul et même milieu.
Cette étape a pour but de permettre l'incorporation et la conversion des marqueurs fluorogéniques dans des cellules viables existant sous ...... .....~.?..... ... ,. . r forme de spores. Le milieu de gonflement sera un milieu de culture susceptible de faire germer les spores, et contenant par conséquent des inducteurs de germination, tels des acides aminés, des peptides, des . sucres etc... A titre d'exemple, on pourra citer, le tampon TCS (tripton 4 The present invention aims to overcome all the drawbacks of the direct labeling with fluorescein esters which, it should be remembered, are basically of three types - the active efflux of ester hydrolysis products, - obtaining false positives by marking suspended particles or dead cells leading to overestimation, - the impossibility of detecting spores of bacteria, yeasts or fungi, leading to an underestimation of viable cells.
To this end, the present invention relates to a detection method and counting viable cells in a total flora by detection and selective measurement of the number of living cells, particles and dead cells in a sample.
More particularly, the present invention relates to a method of detection and / or count of viable cells in a sample and characterized by a succession of steps comprising at least a) bringing the cells into contact with a composition containing blockers of viability markers, b) bringing the cells into contact with one or more markers of viability in a viability buffer, c) detecting and counting viable cells in the total flora.
In the method of the invention, step a) is earlier or concurrent with step b).
The method of the invention advantageously comprises a step which is the bringing of the cells into contact with a swelling, which step is prior to or simultaneous with step b). If she is simultaneous, the swelling medium and the viability buffer may not constitute one and the same medium.
The purpose of this step is to allow incorporation and conversion fluorogenic markers in viable cells existing under ...... ..... ~.? ..... ...,. . r form of spores. The swelling medium will be a culture medium likely to germinate spores, and therefore containing germination inducers, such as amino acids, peptides, . sugars etc ... By way of example, mention may be made of the TCS buffer (tripton

5 caseine soja) qui induira plus particulièrement la germination des spores bactériennes, ou l'extrait de malt qui sera plus particulièrement approprié à
induire la germination de spores de moisissure. Un milieu de gonflement avantageux lorsque l'on souhaite mesurer une flore viable globale, contient donc un mélange de TCS et d'extrait de malt.
Dans le procédé de l'invention, l'échantillon étudié peut être à
l'origine sous forme liquide, apte à être filtré, ou résulter de la mise en suspension de particules présentes sur un solide ou dans un gaz quelconque ; les cellules peuvent être détectées et dénombrées, soit directement dans un échantillon liquide, soit après filtration de l'échantillon liquide.
Le filtre sera bien évidemment choisi de telle façon que la taille des pores soit suffisamment petite pour retenir !'ensemble des cellules viables que l'on souhaite détecter et/ou mesurer.
Les étapes a) et b) sont alors réalisées sur le filtre et l'étape c) est appliquée par l'utilisation d'un cytomètre à balayage de type CHEMSCAN~
de façon à obtenir, d'une part, la détection et le comptage de la fluorescence spécifique des cellules viables et, d'autre part, le cas échéant, la détection de la fluorescence des particules inertes et des cellules mortes, sur la base de leur longueur d'onde d'émission de fluorescence.
L'avantage dans le mode de réalisation de l'invention dans lequel l'échantillon Liquide est préalablement filtré est d'augmenter significativement la concentration des éléments que l'on souhaite détecter.
En outre, la mise en oeuvre des différentes étapes est plus aisée quand les cellules sont déposées sur un support solide.

s Dans le procédé selon l'invention, l'étape de filtration peut être suivie d'une étape de Pavage.
Après filtration de l'échantillon, le vide est cassé et la composition d'agents de blocage telle que décrite ci-dessous est passée suc le filtre portant l'échantillon susceptible de contenir des cellules ou ajouté
directement dans l'échantillon dans fie cas d'une analyse en milieu liquide.
Par agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant, on entend toute molécule ou mélange de molécules susceptible d'interagir avec les sites de fixation du ou des marqueurs de viabilité sur des particules inertes ou des cellules mortes présentes dans l'échantillon à analyser et empêchant une fixation non spécifique du ou des marqueurs de viabilité
sur lesdites particules ou cellules mortes.
Un agent bloquant, agent de blocage ou contre-colorant peut également être constitué de toute molécule ou mélange de molécules suceptibles d'interagir spécifiquement avec les particules inertes ou cellules mortes ayant comme caractéristique de neutraliser une émission éventuelle de fluorescence parasite par le marqueur de viabilité ou ses dérivés, soit par - absorption de la lumière parasite, par transfert d'énergie, - compétition sur le site de fixation non spécifique, - soit les deux simultanément ou par combinaison d'agents de blocage.
De manière avantageuse, les agents bloquants seront choisis dans la gamme de marqueurs fluorescents, ayant des caractéristiques structurales analogues, mais n'émettant pas ou émettant à des longueurs d'onde, différentes de celles de marqueurs de viabilité, et d'une façon avantageuse parmi les marqueurs ayant une longueur d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission des marqueurs de viabilité utilisés.

Les marqueurs de viabilité utilisés dans l'étape b} sont avantageusement des marqueurs fluorescents, tels des esters de la fluorescéine, de fa carboxyfluorescéine, du BCEF, du 5-6-carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) ou du fluorescéine diacétate ou un mélange de ceux-ci. Ces marqueurs de viabilité ont chacun une spécificité
de cibles, et nécessitent des conditions de tampons de marquage adaptées. A titre d'exemple, le CFDA est plus particulièrement approprié
pour marquer des bactéries alors que le FDA a une meilleure capacité
d'accumulation dans les champignons ou les levures dans des conditions de pH neutre. Un mélange de ces deux esters fluorescents permettra donc de détecter et de dénombrer un large spectre de microorganismes présents simultanément dans un échantillon biologique.
De manière générale, les marqueurs de viabilité sont choisis dans le groupe formé par les xanthènes, les acridines, les fluorones et les aminoazides.
II doit être noté ici que le procédé de l'invention est aussi utilisable quand l'isothiocyanate de fluorescéïne (FITC) est utilisé comme marqueur fluorescent en association avec un ligand spécifique (anticorps mono ou polyclonal etlou sonde nucléique) qu'il s'agisse de l'identification de microorganismes ou de cellules animales. Dans ce cas, il est souvent observé une adsorption non spécifique de la fluorescence émise.
L'utilisation d'une composition d'agents bloquants préalable ou simultanée au marquage par le ligand peut permettre d'éviter cet artefact.
L'invention porte également sur une composition d'agents de blocage susceptible de prévenir la fixation de premiers composés fluorescents sur des particules inertes ou des cellules non vivantes caractérisée en ce qu'elle comprend a) un ou plusieurs seconds composés fluorescents ayant une longueur d'onde d'absorption de la fluorescence sensiblement égale à la longueur d'onde d'émission de la fluorescence des premiers marqueurs de viabilité ;
sont plus particulièrement choisis des fluorones tels l'érythrosine B, l'éthyl-éosine, la methyl-eosine, l'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de ceux-ci ;
b) un ou plusieurs composés susceptibles d'entrer en compétition avec le produit résultant de l'hydrolyse du marqueur, cause du marquage parasite ;
c) un mélange de a) et b).
La présente invention est égaiement relative à une composition de marquage constituée d'un ou des mélanges de marqueurs de viabilité dans un tampon à haute force ionique.
L'invention porte égaiement sur l'utilisation du procédé à la détection et/ou à la numération des cellules viables dans un échantillon y compris des formes sporulantes, à l'exclusion des cellules mortes ; elle permet de la méme façon de dénombrer spécifiquement ces dernières.
L'invention porte enfin sur un kit ou trousse permettant la détection et la numération des cellules viables dans une flore totale, lequel kit comprenant au moins - un agent de blocage d'un marquage parasite par les marqueurs de viabilité ou une composition de marqueurs de viabilité telle que décrite ci-dessus ;
- une composition contenant un ou plusieurs marqueurs de viabilité tels que décrits ci-dessus ;
- un tampon de viabilité ;
- le cas échéant, un milieu de gonflement ;
- un protocole expérimental pour les dilutions extemporanées des différents compositions et tampons.
Description détaillée de !'invention Dans le procédé de l'invention, les agents de blocage permettent de différencier d'une part les cellules vivantes et, d'autre part, les particules et ......* . , ,, les cellules mortes par marquage différentiel. Quand les agents de marquage sont des dérivés de la fluorescéine et ayant une longueur d'onde d'émission de 515 nm, les agents de blocage seront de préférence des dérivés halogénés de la famille des xanthènes ayant une longueur d'onde d'absorption dans la même fenêtre ou fies dérivés de ceux-ci.
Dans ce cas, l'agent bloquant est choisi de préférence dans le groupe formé par les fluorones substituées par au moins un atome d'halogène, tel que chlore, brome, fluore et/ou iode; parmi les fluorones substituées on peut citer, par exemple, l'éosine B, I'éosine Y, la phloxine B, l'éryihrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci.
L'agent bloquant est, de manière préférée, choisi dans le groupe formé par les fluorones substituées au moins par 3 atomes d'halogène, et, de préférence, par 4 atomes d'halogène, et, notamment, par 4 atomes d'iode ou 4 atomes de brome, tels que, notamment, l'éosine Y, la phloxine B, l'érythrosine, l'éthyléosine ou un mélange de deux ou plus de ceux-ci. De bons résultats ont été obtenus lorsque l'agent bloquant est choisi dans le groupe formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine ou un mélange de ceux-ci.
La similitude des marqueurs est importante dans ia mesure où la plupart des colorants testés se révèlent inefficaces dans l'application recherchée, en particulier les colorants bleus sont inefficaces comme le bleu evans, le bleu trypan ou le bleu de méthylène.
Le tableau 1 ci-dessous résume les principaux colorants qui ont été
testés avec leurs caractéristiques et leurs effets Tableau 1 Colorants bleus Pas d'action Congo Red Pas d'action :

. bleu Evans, (0,005 %) . bleu Trypan, . bleu Mthylne Rutheni~m Red Pas ou peu d'actionAlizarin Reds Pas d'action (0.005 %) Nile Red Pas d'effet Eosine B (0,005 Peu d'action %) (8 pg/ml) Fast Red Non utilisable Phenosafranine Peu d'action (30 Nglml) (0,002 %) Rouge neutre Actif Eosine Y (0,01 Actif %) (0,003 %) Erythrosine B Actif Phloxine B Actif (0,004 %) (0,005 %) Ethylosine Actif (0,002 %) Les agents bloquants actifs peuvent être utilisés seuls ou en combinaison.
L'avantage d'utiliser une combinaison est d'augmenter le spectre d'action 5 de ces agents bloquants.
A titre d'exemple, l'éthyl-éosine, la Phloxine B et i'Eosine Y qui sont des dérivés bromés de la fluorescéine vont marquer préférentiellement ies microorganismes tués alors que l'érythrosine, dérivé iodé de la fluorescéine, va marquer de préférence les particules inertes dans le milieu 10 à analyser. Un mélange d'éthyl-éosine et d'érythrosine sera donc particulièrement performant pour marquer l'ensemble des parücules o~r cellules qui ne sont pas des microorganismes viables dans un échantillon quelconque.
L'invention porte également sur une composition d'agents bloquants comprenant des fluorones plus particulièrement choisis dans le groupe _... _ _ , . , , , formé par l'érythrosine B, l'éthyl-éosine, la methyl-eosine, l'Eosine B, Y, la Phloxine B ou un mélange de ceux-ci dans des rapports de concentrations en poids allant de 1011 à 1/10. Le choix des fluorones et de leurs concentrations relatives dépendra du type de produit que l'on doit analyser, ainsi que de son milieu. Par exemple, pour l'analyse microbiologique de l'eau, I'érythrosine et l'éthyl-éosine sont utilisées dans des rapports compris entre 5l1 et 1/5, et c~e façon préférée, par exemple de 2/1, soit des concentrations finales respectives de 0,004 %o et 0,002 %°.
La solution comprend les constituants à une concentration qui est entre 2 et 15 fois celle du produit d'hydrolyse du marqueur de viabilité
responsable des signaux de fluorescence non spécifiques, sachant que les produits d'hydrolyse représentent entre 1 et 10 % en poids du marqueur de viabilité selon le type d'échantillon analysé.
Le procédé de l'invention comprend l'utilisation d'une composition de marquage de type universel susceptible de marquer n'importe quel type de cellules présent dans l'échantillon étudié. Les cellules peuvent être un procaryote, un eucaryote monocellulaire, une cellule animale, sous une forme biologiquement active ou sous . une forme sporulante. Une composition de marquage sera, quand le signal fluorescent sera recherché, une composition de marqueurs que l'expérimentateur diluera extemporanément dans le tampon de marquage à haute force ionique. La composition de marqueur sera constituée préférentiellement d'un mélange de 5(6)carboxyfluorescéine diacétate {CFDA) à une concentration comprise entre 5 et 10 mg par ml, et de fluorescéine diacétate (FDA) à une concentration comprise entre 0,5 et 5 mg par ml dans de l'acétone pur (q.s.p.). De préférence, les rapports en poids de CFDA et de FDA seront compris entre 511 et 1511 et de façon optimale de 9l1 soit pour 1 ml, 9 mg/ml (19,5 mM) de CFDA et 1 mglml (2,4 mM) de FDA dans de l'acétone pur.

Au moment du marquage des microorganismes éventuels recherchés dans l'échantillon, la composition de marqueur telle que décrite ci-dessus est diluée au centième dans un tampon de marquage dont la force ionique est supérieure à 0,5 et comprenant dans une solution aqueuse.:
- un détergent non ionique, - un agent chélateur, - un tampon, et - un sel .
Une composition préférée est présentée dans le tableau 2 suivant Tableau 2 Limites de Concentration concentration prfre Tween 20 (Pokyoxythylne 0,005 % - 0,1 0,03 Sorbitan %
Monolaurate) Ethylne Diamine ttra actique1 mM - 10 mM 5 mM
3SS trisodium Actate de Sodium trihydrat 10 mM 50 mM

Chlorure de sodium 0,5 mM - 1,5 1,13 M
M

Eau Ultrapure - qsp Le tampon acétate de sodium peut étre indifféremment remplacé par d'autres tampons de type tampon phosphate, HEPES, citrate, etc... De la même façon, le chlorure de sodium peut étre remplacé par du chlorure de potassium (KCL), du NH4~2~S04 etc...
La composition constituée d'un marqueur, ou d'un mélange de marqueurs telle que décrite ci-dessus et diluée dans le tampon de marquage, fait également partie de l'invention.
L'efficacité particulièrement importante du tampon en question est surprenante du fait de sa très haute force ionique. En effet, l'isotonicité
était ..... ..._..,...,......._.,.~,.~_,.,_.._.._.d,..,.._.~,.. .. ........ .~ ....
~ ,. r,.

'f 3 généralement la solution retenue pour conserver l'intégrité de la cellule viable. Des essais réalisés en cytométrie en flux sur des bactéries en phase stationnaire sont présentés dans la figure 1.
La figure 1 représente l'effet de la force ionique sur le nombre de cellules détectées. L'abscisse indique l'intensité de fluorescence, et l'ordonnée le nombre de cellules détectées. La colonne de gauche représente les résultats avec ~acillus subtifis et celle de droite avec Serratia marcescens. Ils montrent qu'une augmentation de la force ionique s'accompagne d'une augmentation de l'intensité de fluorescence, résultant d'une meilleure accumulation du marqueur dans les cellules vivantes.
Cette expérience indique clairement qu'une force ionique supérieure à 0.8 M est recommandée pour un dénombrement précis.
Dans le procédé de l'invention, une étape de gonflement des spores présentes ie cas échéant dans le milieu à analyser est réalisée par l'addition d'un milieu de type TCS, d'un extrait de malt ou avantageusement d'un mélange des deux.
L'échantillon traité au préalable avec l'agent bloquant tel que décrit plus haut est mis en contact avec le milieu de gonflement soit par dilution ou resuspension de l'échantillon à analyser dans le milieu de gonflement dans le cas d'un dénombrement en milieu liquide, soit par transfert de la membrane sur lequel l'échantillon à analyser a été filtré, sur un support absorbant saturé du milieu de gonflement. L'échantillon est alors incubé de 40 mm à 3 heures à 30° ou 37°C selon l'application recherchée ;
une incubation courte 40 mm à 37°C permettra la détection des spores de bactéries, tandis qu'une incubation . plus longue (3 heures à 30°C) permettra aussi la détection des spores de moisissures.
Néanmoins, on peut diminuer la température et allonger la durée d'incubation pour obtenir le même résultat.

Pour la détection des microorganismes, les échantillons sont mis en présence de la solution de marquage tel que décrit précédemment, d'une manière similaire à l'étape de gonflement et incubés 30 minutes à 30°C
à
plus ou moins 3°C.
Dans le procédé de ('invention, le ou les agents de blocage a comme particularité d'être dans un rapport de concentration avec le ou les marqueurs de viabilité de 5 à 15 pour 1, ce qui est l'inverse des rapports habituels utilisés entre colorants et contre-colorants qui sont de l'ordre de 1110. Un ratio optimal, pour les dérivés dela fluorescéine, sera d'environ 10 pour 1.
Le traitement de l'échantillon avec l'agent de blocage sera toujours antérieur, ou à la limite simultané au traitement par la composition contenant les marqueurs de viabilité.
Dans une variante de l'invention, on peut s'affranchir du support hydrophile, soit dans l'étape de gonflement, soit dans l'étape de marquage par dépôt direct du milieu de gonflement ou du tampon de marquage sur ou sous le filtre porteur des microorganismes filtrés.
Le procédé de l'invention comprend enfin une étape d'analyse par tout moyen approprié à mesurer le signal émis par le marqueur de viabilité.
Si, toutefois, l'analyse n'est pas réalisée immédiatement après l'incubation avec la composition de marquage, les échantillons doivent être placés à 8~
4°C à l'abri de fa lumière, mais sans toutefois excéder une durée de minutes.
Le procédé de détection etlou de numération selon l'invention peut 25 notamment être mis en oeuvre dans l'appareil décrit dans les demandes de brevet EP 0 333 561 et WO 89/08714 et vendu sous les marques CHEMSCAN~ et CHEMFLOW~.
_. r , , ,.

L'invention porte également sur la mise en oeuvre et l'utilisation du kit du procédé de l'invention dans toutes les applications où la présence de cellules vivantes est recherchée.
Le procédé et le kit selon l'invention peuvent être utilisés notamment 5 pour détecter etlou dénombrer d'éventuels microorganismes dans des produits d'hygiène, alimentaires ou pharmaceutiques.
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être également utilisés pour contrôler un processus industriel comme la stérilisation que ce soit dans les applications agroaümentaires, pharmaceutiques ou nutraceutiques 10 et ce, soit dans une étape d'un procédé de fabrication, soit sur ie produit fini. De la même façon, le procédé et le kit peuvent être utilisés pour contrôler la charge bactérienne avant et après une filtration stérilisante (bioburden).
Le procédé et le kit de l'invention peuvent être enfin utilisés pour la 15 mise en évidence de microorganismes viables non détectables par les méthodes classiques. 11 peut s'agir par exemple - du contrôle d'efficacité d'un antibiotique, particulièrement pour ceux qui interfèrent avec la division cellulaire des microorganismes et donc ne sont pas détectables avec les méthodes classiques de type boite de pétri ;
- la recherche de contaminations susceptibles de produire des infections nocosomiales en milieu hospitalier ;
- d'établir une éventuelle corrélation entre un test de pyrogénicité en cours de process de fabrication, par exemple de médicaments, et la présence de micro-organismes dans l'échantillon ;
- la détection de lymphocytes dans les urines.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin, mettre en oeuvre le procédé pour l'utilisation souhaitée.
Pour la première fois, on est en présence d'une invention qui fournit un moyen de marquer dans un seul et même échantillon et discriminer les cellules viables des particules de taille sensiblement identique aux cellules viables que peuvent être des cellules mortes ou des particules en suspension, et ce avec une fabilité confërée par - l'élimination des faux négatifs par fa présence d'un milieu de gonflement et le marquage des spores, - l'élimination des faux positifs grâce à la composition d'agents de blocage, - !'augmentation de la sensibilité du fait de l'utilisation d'un tampon de marquage a haute torce ionique plus particulièrement pour les microorganismes.
Outre les développements et avantages détaillés ci-dessus, l'invention comporte également d'autres avantages et caractéristiques découlant des exemples qui suivent, donnés à titre d'illustration sans cependant en limiter la portée.
Exempte 1 : Mise en oeuvre du r~rocédé en absence de toute filtration d'échantillons Dans un premier temps, la mise en oeuvre du procédé consiste à réaliser un pré-traitement avec un agent de blocage préalablement au traitement par les marqueurs de viabilité. Le but de cette expérimentation est de montrer l'efficacité de ce traitement pour éliminer les faux positifs résultant d'une interaction non spécifique entre tes marqueurs de viabilité et la membrane de filtration.
Nous avons utilisé une composition de contre-colorants contenant Erythrosine et Ethyl Eosine dans un rapport pondéral de 2, appelé CSE
(Counter Staining E), ayant la compositüon suivante : 0,004 %
d'Erythrosine B dilué dans l'Hépès et 0,002 % d'Ethyl-Eosine dilué
également dans l'Hépès. -Le tableau 3 ci-dessous compare les résultats de fluorescence mesurés au CHEMSCAN et obtenus sans ou avec traitement préalable par le CSE
...

Tableau 3 agent de blocageNombre F+ % des r de membranes membranes donnant b Sans 36 mem- . 9 membranes donnent25 braves _ 14 membranes donnent . 3 membranes donnent . 2 membranes donnent .2 membranes ont un nombre de F+>3 Avec CSE 42 mem- . 34 membranes donnent81 (Erythrosine braves + Ethyl _ 1 ,membrane donne Eosine) 1 . 2 membranes donnent .1 membrane a un nombre de F+>3 Le protocole suivi est le suivant a) préparation des supports de filtration Les supports de filtration sont rincés successivement avec trois fois 1 ml d'éthanol à 70 % (vlv) puis par 3 fois 1 ml d'eau filtrée (à travers 1 fltre de 0,22 Nm). Le support de filtration utilisé est une membrane de poyester, qui est ensuite placée sur un support de filtration humide.
b) filtration du contre-colorant CSE
Le CSE est ensuite filtré à travers la membrane de polyester positionnée sur le support de filtration humide à raison de 1 ml de CSE.
c) marquage par les marqueurs de viabilité
Le marqueur de viabilité comprend 9 mg par ml (19,5 mM) de diacétate de carboxyfluorescéine (CFDA) et 1 mg/ml {2,4 mM) de diacétate de fluorescéine (FDA) dans de l'acétone anhydre pure. La solution de viabilité

a été préparée et diluée extemporanément ensuite au centième dans un tampon dont la composition est fa suivante - 0,03 % (v/v) de tween 20 (polyoxyéthylène sorbitan monolaurate), - du phosphate de sodium trihydraté 50 mM, pH7 - du chlorure de sodium 1,13 mM dans de l'eau ultrapure.
c.1 }
- Aspirer 20 ml de milieu de gonflement dans une seringue stérile, - Préfiltrer les 20 ml de milieu de gonflement dans un flacon stérile, - Garder cette solution à température ambiante.
c.2) Dans une boîte de Pétri, placer un support absorbant (PAD) en cellulose ou en polypropylène - Imbiber le support cellulosique absorbant (PAD cellulose) avec 650 NI de milieu de gonflement, ou imbiber le PAD en polypropylène avec 300 pl de milieu de gonflement, tel que décrit plus haut, - Transférer fa membrane polyester sur le PAD, - Placer les boîtes fermées et identifiées dans l'étuve à l'abri de fa lumière - Incuber 40 mm (~ 3°C).
c.3) Durant ce temps d'incubation, préparer la solution de marquage.
Exemple pour 20 analyses - Dans un flacon stérile contenant 20 ml de tampon de marquage préfiltré
sur 0,22 Nm, ajouter 200 NI de substrat de viabilité en prenant soin de ne pas toucher la paroi du flacon, - Homogénéiser, - Envelopper le flacon dans une feuille d'aluminium. Stocker ia solution ainsi préparée entre 8°C ~ 4°C (4 heures maximum).
c.4) Dans chaque boîte de Pétri, placer un nouveau PAD (cellulose ou polypropylène) - imbiber le PAD cellulose avec fi50 pl de solution de marquage, ou le PAD
en polypropylène avec 300 ul de solution de marquage r i .

- transférer la membrane polyester du PAD saturé de milieu de gonflement au PAD saturé de solution de marquage.
- incuber 30 mn {~ 5mn) à 30°C (~3°C) à l'abri de la lumière.
c.5) Analyser chaque échantillon individuellement. Si l'analyse n'est pas immédiate après l'incubation, placer les échantillons (membranes sur PAD) à 8°C ~ 4°C à l'abri de la lumière (Ne pas dépasser 30 mn).
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau II ci-dessus Les 36 membranes non traitées par l'agent de blocage n'ont pas subi l'étape b) ci-dessus.
Les résultats indiquent que le simple fait de traiter avec l'agent de blocage permet de faire passer le nombre de membranes portant des faux positifs de 75 % à 19 %.
Exemple 2 : Efficacité du arocédé sur l'eau~~ehtonée et tam onée L'eau peptonée est une eau utilisée pour faire des dilutions de bactéries afin justement d'en réaliser la numération comme cela est décrit notamment dans le brevet WO 8908714.
Néanmoins, certains types d'eau peptonée posent le problème de donner de nombreux faux positifs quand l'échantillon est traité avec des ester de fiuorescéine, ce qui résulte probablement d'une interaction entre la fluorescéine résultant de l'hydrolyse du marqueur qui s'accrocherait sur des éléments particulaires résidant dans l'eau peptonée. Le mëme protocole que dans l'exemple 1 a été utilisé sauf qu'une étape de filtration de 50 ml d'eau peptonée stérile a été introduite entre l'étape a) de préparation du filtre et l'étape b) de filtration de l'agent de blocage. Les résultats obtenus sont présentés dans les tabieaux 4.1, 4.2 et 4.3 ci-dessous Tableau 4.1 Contre-colorantsComptage primaire F+

Contrle 6835 / 7804110677 8 /4 / 11 Rouge neutre 699 I 1371 / 894 1 l 4 I 3 Contrle 2706 / 3142 I 2848 6 I 7 I 6 Erythrosine 87 / 71 I 107 0 I 0 I 1 B

Contrle 7445 l 7588 J 5986 8 I 9 I 15 Nile red 178 I 678 I 343 10 l 4 I 7 Tableau 4.2 Contre-colorantsComptage primaire F+

Contrle 2674 l 2968 / 2997 69 I 95 l 111 Congo red 1425 I 1361 l 3387 72 I 64 171 Alizarin Red 1762 I 2030 56 I 82 S

Phnosafranine 214 / 252 l 273 18 I 25 I 37 5 Tableau 4.3 Contre-colorantsComptage primaire F+

Contrle 2554 I 2492 l 2299 59 I 57 l 56 Eosine B 1229 l 1471 I 1169 31 I 49 I 41 Eosine Y 278 I 451 I 3166 11 I 21 I 21 Phloxine B 122 I 110 I 129 6 I4 I 16 Ethyi-eosine 82 l 66 I 97 5 I 2 l 3 Six fltrations ont été réalisées en l'absence de l'étape b) et avec l'étape b).
l'agent de blocage et le marqueur de viabilité utilisés sont les mêmes que ceux de l'exemple 1. Le signe F+ indique le nombre de particules 10 fluorescentes détectées par le CHEMSCAN~. La colonne qui indique "comptage primaire" est en fait le comptage de fluorescence avant l'étape .... ..., .,....... . .., ~ . i de discrimination effectuée par le CHEMSCAN~ laquelle permet d'éliminer, nous le rappelons, tous les événements non rattachés à une particule de forme et de taille pris en compte dans le programme de l'appareil.
L'interprétation de ces expériences rend évidente que l'utilisation de l'agent de blocage permet d'éliminer environ 90 % de tous les événements de fluorescence comptés en comptage primaire - et qui sont donc des artefacts dus probablement aux particules présentes sur la membrane - et fa grosse majorité des événements de fluorescence vrais obtenus après discrimination par le CHEMSCAN~ et qui sont donc des faux positifs (les chiffres sont trop faibles pour raisonnablement mesurer la diminution en pourcentage). 11 est notamment observé que deux membranes sur ies six traitées par l'agent de blocage ne donne aucune fluorescence positive par le marqueur de viabilité après le prétraitement par le CSE.
Exemple 3 : Procédé réalisé sur une solution d'antibiotigues stériliség L'expérience est strictement identique à celte de l'exemple 2 à l'exception que 10 ml d'une solution d'antibiotique stérile ont été filtrés sur la membrane de polyester entre ies étapes a) et b) dans l'exemple 1.
Les résultats sont présentés dans ie tableau 5 suivant Tableau 5 Produit strile Solution comptage primaireF+
Ab strile Sans CSE 2 2206-2426 322-293 Avec CSE 2 79-152 5-12 Phioxine B 290 16 16 - 42 0,005 % 566 44 Eosine B 1442 104 100 - 370 0,005 % 2001 374 Là-encore, en l'absence de contre-colorant, le CHEMSCAN~ a détecté
respectivement 322 et 293 particules présentant une fluorescence après discrimination alors que par fe traitement avec le CSE, ce chiffre est ramené à respectivemet 5 et 12 particules fluorescentes soit une diminution de 98,5 % dans le premier cas et de 96 % dans le deuxième cas du nombre de faux positifs.
En conclusion, il apparaît clairement que le procédé de l'invention conduit à une réduction drastique des faux positifs obtenus par utilisation directe de marqueurs de viabilité sur un échantillon susceptible de contenir des microorganismes ; cette diminution allant de 80 à 99 %.
En outre, cette technologie a l'avantage de ne présenter aucun faux négatif, autrement dit l'agent de blocage ne diminue pas le nombre de cellules viables dénombrées dans un échantillon.
Le contre-colorant et plus particulièrement le CSE a en outre l'avantage de pouvoir étre utilisé dans un kit puisqu'il a des propriétés d'autoclavage et de conservation compatibles avec une distribution commerciale.
Un avantage et non des moindres de la composition contenant le ou les agents de blocage est son large spectre d'utilisation puisque le mélange proposé permet tant de marquer les cellules mortes que les particules non organiques. II va de soi que selon l'échantillon que l'on souhaite tester, l'un ou l'autre de ces agents de blocage sera préférentiellement utilisé de telle façon qu'il reste dans les rapports souhaités avec les marqueurs de viabilité utilisés dans la suite du procédé.
L'homme du métier saura, en tant que de besoin et en fonction de l'échantillon qu'il souhaite analyser, choisir tant sa composition d'agents de blocage que celle de marqueurs de viabilité et le rapport pondéral entre les deux.

Enfin, le dernier avantage du procédé et des compositions de l'invention est que, en une seule série de manipulations, ils permettent de dénombrer exclusivement les cellules vivantes y compris les formes sporulantes, d'une part, et les formes inertes, d'autre part.
Le procédé de l'invention est d'application général à d'autres couples agent de marquagelagent de blocage. L'homme du métier pourra toujours déterminer l'agent de blocage ayant l'une ou l'autre des caractéristiques citées en début de texte complémentaires des caractéristiques du marqueur de viabilité. 5 soybean casein) which will more particularly induce the germination of spores bacteria, or malt extract which will be more particularly suitable for induce the germination of mold spores. A swelling medium advantageous when it is desired to measure an overall viable flora, contains so a mixture of TCS and malt extract.
In the process of the invention, the sample studied can be the origin in liquid form, able to be filtered, or result from the setting suspension of particles present on a solid or in a gas any; cells can be detected and counted, either directly in a liquid sample, either after filtration of the sample liquid.
The filter will obviously be chosen in such a way that the size of the pores is small enough to hold all of the viable cells that we want to detect and / or measure.
Steps a) and b) are then carried out on the filter and step c) is applied by the use of a CHEMSCAN ~ type scanning cytometer so as to obtain, on the one hand, the detection and counting of the specific fluorescence of viable cells and, on the other hand, if necessary, detecting the fluorescence of inert particles and cells dead, based on their fluorescence emission wavelength.
The advantage in the embodiment of the invention in which the Liquid sample is filtered beforehand is to increase significantly the concentration of the elements that one wishes to detect.
In addition, the implementation of the various stages is easier when the cells are deposited on a solid support.

s In the process according to the invention, the filtration step can be followed of a Paving step.
After filtration of the sample, the vacuum is broken and the composition blocking agents as described below passed to the filter carrying the sample likely to contain cells or added directly in the sample in the case of an analysis in a liquid medium.
By blocking agent, blocking agent or counter-dye, is meant any molecule or mixture of molecules capable of interacting with binding sites for the viability marker (s) on inert particles or dead cells present in the sample to be analyzed and preventing non-specific binding of the viability marker (s) on said dead particles or cells.
A blocking agent, blocking agent or counter-dye may also consist of any molecule or mixture of molecules likely to interact specifically with inert particles or dead cells with the characteristic of neutralizing an emission possible parasitic fluorescence by the viability marker or its derived either by - absorption of stray light, by energy transfer, - competition on the non-specific binding site, - either both simultaneously or by a combination of blocking agents.
Advantageously, the blocking agents will be chosen from the range of fluorescent markers with structural characteristics analogs, but not emitting or transmitting at wavelengths, different from that of viability markers, and advantageously among the markers having an absorption wavelength of the fluorescence substantially equal to the emission wavelength of viability markers used.

The viability markers used in step b} are advantageously fluorescent markers, such as esters of fluorescein, carboxyfluorescein, BCEF, 5-6-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) or fluorescein diacetate or a mixture of these. These viability markers each have a specificity targets, and require labeling buffer conditions adapted. For example, the CFDA is more particularly suitable to mark bacteria while the FDA has better capacity accumulation in fungi or yeasts under conditions neutral pH. A mixture of these two fluorescent esters will therefore allow detect and count a wide spectrum of microorganisms present simultaneously in a biological sample.
Generally, the viability markers are chosen from the group formed by xanthenes, acridines, fluorones and aminoazides.
It should be noted here that the method of the invention can also be used when fluorescein isothiocyanate (FITC) is used as a marker fluorescent in combination with a specific ligand (mono antibody or polyclonal and / or nucleic probe) whether it is the identification of microorganisms or animal cells. In this case, it is often observed non-specific adsorption of the fluorescence emitted.
The use of a composition of blocking agents prior or simultaneous labeling with the ligand can avoid this artifact.
The invention also relates to a composition of blockage capable of preventing the fixation of first compounds fluorescent on inert particles or non-living cells characterized in that it includes a) one or more second fluorescent compounds having a length wavelength of fluorescence absorption substantially equal to the length emission wave of the fluorescence of the first viability markers;
are more particularly chosen fluorones such as erythrosine B, ethyl-eosin, methyl-eosin, Eosin B, Y, Phloxin B or a mixture of these;
b) one or more compounds liable to compete with product resulting from the hydrolysis of the marker, cause of the parasitic marking;
c) a mixture of a) and b).
The present invention also relates to a composition of labeling consisting of one or more mixtures of viability markers in a high ionic strength pad.
The invention also relates to the use of the detection method.
and / or the count of viable cells in a sample including sporulating forms, excluding dead cells; it allows the same way to specifically count these.
Finally, the invention relates to a kit or kit enabling detection and the count of viable cells in a total flora, which kit including at least an agent for blocking a parasitic marking by the markers of viability or a viability marker composition as described above above ;
- a composition containing one or more viability markers such as described above;
- a viability buffer;
- if necessary, a swelling medium;
- an experimental protocol for extemporaneous dilutions of the different compositions and pads.
Detailed description of the invention In the process of the invention, the blocking agents make it possible to differentiate living cells on the one hand and particles on the other and ...... *. , ,, dead cells by differential labeling. When the agents of labeling are derivatives of fluorescein and having a wavelength 515 nm emission, the blocking agents will preferably be halogenated derivatives of the xanthene family having a wavelength absorption in the same window or fies derived therefrom.
In this case, the blocking agent is preferably chosen from the group formed by fluorones substituted by at least one atom halogen, such as chlorine, bromine, fluorine and / or iodine; among fluorones substituted, for example, eosin B, eosin Y, phloxin B, erythrosin B, ethyl eosin, or a mixture of two or more of these.
The blocking agent is preferably chosen from the group formed by fluorones substituted with at least 3 halogen atoms, and, preferably by 4 halogen atoms, and in particular by 4 iodine atoms or 4 bromine atoms, such as, in particular, eosin Y, phloxin B, erythrosine, ethylosine or a mixture of two or more of these. Of good results have been obtained when the blocking agent is chosen in the group formed by erythrosine B, ethyl eosin or a mixture thereof.
The similarity of the markers is important insofar as the most dyes tested prove ineffective in application sought, in particular blue dyes are ineffective like evans blue, trypan blue or methylene blue.
Table 1 below summarizes the main dyes that have been tested with their characteristics and effects Table 1 Blue dyes No action Congo Red No action :

. Evans blue, (0.005%) . Trypan blue, . methyl blue Rutheni ~ m Red No or little action Alizarin Reds No action (0.005%) Nile Red No Eosin B effect (0.005 Little action %) (8 pg / ml) Fast Red Not usable Phenosafranine Little action (30 Nglml) (0.002%) Neutral red Active Eosine Y (0.01 Active %) (0.003%) Erythrosine B Active Phloxine B Active (0.004%) (0.005%) Active Ethylosin (0.002%) Active blocking agents can be used alone or in combination.
The advantage of using a combination is to increase the spectrum of action 5 of these blocking agents.
By way of example, ethyl eosin, Phloxin B and Eosin Y which are brominated derivatives of fluorescein will preferentially mark ies microorganisms killed while erythrosine, an iodine derivative of fluorescein, will preferably mark inert particles in the medium 10 to analyze. A mixture of ethyl-eosin and erythrosine will therefore particularly effective for marking all the parucles o ~ r cells that are not viable microorganisms in a sample any.
The invention also relates to a composition of blocking agents.
comprising fluorones more particularly chosen from the group _... _ _,. ,,, formed by erythrosine B, ethyl eosin, methyl eosin, Eosin B, Y, Phloxine B or a mixture thereof in concentration reports by weight ranging from 1011 to 1/10. The choice of fluorones and their relative concentrations will depend on the type of product to be analyzed, as well as its environment. For example, for microbiological analysis of water, erythrosine and ethyl eosin are used in reports understood between 5l1 and 1/5, and c ~ e preferably, for example 2/1, or respective final concentrations of 0.004% o and 0.002% °.
The solution includes the constituents at a concentration which is between 2 and 15 times that of the hydrolysis product of the viability marker responsible for non-specific fluorescence signals, knowing that hydrolysis products represent between 1 and 10% by weight of the viability according to the type of sample analyzed.
The method of the invention comprises the use of a composition of universal type marking capable of marking any type of cells present in the sample studied. Cells can be a prokaryote, a monocellular eukaryote, an animal cell, under a biologically active form or in. a sporulating form. A
marking composition will be, when the fluorescent signal is sought, a composition of markers that the experimenter will dilute extemporaneously in the high ionic strength marking buffer. The marker composition will preferably consist of a mixture 5 (6) carboxyfluorescein diacetate (CFDA) at a concentration between 5 and 10 mg per ml, and fluorescein diacetate (FDA) at a concentration between 0.5 and 5 mg per ml in pure acetone (qs). Preferably, the weight ratios of CFDA and FDA will be between 511 and 1511 and optimally 9l1 or 1 ml, 9 mg / ml (19.5 mM) of CFDA and 1 mglml (2.4 mM) of FDA in pure acetone.

When labeling any microorganisms sought in the sample, the marker composition as described above is diluted to the hundredth in a marking buffer whose ionic strength is greater than 0.5 and comprising in a solution aqueous .:
- a non-ionic detergent, - a chelating agent, - a stamp, and - a salt.
A preferred composition is presented in Table 2 below Table 2 Concentration limits preferred concentration Tween 20 (Pokyoxythylene 0.005% - 0.1 0.03 Sorbitan%
Monolaurate) Ethylne Diamine ttra active 1 mM - 10 mM 5 mM
3SS trisodium Sodium Actate trihydrate 10 mM 50 mM

Sodium chloride 0.5 mM - 1.5 1.13 M
M

Ultrapure water - qs The sodium acetate buffer can be replaced by other buffers such as phosphate buffers, HEPES, citrate, etc.
same way, sodium chloride can be replaced by sodium chloride potassium (KCL), NH4 ~ 2 ~ S04 etc ...
The composition consisting of a marker, or a mixture of markers as described above and diluted in the buffer marking, is also part of the invention.
The particularly important effectiveness of the buffer in question is surprising because of its very high ionic strength. Indeed, isotonicity was ..... ..._ .., ..., ......._.,. ~,. ~ _,., _.._.._. d, .., .. _. ~, .. .. ......... ~ ....
~,. r ,.

'f 3 generally the solution chosen to preserve the integrity of the cell viable. Tests performed in flow cytometry on bacteria in stationary phase are shown in Figure 1.
Figure 1 shows the effect of ionic strength on the number of cells detected. The abscissa indicates the fluorescence intensity, and the ordinate the number of cells detected. The left column represents the results with ~ acillus subtifis and the one on the right with Serratia marcescens. They show that an increase in ionic strength is accompanied by an increase in fluorescence intensity, resulting better accumulation of the marker in living cells.
This experiment clearly indicates that a higher ionic strength at 0.8 M is recommended for an accurate count.
In the method of the invention, a step of swelling the spores present, if necessary in the medium to be analyzed, is carried out by the addition of a TCS type medium, a malt extract or advantageously a mixture of the two.
The sample previously treated with the blocking agent as described more top is contacted with the swelling medium either by dilution or resuspension of the sample to be analyzed in the swelling medium in the case of a count in liquid medium, either by transfer of the membrane on which the sample to be analyzed has been filtered, on a support saturated absorbent of the swelling medium. The sample is then incubated with 40 mm at 3 hours at 30 ° or 37 ° C depending on the desired application;
a short 40 mm incubation at 37 ° C will allow the detection of spores bacteria, while an incubation. longer (3 hours at 30 ° C) will also allow the detection of mold spores.
However, we can lower the temperature and extend the duration incubation to achieve the same result.

For the detection of microorganisms, the samples are put presence of the labeling solution as described above, of a similar to the swelling step and incubated for 30 minutes at 30 ° C
at plus or minus 3 ° C.
In the process of the invention, the blocking agent (s) has as a peculiarity of being in a concentration relationship with the one or more viability markers 5 to 15 to 1, which is the reverse of reports usual between dyes and counter-dyes which are of the order of 1110. An optimal ratio for fluorescein derivatives will be around 10 for 1.
The treatment of the sample with the blocking agent will always be prior to, or at the same time as, treatment with the composition containing viability markers.
In a variant of the invention, it is possible to dispense with the support hydrophilic, either in the swelling stage or in the marking stage by direct deposition of the swelling medium or of the marking buffer on or under the filter carrying the filtered microorganisms.
The method of the invention finally comprises a step of analysis by any suitable means of measuring the signal emitted by the viability marker.
If, however, the analysis is not performed immediately after incubation with the marking composition, the samples should be placed at 8 ~
4 ° C away from light, but without exceeding a duration of minutes.
The method of detection and / or counting according to the invention can 25 in particular be implemented in the apparatus described in the applications for Patent EP 0 333 561 and WO 89/08714 and sold under the brands CHEMSCAN ~ and CHEMFLOW ~.
_. r,,,.

The invention also relates to the implementation and use of the kit of the process of the invention in all applications where the presence of living cells is sought.
The method and the kit according to the invention can be used in particular 5 to detect and / or count possible microorganisms in hygiene, food or pharmaceutical products.
The method and the kit of the invention can also be used to control an industrial process like sterilization whatsoever in agrifood, pharmaceutical or nutraceutical applications 10 and this, either in a step of a manufacturing process, or on the product finished. In the same way, the method and the kit can be used to control the bacterial load before and after a sterilizing filtration (bioburden).
The method and the kit of the invention can finally be used for the 15 detection of viable microorganisms not detectable by classical methods. It can be for example - monitoring the effectiveness of an antibiotic, particularly for those who interfere with cell division of microorganisms and therefore are only not detectable with conventional methods such as a petri dish;
- the search for contaminations likely to produce infections nocosomials in hospitals;
- establish a possible correlation between a pyrogenicity test in progress manufacturing process, for example of drugs, and the presence of microorganisms in the sample;
- detection of lymphocytes in the urine.
Those skilled in the art will, as necessary, implement the process for the intended use.
For the first time, we are in the presence of an invention which provides a means of marking in a single sample and discriminating between viable cells particle size substantially identical to cells viable as dead cells or particles can be suspension, and this with a reliability conferred by - elimination of false negatives by the presence of a swelling medium and spore labeling, - elimination of false positives thanks to the composition of blocking agents, -! 'increase in sensitivity due to the use of a buffer of high ion torce marking more particularly for microorganisms.
In addition to the developments and benefits detailed above, the invention also has other advantages and characteristics from the following examples, given by way of illustration without however limit its scope.
Example 1: Implementation of the r ~ rocédé in the absence of any filtration samples Initially, the implementation of the method consists in carrying out pre-treatment with a blocking agent prior to treatment by viability markers. The purpose of this experiment is to show the effectiveness of this treatment to eliminate false positives resulting non-specific interaction between your viability markers and the filtration membrane.
We used a composition of counter-dyes containing Erythrosine and Ethyl Eosine in a weight ratio of 2, called CSE
(Counter Staining E), having the following composition: 0.004%
of Erythrosine B diluted in Hepes and 0.002% of Ethyl-Eosine diluted also in Hepes. -Table 3 below compares the fluorescence results measured at CHEMSCAN and obtained without or with prior treatment by the CSE
...

Table 3 blocking agent Number F +% of r of membranes membranes giving b Without 36 mem-. 9 membranes give 25 brave _ 14 membranes give . 3 membranes give . 2 membranes give .2 membranes have a number of F +> 3 With CSE 42 mem-. 34 membranes give 81 (Brave erythrosine + Ethyl _ 1, membrane gives Eosine) 1 . 2 membranes give .1 membrane has a number of F +> 3 The protocol followed is as follows a) preparation of filtration media The filtration media are rinsed successively with three times 1 ml 70% ethanol (vlv) then 3 times 1 ml of filtered water (through 1 filter of 0.22 Nm). The filtration medium used is a poyester membrane, which is then placed on a wet filtration support.
b) filtration of the CSE counter-dye The CSE is then filtered through the polyester membrane positioned on the wet filtration support at the rate of 1 ml of CSE.
c) labeling with viability markers The viability marker comprises 9 mg per ml (19.5 mM) of diacetate carboxyfluorescein (CFDA) and 1 mg / ml (2.4 mM) of diacetate fluorescein (FDA) in pure anhydrous acetone. The viability solution was prepared and diluted extemporaneously then to the hundredth in a buffer whose composition is as follows - 0.03% (v / v) of tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate), - 50 mM sodium phosphate trihydrate, pH7 - 1.13 mM sodium chloride in ultrapure water.
c.1}
- Draw 20 ml of swelling medium into a sterile syringe, - Pre-filter the 20 ml of swelling medium in a sterile bottle, - Keep this solution at room temperature.
c.2) In a Petri dish, place an absorbent support (PAD) in cellulose or polypropylene - Soak the absorbent cellulosic support (PAD cellulose) with 650 NI of swelling medium, or soak the polypropylene PAD with 300 μl of swelling medium, as described above, - Transfer the polyester membrane to the PAD, - Place the closed and identified boxes in the oven protected from light - Incubate 40 mm (~ 3 ° C).
c.3) During this incubation time, prepare the labeling solution.
Example for 20 analyzes - In a sterile bottle containing 20 ml of prefiltered labeling buffer on 0.22 Nm, add 200 NI of viability substrate taking care not to not touch the wall of the bottle, - Homogenize, - Wrap the bottle in aluminum foil. Store the solution thus prepared between 8 ° C ~ 4 ° C (4 hours maximum).
c.4) In each Petri dish, place a new PAD (cellulose or polypropylene) - soak the cellulose PAD with fi50 pl of labeling solution, or the PAD
polypropylene with 300 µl marking solution laughed.

- transfer the polyester membrane from the PAD saturated with swelling medium PAD saturated with labeling solution.
- incubate for 30 min (~ 5 min) at 30 ° C (~ 3 ° C) protected from light.
c.5) Analyze each sample individually. If the analysis is not immediately after incubation, place the samples (membranes on PAD) at 8 ° C ~ 4 ° C protected from light (Do not exceed 30 min).
The results obtained are recorded in Table II above The 36 membranes not treated with the blocking agent did not undergone step b) above.
The results indicate that simply dealing with the blocking allows to pass the number of membranes carrying false 75% to 19% positive.
Example 2: Effectiveness of the process on water ~~ ehtonée et tam onée Peptone water is water used to dilute bacteria in order to precisely count them as described in particular in patent WO 8908714.
Nevertheless, certain types of peptone water pose the problem of giving many false positives when the sample is treated with esters of fiuorescein, which probably results from an interaction between the fluorescein resulting from the hydrolysis of the marker which would catch on particulate elements residing in peptone water. The same protocol that in Example 1 was used except that a filtration step of 50 ml sterile peptone water was introduced between step a) of preparation of the filter and step b) of filtering the blocking agent. The results obtained are presented in tables 4.1, 4.2 and 4.3 below Table 4.1 Counter colourantsF + primary counting Control 6835/7804110677 8/4/11 Neutral red 699 I 1371/894 1 l 4 I 3 Control 2706/3142 I 2848 6 I 7 I 6 Erythrosine 87/71 I 107 0 I 0 I 1 B

Control 7445 l 7588 J 5986 8 I 9 I 15 Nile red 178 I 678 I 343 10 l 4 I 7 Table 4.2 Counter colourantsF + primary counting Control 2674 l 2968/2997 69 I 95 l 111 Congo red 1425 I 1361 l 3387 72 I 64 171 Alizarin Red 1762 I 2030 56 I 82 S

Phnosafranin 214/252 l 273 18 I 25 I 37 5 Table 4.3 Counter colourantsF + primary counting Control 2554 I 2492 l 2299 59 I 57 l 56 Eosine B 1229 l 1471 I 1169 31 I 49 I 41 Eosine Y 278 I 451 I 3166 11 I 21 I 21 Phloxin B 122 I 110 I 129 6 I4 I 16 Ethyi-eosine 82 l 66 I 97 5 I 2 l 3 Six filtration were carried out in the absence of step b) and with step b).
the blocking agent and the viability marker used are the same as those of example 1. The sign F + indicates the number of particles 10 fluorescents detected by CHEMSCAN ~. The column that indicates "primary count" is actually fluorescence count before the step .... ...,., ........ .., ~. i of discrimination carried out by CHEMSCAN ~ which eliminates, we recall, all events not related to a particle of shape and size taken into account in the device program.
The interpretation of these experiences makes it clear that the use of blocking agent eliminates approximately 90% of all events fluorescence counted in primary counting - and which are therefore artifacts probably due to particles on the membrane - and the vast majority of true fluorescence events obtained after discrimination by CHEMSCAN ~ and which are therefore false positives (the figures are too small to reasonably measure the decrease in percentage). It is notably observed that two membranes out of six treated with the blocking agent gives no positive fluorescence by the viability marker after pre-treatment with the CSE.
EXAMPLE 3 Process Carried Out on a Sterilized Antibiotic Solution The experiment is strictly identical to that of Example 2 with the exception that 10 ml of a sterile antibiotic solution have been filtered on the polyester membrane between steps a) and b) in Example 1.
The results are presented in the following table 5 Table 5 Strile product Primary counting solution F +
Ab strile Without CSE 2 2206-2426 322-293 With CSE 2 79-152 5-12 Phioxin B 290 16 16 - 42 0.005% 566 44 Eosine B 1442 104 100 - 370 0.005% 2001 374 Again, in the absence of a counter-dye, CHEMSCAN ~ detected respectively 322 and 293 particles exhibiting fluorescence after discrimination whereas by fe treatment with the CSE, this figure is reduced to respectively 5 and 12 fluorescent particles, one 98.5% decrease in the first case and 96% decrease in the second case the number of false positives.
In conclusion, it clearly appears that the process of the invention leads to a drastic reduction in false positives obtained by use direct viability markers on a sample likely to contain microorganisms; this decrease going from 80 to 99%.
In addition, this technology has the advantage of not presenting any false negative, in other words the blocking agent does not decrease the number of viable cells counted in a sample.
The counter-dye and more particularly the CSE also has the advantage of being able to be used in a kit since it has properties autoclaving and storage compatible with a distribution commercial.
An advantage and not least of the composition containing the or blocking agents is its wide spectrum of use since the proposed mixture makes it possible to mark both dead cells and non-organic particles. It goes without saying that according to the sample that we wish to test, either of these blocking agents will preferentially used in such a way that it remains in reports desired with the viability markers used in the rest of the process.
Those skilled in the art will know, as needed and depending on the sample he wishes to analyze, choose both its composition of blocking as that of viability markers and the weight ratio between of them.

Finally, the last advantage of the process and the compositions of the invention is that, in a single series of manipulations, they make it possible to exclusively count living cells including forms sporulating, on the one hand, and inert forms, on the other.
The process of the invention is of general application to other couples marking agent blocking agent. A person skilled in the art can always determine the blocking agent having either characteristics cited at the beginning of the text complementary to characteristics of the viability marker.

Claims

1. Method for detecting and enumerating viable cells in a sample comprising a labeling step with one or more viability markers characterized in that it comprises the steps following:
a) bringing the cells into contact with a composition containing blocking agents of viability markers, b) bringing the cells into contact with one or more markers of viability in viability buffer, c) detection and counting of viable cells in the total flora, and in which step a) is prior to or simultaneous with step b).

2. Method according to claim 1 characterized in that the sample is filtered beforehand.

3. Method according to claim 1 or 2 characterized in that step c) is performed by a scanning cytometry device.

4. Method according to claim 1 or 3, characterized in that the ionic strength of the viability buffer is greater than 0.8 M.

5. Method according to one of claims 1 to 4 wherein the cells are further contacted with a swelling medium before or simultaneously with step b).

6. Method according to one of the preceding claims, characterized in that the blocking agents are chosen from the group formed by the halogenated xanthenes or derivatives thereof, and in particular fluorones substituted by at least one halogen atom.

7. Method according to claim 6, characterized in that the agent blocker is chosen from the group formed by erythrosine B, ethyl-eosine, Eosin B, Eosin y, Phloxin B or a mixture thereof.

8. Method according to claim 7, characterized in that the agent blocker is a mixture of erythrosine B and ethyl-eosine in proportions ranging from 10/1 to 1/10.

9. Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the viability markers are selected from the group formed by xanthenes, acridines, fluorones as well as in the aminoazide group.

10. Method according to claim 9, characterized in that the viability marker is selected from the group consisting of FDA, 6-CFDA, 5-CFDA, fluorescein dilaurate, ester of 5 or 6-CFDA, N-hydroxysuccinimide or a mixture thereof.

11. Method according to claim 9 or 10, characterized in that the viability marker is a mixture of FDA and CFDA in proportions between 5/1 and 15/1.

12. Composition of blocking agents capable of preventing the fixation of first fluorescent compounds on inert particles or non-living cells characterized in that it comprises one or a plurality of second fluorescent compounds having a wavelength adsorption of the fluorescence substantially equal to the wavelength emission of the fluorescence of the first viability markers.

13. Composition according to claim 12, characterized in that the second fluorescent agent is selected from the group formed by erythrosine B, ethyl-eosin or a mixture thereof.

14. Composition according to claim 13, characterized in that the blocking agent is CSE consisting of erythrosin B and ethyl-eosin at the respective final concentrations of 0.004% and 0.002%.

15. Use of the method according to one of claims 1 to 11 or of a composition according to one of Claims 12 to 14 upon detection viable cells in a sample, excluding particles and dead cells.

16. Use according to claim 15 characterized in that the cells are viable microorganisms comprising, where appropriate, sporulating forms.

17. Kit or kit allowing the detection and/or enumeration of viable cells in a total duration and comprising at least - one or more agents for blocking parasitic labeling by markers viability;
- one or more viability markers;
- a viability buffer;
- where appropriate, a swelling and/or germination medium.

18. Kit according to claim 17 characterized in that the or the blocking agents are in accordance with one of claims 12 to 14.

19. Kit according to one of claims 17 or 18 characterized in that the viability marker is selected from the group consisting of FDA, du 6-CFDA, 5-CFDA, fluorescein dilaurate, ester of 5 or 6-CFDA, N-hydroxysuccinimide or a mixture thereof.

20. Kit according to one of claims 17 to 19 characterized in that the swelling medium is a mixture of TCS and malt extract.