FR3104170A1 - Use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema. - Google Patents
Use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema. Download PDFInfo
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Abstract
Utilisation d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d’une bactérie appartenant au genre Treponema . La présente invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissance in vitro d’une bactérie appartenant au genre Treponema. Elle concerne également un milieu de culture in vitro comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange d’un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genre Treponema ainsi qu’un procédé de culture in vitro d’une bactérie appartenant au genre Treponema. Figure pour l’abrégé : aucuneUse of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema. The present invention relates to the use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or in admixture for improving the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema. It also relates to an in vitro culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture of a sample comprising a bacterium belonging to the genus Treponema as well as a method for in vitro culture of a bacterium belonging to the genus Treponema. Figure for the abstract: none
Description
La présente invention est relative au domaine de la microbiologie. Plus précisément, la présente invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema. Elle concerne également un milieu de culturein vitrocomprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange d’un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genreTreponemaainsi qu’un procédé de culturein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema.The present invention relates to the field of microbiology. More specifically, the present invention relates to the use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema . It also relates to an in vitro culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture of a sample comprising a bacterium belonging to the genus Treponema as well as a process for the in vitro culture of a bacterium belonging to the genus Treponema .
Les bactéries appartenant au genreTreponemafont partie de la famille desSpirochaetaceae,au sein de l'embranchement desSpirochaetes(1). Ces bactéries sont Gram-négatives et peuvent être micro aérophiles ou strictement anaérobies (2). Les bactéries appartenant au genreTreponemafont partie de la flore normale, et certaines espèces appartenant à ce genre sont des pathogènes tels queTreponema pallidum, l'agent pathogène causal de la syphilis chez l'homme (3). En outre, des études ont montré une association de certaines bactéries appartenant au genreTreponemaavec diverses formes d'infections et de maladies bucco-dentaires humaines (4, 5).Bacteria belonging to the genus Treponema are part of the family Spirochaetaceae, within the phylum Spirochaetes (1). These bacteria are Gram-negative and can be microaerophilic or strictly anaerobic (2). Bacteria belonging to the genus Treponema are part of the normal flora, and some species belonging to this genus are pathogens such as Treponema pallidum , the causative pathogen of syphilis in humans (3). Additionally, studies have shown an association of certain bacteria belonging to the genus Treponema with various forms of human oral infections and diseases (4, 5).
Ces bactéries ont une paroi mince, en forme de spirale et sont très mobiles, ce qui permet de les distinguer facilement des autres bactéries par observation microscopique (6), en revanche ces bactéries sont peu sensibles aux colorants habituellement utilisé pour détecter des bactéries (2). Ainsi, leur détection s'obtient essentiellement par microscopie à fond noir grâce à leur motilité spécifique et à la morphologie cellulaire (7, 8).These bacteria have a thin wall, in the shape of a spiral and are very mobile, which allows them to be easily distinguished from other bacteria by microscopic observation (6), on the other hand these bacteria are not very sensitive to the dyes usually used to detect bacteria (2 ). Thus, their detection is essentially obtained by dark field microscopy thanks to their specific motility and cell morphology (7, 8).
Les bactéries appartenant au genreTreponemasont des organismes fastidieux qui ne sont pas sensibles aux cultures en utilisant des milieux ordinaires (9). Les difficultés à cultiver ces micro-organismes sont liées à leurs besoins nutritionnels complexes, en particulier l’existence d’une divergence des besoins nutritifs pour croître d’une espèce à l’autre et à leur très faible tolérance à l'oxygène (2, 9, 10).Bacteria belonging to the genus Treponema are fastidious organisms that are not susceptible to cultures using ordinary media (9). Difficulties in cultivating these microorganisms are linked to their complex nutritional needs, in particular the existence of a divergence in nutrient needs for growth from one species to another and their very low tolerance to oxygen (2 , 9, 10).
En conséquence, il existe un nombre important de milieux de culturein vitrochacun étant spécifique d’une espèce donnée de tréponèmes. Certains milieux de cultures permettent de cultiver plus d’une espèce de tréponèmes, on peut par exemple faire référence au milieu Omiz-Pat (11), ou au milieu OTEB (12, 13) ou encore au milieu Spirochaetae medium (14). Cependant, ces milieux de culturein vitrone correspondent pas à un milieu de culture dit standard pour l’ensemble des espèces de tréponèmes, dans le sens où ils nécessitent d’être modifiés, adaptés par l’ajout ou le retrait d’un ou plusieurs produits en fonction de la ou des espèces de tréponèmes dont la culturein vitroest recherchée. Par exemple le milieu Omiz-Pat est préparé sans lécithine pour cultiverTreponema lecithinolyticm(15).Consequently, there are a large number of in vitro culture media, each being specific for a given species of treponemes. Certain culture media make it possible to cultivate more than one species of treponemes, one can for example refer to the Omiz-Pat medium (11), or to the OTEB medium (12, 13) or even to the Spirochaetae medium (14). However, these in vitro culture media do not correspond to a so-called standard culture medium for all species of treponemes, in the sense that they need to be modified, adapted by adding or removing one or several products depending on the species or species of treponemes whose in vitro culture is desired. For example, the Omiz-Pat medium is prepared without lecithin to cultivate Treponema lecithinolyticm (15).
De plus, le milieu Omiz-Pat est très difficile à préparer puisqu’il continent plus d’une centaine de produits dont la présence de certains doit être adaptée tel qu’indiqué précédemment.In addition, the Omiz-Pat medium is very difficult to prepare since it contains more than a hundred products, the presence of some of which must be adapted as indicated above.
Enfin, les milieux de culturein vitroexistants à ce jour permettent tout au plus la culture de certaines espèces de Tréponèmes mais ne permettent pas d’en améliorer significativement la croissance de ces bactéries de sorte à faciliter leur isolement et éventuellement leur identification en vue du diagnostic d’une pathologie.Finally, the in vitro culture media existing to date allow at most the culture of certain species of Treponemes but do not allow the growth of these bacteria to be significantly improved so as to facilitate their isolation and possibly their identification for the purpose of diagnosis of a pathology.
Il existe donc un besoin de disposer d’une solution permettant d’améliorer, d’augmenter la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemapour améliorer notamment leur identification etin finela capacité et la précision d’un diagnostic médical. Il existe également un besoin de disposer d’un milieu de culturein vitroqui soit standard, rapide, facile à préparer, peu coûteux, qui soit capable d’assurer la culture de l’ensemble des espèces de bactéries appartenant au genreTreponemaprésentes dans un échantillon, ou du moins de la majorité d’entre elles tout en améliorant leur croissancein vitro.There is therefore a need for a solution making it possible to improve, to increase the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema in order to improve in particular their identification and ultimately the capacity and precision of a medical diagnosis. There is also a need to have an in vitro culture medium which is standard, rapid, easy to prepare, inexpensive, which is capable of ensuring the culture of all the species of bacteria belonging to the genus Treponema present in a sample, or at least the majority of them while improving their growth in vitro .
La vincristine et la vinblastine sont des toxines extraites de la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus). Ce sont des poisons du fuseau mitotique inhibant la polymérisation de la tubuline et bloquant la division cellulaire. Ces toxines sont communément utilisées à des fins médicales, dans un traitement de chimiothérapie pour la lutte contre le cancer. Ces composés ont également été décrits comme antimicrobiens à l’égard de certains microorganismes (16) et comme inefficaces en tant qu’antimicrobiens à l’égard d’autres (17). En revanche, la capacité de ces composés au sein d’un milieu de culture à améliorer la croissance de microorganismes n’a jamais été décrite dans l’art antérieur et notamment pas pour la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema.Vincristine and vinblastine are toxins extracted from Madagascar periwinkle ( Catharanthus roseus ). They are mitotic spindle poisons inhibiting tubulin polymerization and blocking cell division. These toxins are commonly used for medical purposes, in chemotherapy treatment to fight cancer. These compounds have also been described as antimicrobial against some microorganisms (16) and ineffective as antimicrobials against others (17). On the other hand, the capacity of these compounds within a culture medium to improve the growth of microorganisms has never been described in the prior art and in particular not for the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema .
Les inventeurs se sont aperçus que la présence de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange au sein d’un milieu de culturein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemapermettait d’améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema.The inventors noticed that the presence of vinblastine or vincristine alone or as a mixture within an in vitro culture medium of a bacterium belonging to the genus Treponema made it possible to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema .
A cet effet, la présente demande propose l’utilisation d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemaainsi qu’un milieu de culture particulier comprenant la vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange et un procédé de culturein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemaà partir d’un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie.To this end, the present application proposes the use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or in a mixture to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema as well as a culture medium particular comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture and a process for the in vitro culture of a bacterium belonging to the genus Treponema from a sample comprising or likely to comprise said bacterium.
Un premier objet de l’invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema.A first object of the invention relates to the use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture for improving the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema .
Un deuxième objet de l’invention concerne un milieu de culturein vitrod’un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genreTreponema, ledit milieu comprenant outre de l’eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d’infusion cœur-cervelle, et une ou plusieurs vitamines choisies parmi vitamine K1, vitamine B12, biotine, acide folique, acide folinique, nicotinamide, nicotinique, riboflavine, pyrophosphate de thiamine, un ou plusieurs antibiotiques sans activité à l’égard d’une bactérie appartenant au genreTreponemaet de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange.A second object of the invention relates to an in vitro culture medium for a sample comprising a bacterium belonging to the genus Treponema , said medium comprising, in addition to distilled water, the following compounds: 2-methylbutyric acid, valeric acid, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, isobutyric acid, yeast extract, calf serum, isovaleric acid, L-cysteine hydrochloride, proteose peptone, brain-heart infusion broth, and one or more vitamins selected from vitamin K1, vitamin B12 , biotin, folic acid, folinic acid, nicotinamide, nicotinic acid, riboflavin, thiamine pyrophosphate, one or more antibiotics without activity against a bacterium belonging to the genus Treponema and vinblastine or vincristine alone or in a mixture.
Un troisième objet de l’invention concerne un procédé de culturein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemaà partir d’un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie, comprenantsuccessivement:A third object of the invention relates to a process for the in vitro culture of a bacterium belonging to the genus Treponema from a sample comprising or likely to comprise said bacterium, successively comprising:
a) une étape dans laquelle l’échantillon est inoculé dans un milieu de culture selon l’une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C et pendant 4 à 7 jours dans un compartiment supérieur d’un dispositif composé dudit compartiment et d’un compartiment inférieur comprenant ledit milieu de culture stérile, sous forme liquide, lesdits compartiments étant séparés par un micro-filtre de 0,22 µma) a step in which the sample is inoculated in a culture medium according to one of claims 7 to 10, in liquid form, under an anaerobic atmosphere, at a temperature of 37°C and for 4 to 7 days in a upper compartment of a device composed of said compartment and of a lower compartment comprising said sterile culture medium, in liquid form, said compartments being separated by a 0.22 µm micro-filter
b) une étape de récupération et de dilution en cascade du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur du dispositif et comprenant la bactérie appartenant au genreTreponema. b) a cascade recovery and dilution step of the culture medium present in the lower compartment of the device and comprising the bacterium belonging to the genus Treponema.
c) une étape dans laquelle chaque dilution est inoculée dans un milieu de culture selon l’une des revendications 7 à 10 complété par une quantité suffisante d’agar de sorte à être solide et dans laquelle la culture est effectuée sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C, pendant 3 à 5 joursc) a step in which each dilution is inoculated into a culture medium according to one of claims 7 to 10 supplemented with a sufficient quantity of agar so as to be solid and in which the culture is carried out under an anaerobic atmosphere, at a temperature of 37°C, for 3 to 5 days
d) une étape de prélèvement de chaque colonie individuelle développée à l’étape c) puis de transfert de chaque colonie dans un tube contenant le milieu de culture selon l’une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, de sorte à obtenir des cultures pures de bactérie appartenant au genreTreponema, après 5 jours d’incubation sous une atmosphère anaérobie et à une température de 37°Cd) a step of sampling each individual colony developed in step c) then transferring each colony into a tube containing the culture medium according to one of claims 7 to 10, in liquid form, so as to obtain pure cultures of bacteria belonging to the genus Treponema , after 5 days of incubation under an anaerobic atmosphere and at a temperature of 37°C
e) optionnellement une étape d’identification de l’espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice.e) optionally a step of identifying the species present in each of the tubes by matrix-assisted laser desorption-ionization analysis.
Description détailléedetailed description
Ainsi, le premier objet de la présente invention concerne l’utilisation d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange pour améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema.Thus, the first object of the present invention relates to the use of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or as a mixture for improving the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema .
En effet, la Demanderesse s’est aperçue que la présence de la vinblastine ou de la vincristine, connues dans l’art antérieur comme antimitotiques et dans certains cas isolés comme antimicrobiens, à l’égard de certaines bactéries, seule ou en mélange au sein d’un milieu de culture d’une bactérie appartenant au genreTreponemapermettait d’améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema. La présente invention décrit en effet pour la première fois que la présence de ces composés permet en effet d’améliorer la croissance bactérienne, cette amélioration pouvant se traduire par une augmentation de la croissance et/ou une augmentation de la rapidité de croissance de ces bactéries.Indeed, the Applicant has noticed that the presence of vinblastine or vincristine, known in the prior art as antimitotics and in certain isolated cases as antimicrobials, with regard to certain bacteria, alone or in a mixture within of a culture medium of a bacterium belonging to the genus Treponema made it possible to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema . The present invention indeed describes for the first time that the presence of these compounds makes it possible to improve bacterial growth, this improvement being able to result in an increase in the growth and/or an increase in the speed of growth of these bacteria. .
On entend par «améliorer la croissancein vitro», la capacité d’un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange à augmenter la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemaet/ou à augmenter la vitesse de croissancein vitrode ces bactéries, donc à réduire leur temps de croissance.The term “improving in vitro growth” means the capacity of a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or in a mixture to increase the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema and/or to increase the in vitro growth rate of these bacteria, thus reducing their growth time.
La capacité à améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemapeut être évaluée en mesurant la densité cellulaire d’une culture par exemple en mesurant la densité optique par spectrophotomètre et en la comparant à des standards de McFarland. On peut également évaluer la capacité à améliorer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemaenmesurant les CFU (colony-forming unit) par la technique des dilutions en cascade.The ability to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema can be evaluated by measuring the cell density of a culture, for example by measuring the optical density by spectrophotometer and by comparing it with McFarland standards. It is also possible to evaluate the capacity to improve the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema by measuring the CFU (colony-forming unit) by the cascade dilution technique.
Dans le cadre de la présente invention, une augmentation de 1 log de la densité cellulaire en utilisant un milieu de culture comprenant de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange en comparaison à un milieu de culture dépourvu de vinblastine ou de vincristine, est considérée comme une amélioration de la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema.In the context of the present invention, an increase of 1 log in the cell density using a culture medium comprising vinblastine or vincristine alone or in a mixture in comparison with a culture medium lacking vinblastine or vincristine, is considered to enhance the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema .
La vinblastine et la vincristine sont des toxinesextraites de la pervenche de Madagascar (Catharanthus roseus). Elles appartiennent à la classe des alcaloïdes et ont la capacité de bloquer la division cellulaire en inhibant la polymérisation de la tubuline. Ces composés sont utilisés en tant qu’antimitotiques, antinéoplasiques pour traiter différents cancers. Dans le cadre de la présente invention, ces composés peuvent être utilisés sous forme d’extrait pur, ou encore sous forme de sel par exemple sous forme de sel de sulfate à 97% (Sigma Aldrich, France) ou encore sous forme d’une solution injectable (10mg / 10ml). Ces composés peuvent par exemple être obtenus par extraction à l’aide de différents solvants à partir des feuilles, tiges et/ou fleurs de la pervenche de Madagascar, ou par exemple par biosynthèse à partir de la catharanthine et la vindoline présents en quantité élevée dans la pervenche de Madagascar ou encore par synthèse chimique. Des extraits commerciaux de vinblastine ou de vincristine sont disponibles dans le commerce (Sigma Aldrich, France).De préférence dans le cadre de la présente invention la vinblastine et la vincristine sont utilisées sous forme dede sel de sulfate à 97%( Sigma Aldrich, France) ou encore sous forme d’une solution injectable (10mg / 10mL).Vinblastine and vincristine are toxins extracted from Madagascar periwinkle ( Catharanthus roseus ). They belong to the class of alkaloids and have the ability to block cell division by inhibiting the polymerization of tubulin. These compounds are used as antimitotics, antineoplastics to treat various cancers. In the context of the present invention, these compounds can be used in the form of a pure extract, or else in the form of a salt, for example in the form of a 97% sulphate salt (Sigma Aldrich, France) or even in the form of a injectable solution (10mg / 10ml). These compounds can for example be obtained by extraction using different solvents from the leaves, stems and/or flowers of the Madagascar periwinkle, or for example by biosynthesis from catharanthine and vindoline present in high quantities in Madagascar periwinkle or by chemical synthesis. Commercial extracts of vinblastine or vincristine are commercially available (Sigma Aldrich, France). ) or in the form of an injectable solution (10mg / 10mL).
La formule chimique de la vinblastine et de la vincristine sont reproduites ci-dessous.The chemical formula of vinblastine and vincristine are reproduced below.
[Chem. 1] Vincristine[Chem. 1] Vincristine
[Chem. 2] Vinblastine[Chem. 2] Vinblastine
Les Tréponèmes sont un genre de bactéries appartenant à la famille desSpirochaetaceae, elles sont de forme hélicoïdale, très mobiles, leur paroi est Gram négatif, et peuvent être micro aérophiles ou strictement anaérobies. Ces bactéries sont commensales chez l’Homme et l’animal, et vivent sur les muqueuses, dans les mucus, au niveau de la bouche, du tractus intestinal et de l’appareil urogénital. L’introduction de certaines d’entre elles dans l’organisme par des points d’inoculation peut être pathogène comme par exemple leTreponema pallidumqui est l’agent responsable de la syphilis. Tel qu’énoncé ci-dessus ces bactéries sont difficiles à cultiver, étant donné que leurs besoins nutritifs diffèrent d’une espèce à l’autre. Cette difficulté de culture explique pourquoi il existe de nombreuses espèces de Tréponèmes non identifiées à ce jour, car non cultivées efficacement ou du moins en quantité insuffisantes.Treponemas are a genus of bacteria belonging to the Spirochaetaceae family, they are helicoidal in shape, very mobile, their wall is Gram negative, and can be microaerophilic or strictly anaerobic. These bacteria are commensal in humans and animals, and live on the mucous membranes, in the mucus, in the mouth, the intestinal tract and the urogenital system. The introduction of some of them into the body through inoculation points can be pathogenic, for example Treponema pallidum , which is the agent responsible for syphilis. As stated above these bacteria are difficult to cultivate, since their nutrient requirements differ from species to species. This difficulty in cultivation explains why there are many species of Treponemas not identified to date, because they are not cultivated effectively or at least in insufficient quantities.
La présente invention s’applique à l’ensemble des espèces de Tréponèmes. En particulier la présente invention s’applique aux espèces de Tréponèmes suivantes:The present invention applies to all species of Treponemas. In particular, the present invention applies to the following Treponema species:
Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maltophilum, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponema lecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. De façon préférée, la présente invention s’applique aux espèces de Tréponèmes suivantes:Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis, de préférence encoreTreponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maltophilum, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponema lecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectino pevorum, Treponema pevorum, Treponema . Preferably, the present invention applies to the following Treponema species: Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis , more preferably Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis .
En référence aux bactéries appartenant au genreTreponemaprésentes ou susceptibles de l’être dans un échantillon, la présente demande utilise le singulier pour des raisons de clarté bien que la présente invention concerne la culturein vitrode plusieurs bactéries appartenant au genreTreponemaprésentes ou susceptibles de l’être dans un échantillon, notamment clinique.With reference to bacteria belonging to the genus Treponema present or likely to be in a sample, the present application uses the singular for reasons of clarity although the present invention relates to the in vitro culture of several bacteria belonging to the genus Treponema present or likely to be in a sample, in particular clinical.
Dans le cadre de la présente invention, on fait référence par «échantillon» à un échantillon clinique par exemple de la salive, un frottis de la cavité buccale, des selles, des sécrétions vaginales, de la sueur, des larmes, des urines, ou encore des prélèvements bucco-dentaires réalisés sur des patients atteints de parodontite ou de maladies parodontales aussi appelés prélèvements prodontopathiques. De préférence dans le cadre de l’invention l’échantillon clinique estde la salive, ou des prélèvements bucco-dentaires réalisés sur des patients atteints de parodontite ou de maladies parodontales.In the context of the present invention, the term "sample" refers to a clinical sample, for example saliva, a smear from the oral cavity, stool, vaginal secretions, sweat, tears, urine, or Oral samples taken from patients with periodontitis or periodontal diseases, also called prodontopathic samples. Preferably, in the context of the invention, the clinical sample is saliva, or oral samples taken from patients suffering from periodontitis or periodontal diseases.
Pour l’utilisation selon la présente invention, le milieu de culture peut être mis en œuvre sous forme liquide ou solide par exemple par l’ajout d’une quantité suffisante d’agar. De préférence le milieu de culture est mis en œuvre sous forme liquide.For the use according to the present invention, the culture medium can be implemented in liquid or solid form, for example by adding a sufficient quantity of agar. Preferably the culture medium is implemented in liquid form.
En particulier, pour l’utilisation selon l’invention la vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange sont présentes dans le milieu de culture à une concentration d’au moins 20 mg/L.In particular, for the use according to the invention, vinblastine or vincristine alone or as a mixture are present in the culture medium at a concentration of at least 20 mg/L.
De préférence la vinblastine ou la vincristine seules ou en mélange sont présentes dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 20 mg/L et 150 mg/L, de préférence encore à une concentration comprise entre 20 mg/L et 100 mg/L.Preferably vinblastine or vincristine alone or as a mixture are present in the culture medium at a concentration of between 20 mg/L and 150 mg/L, more preferably at a concentration of between 20 mg/L and 100 mg/L .
Selon un premier mode de réalisation la vinblastine ou la vincristine est utilisée seule dans le milieu de culture. Selon un autre mode de réalisation la vinblastine et la vincristine sont utilisées ensemble dans le milieu de culture.According to a first embodiment, vinblastine or vincristine is used alone in the culture medium. According to another embodiment, vinblastine and vincristine are used together in the culture medium.
En particulier pour l’utilisation selon l’invention, le milieu de culture comprend un ou plusieurs antibiotiques, sans activité à l’égard d’une bactérie appartenant au genreTreponema. De préférence ces antibiotiques sont choisis parmi les composés suivants : acide nalidixique, polymyxine B, fosphomycine, rifampicin ou un mélange de ceux-ci.In particular for the use according to the invention, the culture medium comprises one or more antibiotics, without activity with regard to a bacterium belonging to the genus Treponema . Preferably, these antibiotics are chosen from the following compounds: nalidixic acid, polymyxin B, fosphomycin, rifampicin or a mixture thereof.
Le milieu de culture mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend également outre de l’eau distillée, les composés suivants: acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d’infusion cœur-cervelle.The culture medium used in the context of the present invention also comprises, in addition to distilled water, the following compounds: 2-methylbutyric acid, valeric acid, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, isobutyric acid, extract of yeast, calf serum, isovaleric acid, L-cysteine hydrochloride, proteose peptone, brain-heart infusion broth.
Plus particulièrement, le milieu de culture mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend outre de l’eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d’infusion cœur-cervelle, et une ou plusieurs vitamines choisies parmi vitamine K1, vitamine B12, biotine, acide folique, acide folinique, nicotinamide, nicotinique, riboflavine, pyrophosphate de thiamine.More particularly, the culture medium used in the context of the present invention comprises, in addition to distilled water, the following compounds: 2-methylbutyric acid, valeric acid, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, isobutyric acid, yeast extract, calf serum, isovaleric acid, L-cysteine hydrochloride, proteose peptone, brain-heart infusion broth, and one or more vitamins selected from vitamin K1, vitamin B12, biotin, folic acid, folinic acid, nicotinamide, nicotinic, riboflavin, thiamine pyrophosphate.
Plus particulièrement encore, le milieu de culture mis en œuvre dans le cadre de la présente invention comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L:More particularly still, the culture medium used in the context of the present invention comprises the following compounds in the following quantities or volumes for 1 L:
-acide 2-méthylbutyrique: 0.1 ml-2-methylbutyric acid: 0.1 ml
-acide valérique: 0.1 ml- valeric acid: 0.1 ml
-glucose: 0.4g-glucose: 0.4g
-maltose: 0.4g-maltose: 0.4g
-xylose : 0.4g-xylose: 0.4g
-arabinose: 0.4g-arabinose: 0.4g
-mannose: 0.4g-mannose: 0.4g
-acide isobutyrique: 0.1 ml-isobutyric acid: 0.1 ml
-extrait de levure: 5.0 g- yeast extract: 5.0 g
-sérumde veau: 100 mL-calf serum: 100 mL
-acide isovalérique: 0.1 ml-isovaleric acid: 0.1 ml
-L-cystéine chlorhydrate: 0.5 g-L-cysteine hydrochloride: 0.5 g
-peptone: 5.0 g-peptone: 5.0 g
-bouillon d’infusion cœur-cervelle: 5.0 g-brain-heart infusion broth: 5.0 g
-vitamine K1: 1 mg-vitamin K1: 1mg
-vitamine B12: 5 mg-vitamin B12: 5mg
-biotine: 5 mg-biotin: 5 mg
-acide folique: 5 mg-folic acid: 5mg
-acide folinique: 10 mg-folinic acid: 10 mg
-nicotinamide: 5 mg-nicotinamide: 5 mg
-nicotinique: 10 mg-nicotinic: 10 mg
-riboflavine: 1 mg-riboflavin: 1 mg
-pyrophosphate de thiamine: 0.08mg-thiamin pyrophosphate: 0.08mg
-acide nalidixique: 30 mg-nalidixic acid: 30 mg
-polymyxine B: 5mg-polymyxin B: 5mg
-fosphomycine: 100mg-fosphomycin: 100mg
-rifampicin: 2mg-rifampicin: 2mg
-vinblastine et/ou vincristine: 20 mg-vinblastine and/or vincristine: 20 mg
-eau distillée: QSP-distilled water: QSP
Le milieu de culture mis en œuvre dans l’utilisation selon la présente invention peut comprendre en outre les composés suivants: acide casamino, phosphate de potasium, sulfate d’ammonium, chlorure de calcium, chlorure de sodium, bicarbonate de sodium, thioglycolate de sodium, sulfate de magnesium, acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide caproïque, glutathion, acide urique, acide ascorbique, sulfure de sodium, fructose, sucrose, ribose, mannitol, arabinose, fucose, threhalose, rhamnose, amidon soluble, pectine.The culture medium used in the use according to the present invention may also comprise the following compounds: casamino acid, potassium phosphate, ammonium sulphate, calcium chloride, sodium chloride, sodium bicarbonate, sodium thioglycolate , magnesium sulfate, acetic acid, propionic acid, butyric acid, caproic acid, glutathione, uric acid, ascorbic acid, sodium sulfide, fructose, sucrose, ribose, mannitol, arabinose, fucose, threhalose, rhamnose, soluble starch, pectin.
En particulier dans l’utilisation selon la présente invention, l’échantillon est inoculé avec une quantité suffisante du milieu de culture pour assurer la croissancein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponema. Plus précisément, après avoir été inoculé avec ladite quantité de milieu de culture, l’échantillon est incubé sous une atmosphère microaérophile ou anaéorobie, de préférence anaérobie, à une température de 37°C pour assurer la croissance de ladite bactérie. De préférence, l’échantillon est incubé pendant 2 à 7 jours en présence dudit milieu de culture, de préférence encore pendant 3 jours.In particular in the use according to the present invention, the sample is inoculated with a sufficient quantity of the culture medium to ensure the in vitro growth of a bacterium belonging to the genus Treponema . More precisely, after having been inoculated with said quantity of culture medium, the sample is incubated under a microaerophilic or anaerobic atmosphere, preferably anaerobic, at a temperature of 37° C. to ensure the growth of said bacterium. Preferably, the sample is incubated for 2 to 7 days in the presence of said culture medium, more preferably for 3 days.
De préférence la bactérie appartenant au genreTreponemaappartient à une ou plusieurs des espèces de Tréponèmes suivantes:Preferably, the bacterium belonging to the genus Treponema belongs to one or more of the following Treponema species:
Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maltophilum, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponemalecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. De façon préférée, la bactérie appartient à l’une des espèces de Tréponèmes suivantes:Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis, de préférence encoreTreponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maltophilum, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponema malecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectino pevorum, Treponema pevorum . Preferably, the bacterium belongs to one of the following Treponema species: Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis , more preferably Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis .
Un second objet de la présente invention concerne un milieu de culturein vitrod’un échantillon comprenant une bactérie appartenant au genreTreponema, ledit milieu comprenant outre de l’eau distillée, les composés suivants : acide 2-méthylbutyrique, acide valérique, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, acide isobutyrique, extrait de levure, sérum de veau, acide isovalérique, L-cystéine chlorhydrate, protéose peptone, bouillon d’infusion cœur-cervelle, et une ou plusieurs vitamines choisies parmi vitamine K1, vitamine B12, biotine, acide folique, acide folinique, nicotinamide, nicotinique, riboflavine, pyrophosphate de thiamine, un ou plusieurs antibiotiques sans activité à l’égard d’une bactérie appartenant au genreTreponemaet de la vinblastine ou de la vincristine seule ou en mélange.A second object of the present invention relates to an in vitro culture medium for a sample comprising a bacterium belonging to the genus Treponema , said medium comprising, in addition to distilled water, the following compounds: 2-methylbutyric acid, valeric acid, glucose, maltose, xylose, arabinose, mannose, isobutyric acid, yeast extract, calf serum, isovaleric acid, L-cysteine hydrochloride, proteose peptone, brain-heart infusion broth, and one or more vitamins selected from vitamin K1, vitamin B12 , biotin, folic acid, folinic acid, nicotinamide, nicotinic acid, riboflavin, thiamine pyrophosphate, one or more antibiotics without activity against a bacterium belonging to the genus Treponema and vinblastine or vincristine alone or in a mixture.
Le milieu de culture selon l’invention peut être sous forme liquide ou solide par exemple par l’ajout d’une quantité suffisante d’agar. De préférence le milieu de culture selon l’invention est sous forme liquideThe culture medium according to the invention can be in liquid or solid form, for example by adding a sufficient quantity of agar. Preferably the culture medium according to the invention is in liquid form
En particulier dans le milieu de culture selon l’invention, la vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange est présente dans ledit milieu à une concentration d’au moins 20 mg/L. De préférence la vinblastine ou la vincristine seule ou en mélange est présente dans le milieu de culture à une concentration comprise entre 20 mg/L et 150 mg/L, de préférence encore à une concentration comprise entre 20 mg/L et 100 mg/L.In particular in the culture medium according to the invention, vinblastine or vincristine alone or as a mixture is present in said medium at a concentration of at least 20 mg/L. Preferably, vinblastine or vincristine alone or as a mixture is present in the culture medium at a concentration of between 20 mg/L and 150 mg/L, more preferably at a concentration of between 20 mg/L and 100 mg/L .
Les antibiotiques sans activité à l’égard d’une bactérie appartenant au genreTreponemapeuvent par exemple être sont choisis parmi les composés suivants : acide nalidixique, polymyxine B, fosphomycine, rifampicin ou un mélange de ceux-ci.The antibiotics without activity with regard to a bacterium belonging to the genus Treponema can for example be chosen from the following compounds: nalidixic acid, polymyxin B, fosphomycin, rifampicin or a mixture thereof.
Plus particulièrement, le milieu de culturein vitroselon l’invention, comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L:More particularly, the in vitro culture medium according to the invention comprises the following compounds in the following quantities or volumes for 1 L:
-acide 2-méthylbutyrique: 0.1 ml-2-methylbutyric acid: 0.1 ml
-acide valérique: 0.1 ml- valeric acid: 0.1 ml
-glucose: 0.4g-glucose: 0.4g
-maltose: 0.4g-maltose: 0.4g
-xylose : 0.4g-xylose: 0.4g
-arabinose: 0.4g-arabinose: 0.4g
-mannose: 0.4g-mannose: 0.4g
-acide isobutyrique: 0.1 ml-isobutyric acid: 0.1 ml
-extrait de levure: 5.0 g- yeast extract: 5.0 g
-sérumde veau: 100 mL-calf serum: 100 mL
-acide isovalérique: 0.1 ml-isovaleric acid: 0.1 ml
-L-cystéine chlorhydrate: 0.5 g-L-cysteine hydrochloride: 0.5 g
-peptone: 5.0 g-peptone: 5.0 g
-bouillon d’infusion cœur-cervelle: 5.0 g-brain-heart infusion broth: 5.0 g
-vitamine K1: 1 mg-vitamin K1: 1mg
-vitamine B12: 5 mg-vitamin B12: 5mg
-biotine: 5 mg-biotin: 5 mg
-acide folique: 5 mg-folic acid: 5mg
-acide folinique: 10 mg-folinic acid: 10 mg
-nicotinamide: 5 mg-nicotinamide: 5 mg
-nicotinique: 10 mg-nicotinic: 10 mg
-riboflavine: 1 mg-riboflavin: 1 mg
-pyrophosphate de thiamine: 0.08mg-thiamin pyrophosphate: 0.08mg
-acide nalidixique: 30 mg-nalidixic acid: 30 mg
-polymyxine B: 5mg-polymyxin B: 5mg
-fosphomycine: 100mg-fosphomycin: 100mg
-rifampicin: 2mg-rifampicin: 2mg
-vinblastine et/ou vincristine: 20 mg-vinblastine and/or vincristine: 20 mg
-eau distillée: QSP-distilled water: QSP
Plus particulièrement encore, le milieu de culture selon l’invention comprend en outre les composés suivants: acide casamino, phosphate de potasium, sulfate d’ammonium, chlorure de calcium, chlorure de sodium, bicarbonate de sodium, thioglycolate de sodium, sulfate de magnesium, acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide caproïque, glutathion, acide urique, acide ascorbique, sulfure de sodium, fructose, sucrose, ribose, mannitol, arabinose, fucose, threhalose, rhamnose, amidon soluble, pectine.More particularly still, the culture medium according to the invention additionally comprises the following compounds: casamino acid, potassium phosphate, ammonium sulphate, calcium chloride, sodium chloride, sodium bicarbonate, sodium thioglycolate, magnesium sulphate , acetic acid, propionic acid, butyric acid, caproic acid, glutathione, uric acid, ascorbic acid, sodium sulphide, fructose, sucrose, ribose, mannitol, arabinose, fucose, threhalose, rhamnose, soluble starch, pectin.
Un troisième objet de l’invention concerne un procédé de culturein vitrod’une bactérie appartenant au genreTreponemaà partir d’un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie, comprenantsuccessivement:A third object of the invention relates to a process for the in vitro culture of a bacterium belonging to the genus Treponema from a sample comprising or likely to comprise said bacterium, successively comprising:
a) une étape dans laquelle l’échantillon est inoculé dans un milieu de culture selon l’une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C et pendant 4 à 7 jours dans un compartiment supérieur d’un dispositif composé dudit compartiment et d’un compartiment inférieur comprenant ledit milieu de culture stérile, sous forme liquide, lesdits compartiments étant séparés par un micro-filtre de 0,22 µma) a step in which the sample is inoculated in a culture medium according to one of claims 7 to 10, in liquid form, under an anaerobic atmosphere, at a temperature of 37°C and for 4 to 7 days in a upper compartment of a device composed of said compartment and of a lower compartment comprising said sterile culture medium, in liquid form, said compartments being separated by a 0.22 µm micro-filter
b) une étape de récupération et de dilution en cascade du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur du dispositif et comprenant la bactérie appartenant au genreTreponema b) a cascade recovery and dilution step of the culture medium present in the lower compartment of the device and comprising the bacterium belonging to the genus Treponema
c) une étape dans laquelle chaque dilution est inoculée dans un milieu de culture selon l’une des revendications 7 à 10 complété par une quantité suffisante d’agar de sorte à être solide et dans laquelle la culture est effectuée sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C, pendant 3 à 5 joursc) a step in which each dilution is inoculated into a culture medium according to one of claims 7 to 10 supplemented with a sufficient quantity of agar so as to be solid and in which the culture is carried out under an anaerobic atmosphere, at a temperature of 37°C, for 3 to 5 days
d) une étape de prélèvement de chaque colonie individuelle développée à l’étape c) puis de transfert de chaque colonie dans un tube contenant le milieu de culture selon l’une des revendications 7 à 10, sous forme liquide, de sorte à obtenir des cultures pures de bactérie appartenant au genreTreponema, après 5 jours d’incubation sous une atmosphère anaérobie et à une température de 37°Cd) a step of sampling each individual colony developed in step c) then transferring each colony into a tube containing the culture medium according to one of claims 7 to 10, in liquid form, so as to obtain pure cultures of bacteria belonging to the genus Treponema , after 5 days of incubation under an anaerobic atmosphere and at a temperature of 37°C
e) optionnellement une étape d’identification de l’espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice.e) optionally a step of identifying the species present in each of the tubes by matrix-assisted laser desorption-ionization analysis.
Le procédé de culture selon l’invention permet avantageusement d’isoler les bactéries appartenant au genreTreponemaprésentes dans un échantillon donné.The culture method according to the invention advantageously makes it possible to isolate the bacteria belonging to the genus Treponema present in a given sample.
De préférence l’échantillon mis en œuvre dans le cadre du procédé selon la présente invention comprend une ou plusieurs espèces de bactéries appartenant au genreTreponema, de préférence choisies parmi:Preferably, the sample used in the context of the method according to the present invention comprises one or more species of bacteria belonging to the genus Treponema , preferably chosen from:
Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maltophilum, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponemalecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. De façon préférée, la bactérie appartient à l’une des espèces de Tréponèmes suivantes:Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis, de préférence encoreTreponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema socranskii, Treponema vinventii, Treponema maltophilum, Treponema medium, Treponema amylovorum, Treponema malecithinolyticum, Treponema parvum, Treponema putidum, Treponema phagedenis, Treponema minutum, Treponema refringens, Treponema denticula, Treponema pectino pevorum, Treponema pevorum . Preferably, the bacterium belongs to one of the following Treponema species: Treponema pallidum, Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis , more preferably Treponema denticula, Treponema pectinovorum, Treponema pedis .
Par «atmosphère anaérobie» on fait référence à une atmosphère comprenant une proportion molaire d’oxygène strictement inférieure à 1%, de préférence inférieure à 0,1% et de préférence encore de 0%. Cette atmosphère anaérobie peut être obtenue dans des étuves ne comportant pas d’oxygène soit dans des compartiments désoxygénés. Plus précisément, le dispositif mis en œuvre à l’étape a) comprend deux compartiments séparés par un micro-filtre de 0,22 µm, avec i) un compartiment supérieur qui comprend le milieu de culture selon l’invention sous forme liquide inoculé avec un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre une bactérie appartenant au genreTreponemaet ii) un compartiment inférieur qui comprend le milieu de culture selon l’invention stérile, sous forme liquide, et destiné à collecter les bactéries appartenant au genreTreponemainitialement présentes dans le compartiment supérieur, lesdites bactéries ayant rejoint le compartiment inférieur depuis le compartiment supérieur par filtration passive.“Anaerobic atmosphere” refers to an atmosphere comprising a molar proportion of oxygen strictly less than 1%, preferably less than 0.1% and more preferably 0%. This anaerobic atmosphere can be obtained in ovens not containing oxygen or in deoxygenated compartments. More specifically, the device implemented in step a) comprises two compartments separated by a 0.22 μm micro-filter, with i) an upper compartment which comprises the culture medium according to the invention in liquid form inoculated with a sample comprising or likely to comprise a bacterium belonging to the genus Treponema and ii) a lower compartment which comprises the sterile culture medium according to the invention, in liquid form, and intended to collect the bacteria belonging to the genus Treponema initially present in the compartment upper, said bacteria having joined the lower compartment from the upper compartment by passive filtration.
Ce dispositif permet donc d’assurer une culture et un isolement primaire des bactéries appartenant au genreTreponemaprésentes dans le milieu de culture selon l’invention inoculé avec l’échantillon, par filtration passive à travers le filtre de 0,22 µm depuis le compartiment supérieur vers le compartiment inférieur. En effet, le microfiltre présentant des ouvertures de 0,22 µm permet de ne laisser passer essentiellement que les bactéries appartenant au genreTreponema.This device therefore makes it possible to ensure a culture and a primary isolation of the bacteria belonging to the genus Treponema present in the culture medium according to the invention inoculated with the sample, by passive filtration through the 0.22 μm filter from the compartment upper to lower compartment. In fact, the microfilter having openings of 0.22 μm makes it possible to allow essentially only the bacteria belonging to the genus Treponema to pass.
De préférence, la présence de bactéries appartenant au genreTreponemadans le compartiment inférieur est évaluée chaque jour par microscopie électronique et le milieu de culture présent dans le compartiment inférieur est récupéré pour procéder à l’étape b) dès que la présence de bactéries appartenant au genreTreponemaest détectée dans le milieu. Cela permet en effet de limiter la contamination du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur par des bactéries n’appartenant pas au genreTreponema.Preferably, the presence of bacteria belonging to the genus Treponema in the lower compartment is evaluated each day by electron microscopy and the culture medium present in the lower compartment is recovered to proceed to step b) as soon as the presence of bacteria belonging to the genus Treponema is detected in the medium. This in fact makes it possible to limit the contamination of the culture medium present in the lower compartment by bacteria not belonging to the genus Treponema .
De préférence le milieu de culture présent dans le compartiment inférieur est récupéré au bout de 3 à 7 jours d’incubation et de préférence encore au bout de 5 jours d’incubation.Preferably the culture medium present in the lower compartment is recovered after 3 to 7 days of incubation and more preferably after 5 days of incubation.
En particulier, la présence d’une bactérie du genreTreponemapeut être vérifiée par observation au microscope optique ou électronique avant l’étape a) au sein de l’échantillon, et/ou après l’étape a) au sein du milieu de culture présent dans le compartiment inférieur. De préférence cette étape de vérification est effectuée par microscope électronique.In particular, the presence of a bacterium of the genus Treponema can be verified by observation under an optical or electronic microscope before step a) within the sample, and/or after step a) within the culture medium present in the lower compartment. Preferably, this verification step is carried out by electron microscope.
A l’étape c), la quantité suffisante d’agar pour solidifier le milieu de culture est déterminée par la quantité de milieu de culture dilué considéré, par exemple pour 25 mL de milieu de culture dilué considéré on ajoutera de préférence 0.35g/L d’agar.In step c), the sufficient quantity of agar to solidify the culture medium is determined by the quantity of diluted culture medium considered, for example for 25 mL of diluted culture medium considered, 0.35 g/L will preferably be added of agar.
La culture de chaque dilution réalisée à l’étape c) est effectuée pendant 3 à 7 jours, de préférence pendant 5 jours.The culture of each dilution carried out in step c) is carried out for 3 to 7 days, preferably for 5 days.
L’étape optionnelle d’identification de l’espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) permet avantageusement de pouvoir identifier l’espèce de bactérie présente dans l’échantillon testé en vue d’améliorer les bases de données existantes, d’identifier éventuellement une nouvelle espèce, souche, ou encore de pouvoir établir un diagnostic médical.The optional step of identifying the species present in each of the tubes by a matrix-assisted laser desorption-ionization analysis (MALDI-TOF MS) advantageously makes it possible to be able to identify the species of bacteria present in the sample tested in with a view to improving existing databases, possibly identifying a new species, strain, or even being able to establish a medical diagnosis.
Cette étape d’identification peut être effectuée classiquement par technique de MALDI-TOF MS et la comparaison du spectre obtenu, à une base de données comprenant l’ensemble des spectres existants pour une espèce voire une souche donnée.This identification step can be carried out conventionally by the MALDI-TOF MS technique and the comparison of the spectrum obtained with a database comprising all the existing spectra for a given species or even strain.
La présente invention concerne également l’utilisation d’un milieu de culture selon la présente invention pour le transport des bactéries appartenant au genreTreponema.The present invention also relates to the use of a culture medium according to the present invention for the transport of bacteria belonging to the genus Treponema .
L'invention sera davantage illustrée par les exemples suivants. Cependant, ces exemples ne doivent en aucun cas être interprétés comme limitant la portée de l'invention.The invention will be further illustrated by the following examples. However, these examples should in no way be interpreted as limiting the scope of the invention.
EXEMPLESEXAMPLES
Exemple 1: Procédé de cultureExample 1: Cultivation method in vitroin vitro d’une bactérie appartenant au genreof a bacterium belonging to the genus TreponemaTreponema à partir d’un échantillon comprenant ou susceptible de comprendre ladite bactérie selon l’inventionfrom a sample comprising or likely to comprise said bacterium according to the invention
Matériel et méthodesMaterial and methods
1) Echantillons1) Samples
Les échantillons biologiques ont été prélevés dans la cavité buccale de 23 femmes et 21 hommes âgés de 25 à 38 ans. Les donneurs sont des volontaires en bonne santé qui ne présentent pas de symptômes de gingivite et/ou de parodontite. Les échantillons oraux ont été prélevés à l'aide d'une brosse à dents stérile avant le brossage du matin. Après l'échantillonnage, chaque brosse à dents a été placée dans un tube contenant 10 mL de milieu de culture des tréponèmes selon l’invention. Ensuite, les tubes sont fermés et placés dans un sac plastique contenant un générateur anaérobie (Thermo Scientific, Dardilly, France) et les échantillons sont analysés en laboratoire immédiatement après réception.The biological samples were taken from the oral cavity of 23 women and 21 men aged 25 to 38 years. The donors are healthy volunteers who show no symptoms of gingivitis and/or periodontitis. Oral samples were collected using a sterile toothbrush prior to morning brushing. After sampling, each toothbrush was placed in a tube containing 10 mL of treponeme culture medium according to the invention. Then, the tubes are closed and placed in a plastic bag containing an anaerobic generator (Thermo Scientific, Dardilly, France) and the samples are analyzed in the laboratory immediately after receipt.
2) Milieux de culture testés2) Culture media tested
Milieu de culture A (selon l’invention)Culture medium A (according to the invention)
Le milieu de culture A comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L :Culture medium A comprises the following compounds in the following quantities or volumes for 1 L:
-acide 2-méthylbutyrique : 0.1 ml-2-methylbutyric acid: 0.1 ml
-acide valérique : 0.1 ml- valeric acid: 0.1 ml
-glucose : 0.4g-glucose: 0.4g
-maltose : 0.4g-maltose: 0.4g
-xylose : 0.4g-xylose: 0.4g
-arabinose : 0.4g-arabinose: 0.4g
-mannose : 0.4g-mannose: 0.4g
-acide isobutyrique : 0.1 ml-isobutyric acid: 0.1 ml
-extrait de levure : 5.0 g- yeast extract: 5.0 g
-sérum de veau: 100 mL-calf serum: 100 mL
-acide isovalérique : 0.1 ml-isovaleric acid: 0.1 ml
-L-cystéine chlorhydrate : 0.5 g-L-cysteine hydrochloride: 0.5 g
-peptone : 5.0 g- peptone: 5.0 g
-bouillon d’infusion cœur-cervelle : 5.0 g-brain-heart infusion broth: 5.0 g
-vitamine K1 : 1 mg-vitamin K1: 1mg
-vitamine B12 : 5 mg-vitamin B12: 5mg
-biotine : 5 mg-biotin: 5 mg
-acide folique : 5 mg- folic acid: 5 mg
-acide folinique : 10 mg-folinic acid: 10 mg
-nicotinamide : 5 mg-nicotinamide: 5 mg
-nicotinique : 10 mg-nicotinic: 10 mg
-riboflavine : 1 mg-riboflavin: 1 mg
-pyrophosphate de thiamine : 0.08mg-thiamine pyrophosphate: 0.08mg
-acide nalidixique : 30 mg-nalidixic acid: 30 mg
-polymyxine B : 5mg-polymyxin B: 5mg
-fosphomycine : 100mg-fosphomycin: 100mg
-rifampicin : 2mg-rifampicin: 2mg
-vinblastine et/ou vincristine : 20 mg-vinblastine and/or vincristine: 20 mg
-eau distillée : QSP- distilled water: QSP
Milieu de culture BCulture medium B
Le milieu de culture B comprend les composés suivants dans les quantités ou volumes suivants pour 1 L :Culture medium B comprises the following compounds in the following quantities or volumes for 1 L:
-acide 2-méthylbutyrique : 0.1 ml-2-methylbutyric acid: 0.1 ml
-acide valérique : 0.1 ml- valeric acid: 0.1 ml
-glucose : 0.4g-glucose: 0.4g
-maltose : 0.4g-maltose: 0.4g
-xylose : 0.4g-xylose: 0.4g
-arabinose : 0.4g-arabinose: 0.4g
-mannose : 0.4g-mannose: 0.4g
-acide isobutyrique : 0.1 ml-isobutyric acid: 0.1 ml
-extrait de levure : 5.0 g- yeast extract: 5.0 g
-sérum de veau: 100 mL-calf serum: 100 mL
-acide isovalérique : 0.1 ml-isovaleric acid: 0.1 ml
-L-cystéine chlorhydrate : 0.5 g-L-cysteine hydrochloride: 0.5 g
-peptone : 5.0 g- peptone: 5.0 g
-bouillon d’infusion cœur-cervelle : 5.0 g-brain-heart infusion broth: 5.0 g
-vitamine K1 : 1 mg-vitamin K1: 1mg
-vitamine B12 : 5 mg-vitamin B12: 5mg
-biotine : 5 mg-biotin: 5 mg
-acide folique : 5 mg- folic acid: 5 mg
-acide folinique : 10 mg-folinic acid: 10 mg
-nicotinamide : 5 mg-nicotinamide: 5 mg
-nicotinique : 10 mg-nicotinic: 10 mg
-riboflavine : 1 mg-riboflavin: 1 mg
-pyrophosphate de thiamine : 0.08mg-thiamine pyrophosphate: 0.08mg
-acide nalidixique : 30 mg-nalidixic acid: 30 mg
-polymyxine B : 5mg-polymyxin B: 5mg
-fosphomycine : 100mg-fosphomycin: 100mg
-rifampicin : 2mg-rifampicin: 2mg
-eau distillée : QSP- distilled water: QSP
3) Préparation d'échantillons pour la microscopie électronique3) Preparation of samples for electron microscopy
Les frottis ont été réalisés sur des lames de microscopie directement à partir de chaque échantillon oral. Une goutte de solution fixatrice de glutaraldéhyde à 2,5 % a été ajoutée et l'observation a été réalisée sans coloration supplémentaire.Smears were made on microscopy slides directly from each oral sample. One drop of 2.5% glutaraldehyde fixative solution was added and observation was performed without additional staining.
Les images ont été prises directement par la suite, et 1% d'acide phosphotungstique (PTA) dans une solution aqueuse à (pH 2) pendant 2 minutes a parfois été ajouté, la lame a été délicatement lavée à l'eau, séchée à l'air et examinée au microscope électronique à balayage (SEM) sur ordinateur portable. Cette procédure a été réalisée afin d'augmenter le contraste des images SEM en cas de besoin.Images were taken directly afterwards, and 1% phosphotungstic acid (PTA) in an aqueous solution at (pH 2) for 2 minutes was sometimes added, the slide was gently washed with water, dried at air and examined under a scanning electron microscope (SEM) on a laptop computer. This procedure was performed in order to increase the contrast of SEM images when needed.
4) Détection directe par microscopie électronique à balayage (MEB)4) Direct detection by scanning electron microscopy (SEM)
Chaque échantillon oral est traité directement sous le microscope électronique pour détecter la présence deTreponema sp. Après la détection et l'optimisation de la culture, lesTreponema sp.en culture ont également été imagées par le même procédé afin de valider la croissance. L'échantillonnage et l'observation au microscope ont été effectués comme suit.Each oral sample is processed directly under the electron microscope to detect the presence of Treponema sp . After detection and culture optimization, Treponema sp. in culture were also imaged by the same method to validate growth. Sampling and microscopic observation were carried out as follows.
5) Observation et acquisition d'images5) Observation and image acquisition
Un microscope électronique à balayage (MEB) de table (Hitachi TM4000) mesurant environ 60 centimètres de haut sur 33 cm de large a été utilisé pour évaluer les structures bactériennes. Ce microscope électronique à balayage a la capacité d'observer des échantillons à basse pression sous vide (100 Pa à 101 Pa) pour réduire la charge sur la surface de l'échantillon par les électrons irradiés. Le temps d'évacuation après le chargement de l'échantillon dans la chambre du MEB est d'environ quelques minutes, ce qui est beaucoup plus rapide que les MEB conventionnels avec une condition de vide élevé, installés directement dans le plancher, car la chambre du MEB sur table est plus petite que celle du type conventionnel. Les conditions d'observation optimisées de la tension d'accélération et du courant du faisceau d'électrons permettent de faire fonctionner facilement et rapidement le MEB de sorte qu'il ne faut que quelques minutes pour trouver et observer les régions d'intérêt, tandis que les MEB conventionnels à haute performance nécessitent des ajustements fins mais complexes de mise au point et de stigmatisation selon les microscopes. Les images SEM ont été obtenues avec un grossissement de 1000 à 10 000 fois. Des électrons rétrodiffusés (ESB) provenant de la surface de l'échantillon ont été détectés par un détecteur ESB à la tension d'accélération de 15 kV. Le vide autour de l'échantillon est d'environ 30 Pa.A tabletop scanning electron microscope (SEM) (Hitachi TM4000) measuring approximately 60 centimeters high by 33 cm wide was used to assess bacterial structures. This scanning electron microscope has the ability to observe samples at low pressure under vacuum (100 Pa to 101 Pa) to reduce the charge on the sample surface by irradiated electrons. The evacuation time after loading the sample into the SEM chamber is about a few minutes, which is much faster than conventional SEMs with a high vacuum condition, installed directly in the floor, because the chamber tabletop SEM is smaller than that of the conventional type. The optimized observation conditions of accelerating voltage and electron beam current make it easy and fast to operate the SEM so that it only takes a few minutes to find and observe regions of interest, while that conventional high-performance SEMs require fine but complex adjustments of focus and stigma depending on microscopes. SEM images were obtained with 1000 to 10,000 times magnification. Backscattered electrons (BSE) from the sample surface were detected by a BSE detector at the accelerating voltage of 15 kV. The vacuum around the sample is about 30 Pa.
6) Etape de culture et d'isolement primaire par filtration passive6) Stage of culture and primary isolation by passive filtration
L'isolement et l'enrichissement en milieu liquide ont été réalisés en anaérobiose dans une chambre anaérobie (Don Whitley Scientific Limited, West Yorkshire, Royaume-Uni) sous une atmosphère composée de 80% N2, 15% CO2 et 5% H2. La culture des tréponèmes a été réalisée à l'aide d'un dispositif de culture composé de deux compartiments séparés par un micro-filtre 0.22μm (Dominique DUTSCHER, Brumath, France). Cette technique de culture est basée sur un principe de filtration passive permettant aux microorganismes mobiles ayant une taille inférieure à 0,22μm de passer à travers la paroi de filtre.Isolation and enrichment in liquid medium were performed anaerobically in an anaerobic chamber (Don Whitley Scientific Limited, West Yorkshire, UK) under an atmosphere composed of 80% N2, 15% CO2 and 5% H2. The culture of the treponemes was carried out using a culture device composed of two compartments separated by a 0.22 μm micro-filter (Dominique DUTSCHER, Brumath, France). This culture technique is based on a principle of passive filtration allowing mobile microorganisms with a size of less than 0.22μm to pass through the filter wall.
La culture est réalisée comme suit; dans des conditions stériles, le compartiment inférieur du dispositif de filtration est entièrement rempli avec le milieu de culture liquide stérile préalablement préparé et le compartiment supérieur avec 100 mL du même milieu de culture. L’unité préparée précédemment est transférée dans une enceinte anaérobie permettant de dégazer le milieu 1h avant l’inoculation. Ensuite chaque échantillon est homogénéisé sur un mélangeur vortex pendant 10 secondes, le milieu de culture du compartiment supérieur de chaque unité de filtration est inoculé avec 200μL d'échantillon. Les unités de filtration inoculées sont incubées dans la chambre anaérobie à 37°C pendant 4 à 7 jours.Cultivation is carried out as follows; under sterile conditions, the lower compartment of the filtration device is completely filled with the previously prepared sterile liquid culture medium and the upper compartment with 100 mL of the same culture medium. The previously prepared unit is transferred to an anaerobic enclosure allowing the medium to be degassed 1 hour before inoculation. Then each sample is homogenized on a vortex mixer for 10 seconds, the culture medium in the upper compartment of each filtration unit is inoculated with 200 μL of sample. The inoculated filtration units are incubated in the anaerobic chamber at 37°C for 4 to 7 days.
7) Détermination du temps d’incubation optimal de la culture liquide par filtration passive7) Determination of the optimal incubation time of the liquid culture by passive filtration
Dans l’objectif de recueillir une culture de tréponèmes fraiche en pleine phase de croissance, et de limiter les contaminations liées à la dégradation du filtre avec la chaleur et le temps d’incubation allongé ou à l’ouverture quotidienne de l’unité de culture pour récupérer une quantité de milieu du compartiment inférieur, le temps d’incubation optimal a été déterminé.With the aim of collecting a culture of fresh treponemes in full growth phase, and to limit contamination related to the degradation of the filter with heat and the extended incubation time or the daily opening of the culture unit to recover a quantity of medium from the lower compartment, the optimal incubation time was determined.
Pour le même spécimen la culture a été réalisée sur six unités de filtration en même temps avec un dispositif comprenant un compartiment supérieur et un compartiment inférieur séparés par un filtre de 0,22 µm. Par la suite, une unité de culture est fermée toutes les 24h pour vérifier la présence et le passage des tréponèmes par microscopie électronique SEM (Hitachi TM4000) comme indiqué précédemment. Cette expérience est réalisée en triplicata sur un prélèvement de la cavité buccale positif au tréponème et préalablement cultivé et sur une détermination de temps d’incubation de la culture liquide par filtration passive.For the same specimen, the culture was carried out on six filtration units at the same time with a device comprising an upper compartment and a lower compartment separated by a 0.22 μm filter. Subsequently, a culture unit is closed every 24 hours to verify the presence and passage of treponemes by SEM electron microscopy (Hitachi TM4000) as indicated above. This experiment is carried out in triplicate on a sample from the oral cavity positive for treponema and previously cultured and on a determination of the incubation time of the liquid culture by passive filtration.
8) Etape de récupération, de dilution, de culture solide et d’isolement secondaire8) Recovery, dilution, solid culture and secondary isolation step
Après l'isolement primaire des tréponèmes dans le milieu de culture liquide, une culture en gélose a été réalisée en utilisant le même composition de milieu liquide préparé dans 800 ml de volume final filtré à 0.2µm, et complété par 7 g/L d’agar(Fisher Scientific, Illkirch, France), préparé dans 200ml d’eau stérile.After the primary isolation of the treponemes in the liquid culture medium, an agar culture was carried out using the same composition of liquid medium prepared in 800 ml of final volume filtered at 0.2 μm, and supplemented with 7 g/L of agar (Fisher Scientific, Illkirch, France), prepared in 200ml of sterile water.
Apres obtention d’une culture liquide positive aux bactéries appartenant au genreTreponemadans le compartiment inférieur du dispositif mis en œuvre précédemment, confirmée par microscopie électronique SEM (Hitachi TM4000), des dilutions en cascade allant jusqu'à 10E-10 pour chaque culture liquide positive ont été réalisées dans des conditions stériles. Par la suite la totalité de chaque dilution (900µL) est inoculée dans un tube contenant 25 mL de milieu de culture supplémenté par 0.35g d’agar, préalablement préparé et maintenu à 56°C. Le mélange a été délicatement homogénéisé manuellement et versé directement dans des boîtes de Petri. Après solidification, les boîtes de pétri inoculées ont été incubées dans la chambre anaérobie à 37 °C. Ensuite, après un temps d’incubation allant de 4-7 jours des colonies individuelles ont été prélevées dans la gélose à l'aide d'une pipette pasteur stérile (Biosegama, Brumath, France) et transférées dans des tubes Hungate contenant un milieu liquide afin d'obtenir des cultures pures de de bactéries appartenant au genreTreponemaaprès une incubation à 37 °C.After obtaining a liquid culture positive for bacteria belonging to the genus Treponema in the lower compartment of the device implemented previously, confirmed by electron microscopy SEM (Hitachi TM4000), cascade dilutions of up to 10E-10 for each liquid culture positive were performed under sterile conditions. Subsequently all of each dilution (900 μL) is inoculated into a tube containing 25 mL of culture medium supplemented with 0.35 g of agar, previously prepared and maintained at 56°C. The mixture was gently homogenized manually and poured directly into Petri dishes. After solidification, the inoculated petri dishes were incubated in the anaerobic chamber at 37°C. Then, after an incubation time ranging from 4-7 days, individual colonies were picked from the agar using a sterile pasteur pipette (Biosegama, Brumath, France) and transferred to Hungate tubes containing liquid medium. in order to obtain pure cultures of bacteria belonging to the genus Treponema after incubation at 37°C.
9) Analyse MALDI-TOF MS9) MALDI-TOF MS analysis
Pour une identification directe depuis le milieu de culture, 2mL de milieu de culture liquide a été centrifugé à 13000 rpm pendant 5 minutes. Le surnageant a été écarté et le culot comprenant les bactéries a été récupéré. Douze points ont ensuite été faits pour chaque culot bactérien et recouverts de 1µL de solution de matrice, avant d’être analysé par désorption-ionisation laser assistée par matrice (MALDITOF MS). Après analyse du profil protéique de chaque isolat deTreponema, les spectres générés par MALDI-TOF MS sans identification initiale ont été récupérés pour contrôler leur qualité. Ensuite, après validation des spectres par le logiciel Bruker, le logiciel MALDI Biotyper 3.0 a été utilisé pour construire des dendrogrammes permettant la comparaison des différents isolats. Puis, un isolat de chaque échantillon a été retenu pour le séquençage de son génome. Grâce à cette procédure, seuls cinq isolats différents par analyse MALDI ont vu leur génome séquencé et analysé pour établir une identification basée sur la comparaison de chaque blast obtenu à partir de chaque séquence du gène ARNr 16s avec ceux présents sur la base de données NCBI.For direct identification from the culture medium, 2mL of liquid culture medium was centrifuged at 13,000 rpm for 5 minutes. The supernatant was discarded and the pellet comprising the bacteria was recovered. Twelve dots were then made for each bacterial pellet and covered with 1 μL of matrix solution, before being analyzed by matrix-assisted laser desorption-ionization (MALDITOF MS). After analysis of the protein profile of each Treponema isolate, the spectra generated by MALDI-TOF MS without initial identification were retrieved to control their quality. Then, after validation of the spectra by the Bruker software, the MALDI Biotyper 3.0 software was used to construct dendrograms allowing the comparison of the different isolates. Then, one isolate from each sample was selected for genome sequencing. Thanks to this procedure, only five different isolates by MALDI analysis had their genome sequenced and analyzed to establish an identification based on the comparison of each blast obtained from each sequence of the 16s rRNA gene with those present on the NCBI database.
Après l'identification de l'ARNr 16S, les spectres ont été ajoutés à notre base de données MALDI-TOF MS.After identification of the 16S rRNA, the spectra were added to our MALDI-TOF MS database.
RésultatsResults
1) Détection, observation et acquisition d’image par microscopie électronique1) Detection, observation and image acquisition by electron microscopy
L’utilisation du microscope électronique a permis d’observer la présence de bactérie présentant la morphologie typique des bactéries appartenant au genreTreponemadans 14 échantillons sur 44. La taille des bactéries a été déterminée à l’aide du logiciel TM4000 et les bactéries identifiées présentaient une longueur moyenne de 9,15 µm et une largeur variant entre 383.7 +/-60 nm.The use of the electron microscope made it possible to observe the presence of bacteria presenting the typical morphology of bacteria belonging to the genus Treponema in 14 out of 44 samples. The size of the bacteria was determined using the TM4000 software and the bacteria identified presented an average length of 9.15 µm and a width varying between 383.7 +/-60 nm.
2) Détermination du temps d’incubation optimal de la culture liquide par filtration passive2) Determination of the optimal incubation time of the liquid culture by passive filtration
La filtration a été interrompue le plus tôt possible après le premier passage des bactéries appartenant au genreTreponemaet avant l'apparition d’une turbidité.Filtration was stopped as soon as possible after the first passage of bacteria belonging to the genus Treponema and before the appearance of turbidity.
[Table 1] Observation des bactéries appartenant au genreTreponemaau sein du compartiment inférieur du dispositif, au fil des jours d’incubation[Table 1] Observation of bacteria belonging to the genus Treponema within the lower compartment of the device, over the days of incubation
[Table 2] Observation des bactéries appartenant à l’espèceTreponema denticolaau sein du compartiment inférieur du dispositif, au fil des jours d’incubation[Table 2] Observation of bacteria belonging to the species Treponema denticola within the lower compartment of the device, over the days of incubation
La période d'incubation optimale a été estimée à la 4ème journée d'incubation. Cette période d'incubation a donné les meilleures cultures fraîches de bactéries appartenant au genreTreponemaet non contaminées.The optimal incubation period was estimated at the 4th day of incubation. This incubation period gave the best fresh cultures of bacteria belonging to the genus Treponema and uncontaminated.
3) Culture solide et isolement secondaire3) Solid culture and secondary isolation
Après l'isolement primaire des tréponèmes dans le milieu de culture liquide au sein du compartiment inférieur du dispositif, la technique d’inoculation sur un milieu de culture solide comprenant 7g/L d’agar a permis d’observer la présence de colonies sur l’ensemble des 14 échantillons, c’est-à-dire 100% des cultures liquides positives.After the primary isolation of the treponemes in the liquid culture medium within the lower compartment of the device, the technique of inoculation on a solid culture medium comprising 7g/L of agar made it possible to observe the presence of colonies on the all 14 samples, i.e. 100% of the positive liquid cultures.
4) Analyse MALDI-TOF MS4) MALDI-TOF MS analysis
Après l’identification par ARN 16S, la base de données a été complétée avec 10 spectres correspondant à des bactéries appartenant à l’espèceT.pectinovorum, 5 spectres correspondant à des bactéries appartenant à l’espèceT.denticola, et d’autres spectres correspondant à des bactéries appartenant à l’espèceT. brennaborense, T. maltophilum, T.parvum, T.pedis, T.zuelzerae, T. succinifaciens, T.stenostreptum, T. saccharophilum, T.ruminis, T.rectale, T.caldarium et T.bryantii. After identification by 16S RNA, the database was completed with 10 spectra corresponding to bacteria belonging to the species T.pectinovorum , 5 spectra corresponding to bacteria belonging to the species T.denticola , and others spectra corresponding to bacteria belonging to the species T. brennaborense, T. maltophilum, T. parvum, T. pedis, T. zuelzerae, T. succinifaciens, T. stenostreptum, T. saccharophilum, T. ruminis, T. rectale, T.caldarium and T.bryantii.
Conclusion:Les deux milieux de culture testés ont permis d’assurer la croissance des bactéries appartenant au genreTreponema. Conclusion: The two culture media tested ensured the growth of bacteria belonging to the genus Treponema .
Exemple 2: Evaluation de la croissance d’une bactérie appartenant au genreExample 2: Evaluation of the growth of a bacterium belonging to the genus TreponemaTreponema en présence de différentes concentrations de vinblastine et/ou vincristine dans le milieu de culture (milieu A) ou en absence de vinblastine et/ou vincristine dans le milieu de culture (milieu B).in the presence of different concentrations of vinblastine and/or vincristine in the culture medium (medium A) or in the absence of vinblastine and/or vincristine in the culture medium (medium B).
Les milieux de culture testés sont similaires à ceux mis en œuvre dans l’exemple 1, mis à part que dans le milieu A testé dans le présent exemple, différentes concentrations de vinblastine ou vincristine ont été testées (20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L). Le milieu B est identique à celui mis en œuvre dans l’exemple 1, il est dépourvu de vinblastine et vincristine.The culture media tested are similar to those used in example 1, except that in medium A tested in the present example, different concentrations of vinblastine or vincristine were tested (20 mg/L, 30 mg/ L, 50mg/L, 100mg/L, 150mg/L). Medium B is identical to that used in example 1, it is devoid of vinblastine and vincristine.
A) Des tubes contenant une culture pure de bactéries appartenant à l’espèceT.denticolaont été considérés pour étudier la croissance bactérienne en présence du milieu A avec différentes concentrations de vinblastine ou vincristine (20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L) ou en présence du milieu B après une incubation à 37 °C.A) Tubes containing a pure culture of bacteria belonging to the T.denticola species were considered to study bacterial growth in the presence of medium A with different concentrations of vinblastine or vincristine (20 mg/L, 30 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L, 150 mg/L) or in the presence of medium B after incubation at 37°C.
Après incubation de trois jours en anaérobiose et à 37°C, l’évaluation de la croissance a été réalisée en mesurant la densité optique par spectrophotomètre et en la comparant à des standards de McFarland.After incubation for three days in anaerobiosis and at 37°C, growth was assessed by measuring the optical density by spectrophotometer and comparing it to McFarland standards.
Les deux types de milieux testés à savoir le milieu A avec les différentes concentrations de vinblastine ou vincristine testées et le milieu B ne comprenant pas lesdits composés, ont permis d’assurer la croissance de la bactérie appartenant à l’espèceT.denticola.The two types of media tested, namely medium A with the different concentrations of vinblastine or vincristine tested and medium B not comprising said compounds, made it possible to ensure the growth of the bacterium belonging to the species T. denticola .
Il a été observé, l’apparition d’un trouble plus important en présence du milieu A en comparaison avec le milieu B n’en comprenant pas.It was observed, the appearance of a greater disorder in the presence of medium A in comparison with medium B not including it.
La mesure de la densité cellulaire a permis de montrer qu’il n’y a pas de différence significative de la densité bactérienne observée pour le milieu A aux différentes concentrations de vinblastine ou de vincristine, par contre une différence significative a été observée entre le milieu A et le milieu B.The measurement of the cell density made it possible to show that there is no significant difference in the bacterial density observed for medium A at the different concentrations of vinblastine or vincristine, on the other hand a significant difference was observed between the medium A and medium B.
En effet, le milieu A pour chacune des concentrations de vinblastine ou de vincristine testée a permis d’assurer une croissance plus importante de la bactérie appartenant à l’espèceT.denticolaen comparaison au milieu de culture B.Indeed, medium A for each of the concentrations of vinblastine or vincristine tested made it possible to ensure greater growth of the bacterium belonging to the species T. denticola in comparison to culture medium B.
On note en particulier une augmentation de la croissance d’1 log avec le milieu A de vinblastine ou vincristine en comparaison avec le milieu B, après 3 jours d’incubation.In particular, a 1-log increase in growth is noted with medium A of vinblastine or vincristine compared with medium B, after 3 days of incubation.
[Table 3] Différences de croissance d’une bactérie appartenant à l’espèceT.denticolaavec le milieu A ou le milieu B[Table 3] Growth differences of a bacterium belonging to the species T.denticola with medium A or medium B
B) Cette même étude a été réalisée à partir de tube contenant une culture pure de bactéries appartenant à l’espèceT.denticola, ouT.pectinovorumouT.pedispour étudier la croissance bactérienne en présence du milieu A comprenant 20 mg/L de vinblastine ou de vincristine et en présence du milieu B après une incubation à 37 °C en anaérobiose après 3 jours d’incubation.B) This same study was carried out using a tube containing a pure culture of bacteria belonging to the species T.denticola , or T.pectinovorum or T.pedis to study bacterial growth in the presence of medium A comprising 20 mg/L vinblastine or vincristine and in the presence of medium B after incubation at 37° C. in anaerobiosis after 3 days of incubation.
[Table 4] Différences de croissance d’une bactérie appartenant à l’espèceT.denticola,T. pectinovorum, T.pedisavec le milieu A comprenant 20 mg/L de vinblastine ou de vincristine ou le milieu B. [Table 4] Growth differences of a bacterium belonging to the species T.denticola , T. pectinovorum, T.pedis with medium A comprising 20 mg/L of vinblastine or vincristine or medium B.
Le milieu de croissance selon l’invention comprenant 20mg/L de vincristine ou de vinblastine permet avantageusement d’augmenter de façon significative la croissance bactérienne des bactéries appartenant aux espèces suivantesT.denticola,T. pectinovorum, T.pedisen comparaison avec le milieu B dépourvu de vinblastine ou de vincristine.The growth medium according to the invention comprising 20mg/L of vincristine or vinblastine advantageously makes it possible to significantly increase the bacterial growth of bacteria belonging to the following species T.denticola , T. pectinovorum, T.pedis in comparison with the medium B devoid of vinblastine or vincristine.
C) Afin de déterminer la concentration minimale d’inhibition (CMI) de vinblastine ou de vincristine différentes concentrations au sein du milieu A ont été testées (20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 et 500 µg/mL) sur trois espèces de tréponemes:Treponema denticola, Treponema pectinovorum, Treponema pedis.La croissance est vérifiée par microscope électronique (Hitachi TM4000).C) In order to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) of vinblastine or vincristine different concentrations within medium A were tested (20, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450 and 500 µg/mL) on three species of treponemes: Treponema denticola, Treponema pectinovorum, Treponema pedis. Growth is checked by electron microscope (Hitachi TM4000).
Les résultats obtenus montrent que la croissance des bactéries n’est pas inhibée sur toutes les concentrations testées et cela pour les trois espèces.The results obtained show that the growth of bacteria is not inhibited on all the concentrations tested and this for the three species.
Le milieu de culture selon l’invention permet donc avantageusement d’assurer une croissance améliorée des bactéries appartenant au genreTreponemaet ce, sans effet inhibiteur de la croissance en présence d’une concentration élevée de vinblastine ou de vincristine.The culture medium according to the invention therefore advantageously makes it possible to ensure improved growth of bacteria belonging to the genus Treponema and this, without an inhibiting effect on growth in the presence of a high concentration of vinblastine or vincristine.
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11. Wyss C, Choi BK, Schüpbach P, Guggenheim B, Göbel UB. 1996. Treponema maltophilum sp. nov., a small oral spirochete isolated from human periodontal lesions. Int J Syst Bacteriol 46:745–752.11. Wyss C, Choi BK, Schüpbach P, Guggenheim B, Göbel UB. 1996. Treponema maltophilum sp. nov., a small oral spirochete isolated from human periodontal lesions. Int J Syst Bacteriol 46:745–752.
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13. Hungate RE. 1969. Chapter IV A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes, p. 117–132. In Norris, JR, Ribbons, DW (eds.), Methods in Microbiology. Academic Press.13.Hungate RE. 1969. Chapter IV A Roll Tube Method for Cultivation of Strict Anaerobes, p. 117–132. In Norris, JR, Ribbons, DW (eds.), Methods in Microbiology. AcademicPress.
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15. Wyss, C., B. K. Choi, P. Schüpbach, A. Moter, B. Guggenheim, et U. B. Göbel. 1999. Treponema Lecithinolyticum Sp. Nov., a Small Saccharolytic Spirochaete with Phospholipase A and C Activities Associated with Periodontal Diseases. International Journal of Systematic Bacteriology 49 Pt 44132939.15. Wyss, C., B.K. Choi, P. Schüpbach, A. Moter, B. Guggenheim, and U.B. Göbel. 1999. Treponema Lecithinolyticum Sp. Nov., a Small Saccharolytic Spirochaete with Phospholipase A and C Activities Associated with Periodontal Diseases. International Journal of Systematic Bacteriology 49 Pt 44132939.
16. Shanmugaraju V, Bhakyaraj R. 2016. Antimicrobial potential activity of leaf extracts of Catharanthus roseus against human pathogens under laboratory conditions. 17.16. Shanmugaraju V, Bhakyaraj R. 2016. Antimicrobial potential activity of leaf extracts of Catharanthus roseus against human pathogens under laboratory conditions. 17.
17. Safhi MM, Ali M, Sivakumar SM, Jabeen A. 2013. Antibacterial studies of Catharanthus roseus of Jazan province against the selected bacterial strains 4.17. Safhi MM, Ali M, Sivakumar SM, Jabeen A. 2013. Antibacterial studies of Catharanthus roseus of Jazan province against the selected bacterial strains 4.
Claims (11)
- acide 2-méthylbutyrique: 0.1 ml
- acide valérique: 0.1 ml
- glucose: 0.4g
- maltose: 0.4g
- xylose : 0.4g
- arabinose: 0.4g
- mannose: 0.4g
- acide isobutyrique: 0.1 ml
- extrait de levure: 5.0 g
- sérumde veau: 100 mL
- acide isovalérique: 0.1 ml
- L-cystéine chlorhydrate: 0.5 g
- peptone: 5.0 g
- bouillon d’infusion cœur-cervelle: 5.0 g
- vitamine K1: 1 mg
- vitamine B12: 5 mg
- biotine: 5 mg
- acide folique: 5 mg
- acide folinique: 10 mg
- nicotinamide: 5 mg
- nicotinique: 10 mg
- riboflavine: 1 mg
- pyrophosphate de thiamine: 0.08mg
- acide nalidixique: 30 mg
- polymyxine B: 5mg
- fosphomycine: 100mg
- rifampicin: 2mg
- vinblastine et/ou vincristine: 20 mg
- eau distillée: QSPUse according to one of the preceding claims, in which the culture medium comprises the following compounds in the following quantities or volumes per 1 L:
- 2-methylbutyric acid: 0.1 ml
- valeric acid: 0.1 ml
- glucose: 0.4g
- maltose: 0.4g
- xylose: 0.4g
- arabinose: 0.4g
- mannose: 0.4g
- isobutyric acid: 0.1 ml
- yeast extract: 5.0 g
- calf serum: 100 mL
- isovaleric acid: 0.1 ml
- L-cysteine hydrochloride: 0.5 g
- peptone: 5.0 g
- brain-heart infusion broth: 5.0 g
- vitamin K1: 1mg
- vitamin B12: 5mg
- biotin: 5 mg
- folic acid: 5 mg
- folinic acid: 10 mg
- nicotinamide: 5 mg
- nicotine: 10 mg
- riboflavin: 1 mg
- thiamine pyrophosphate: 0.08mg
- nalidixic acid: 30 mg
- polymyxin B: 5mg
- fosphomycin: 100mg
- rifampicin: 2mg
- vinblastine and/or vincristine: 20 mg
- distilled water: QSP
- acide 2-méthylbutyrique: 0.1 ml
- acide valérique: 0.1 ml
- glucose: 0.4g
- maltose: 0.4g
- xylose : 0.4g
- arabinose: 0.4g
- mannose: 0.4g
- acide isobutyrique: 0.1 ml
- extrait de levure: 5.0 g
- sérumde veau: 100 mL
- acide isovalérique: 0.1 ml
- L-cystéine chlorhydrate: 0.5 g
- peptone: 5.0 g
- bouillon d’infusion cœur-cervelle: 5.0 g
- vitamine K1: 1 mg
- vitamine B12: 5 mg
- biotine: 5 mg
- acide folique: 5 mg
- acide folinique: 10 mg
- nicotinamide: 5 mg
- nicotinique: 10 mg
- riboflavine: 1 mg
- pyrophosphate de thiamine: 0.08mg
- acide nalidixique: 30 mg
- polymyxine B: 5mg
- fosphomycine: 100mg
- rifampicin: 2mg
- vinblastine et/ou vincristine: 20 mg
- eau distillée: QSPCulture medium according to one of Claims 6 or 7, comprising the following compounds in the following quantities or volumes per 1 L:
- 2-methylbutyric acid: 0.1 ml
- valeric acid: 0.1 ml
- glucose: 0.4g
- maltose: 0.4g
- xylose: 0.4g
- arabinose: 0.4g
- mannose: 0.4g
- isobutyric acid: 0.1 ml
- yeast extract: 5.0 g
- calf serum: 100 mL
- isovaleric acid: 0.1 ml
- L-cysteine hydrochloride: 0.5 g
- peptone: 5.0 g
- brain-heart infusion broth: 5.0 g
- vitamin K1: 1mg
- vitamin B12: 5mg
- biotin: 5 mg
- folic acid: 5 mg
- folinic acid: 10 mg
- nicotinamide: 5 mg
- nicotine: 10 mg
- riboflavin: 1 mg
- thiamine pyrophosphate: 0.08mg
- nalidixic acid: 30 mg
- polymyxin B: 5mg
- fosphomycin: 100mg
- rifampicin: 2mg
- vinblastine and/or vincristine: 20 mg
- distilled water: QSP
a) une étape dans laquelle l’échantillon est inoculé dans un milieu de culture selon l’une des revendications 6 à 9, sous forme liquide, sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C et pendant 4 à 7 jours dans un compartiment supérieur d’un dispositif composé dudit compartiment et d’un compartiment inférieur comprenant ledit milieu de culture stérile, sous forme liquide, lesdits compartiments étant séparés par un micro-filtre de 0,22 µm
b) une étape de récupération et de dilution en cascade du milieu présent dans le compartiment inférieur du dispositif et comprenant la bactérie appartenant au genreTreponema
c) une étape dans laquelle chaque dilution est inoculée dans un milieu de culture selon l’une des revendications 6 à 9 complété par une quantité suffisante d’agar de sorte à être solide et dans laquelle la culture est effectuée sous une atmosphère anaérobie, à une température de 37°C, pendant 3 à 5 jours
d) une étape de prélèvement de chaque colonie individuelle développée à l’étape c) puis de transfert de chaque colonie dans un tube contenant le milieu de culture selon l’une des revendications 6 à 9, sous forme liquide selon l’une des revendications 6 à 9, de sorte à obtenir des cultures pures de bactérie appartenant au genreTreponema, après 5 jours d’incubation sous une atmosphère anaérobie et à une température de 37°C
e) optionnellement une étape d’identification de l’espèce présente dans chacun des tubes par une analyse de désorption-ionisation laser assistée par matrice.Process for the in vitro culture of a bacterium belonging to the genus Treponema from a sample comprising or likely to comprise said bacterium, successively comprising:
a) a step in which the sample is inoculated in a culture medium according to one of claims 6 to 9, in liquid form, under an anaerobic atmosphere, at a temperature of 37°C and for 4 to 7 days in a upper compartment of a device composed of said compartment and of a lower compartment comprising said sterile culture medium, in liquid form, said compartments being separated by a 0.22 µm micro-filter
b) a cascade recovery and dilution step of the medium present in the lower compartment of the device and comprising the bacterium belonging to the genus Treponema
c) a step in which each dilution is inoculated into a culture medium according to one of claims 6 to 9 supplemented with a sufficient quantity of agar so as to be solid and in which the culture is carried out under an anaerobic atmosphere, at a temperature of 37°C, for 3 to 5 days
d) a step of sampling each individual colony developed in step c) then transferring each colony into a tube containing the culture medium according to one of claims 6 to 9, in liquid form according to one of claims 6 to 9, so as to obtain pure cultures of bacteria belonging to the genus Treponema , after 5 days of incubation under an anaerobic atmosphere and at a temperature of 37° C.
e) optionally a step of identifying the species present in each of the tubes by matrix-assisted laser desorption-ionization analysis.
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|---|---|---|---|---|
| US20150005248A1 (en) * | 2011-09-30 | 2015-01-01 | Advanced Laboratory Services, Inc. | Compositions and Methods for Culturing Spirochetes |
-
2019
- 2019-12-09 FR FR1913945A patent/FR3104170B1/en active Active
-
2020
- 2020-12-07 WO PCT/FR2020/052300 patent/WO2021116574A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| US20150005248A1 (en) * | 2011-09-30 | 2015-01-01 | Advanced Laboratory Services, Inc. | Compositions and Methods for Culturing Spirochetes |
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